Cahier de Reference Technique

Micropropagation pour lentreprise serricole
Cah ier d e r fr ences techniques
d ition 1999
Table des matires

1. 2. Introduction _____________________________________________________________ 5 Les phases de la micropropagation ___________________________________________6
2.1 Stade 0 : Conditionnement des plants mres__________________________________ 6 2.2 Stade 1 : tablissement dune culture aseptique : Dure 6 8 semaines ___________6 2.3 Stade 2 : La multiplication des tiges : Dure 4 5 semaines._____________________ 7 2.4 Stade 3 : La rhizognse (enracinement ) : Dure 2 4 semaines ________________ 8 2.5 Stade 4 : Lacclimatation : Dure 3 4 semaines_______________________________8
3.
La prparation dun milieu de culture ________________________________________ 9

3.1 Solution-mres de macro et micro-lments, fer et vitamines pour le milieu MS _____ 9 3.2 Rgulateurs de croissance _______________________________________________11 3.3 Volume des solution-mres_______________________________________________12 3.4 Prparation du milieu MS pour un volume de 1 000 ml ________________________ 14 3.5 Prparation du milieu MS pour un volume de 500 ml __________________________14 3.6 Prparation du milieu MS avec sachet commercial ____________________________ 15 3.7 La strilisation_________________________________________________________ 17
3.7.1 Strilisation lautocuiseur_______________________________________________________18
3.8 Matriel et quipement requis ____________________________________________ 19
4.
Les constituants des milieux nutritifs ________________________________________ 21

4.1 Les sels minraux ______________________________________________________21 4.2 Les vitamines _________________________________________________________ 21 4.3 Les rgulateurs de croissance ____________________________________________ 21
4.3.1 4.3.2 4.3.3 4.3.4 4.3.5 Les auxines __________________________________________________________________ 22 Les cytokinines _______________________________________________________________ 23 Les gibberellines ______________________________________________________________23 Balance hormonale vs rponse physiologique ________________________________________ 24 Nomenclature_________________________________________________________________ 24
4.4 Les sucres ____________________________________________________________ 26 4.5 Les gloses ___________________________________________________________26

4.5.1 4.5.2 Agar-agar ___________________________________________________________________ 26 Gels synthtiques (Substituts dagar) _______________________________________________27
4.6 Charbon activ_________________________________________________________ 27 4.7 Les composs organiques divers __________________________________________28 4.8 Les produits antibiotiques ou antiseptiques __________________________________28
5.
Les contenants __________________________________________________________30

5.1 Pots de bb __________________________________________________________30 5.2 Pots conserve (Mason) ________________________________________________ 30 5.3 Pots de boucher________________________________________________________ 31
6.
Prparation des solutions strilisantes _______________________________________32

6.1 Prparation dune solution de javel ________________________________________ 33 6.2 Prparation de lalcool 70 %______________________________________________33 6.3 Prparation dune solution anti-oxydante ____________________________________ 34
7. 8.
Strilisation de la hotte ___________________________________________________34 Manipulations des vgtaux sous la hotte_____________________________________ 34

8.1 Matriel requis ________________________________________________________ 34 8.2 Strilisation des vgtaux ________________________________________________ 35 8.3 Conditions et difficults de lasepsie _______________________________________36 8.4 Les infections et quelques unes de leurs causes: _____________________________ 37
9.
Inventaire global du matriel et des quipements ______________________________39
10. Glossaire des termes ______________________________________________________43
Micropropagation en entreprise Cahier de rfrences techniques dition 1999
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1. Introduction
La culture in vitro est un terme trs gnral pour dsigner la culture de cellules ou de tissus qui se dveloppent dans un milieu nutritif en conditions dasepsie pour une priode de temps indfinie. Les trois principaux champs daction de la culture in vitro concernent : la culture de cellules individuelles ou de protoplastes; la culture de tissus ou dorganes; la culture de plantes entires. La micropropagation sinscrit dans ce dernier champ dactivits et a pour principal objectif la multiplication de clones grande chelle. Elle consiste multiplier un individu donn partir dun fragment de vgtal plac sur un milieu nutritif en conditions aseptiques. La base biologique de la mthode est le dveloppement de bourgeons prexistants sur les fragments de plantes mis en culture, ou linduction de nouveaux bourgeons dits adventifs (noformation) sur les explants.
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2. Les phases de la micropropagation

Voici globalement les cinq stades de la micropropagation : 0. 1. 2. 3. 4. Conditionnement des plants mres; tablissement (ou initiation ) dune culture aseptique; Multiplication des tiges; Rhizognse (ou enracinement des tiges); Acclimatation des plantules.
2.1 Stade 0 : Conditionnement des plants mres Dans la description de cette technique on passe souvent sous silence le stade 0 qui contribue pourtant pour beaucoup au succs des stades suivants. Ce stade 0 rfre au conditionnement du plant mre. En effet, le plant mre devrait tre dpourvu de carences minrales et en pleine turgescence donc sans stress hydrique important. Au mieux et dans presque tous les cas, le plant devrait tre en croissance active, donc mis en culture en dehors de sa priode de dormance. Ceci limite dans le calendrier de production, les dates prfrables de mises en culture pour le stade dinitiation. Mais, une fois in vitro, ces plants pourront tre multiplis lanne longue. Aussi les plants mres choisis le seront en fonction de leur tat sanitaire. Des plants infests dinsectes peuvent apporter des problmes de taille toute une chambre de culture. A titre dexemple, les de thrips qui se logent dans ufs les interstices des bourgeons rsisteront la strilisation de surface des apex. Par la suite, des conditions favorables permettront leur closion. Les larves et les adultes particulirement se dplaceront dun tube lautre en qute de nourriture. Ces insectes sont suffisamment petits pour se glisser sous les bouchons et pntrer dans les tubes. On peut souponner leur visite lorsque des moisissures envahissent les contenants longtemps aprs la mise en culture. 2.2 Stade 1 : tablissement dune culture aseptique : Dure 6 8 semaines La littrature fournie souvent les premires informations essentielles au dpart dune culture. On trouve dans les livres ou revues spcialiss le dtail des formulations (recettes) de milieux nutritifs convenant de trs nombreuses espces vgtales. Gnralement les auteurs prcisent aussi le protocole de dsinfection de surface des explants ainsi quune description de lexplant mis en culture. Ce stade est de premire importance puisquil comporte de nombreux facteurs critiques : Le choix du plant mre; Le choix du fragment vgtal mettre en culture; Une strilisation de surface adquate garantissant la survie de lexplant tout en assurant lasepsie; La dcoupe de lexplant et sa position sur la glose;
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Le choix du milieu de culture quil est parfois ncessaire dajuster lgrement par la suite suivant la rponse de lexplant; La qualit du travail en asepsie de la technicienne ou du technicien. Dans plus de 50 % des cas, les premiers essais de mise en culture sont trs satisfaisants et demandent trs peu ou pas dajustements. Pour certains autres cas, la difficult rside dans la dsinfection des vgtaux, pour dautres dans lajustement de lquilibre hormonal. Mais selon tous les auteurs, thoriquement tous les vgtaux quels que soient leur espce ou leur cultivar, peuvent tre cultivs in vitro. Les explants les plus aptes entreprendre une multiplication sont gnralement riches en bourgeons ou en zones mristmatiques potentielles. Ils varient selon les espces : Les feuilles (ex. Ficus, Saintpaulia, Bgonia); Les tiges (asperge, colza); Les bourgeons (fraisier, vigne, lilas, bleuet); Inflorescences (chou-fleur, gerbera, hosta, poireau ).
La multiplication partir de la croissance de bourgeons axillaires offre les meilleures chances de conserver les caractristiques de lespce ou de la varit. En effet, cette technique ne fait quacclrer le fonctionnement normal des mristmes de bourgeons dj prsents sur la plante. Par contre, on diminue les chances dune stabilit gntique en provoquant lapparition de bourgeons nouveaux (la plupart du temps partir dun cal, en des endroits inhabituels tels les feuilles, les tiges, les racines). 2.3 Stade 2 : La multiplication des tiges : Dure 4 5 semaines. Cette tape seffectue au repiquage des plantules obtenues au stade prcdent. On veut ici accrotre le nombre de plants dun facteur de 4 5 chaque cycle chez les ligneux, et dun facteur de 4 12 chez les herbaces. Le milieu nutritif utilis est souvent identique celui du premier, bien quune diffrence parfois mineure sobserve dans la balance hormonale (quilibre auxine-cytokinine). Au stade de la multiplication, les cytokinines sont gnralement prsentes en plus grande concentration dans le milieu que les auxines. Ceci sexplique dun point de vue physiologique par le fait que les cytokinines sopposent la dominance apicale donc stimulent la croissance de nouvelles tiges. Encore une fois, la littrature fournie gnralement les informations ncessaires nous permettant de fixer notre choix sur une formulation approprie. La vitesse de croissance des plantes in vitro se module celle in situ. Si lespce mise en culture est croissance lente, on peut sattendre observer une croissance lente dans les tubes.
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2.4 Stade 3 : La rhizognse (enracinement ) : Dure 2 4 semaines Cette tape se caractrise par la naissance de racines sur les tiges feuilles obtenues au stade de la multiplication. Il arrive parfois que des espces prsentent un systme racinaire plus ou moins dvelopp au stade de la multiplication. Dans ce cas, il serait avantageux de faire des essais pour le passage immdiat en acclimatation. On conomise ainsi temps et argent sil nous est possible de passer outre cette tape (ex. Bgonia, Saintpaulia, fougre). Toutefois, si ce stade savre ncessaire, le milieu de culture varie quelque peu des milieux prcdents. Les sels minraux et les vitamines demeurent gnralement les mmes. Mais dans le cas du rosier par exemple, on suggre de diminuer la concentration des sels minraux de moiti. La diffrence majeure se situe principalement au niveau de lquilibre hormonal qui se fera cette fois en faveur des auxines. Des tiges trs feuilles et bien pourvues de bourgeons senracineront assez facilement dans un milieu dpourvu de rgulateurs de croissance. Les jeunes feuilles et les bourgeons sont des sites naturels de production dauxine et limage des boutures traditionnelles, ces jeunes plantules sauront senraciner delles-mmes. Par contre, certaines espces exigent lapport dauxines afin de stimuler linitiation de leurs racines. Cet auxine est souvent fourni sous forme dAIA. 2.5 Stade 4 : Lacclimatation : Dure 3 4 semaines Il sagit de la dernire tape qui consiste adapter progressivement les microplantules aux conditions qui prvalent dans la s erre ou lextrieur. Aprs avoir limin la glose de la base des plants, ils sont transfrs dans un substrat horticole. Les parties ariennes sont ensuite recouvertes de manire les maintenir dans un environnement qui avoisine les 100 % dhumidit relative. Les stomates de ces jeunes feuilles cultives in vitro demeurent constamment ouverts et laissent donc schapper leau de transpiration de manire continue. Les risques de desschement sont trs levs. Aussi doit-on attendre la croissance de nouvelles feuilles fonctionnelles avant denlever progressivement la pellicule de recouvrement.
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3. La prparation dun milieu de culture

Un milieu de culture est constitu principalement deau, de sels minraux (macro-lments, micro-lments, fer), dlments organiques (vitamines, sucre, parfois des acides amins, etc) de phytohormones ou de rgulateurs de croissance. Cette solution aqueuse est souvent solidifie au moyen dagar (substance extraite des algues marines que lon appelle agar-agar ou glose ). La glose est facilement dissoute 100oC, on doit donc atteindre le point dbullition afin de lincorporer au milieu de manire uniforme, cest pourquoi lon parle de la cuisson des milieux. Certains composs comme les micro-lments ou oligo-lments (B, Mn, Zn, Cu, Ni, Co, Mo, Al, I, Fe) , certaines vitamines et rgulateurs de croissance sont requis en si petite quantit quil est impossible de les peser. On doit donc les concentrer pralablement sous forme de solutions-mres . Par la suite, on pourra puiser mme ces solutions-mres la quantit requise dagent actif pour chacune des formulations de milieu recommand. Comme il peut tre long et fastidieux de peser les produits ncessaires chaque fois que lon fait un milieu, on utilise couramment des solutions o tous les ingrdients sont incorpors. 3.1 Solution-mres de macro et micro-lments, fer et vitamines pour le milieu MS Macro-lments (MS) - ( 20 X , tableau 1 : Milieu MS )
q q q q q
Verser approximativement 600 ml deau distille dionise (DDH2O) dans un bcher de 1 litre. Peser et dissoudre chacun des sels indiqus en chauffant lgrement au besoin. Transfrer la solution un flacon volumtrique de 1 litre et complter 1 litre avec DDH2O. Transfrer dans un contenant hermtique. Identifier puis ranger au rfrigrateur. Au besoin, pipetter 50 ml de cette solution pour 1 litre de milieu MS.
N.B. : Ne jamais pipetter directement dans le flacon de solution-mre. Verser la quantit approximative dans un bcher, en pipetter la quantit dsire ; le reste du bcher est rejet dans un contenant rebut. Micro-lments (MS) (100 X, voir tableau 1 : Milieu MS )
q q q q
Verser approximativement 600 ml de DDH2O dans un bcher de 1 litre. Peser et dissoudre chacun des sels indiqus. Transfrer la solution un flacon volumtrique de 1 litre et complter 1 litre avec DDH2O. Transfrer dans un contenant hermtique. Identifier puis ranger au rfrigrateur.
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Au besoin, pipetter 10 ml de cette solution pour 1 litre de milieu MS. (100X, voir tableau 1 : Milieu MS )
Fer (MS)
q q q q q q q q
Verser approximativement 600 ml de DDH2O dans un bcher de 1 litre. Ajouter quelques gouttes de NaOH (1N) et chauffer jusqu bullition. Couper la source de chaleur. Ajouter le Na2EDTA et mlanger jusqudissolution. Ajouter lentement le FeSO4-7 H2O, et mlanger jusqu dissolution. Transfrer la solution un flacon volumtrique de 1 litre et complter 1 litre avec DDH2O. Ranger dans un contenant ambr (ou recouvert dun papier daluminium) , identifier puis conserver temprature de la pice. Au besoin, pipetter 10 ml de cette solution-mre de fer pour 1 litre de milieu MS.
Vitamines (MS) (10 X, voir tableau 1 : Milieu MS)

q q q q q
Verser approximativement 70 ml de DDH2O dans un bcher de 100 ml. Peser et dissoudre chacune des vitamines indiques. Transfrer la solution un flacon volumtrique de 100 ml et complter 100 ml avec DDH2O. Ranger au rfrigrateur dans un contenant hermtique et bien identifi. Au besoin, pipetter 10 ml de cette solution pour la prparation dun litre de milieu MS.
NOTE : En raison de leur sensibilit la chaleur, les vitamines peuvent tre ajoutes au reste du milieu MS autoclav. Dans ce cas, les 10 ml de solution-mre de vitamines seront striliss mcaniquement laide de filtres micropores puis ajout, en conditions aseptiques, au litre de milieu MS avant glification. Conservation : maximum 4 semaines. Tableau 1 : Milieu MS Constituant
Macro-lments 20X NH4NO3 KNO 3 CaCl2 - 2 H2O MgSO4 - 7 H2O KH2PO4 Micro-lments 100X
Solution mre (mg par litre)

33 000 38 000 8 800 7 400 3 400
Volume ajouter Concentration (ml par litre) finale (mg par litre)
50 ml 1 650 1 900 440 370 170 10 ml
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MnSO4 - H2O ZnSO4 - 7 H2O H3BO3 KI Na2MoO 4 - 2 H2O CuSO4 - 5 H2O CoCl2 - 6 H2O Fer 100 X Na2EDTA FeSO4 - 7 H2O Acides amine et vitamines 10 X Glycine Ac. Nicotinique Pyridoxine HCl Thiamine HCl Sucres Myo-inositol Sucrose Agar 3 730 2 780
2 230 860 620 83 25 2.5 2.5 10 ml 37.3 27.8 10 ml 20 mg pour 100 L 5 mg pour 100 L 5 mg pour 100 L 1 mg pour 100 L
22.3 8.6 6.2 0.83 0.25 0.025 0.025
2.0 0.5 0.5 0.1 100 30 000 10 000
3.2 Rgulateurs de croissance Les rgulateurs de croissance utiliss vari eront selon lessai envisag. Notons ici que chaque espce vgtale (voire mme varit) peut exiger une combinaison particulire de rgulateurs de croissance. Ainsi, chez une mme espce ou varit, cette combinaison diffre selon la rponse attendue quil sagisse par exemple de multiplication de tiges, rhizognse ou autre. Suivant la littrature et lessai envisag, les types et les quantits de rgulateurs seront dtermins. Ces composs, contrairement aux lments nutritifs et aux vitamines, ne sont pas solubles dans leau. Ils doivent donc tre pralablement solubiliss dans un solvant appropri. Si les quantits requises par litre de milieu raliser dpasse 2 mg, on peut simplement peser et dissoudre le rgulateur dans le solvant appropri et lajouter au reste du milieu. Si la quantit dsire est infrieure 2 mg, il est conseill pour plus de prcision de procder la fabrication dune solution-mre. Ainsi, on peut concentrer 10, 100 ou 1 000 fois le compos requis dans un volume de 100 ml ou 1 000 ml. Prparation des solutions-mres de rgulateurs de croissance :
q
Peser le rgulateur de croissance dsir et le dissoudre dans quelques gouttes du solvant appropri.
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tendre avec un peu deau, vrifier ltat de dissolution et ajouter un peu de solvant au besoin. Rincer la nacelle une fois ou deux laide du solvant recommand. Complter au volume prvu dans un flacon volumtrique avec DDH2O. Transfrer dans un flacon hermtique (identifi) et ranger au rfrigrateur
q q q
Conservation : Pour lAIA, cest quelques jours et pour les autres 4 semaines au maximum. Rangement : Rfrigrateur (4 5 o C) ou conglateur. Plusieurs rgulateurs de croissance sont dgrads par la lumire en solution aqueuse. Plusieurs sont dgrads par la chaleur, mais c ertains sont stables 120oC (ANA, 2-4-D, Kin, BAP, Za). La gibbrelline et lAIA sont trop instables pour tre conservs de manire routinire; ne prparer que la quantit requise au moment de lutilisation. Tableau 2 :Types de rgulateurs de croissance et leur solubilit 1. Auxines Rgulateurs 2-4-D AIA AIB ANA Adnine Adnine sulfate BAP BA 2iP Kintine Thidiazuron Zatine GA3 Solvants EtOH ou 1N NaOH EtOH ou 1N NaOH EtOH ou 1N NaOH 1N NaOH 1.0 HCl ou NaOH NaOH ou HCl EtOH ou NaOH 1N NaOH 1N NaOH 1N NaOH DMSO 1N NaOH EtOH
2. Cytokinines
3. Gibberellines
3.3 Volume des solution-mres Dans la pese de produits demandant de trs faible quantit, on peut parfois contourner le besoin dune balance de prcision 0.001g en utilisant une balance moins prcise par exemple 0.001g ou 0.01 g. Il sagit alors de prparer une solution-mre du produit en pesant une plus grande quantit et en oprant des dilutions. Par exemple vous avez besoin de 0.1 mg - Solution-mre no.1 Peser 1 gramme du produit (cest- -dire 1 000 mg);
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Dissoudre avec le solvant appropri et complter le volume 100 ml avec de leau distille; Rsultat : 1 000 mg / 100 ml donc chaque ml de cette solution contient 10 mg du produit. - Solution-mre no.2 Prendre ensuite 1 ml de cette solution no.1 (10 mg) dans 99 ml deau distille; Rsultat : 10 mg / 100 ml donc chaque ml de cette solution contient 0.1 mg du produit; Il suffit dajouter 1 ml de cette dernire solution-mre no.2 afin dobtenir le 0.1 mg du produit dsir. Lorsque vous dsirez connatre la quantit de solution-mre ajouter un milieu de culture afin dobtenir un nombre de milligrammes spcifique, vous devez simplement utiliser la rgle du produit crois rgle de trois). Les deux problmes suivants vous proposent deux faons diffrentes de solutionner cette difficult. Problme 1 : Vous voulez utiliser un total de 3 270 mg de sels pour fabriquer un litre de solution-mre doligo-lments MS. Pour une recette particulire, vous devez incorporer 32,7 mg (oligolments MS) au litre de milieu en prparation. Quelle volume de solution-mre devez-vous utiliser ? Solution : 3 270 mg 1 000 ml = 32,7 mg ? ml = = (produit crois)
1 000 ml X 32,7 mg 32 700 32 700 3 270 = ?
3 270 mg X 3 270 X
? ?
Rponse : 10 ml Problme 2 : Vous avez une solution-mre dauxine dont la concentration est de 1 mg / 100 ml, combien de millilitres de cette solution devez-vous utiliser, si la recette indique 0,1 mg / l dauxine ? Solution : Il faut dabord exprimer les concentrations en pourcentage. Ensuite, compltez lquation suivante laide des donnes qui vous sont fournies dans lnonc du problme: Volume utilis sol.-mre Vol. sol. Prescrite ________?________ = Concentration prescrite (%) Concentration sol.-mre _______0.01 %_________
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1 000 ml 1 000 ml X 0.01 % 0,01 % = =
1.00 % 1,00% X 10 ml ?
1 000 ml X 1,00 %
Rponse :10ml 3.4 Prparation du milieu MS pour un volume de 1 000 ml

q
q q q q q q q q q q
q q q
Verser approximativement les deux tiers de la quantit deau requise (soit environ 600 ml) dans un bcher de 2 litres. Leau utilise doit avoir t dminralise et distille (DDH2O). Agiter. Un la fois, les composs (mis part le sucre et lagar) sont ajouts leau dans lordre prvu sur la feuille descriptive (macro-micro-fer-vitamines-rgulateurs). NE PAS CHAUFFER. Pour de meilleurs rsultats, on attend la dissolution complte avant lajout du compos suivant. Dans le cas dune solution-mre, ne jamais pipetter dans le contenant Dans le cas de composs solides (2 mg et plus) , dissoudre dans le solvant appropri et rincer les nacelles leau afin de recueillir toutes traces de composs. Ajuster le pH du milieu avec du NaOH ou du HCl tout en agitant la solution. Si dsir, le milieu peut alors tre entrepos au rfrigrateur pour une journe. Complter le volume de la solution 1 000 ml laide dun ballon volumtrique. La solution doit tre la temprature de la pice. Verser nouveau le milieu dans le bcher de 2 litres recouvert dun papier daluminium. Le dposer sur une plaque chauffante : CHAUFFER ET AGITER. Ajouter graduellement le sucrose, attendre quil soit compltement dissout. Ajouter graduellement lagar en neige fine en prenant soin de ne pas saupoudrer les parois internes du bcher. Continuer de chauffer la solution jusqu bullition et dissolution de toutes les particules dagar. Lagar est compltement dissout lorsque la solution redevient claire. Transfrer le milieu chaud dans les contenants appropris et identifier. Striliser les contenants lautoclave (121oC ; 15 20 minutes selon le volume des contenants). Garder le milieu au rfrigrateur jusquson utilisation.
3.5 Prparation du milieu MS pour un volume de 500 ml

q
Verser approximativement les deux tiers de la quantit deau requise (soit environ 300 ml) dans un bcher de 1 litres. Leau utilise doit avoir t dminralise et distille (DDH2O). Agiter.
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q q q q q q q q q q
q q q
Un la fois, les composs (mis part le sucre et lagar) sont ajouts leau dans lordre prvu sur la feuille descriptive (macro-micro-fer-vitamines-rgulateurs). NE PAS CHAUFFER. Pour de meilleurs rsultats, on attend la dissolution complte avant lajout du compos suivant. Dans le cas dune solution mre, ne jamais prlever directement du contenant Dans le cas de composs solides (2 mg et plus) , dissoudre dans le solvant appropri et rincer les nacelles leau afin de recueillir toutes traces de composs. Ajuster le pH du milieu avec du NaOH ou du HCl tout en agitant la solution. Si dsir, le milieu peut alors tre entrepos au rfrigrateur pour une journe. Complter le volume de la solution 500 ml laide dun ballon volumtrique. La solution doit tre la temprature de la pice. Verser nouveau le milieu dans le bcher de 1 litre recouvert dun papier daluminium. Le dposer sur une plaque chauffante : CHAUFFER ET AGITER. Ajouter graduellement le sucrose, attendre quil soit compltement dissout. Ajouter graduellement lagar en neige fine en prenant soin de ne pas saupoudrer les parois internes du bcher. Continuer de chauffer la solution jusqu bullition et dissolution de toutes les particules dagar. Lagar est compltement dissout lorsque la solution redevient claire. Transfrer le milieu chaud dans les contenants appropris et identifier. Striliser les contenants lautoclave ( 121oC ; 15 20 minutes selon le volume des contenants). Garder le milieu au rfrigrateur jusquson utilisation.
3.6 Prparation du milieu MS avec sachet commercial Plusieurs compagnies offrent des poudres prtes utiliser vendues en sachet pour la ralisation de milieu. Il faut toutefois apporter une attention particulire au contenu de ces poudres qui sont gnralement dcrites laide dun tableau. En effet, les sachets identifis MS medium ne contiennent pas les mmes produits quun milieu MS salts par exemple disponibles chez Sigma. Dans ce cas particulier, le sachet MS salts contient tous les sels minraux (macro et micro-lments) prescrits par Murashige et Skoog tandis que le sachet MS medium contient en plus de ces sels minraux, les vitamines dcrites par ces auteurs. Certains sachets comptent, en plus des sels minraux et des vitamines, les rgulateurs de croissance indispensables la croissance et au dveloppement des plantes propres chacun des stades : initiation dune culture, multiplication et rhizognse. Ces poudres pr-mlanges prsentent de nombreux avantages et sont gnralement fiables utiliser. Les diffrents fournisseurs de produits et quipements ncessaires la culture in vitro, offrent une gamme de plus en plus varie de ce type de produits dont voici quelques exemples : Murashige et Skoog (MS) basal salts :
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Il sagit dun produit intressant puisque ce milieu est trs largement utilis et convient de trs nombreuses culture. Il permet lajout des produits organiques (vitamines et rgulateurs) spcifiques la culture convoite. Murashige et Skoog (MS) medium : Dans le cas o la plante cultive demande des vitamines de types MS, ce sachet nous vite la prparation de solutions-mres de vitamines donc une conomie de temps. Anderson : Ce type de milieu savre intressant dans le cas de cultures de plantes acidophylles. Les sachets contenants uniquement des sels sont disponibles. Aussi trouve-t-on sur le march des milieux pr-mlangs pour la culture du Rhododendron (stades I, II, et III). Vacin et Went medium : Ce mlange de sels minraux est trs utilis dans la culture dorchide, particulirement pour le Cybidium. Knudson medium : Utilis pour la germination des orchides in vitro WMP medium : Ce milieu Woody plant medium (WPM) est plus frquemment employ dans la culture des plantes ligneuses mais aussi loccasion dans la culture des plantes vivaces. White medium Milieu de culture faible concentration en sels minraux.
Plusieurs milieux sont maintenant vendus pour la ralisation de cultures spcifiques : Saintpaulia ionantha; Fougre; Rhododendron; Drosera; Kalanchoe; Gerbera; Begonia; Cattleya; Poinsettia; Lys; etc. Prparation dun litre de milieu nutritif (sachet commercial)
q q q
Verser 800 ml deau distille dans un contenant de 2 litres. Ajouter tout le contenu du sachet contenant le milieu pr-prpar en remuant constamment. Rincer lintrieur du sachet laide de quelques ml deau distille contenue dans un flacon laveur afin den rcuprer toute la poudre.
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q q q
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Mesurer le pH de la solution et au besoin lajuster la valeur dsire. Si le pH est trop acide (bas), lajuster laide dune solution de NaOH 1N; si il est trop alcalin (haut), utiliser du HCl 1N. Sassurer de la bonne dispersion de lacide ou de la base avant de tester nouveau. Ajuster le volume 1 litre laide dun ballon jaug. Chauffer la solution dans le contenant de dpart (2 litres) et ajouter le sucrose graduellement en remuant constamment. Une fois le sucre dissout, ajouter en neige fine la glose toujours en remuant et chauffer jusquau point dbullition. La glose sera compltement dissoute lorsque le milieu sera redevenu clair. Partager le milieu de culture de faon obtenir 40 tubes culture contenant chacun environ 12 14 ml. Striliser les tubes (ou autres contenants) lautoclave ( ou autocuiseur ) durant 15 minutes 15 lb de pression ( 121oC ) Laisser refroidir la temprature de la pice. Les milieu de culture peuvent tre refroidi en pente de 45o sils sont simplement maintenus dans cette position lors du refroidissement. Les milieux doivent tre conservs au rfrigrateur sils ne sont pas utiliss dans la semaine suivante. Dans tous les cas, pour de meilleurs rsultats, ils devraient tre utiliss dans les deux semaines suivant leur fabrication.
3.7 La strilisation Le maintien des cultures en conditions aseptiques sous entend la strilisation des milieux de culture, dinstruments de manipulation et de dissection, deau de rinage, etc. Lacquisition dun quipement permettant la strilisation est donc indispensable au laboratoire de micropropagation. Lquipement de strilisation par excellence est sans conteste lautoclave. Cependant, compte tenu de son cot dachat (jusqu $5 000), il convenait ici de trouver un quipement de remplacement efficace moindre cot. Trois modes de strilisation ont donc t tests afin de rpondre notre besoin et les rsultats sont dtaills au chapitre 4 : Utilisation dun bain deau bouillante dans lequel les tubes (ou autres contenants) sont plongs pendant 30 minutes; Utilisation dun micro-ondes dune puissance de 700W dans lequel les tubes (10 la fois) sont chauffs pendant 10 minutes; Utilisation dune cocotte minute (autocuiseur; autoclave conserve) pendant 15 minutes 15 lb de pression. Pour des raisons techniques et pratiques, nous avons retenu lutilisation de lautocuiseur domestique. Son cot est denviron 130$. Il permet la strilisation de prs dun litre de milieu la fois et il sutilise sur une cuisinire conventionnelle. De plus, il nous assure latteinte dune temprature de 121oC. Leau bout 100 oC sauf dans les rgions montagneuses, et ceci est normalement suffisant pour dtruire la plupart des moisissures
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et les levures. Toutefois, une temprature de 115 oC (240oF) est ncessaire pour dtruire les bactries nuisibles. Durant la strilisation sous pression, une portion de leau dans lautoclave ou lautocuiseur est change en vapeur et quand lair est compltement sorti par le tuyau dchappement, on place le rgulateur de pression. La vapeur qui se dilate crera de la pression. Quand la pression augmente dans lautoclave, la temprature augmente aussi. Ainsi un rgulateur assurant 5 lb de pression permettra la temprature datteindre 110oC, 10 lb de pression la temprature slvera 115oC et 15 lb de pression la temprature atteinte sera denviron 121 oC. La technique de culture in vitro exige des tempratures de strilisation de 121 oC. Seule une temprature aussi leve permettra la destruction de bactries rsistantes. Une seule bactrie prsente dans un tube culture donnera naissance en moins dune ou deux semaines une colonie de bactries visible loeil nu. La qualit nutritive des milieux de culture permet un essor rapide de la croissance des micro-organismes qui entre en comptition avec la croissance des vgtaux. Il est donc impratif dliminer par strilisation des milieux tous les micro-organismes. Le temps de strilisation est galement important. Il convient gnralement dobserver un temps de strilisation de 15 20 minutes 15 lb de pression afin de s assurer de la destruction des bactries endosporulantes les plus rsistantes la chaleur. Si toutefois le volume de milieux ou deau striliser est plus important, par exemple 250 ml par contenant, il est alors recommand daugmenter le temps de strilisation 30 minutes aprs la mise sous pression de lautocuiseur.
3.7.1
Strilisation lautocuiseur
Important: Le protocole suivant a pour but de vous informer des principales tapes suivre lors de la strilisation lautocuiseur. Il ne doit en aucun cas remplacer le suivi des instructions dutilisation du fabricant de votre autocuiseur. Sassurer que lautocuiseur est bien propre et en bonne condition (joint dtanchit, valve); Sassurer que les tubes ou les contenants ne sont pas craqus ou brchs et que les bouchons sont en bonne condition; Sassurer que les contenants ne contiennent pas plus de la moiti de leur volume. Les tubes contiennent gnralement entre 12 et 14 ml de milieux; Ajuster les couvercles suivant les instructions du fabricant. On dvisse dau moins tour les couvercles sur les pots Mason; Verser 3.5 L deau bouillante (ou lquivalent de 1 1/2 pouce) dans lautocuiseur avec le support en place. Placer lautoclave sur un feu bas; Placer chaque contenant debout sur le support dans lautocuiseur. Les tubes peuvent tre maintenus debout en les attachant par lots de 5 ou insrs debout dans des pots vides. Toujours utiliser le support pour la strilisation. Les bocaux ou les tubes peuvent se briser sils sont en contact direct avec le fond de lautoclave; Disposer sur un des contenants un ruban rvlateur de strilisation celui-ci permettra de confirmer si les conditions de strilisation ont t atteintes (121oC durant 15 minutes);
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Sassurer que le tuyau dchappement est ouvert avant de mettre le couvercle sur lautocuiseur; Placer le couvercle sur lautoclave et le fermer solidement. Les poignes du couvercle doivent tre au centre des poignes de la marmite. NE PAS laisser monter la pression dans lautoclave avant davoir ferm le couvercle solidement en place; Pour faire vacu lair de lautoclave et des contenants, mettre lautoclave sur un feu assez haut pour que la vapeur jaillisse librement par le tuyau dchappement. Rduire la chaleur pour maintenir un jaillissement de vapeur modr. Laisser la vapeur sortir durant 7 10 minutes; Dposer le rgulateur de pression (15 lb) sur le tuyau dchappement; Si votre autoclave est muni dune valve de scurit automatique, elle devrait se soulever pour sceller la marmite. (Voir instruction du fabricant); Faire chauffer lautoclave jusqu ce que le rgulateur de pression commence remuer gentiment . Ajuster la chaleur afin dobtenir un rythme lent et rgulier. Un feu relativement lev est ncessaire pour la plupart des cuisinires. N PAS toucher et NE PAS E enlever le rgulateur de pression durant la priode de strilisation; A la fin de la dure de strilisation, arrter la chaleur et laisser la pression tomber par elle mme afin quil ny est pas de dbordement. La pression est tombe lorsque le plongeur de la valve de scurit est descendu et quil ny a plus de vapeur qui schappe lorsque le rgulateur est pench; Enlever le rgulateur de pression du tuyau dchappement; Laisser lautoclave refroidir 1 2 minutes et lever le couvercle de lautoclave de faon ce que la vapeur soit loigne de vous; Sortir le matriel de lautoclave et ajuster les couvercles si ncessaire. 3.8 Matriel et quipement requis
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Plaque chauffante pourvue dun agitateur (une cuisinire lectrique ou au gaz ainsi quun fouet tel quutilis en cuisine); Bcher de 2 litres (chaudron 2 L en verre ou en stainless steel); Flacon laveur (distributeur condiments (moutarde) en plastique dont on perce le bec dun trou fin fait laiguille); Dispensette ( rcipient avec bec verseur pouvant contenir 1 litre de milieu chaud ou bouteille dun litre avec goulot pouvant recevoir une pompe en plastique souvent retrouve sur les format gant de shampoing ); Gants isolants (mitaines ou autres pour la cuisine permettant de tenir des contenants chauds); 80 tubes de culture (25 X 150 mm) pour 1 litre de milieu ou 40 tubes pour litre dans un ratelier (des pots Mason, des petits pots de verre pour la nourriture de bb, pot de plastiques autoclavables portant la mention pp); pH mtre ( un pH mtre portatif peut-tre utilis mais toutefois beaucoup moins fiable); NaOH 1N et HCl 1N (pour ajuster le pH du milieu); Autoclave (un autocuiseur domestique dune capacit de 20 litres ou plus);
Micropropagation en entreprise Cahier de rfrences techniques dition 1999 q q q q q q q q q q
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Balance analytique dune prcision au 10 millime de gramme 0.0001; Balance digitale dune prcision au 0.10 gramme; Spatule (pour peser les poudres et les sels); Nacelles (petits contenants lgers en plastique pour contenir les produits peser); Eau dionise (eau distille disponible en pharmacie); Flacon volumtrique ( 1 000 ml et/ou 500 ml); Contenants hermtiques ambrs pour la conservation des solutions-mres; Pipettes (1, 5, et 10 ml); Ruban tiqueter et crayon encre permanente; Ruban rvlateur de strilisation.
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4. Les constituants des milieux nutritifs

4.1 Les sels minraux Les besoins nutritifs des plantes en culture in vitro concernent dabord les sels minraux. Le praticien doit avant toute chose recrer pour la plante un milieu de vie comparable au sol dont elle sera maintenant dpourvue. Tous les lments essentiels sa croissance doivent donc tre incorpors au milieu sans quoi une carence minrale peut survenir. De plus, le choix des diffrents sels devra respecter un quilibre ionique afin de favoriser une croissance harmonieuse sans crer dinhibition. Les besoins des cultures de tissus en lments minraux ont t tudis par diffrents auteurs et le fruit de leurs recherches a donn lieu diffrentes compositions minrales toujours utilises aujourdhui. Ces formulations portent souvent le nom de leurs auteurs tels que GAMBORG (Canada), GAUTHERET (France), HELLER (France), MURASHIGE et SKOOG (Etats-Unis), WHITE (Etats-Unis), MOREL (France ), etc. La composition du milieu de culture Murashige et Skoog est sans doute la plus utilise car elle convient un trs grand nombre de plantes de familles botaniques diffrentes. Ce milieu est trs riche en sels minraux et il convient souvent de le diluer de moiti ou plus afin dviter des effets osmotiques inhibiteurs, particulirement chez les espces croissance trs lente. 4.2 Les vitamines Les vitamines sont des substances organiques reconnues pour stimuler la croissance. Elles sont particulirement utiles en micropropagation lorsquun fragment seulement de la plante est utilis pour gnrer la culture de plantes entires. On comprendra que dans ces circonstances, la synthse endogne (par le tissu vgtal lui-mme) de vitamines risque dtre insuffisante et que le milieu devra y suppler en consquence. Les vitamines les plus frquemment utilises sont la thiamine HCL, la pyridoxine, la biotine, le pantothnate de calcium et le myo-inositol (le myo-inositol est parfois considr comme un sucre). Les concentrations sont souvent faibles et il sera alors ncessaire de fabriquer des solutions-mres. La conservation de ces solutions-mres pourra se faire au conglateur en contenants de plastique ou distribues dans des cubes glaon par petits volumes (exemple 10 ml), puis dmouls une fois gels et rangs dans des sacs conglation. Une fois la solution sortie et dcongele, elle devra tre utilise dans les 2 4 semaines qui suivent. 4.3 Les rgulateurs de croissance On les appelle aussi phytohormones ou hormones vgtales , mais considrant quil sagit variablement de produits de synthse ou de produits synthtiques, il est prfrable dutiliser le terme rgulateurs de croissance. Ces substances sont utilises des doses trs faibles (0.01mg/l 10 mg/l) et ncessitent le plus souvent dtre peses sur une balance de prcision 0.0001g. Il est toutefois possible de fabriquer des solutions-mres partir de masses slevant 100 mg et doprer par la suite une srie de dilutions. Les trois principaux groupes de rgulateurs de croissance dusage frquent sont les AUXINES, les CYTOKININES et les GIBBERELLINES. Le choix du ou des rgulateurs utiliss ainsi que
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leur quantit est gnralement guid par la littrature. Si lespce vgtale convoite ne figurent pas parmi vos lectures et quaucun milieu de culture ne semble disponible titre de rfrence, une premire exprience pourrait tre tente en utilisant un milieu de culture rput convenable pour une espce voisine ou pour une plante dun mme genre ou mme dune mme famille botanique.
4.3.1 Les auxines
Rles in vitro : Favorise la croissance de cals, les divisions cellulaires, lallongement cellulaire Favorise le dveloppement de bourgeons adventifs Favorise lenracinement. Acide indole-3-actique (A .I.A.) : Substance naturelle pouvant tre obtenue par synthse chimique; Auxine relativement faible; Se dgrade rapidement la lumire (oxydation); Conserve prfrablement dans un contenant ambr (obscurit) au rfrigrateur (4 -5 oC). Se conserve 7 jours dans ces conditions; Soluble dans lthanol ou le mthanol (96o). Acide naphtalne actique (ANA) : Substance de synthse stable en solution et la chaleur (autoclave); Auxine forte et trs stable; Souvent utilise pour favoriser la rhizognse (initiation des racines); Conserve au rfrigrateur ou au conglateur; Soluble dans lthanol ou le mthanol (96o). Acide indole-butyrique (A.I.B.) : Substance de synthse relativement stable; Auxine relativement faible; Soluble dans lthanol ou le mthanol (96o). Acide 2,4 dichlorophnoxyactique (2,4-D) : Substance de synthse stable la chaleur (autoclave); Largement utilise comme herbicide; Auxine trs forte et dont le niveau toxique est atteint trs rapidement; Utilise pour la production de cals surtout; Peu soluble dans leau. Dissoudre dans lthanol. Chauffer lgrement. Diluer progressivement avec de leau; Conserve lobscurit au rfrigrateur ou au conglateur.
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4.3.2
Les cytokinines
Rles in vitro : Stimule les divisions cellulaires; Rgularise la morphognse (acquisition de la forme); Stimule la croissance des bourgeons axillaires; Contribue au renouvellement de la chlorophylle. Toutes les cytokinines sont peu solubles dans leau et doivent tre pralablement dissoutes dans quelques gouttes de NaOH 1N ou de HCl 1N. Elles sont dgrades par la lumire et doivent tre conserves au rfrigrateur lobscurit. Elles sont stables en solutions aqueuses et la chaleur (autoclave). Zatine : Substance naturelle. Isopenthnyladdine (2-i-P) : Substance naturelle; Cytokinine relativement faible. Kintine : Substance de synthse. 6-benzylaminopurine (BAP) et benzyladnine (BA) : Substance de synthse; Largement utilis en raison de sa grande activit et de son faible cot.
4.3.3
Les gibberellines
Rles in vitro : Favorise le grandissement cellulaire; Favorise lallongement des entre-n uds; Lve la dormance des graines. Seul lacide gibberellique A 3 (Ga3) est utilis. Vrifier sa concentration sur ltiquette; Substance de synthse peu stable en solution aqueuse; Devrait tre prpare juste au moment de lutilisation; Pourrait tre conserve dans lalcool (thanol ou mthanol 96o) au rfrigrateur.
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4.3.4
Balance hormonale vs rponse physiologique
Ce schma1 reprsente les niveaux relatifs dune auxine et dune cytokinine ncessaire afin dobtenir diffrentes rponses morphogniques.
lev Faible
Formation de racines sur les boutures Embryognse Formation de racines adventives sur le cal Initiation de cal chez les dicotyldones Formation de tiges adventives
Faible
Formation de tiges auxiliaires
lev
Auxines
4.3.5 Nomenclature
Cytokinine
Les tableaux suivants dressent la liste des abrviations courantes. Rgulateur de croissance AIA (IAA en anglais) AIB (IBA en anglais) ANA (NAA en anglais) 2,4-D 2,4,5-T CPA PIC NOA BTO A BA ou 6-BA ZEA GA ABA
1
Poids molculaire (g) 175.2 203.2 186.2 221.04 255.5 241.5 202.20 BA (225.3) 219.2 346.37 264.31 Acide indole-3-actique Acide indole-3-butyrique Acide naphtalne actique Acide 2,4-dichlorophnoxyactique Acide 2,4,5-trichlorophnoxyactique Acide 4-chlorophnoxyactique Picloram (acide amino -3,5,6trichloropicolinique) Acide 2 -naphthoxyactique Acide 2-benzothiazolactique 6-benzylaminopurine Zatine Acide gibberellique Acide Abscissique
Source : Georges E.F. et P.D. Sherrington, Plant propagation by tissue culture , Handbook and directories of commercial laboratories, Exegetics Ltd, 1984 p. 307.
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KIN 2 iP Additifs CH CW EDTA ADE ou Ad Formulations MS B5 ER WH
215.2 203.2
Kintine 2- iopenthnyladnine
Hydrolysat de casine Coconut water Acide thylnedinitrilo-ttraactique Adnine
Murashige et Skoog (1962) Gamborg et al. (1968) Erikkson (1965) White (1963)
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4.4 Les sucres Les tissus vgtaux en culture in vitro sont trs peu performants au niveau photosynthtique. Ils produisent de la chlorophylle comme des tissus normaux, mais leur faible capacit produire des sucres par photosynthse est sans doute due la faible concentration en gaz carbonique (CO2) des contenants. Ainsi doit-on ajouter au milieu de culture des glucides sous forme de saccharose (sucrose) afin que la plante les utilisent comme source dnergie dfaut den produire elle-mme. En gnral, la concentration prescrite est de 30 g au litre. Le passage lautoclave provoque une altration des sucres par hydrolyse (glucose-fructose) mais cette modification ne semble pas nuire la croissance. 4.5 Les gloses La glose (ou agar) ajoute au milieu nutritif permet lobtention dun milieu semi-solide ou solide dans lequel les explants peuvent tre repiqus et supports. En labsence de glose, les milieux liquides doivent tre agits (sur de plaque rotative raison dune ou deux tours minute ) afin de permettre lincorporation de loxygne ncessaire leur survie, on vite ainsi leur asphyxie. La glose a lavantage de retenir trs peu les ions mais en contrepartie il fournit un milieu de vie pauvre en oxygne lorsquelle est utilise forte concentration. Une variation de la concentration en glose (entre 6 et 10 g/litre), a aussi pour effet de modifier lquilibre osmotique du milieu crant parfois des problmes de vitrification. La qualit dun milieu glos est donc dpendante dune part de sa fermet, indispensable au support des plantes, et dautre part de sa souplesse, qui facilite la diffusion des lments nutritifs. La concentration utilise varie selon le niveau de puret de la glose et lobjectif de la culture.
4.5.1 Agar-agar
Il sagit dune substance naturelle extraite de diffrentes espces dalgues marines. On la classe parmi les sucres parce quelle est identifie comme un polyoside (donc un glucide). Elle se dissout dans leau entre 90 et 100oC. En refroidissant, elle demeure ltat liqui de jusque vers 55oC et elle se solidifie en un gel relativement clair au environ de 40oC. Le milieu glos ne peut tre port bullition une seconde fois car cette sur-cuisson entranerait une dgradation de lagar qui perdrait alors ses proprits. De plus, la solidification du milieu glos peut tre compromise si le pH de la solution a t ajust sous les 4.8. En effet, il semble qu des pH aussi bas (plantes acidophiles), lagar perd de ses proprits au moment de lautoclavage. la sortie de lautoclave, la glification se fait normalement en 2 3 heures, selon le volume de milieu par contenant. Lagar vendu commercialement contient malgr tout des impurets (des ions sulfates, calcium, magnsium, fer, etc.). Cest pourquoi son prix varie en fonction de la purification du produit. La mention purifi est dune qualit suffisante lexercice de cette technique.
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4.5.2
Gels synthtiques (Substituts dagar)
Il existe prsentement sur le march, de nouveaux produits permettant de solidifier les milieux de culture. Par exemple, le Gelrite ou Phytagel dont plusieurs auteurs font mention est driv dune bactrie (Pseudomonas sp). Il sagit dun sucre complexe hautement raffin. Leur utilisation est intressante. Elle permet de raliser un milieu dune clart cristalline, et des quantits avoisinant 2 g/litre permettent dobtenir une glification quivalente lagar traditionnel 7 g/litre. Son prix de revient est le double de celui de lagar mais compte tenu quon en utilise seulement le tiers de la quantit de lagar conventionnel, son utilisation demeure intressante. On doit toutefois prendre note que la clart du milieu ralis avec ces gels synthtiques peu faussement laisser croire une contamination bactrienne autour de lexplant. En effet, les exsudats produits en cours de culture seront maintenant plus visibles et ne devront pas tre confondus une quelconque colonie bactrienne. Nos essais nous ont fait prfrer le Phytagel pour sa facilit de dissolution, son prix et le rsultat de culture en tout point comparable lutilisation de lagar conventionnel. Lors de nos essais, nous avons incorpor 2 g de Phytagel par litre de milieu de culture. Dautres auteurs, comme Lydianne Kyte, suggrent de recourir lusage de lagar et des gels synthtiques combins. En effet, Mme L. Kyte propose lutilisation de 3 parties de Gelrite pour 1 partie dagar. Pour satisfaire cette demande des utilisateurs, la compagnie Sigma offre un nouveau produit, l Agargel . Il sagit dune combinaison des deux produits : agar et gel synthtique. 4.6 Charbon activ Le charbon activ est frquemment utilis au stade de lenracinement (stade III). Plusieurs praticiens utilisent ce produit tout au cours des stades I, II et III. Le charbon activ est une substance adsorbante qui permet la neutralisation de produits toxiques exsuds dans le milieu par la plante. Il peut sagir plus couramment de substances phnoliques naturellement produites lors de la taille ou la dcoupe de certaines plantes, comme les ligneuses par exemple. En contexte normal, ces substances sont lentement lessives des plaies par les pluies ou autrement. Ces substances phnoliques apparaissent aprs oxydation de prcurseurs prsents au site de la plaie et joue le rle dantiseptique (toxique pour les micro-organismes). Il sagit en quelque sorte dune dfense naturelle des plantes. Cependant, en culture in vitro ces plantes mettent ces substances toxiques dans un milieu ferm. On remarque la prsence de ces phnols la base des plantules o elles saccumulent dans la glose formant une zone nbuleuse noirtre. Selon certaines expriences, le charbon activ a t tout dsign pour neutraliser leffet inhibiteur et toxique de ces substances phnoliques dans le milieu en cours de culture. Entre autre application, le charbon activ serait bnfique lors de lenracinement. cette tape, la ralisation dun milieu opaque et sombre grce lajout du charbon activ aurait pour effet dimiter ces conditions prsentes dans le sol o voluent normalement les racines.
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Lessai conduit dans le cadre de ce projet concerne le stade dinitiation (stade I) de la culture du Bgonia. Le Bgonia tant frquemment cultiv sur milieu additionn de charbon activ, nous avons voulu savoir sil tait avantageux den incorporer de manire routinire. Les essais ont dmontr que le plus grand nombre de bourgeons adventifs a t produit sur les milieux tmoins dpourvus de charbon activ. Les concentrations de charbon activ utilises pour ces essais taient de 0.1, 0.2, 0.4 0.6 et 0.8 g par litre de milieu. Cette rponse des explants de Bgonia sexplique peut tre par le fait que dans son pouvoir dadsorption, le charbon activ adsorbe aussi dautres substances telles que les auxines, certaines vitamines et des cytokinines. Si toutefois les missions de substances phnoliques compromettent toute croissance de votre culture ou mme la mort des explants, il serait intressant de faire lessai du charbon activ ou de pr-tremper les explants dans des solutions anti-oxydantes comme une solution de vitamine C (acide ascorbique) pralablement strilises lautoclave ou ultrafiltre (voir la procdure plus loin dans le texte).
4.7 Les composs organiques divers Nous prsentons ici des additifs de diffrentes sources comme les acides amins, les extraits de protines, les acides organiques, les produits stimulants de composition mal dfinie ainsi que les produits antiseptiques ou antibiotiques. Les acides amins (constituants des protines) et les extraits de protines (exemple lhydrolysat de casine) sont occasionnellement ajouts au milieu de culture dans le but de favoriser lorganognse, cest- -dire la formation de nouveaux organes (bourgeons, racines). Lacide amin le plus couramment utilis est la Glycine (C2H5O2) notamment retrouve dans les composants organiques du milieu MS. Les acides organiques comme le citrate et le malate sont parfois ajouts au milieu de culture. Dautres produits ( composition mal dfinie) reconnus pour stimuler la croissance sont parfois utiliss c omme par exemple, des extraits de levure (0,5 1g/litre) qui sont une riche source de vitamines du complexe B; le lait de coco ( 5 15 % ) retenue pour sa teneur en hormones naturelles (auxines, cytokinines) et en vitamines; la peptone une riche source de protines. On peut se procurer de leau de coco chez les fournisseurs de produits de laboratoires comme Sigma. Selon les auteurs du livre La culture in vitro et ses applications horticoles , on peut prparer du lait de coco en lextrayant directement de la noix que lon achte lpicerie. On extrait lalbumen, liquide de la noix, que lon autoclave immdiatement et que lon conserve au conglateur. 4.8 Les produits antibiotiques ou antiseptiques Les produits antibiotiques ajouts au milieu comme la ttracycline, streptomycine, polymyxine-B, etc. sont souvent utiliss en combinaison afin de lutter contre des bactries endognes des plantes. Il arrive occasionnellement que certaines plantes (les plantes ligneuses plus spcialement) contiennent des bactries qui schappent dans le milieu nutritif, et se dveloppent en colonies suffisamment importantes pour compromettre la
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culture. Les produits antibiotiques ajouts au milieu comme la ttracycline, streptomycine, polymyxine-B, etc. sont souvent utiliss en combinaison afin de lutter contre ces bactries endognes des plantes ( lintrieur de la plante). Mais ces produits antibiotiques sont coteux et sont souvent contourns par les bactries qui leur deviennent rsistantes. Des recherches sur Internet ont permis trouver dautres moyens de lutte contre ces bactries endognes. Nous avons fait lessai dhypochlorite de sodium (5.25%) directement ajout au milieu de culture avant lautoclavage raison de 2 ml/ litre de milieu. Il sagissait de la culture du lilas. Les 40 tubes culture contenant du Javel sont demeurs sans contamination tandis que des 40 tubes sans Javel, 5 ont t contamins par des bactries ou des moisissures. Bien quil ne sagisse que dun seul essai, le Javel semble dmontrer une certaine capacit contrler le dveloppement des micro-organismes. Pourrait-il tre efficace contre les bactries endognes proprement dites ? Dautres essais devront en faire la dmonstration. Un autre produit, le PPM (Preservative Plant Mixture ) vient de faire son apparition aux tats-Unis. Il est vendu par la compagnie Plant Cell Technology, Inc. de Washington D.C.. Ce produit est vendu comme un prservatif/biocide stable la chaleur (pouvant donc tre autoclav). Les fabricants prcisent quil ne sagit pas dun antibiotique mais quil prvient la germination des spores de bactries et de champignons et quil tue les cellules bactriennes et mycliennes. Il est spcialement conu pour enrayer les contaminations provenant de lair ambiant, de leau, des contacts humains et mme, forte concentration il peut enrayer les contaminations endognes. Le produit est, dit-on, spcialement conu pour la culture in vitro de tissus vgtaux et nest pas phytotoxique. Les doses proposes sont de 1 2 ml par litre de milieu pour une utilisation routinire; et de 5 20 ml pour llimination des bactries endognes. Son prix est de $1.00 / ml. Nous avons fait lessai du produit raison de 12 ml / litre pour la culture du lilas qui prsentait une contamination endogne. Tous les explants ayant t cultivs dans le milieu de culture contenant du PPM ont en effet t exempts de contamination bactrienne ou fongique, tandis que tous les autres explants ont t contamins. Les explants traits nont pas montr de signe de toxicit. Nous avons donc tent un autre essai cette fois avec une culture de Saintpaulia en stade de multiplication. Le milieu a t additionn de 10 et 16 ml / litre de PPM et un lot tmoin sans PPM. Le transfert des plants a t ralis par des gens non initis la technique et dans un laboratoire de classe sans utilisation de la hotte flux laminaire. Voil pourquoi nous avions augment les doses de PPM. Les milieux enrichis de 10 et de 16 ml de PPM ont t exempts de toute contamination lexception des spores de champignon qui ont germ la surface des explants. Mais la surface de la glose na permis aucun dveloppement. Cependant tous les explants sans exception ont montr une forte toxicit de telles doses. Les tissus ont ncros (du moins la partie au contact de lagar) en 24 48 heures. Les milieux sans PPM ont t contamins dans une proportion de 70 % mais leurs explants se sont dvelopps normalement. Des doses aussi fortes pour les espces herbaces comme le Saintpaulia seraient peut-tre proscrire. Mais la lumire de ces rsultats, ce nouveau produit se montre trs efficace pour lutter contre les contaminations mais quelle dose, avec quelle culture, de manire routinire, au stade de ltablissement de la culture seulement?
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5. Les contenants
Une varit de contenants peuvent tre utiliss pour raliser la culture in vitro. Le choix du type de contenant dpend de plusieurs facteurs : Il doit tre autoclavable; Il doit laisser passer la lumire; Il doit sajuster la taille et au nombre dexplants; Son obturation doit assurer lasepsie; Il doit se nettoyer et se manipuler facilement; Si possible, il doit tre rutilisable; Il doit tre peu coteux. De manire gnrale les tubes culture (25mm x 150mm) sont largement utiliss au stade de linitiation dune culture aseptique (stade I). Les dsinfection de surface des vgtaux avant leur premire introduction in vitro est souvent difficile russir. Aussi, ont-ils avantage tre mis en culture individuellement pour ne pas faire chuter le taux de russite par une contamination secondaire, car un explant contamin nous forcerait jeter tous les autres du mme rcipient. Une fois lasepsie russie, les explants peuvent tre transfrer dans des rcipients plus grands. 5.1 Pots de bb Lors de nos essais nous avons expriment lutilisation de pots de verre (nourriture pour bb) avec couvercles Nalgne rsistants lautoclave spcialement conus pour ce type de pots. Nos rsultats sont mitigs. Louverture des pots napparat pas toujours uniforme, il faut donc trier les couvercles afin de trouver un ajustement convenable. On note de 10 20 % plus de contaminations si lon compare lusage de tubes ou de contenants GA7 et la manipulation est plus laborieuse pour la strilisation (les pots sont manipuls individuellement). Chaque pot peut abriter de 3 4 plantes selon lespce. Ce choix savre cependant intressant pour le travail petite chelle puisquils sont peu coteux et assez faciles trouver. 5.2 Pots conserve (Mason) Dans la catgorie pot de verre, notons aussi lusage frquent de pots conserve (Mason). On trouve chez Sigma des couvercles rsistants lautoclave qui se visse sur lembouchure. Ils rpondent bien lensemble des critres de slection mais sont cependant volumineux manipuler sous la hotte compte tenu quil est prilleux de les empiler. Ils peuvent accueillir jusqu 12 ou 15 explants. La glose est gnralement solidifie dans le pot lorsquil repose sur le ct en ayant soin que celle-ci natteigne pas le goulot. Danc ce cas, les risques de contamination sont levs lors du repiquage. Lavantage de ces pots est sans doute leur faible cot.
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5.3 Pots de boucher Une autre alternative intressante serait lachat de pots de plastique translucides autoclavables (pots de boucher dans lesquels on retrouve les cretons, le vrac ..). Selon Bhojwani et Razdan2, certains contenants en plastique peuvent en effet tre striliss par la chaleur. Ils font mention des matires suivantes : Polypropylne; Polymthylpentne; Polyallomre; Tfzel ETFE; Teflon FEP; Produits de marque Nalgene et Thermolyne apparatus . Tous ces produits plastiques rsistent des autoclavages rpts mais seuls les produits faits de Teflon FEP rsistent la chaleur sche. Les auteurs prcisent en outre que les contenants faits de polycarbone perdent peu peu leurs proprits lastiques et que par consquent, les cycles dautoclavage doivent tre limits une dure de 20 minutes. On retrouve sous les pots et les couvercles un code de 2 4 lettres moules. Elles correspondent au type de plastique composant le contenant. Le tableau suivant liste les caractristiques propres quelques-uns de ces plastiques. Rappelons ici que la temprature de lautoclave doit atteindre 121oC afin dassurer lasepsie. Table 3 : Caractristiques des plastiques
Code Nom des rsines Plastique Plastique LDPE Low density Polyethylene HDPE PP PMP FEP Hight density Polyethylene Polypropylene Polymethylpentene ( TPX ) Teflon FEP Fluorinated ethylene propylene Tefzel ETFE Ethylenetetrafluoroethylene Polysulfone Polyallomer Polyvinyl chloride Temprature max. Transparence dutilisation (oC) 80 Translucide 120 135 175 205 Translucide Translucide Clair Translucide Autoclave Non Non Oui Oui Oui Strilisation Chaleur sche Non Non Non Non Oui
ETFE
150
Translucide
Oui
Oui
PSF PA PVC
165 130
Clair Translucide Clair
Oui Oui Non
Non Non Non
Bhojwani S .S., et Razdan M.K., Plant tissue culture :theory and practice , Elsevier, New-York, 1983, 502 pp.
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Nos essais de pots de plastique ont t effectus avec des contenants cods PP . Nous les avons utiliss pour la strilisation deau de rinage pour des volumes de 250 ml. De tels volumes ncessites une dure de strilisation plus longue, soit 30 minutes. Tel que dcrit par Bhojwani et Razdan pour les contenants de polycarbone, une telle dure de strilisation a entran la dformation des pots. Nous suggrons donc, pour de meilleurs rsultats dutiliser des pots de verre (de type Mason) pour striliser des volumes de 150 ml et plus par contenant. Toutefois, ce type de contenant (pot de boucher) tant facilement accessible et trs peu coteux, il demeure trs avantageux pour la culture in vitro lchelle commerciale. Dautant plus que les volumes de milieux nutritifs par contenant ne dpasse guerre 100 ml, et peuvent donc tre adquatement striliss 121oC pour une dure de 20 minutes. Rgle gnrale, les dimensions des rcipients seront choisies en fonction du nombre et de la taille des explants. Un mristme dun millimtre de diamtre pourrait rapidement de se desscher dans un contenant trop grand. Idalement les mristmes sont disposs dans de petits tubes ( 4 ml de milieu) dits hmolyse. Suite leur croissance, on pourra transfrer les nouvelles plantules dans des tubes plus grands (25 X 150 mm) ou dans des contenants de plus grande capacit (jusqu82 20 plantules par pot). Le plus souvent les tubes culture sont ferms au moyen de bouchons en matire plastique rsistant lautoclave qui permettent cependant un minimum dchanges gazeux avec lair ambiant. Des fermetures trop tanches sont parfois lorigine de troubles de culture, par exemple si lespce en croissance est rpute dgager naturellement un fort taux dthylne. En effet, lthylne est une substance naturelle caractre hormonal, inhibiteur de la croissance.
6. Prparation des solutions strilisantes

Afin dobtenir une culture aseptique, les tissus vgtaux mettre en culture doivent tre striliss en surface, cest- -dire dbarrasss des bactries ou spores de champignon (moisissures) qui adhrent leur surface. Il sagit de la partie la plus difficile de ltablissement dune culture in vitro. Le dfit est de dsinfecter le vgtal sans compromettre sa survie. Il faut dabord savoir que : Le degr dinfection des tissus en surface est trs variable; Les parties ariennes sont gnralement les moins infectes; Il est prfrable dutiliser les nouvelles pousses car elles sont relativement plus propres que les plus ges; Les plantes provenant de la serre sont souvent plus propres que celles qui viennent du champ; Plus lexplant est petit, plus les chances de contamination sont faibles; mais plus lexplant est gros, plus les chances de reprise sont grandes;
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La concentration la plus faible de solution de javel qui assure lasepsie, devrait tre celle quon utilise, puisque le matriel vgtal peut tre brl si la concentration es trop forte. La littrature fournie souvent les concentrations adquates utiliser mais ce nest pas le cas, seule lexprimentation diffrentes concentrations vous procurera linformation. Les explants sont le plus souvent dsinfects par immersion dans une solution de javel commercial (hypochlorite de sodium Na OCl) dont la teneur varie selon la marque de commerce entre 4 et 6 %. La concentration finale de la solution de javel se situe gnralement 0.5%. Dautres produits peuvent tre utiliss : Alcool thylique ou isopropylique 70 % ( trempage 20 secondes, utilis comme agent mouillant) Hypochlorite de calcium 0.8 % ( produit trs intressant car il pntre trs peu les tissus mais difficile trouve r et long prparer) Chlorure mercurique HgCl2 0.01 % ( poison violent ! ) (doit tre utilis sous une hotte chimique, trs difficile liminer de la surface des vgtaux) dconseiller, 6.1 Prparation dune solution de javel Le javel se trouve facilement en contenant de plastique dans les picerie. On trouve sur ltiquette la concentration dhypochlorite de sodium, laquelle peut varier dune marque de commerce lautre. Plus couramment il sagit de 5.25 % dhypochlorite de sodium. Pour prparer la solution dsinfectante environ 0.5 % , cest- -dire une partie de javel pour 9 parties deau prpare comme suit : Pour fabriquer 1 litre de solution : Mesurer 100 ml de javel laide dun cylindre gradu (ou dune tasse mesurer) Ajouter 900 ml deau afin de complter le volume 1 000 ml.(leau du robinet peut faire laffaire) Bien mlanger (les deux liquides nont pas la mme densit) Prparer cette solution juste au moment de lutiliser puisquelle perd rapidement de lefficacit. 6.2 Prparation de lalcool 70 % Lalcool recommand est lalcool thylique (thanol) ou lisopropanol. On ne doit jamais utiliser lalcool mthylique (mthanol) pour striliser ou flamber. Le mthanol peut tre utilis dans les dissolution de rgulateur de croissance seulement. Lalcool thylique est gnralement vendu une concentration de 96%. Ses proprits antiseptiques sont optimales une concentration de 65 70% soit une dilution de 7 parties
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dalcool dans trois parties deau. Donc pour fabriquer 1 litre dune solution dalcool 70 % , on mlange 700 ml dalcool 96% 300 ml deau (distille ou non). En pharmacie, on peut aussi trouver de lalcool friction qui est lisopropanol 70% mais qui est moins recommandable que lalcool thylique. 6.3 Prparation dune solution anti-oxydante Dissoudre 100 mg d acide ascorbique et 150 mg dacide citrique dans 1 litre deau. Striliser la solution avant son utilisation sous la hotte. La strilisation se fait par ultrafiltration dans la plupart des cas. Sous la hotte, avant de dcouper les explants, tremper les vgtaux dans la solution antioxydante afin dviter le noircissement des tissus.
7. Strilisation de la hotte
La hotte flux laminaire doit tre prpare de prfrence 30 minutes avant son utilisation. Vaporisation lalcool 70% de lintrieur des parois verticales ( lexclusion du filtre) et la surface de travail; Mettre le moteur en marche; Vaporiser lalcool 70o tous le matriel et les instruments ncessaires tels que : Scopule mtallique (servira de support); 2 scalpels; 2 pinces long manche ( 12 pouces ); brleur alcool; alcool flamber (environ 125 ml dans un contenant de verre base stable); pice de tissu coton fromage (imbibe dalcool servira au nettoyage de la surface de travail); ptris ou surface de travail strile; binoculaire (25X) et instruments de dissection si ncessaire; eaux striles (3) sil y a lieu.
8. Manipulations des vgtaux sous la hotte

8.1 Matriel requis Matriel vgtal; Rcipient contenant 100 ml dalcool thylique 70o; Pince longue; Chronomtre;
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Rcipient contenant environ 200 ml dune solution dhypochlorite de sodium (Javel) 0.5%; Plaque avec agitation (ou agitation manuelle); Tween-20 ou savon liquide (quelques gouttes); 3 rcipients deau strile (contenant environ 300 ml chacun); Ptris striles ( ou papier cir brun dcoup en carr de 20 cm de ct envelopps dans du papier daluminium et striliss par paquet de 3 5 units); Vaporisateur contenant alcool 70 %; Ouate hydrophile ou coton fromage; Rcipient de verre contenant environ 125 ml dalcool 96o (pour flamber les instruments); Lampe alcool; Instruments : 2 pinces longues; 2 scalpels; 1 scopule. 8.2 Strilisation des vgtaux Avant de commencer travailler Se laver les mains au savon antiseptique puis remonter les manches de la blouse jusquau dessus des coudes; on porte un sarrau. Prparer les explants tel que dcrit dans la littrature; Sil sagit dune espce pubescente : tremper les explants dans lthanol 70 % pendant 20 secondes (lalcool agira ici comme agent mouillant); De lalcool, transfrer directement les explants dans une solution dhypochlorite de sodium 0.5% laquelle on a ajout quelques gouttes de Tween-20 ou de savon. Les explants devront rester dans cette solution (en agitation ou en rotation) pendant 5, 10 , 12 ou 15 minutes selon les recommandations. Pendant lattente . On maintient les cheveux longs attachs et on enlve montre et bracelet. Au moment de travailler sous la hotte, on porte des gants de plastique que lon vaporisera frquemment lalcool 70% et systmatiquement aprs avoir t en contact avec du matriel non strile (cheveux, vtements, verrerie). On strilise tous les instruments par trempage dans lalcool 96% puis passage la flamme. Les instruments ainsi striliss repose sur une scopule (support mtallique) qui a pralablement t flambe ses deux extrmits. Les instruments sont toujours doubls pour permettre le refroidissement de lun tandis que lautre est en usage. Un instrument chaud peut endommager les tssus vivants. On ne i trempe jamais un instrument chaud dans lalcool, celui-ci pourrait prendre en feu. Manipulations de lexplant Le rcipient contenant les explants est ensuite amen sous la hotte aprs avoir t vaporis lalcool 70%.
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En vitant toute contamination, les explants sont transfrs dans un premier pot deau strile pour une dure de 5 minutes; puis dans un deuxime et un troisime pot deau strile pour une dure de 5 minutes chacun. Les transferts seffectuent laide dune pince longue tenue entre le pouce, lindex et le majeur. Les pots sont placs en diagonale lun par rapport lautre, et le transfert seffectue du premier (que lon maintient angle) au deuxime pot, sans que la main ne passe au-dessus de louverture des pots. Aprs le troisime et dernier rinage en eau strile, les explants sont transfrs un la fois sur une surface de travail strile (ptri ou autre), dcoup de la faon dcrite (apex de tige, n ud,) Transfert de lexplant sur la glose : La pince longue tenue entre le pouce, lindex et le majeur, permet au petit doigt de cette mme main de prendre le bouchon du tube de faon ne pas le dposer sur la table, ce qui risque de linfecter. De lautre main, on chauffe le col du tube inoculer laide de la pince, on dpose lexplant sur le milieu en prenant le minimum de temps; la rapidit est une des conditions de la russite des cultures Tout explant qui sera tomb sur la table, ou qui aura touch autre chose que le papier ou le ptri strile, sera limin Si lon devait poser un bouchon sur la table, il devrait tre dpos lenvers Avant de remettre le bouchon, on flambe nouveau louverture du tube (on ne flambe pas lembouchure des pots seulement des tubes) On veillera changer la surface de travail strile (ptri ou autre) tous les 3 ou 4 explants environ et striliser les instruments encore plus frquemment. Une fois le travail termin, on identifie la culture, on inscrit la date de linoculation et on place les explants en chambre de culture. 8.3 Conditions et difficults de lasepsie La technique de culture in vitro exige beaucoup de soin pour le maintien des culture en condition dasepsie. Pour quiconque entreprend ses premires exprimentations, plusieurs gestes et prcautions semblent superflus. Mais il faut toujours se rappeler que les microorganismes sont partout (spores de champignon, bactries). Il ne suffit pas dinstruments ou dune surface de travail propres, mais bien striles sans quoi un seul micro-organisme en contact avec la glose finira par envahir le milieu entranant la mort du plant. Ainsi, il vaut mieux au dbut respecter le maximum de rgles, quitte les simplifier par la suite selon son exprience personnelle. Quelques rgles utiles : Les pots Mason contenants de leau strile peuvent tre conservs plusieurs mois sils sont ferms par des couvercles filet (vissant) Si leau strilise dans des pots de plastique rsistants lautoclave ne devrait pas tre conserve plus de quelques jours
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Les papiers de boucher (cirs dun seul ct) et dcoups en carr en guise de surface de travail seront striliss lavance la condition dtre gnreusement emballs dans le papier daluminium Tout matriel introduit sous la hotte devrait tre vaporis lalcool 70% (si possible plus de 15 minutes avant le dbut du travail) Les vtements ne devrait pas pendre au-dessus de la surface de travail dans la hotte : les fibres textiles transportent de nombreux germes On vite les grands gestes et lentre du corps dans lenceinte de la hotte : risques levs de transporter des germes On vaporise nos gants chaque fois que lon dsire rintgrer notre place sous la hotte On nettoie rgulirement la table de travail lalcool 70% laide du chiffon coton fromage en commenant par le fond de la hotte et en finissant vers soi. On ne vaporise pas dans la hotte si le brleur est allum. DANGER On prend lhabitude ds le dbut de dplacer les mains paralllement lune par rapport lautre afin dviter le passage au-dessus des instruments striles, de la surface de travail dans laquelle on dcoupe les vgtaux, ou les embouchures des pots deau strile : bien que les gants soient vaporiss lalcool ceci ne garanti aucunement leur strilisation. La peau morte est aussi porteuse de germes ne loublions pas ! Changer frquemment la surface de travail (tous les 3 ou 4 explants) contribue aussi au succs de la technique, particulirement pour les dbutants. 8.4 Les infections et quelques unes de leurs causes3: Lorsque lon a des cultures infectes, cela peut provenir de diffrentes causes. Ds lapparition des symptmes, on regarde dabord sil sagit dun champignon (moisissure) ou dune bactrie. Sil sagit dun champignon, on voit un dveloppement myclien qui a une texture feutre, souvent blanche ou gristre. Si le feutrage est vert, il sagit sans doute du Penicillium. Si le feutrage prsente des petits grains noirs (fructifications), il peut sagir du Rhizopus nigricans qui se multiplie trs vite et quil faut dtruire lautoclave sans tarder. Sil sagit dune bactrie, on voit alors un voile daspect laiteux, dvelopp lintrieur du milieu et la surface. Ce voile est quelquefois color (rose, jaune, orang ). On regardera ensuite si linfection part de la zone de contact entre les tissus et le milieu, et si oui, ce sont les tissus eux-mmes qui sont la source de linfection. Si linfection part dun point quelconque du milieu, la source de linfection peut tre soit lair, soit une mauvaise strilisation du milieu, soit une infection de lair ambiant par lintermdiaire de leau de condensation au niveau du couvercle. Dans certains cas, rares heureusement, des spores de certaines bactries peuvent rsister lautoclave; il faudra alors striliser la verrerie leau de Javel. Lorsque lon voit un dveloppement de myclium de Penicillium, cela provient de lair et indique une mauvaise manipulation. Les exemples de mauvaises
3
Auger et al. La culture in vitro et ses applications horticoles , technique et documentation-Lavoisier, 1989, Paris p.61.
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manipulations sont nombreux : bavardage pendant le travail sous la hotte flux laminaire, contact des tissus vgtaux avec des doigts, mauvaise strilisation des instruments qui portent alors les micro-organismes de lexplant infect sur les autres. En cours de culture, on peut ne voir apparatre aucune trace de voile bactrien, alors que les bactries sont prsentes dans les tissus. Dans ce cas, le milieu de culture utilis ne permet pas le dveloppement de la bactrie; toutefois, on peut permettre son expression en ajoutant de la peptone 2 g/L dans le milieu (la peptone est un constituant classique des milieux de culture des bactries). On fera ensuite le tri en liminant les tubes infects, et on obtiendra ainsi une collection de tissus indemnes de bactries.
p.39
9. Inventaire global du matriel et des quipements

Linventaire de la verrerie, du petit matriel et des plus gros quipements peut varier dun laboratoire lautre suivant sa capacit dachat, le nombre dutilisateurs ainsi que limportance que prend la micropropagation dans lentreprise. Le dveloppement du laboratoire peut seffectuer par tapes. Des acha ts minimum sont prvus au dbut, les premires exprimentations sont faites avec une ou deux espces vgtales tout au plus. Bien que la culture des espces choisies dj exprimentes ailleurs, comme toute technique, elle devra tre prouve sur place, dans lentreprise, avec les quipements choisis dans lenvironnement (chambre culture) prvu. La mise au point du nouveau laboratoire demande quelques mois dutilisation. Le tableau qui suit prsente une gamme de matriel, produits et quipements parmi lesquels on choisi ce qui se prte le mieux notre entreprise.
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Table 4 : Liste de matriel et dquipements

Matriel divers Tubes culture Bouchons pour tubes 25X150mm Pipette Pipette Ballon volumtrique Ballon volumtrique Ballon volumtrique Ballon volumtrique Distributeur pour pipette Bcher Bcher 2 litres Pots Mason Couvercles NALGENE Pour pots Mason Flacon laveur Ruban strilisation Lampe alcool Gants jetables latex Masque Pinces longues 12 po. Manche scalpel Lames pour scalpel Pinces courtes Baby jars BBjars couvercles MAGENTA Ratelier mtal (48 tubes) Tige dagitation aimante Barre aimante Nacelles Format 25X150mm Quantit 500 500 1 1 1 1 1 1 1 1 1 12 250 ml Rouleau 1 1 1 100/bte 2 Fournisseur Sigma Sigma No.Catalogue C 5916 C 1934 Prix 1999 80/caisse $ 77.20 500/caisse Culture stade I Obturation des tubes Utilisation
5 ml 10 ml 50 ml 100 ml 500 ml 1 000 ml Jusqu 10ml 1 litre 2 litres
Fisher Fisher Fisher Fisher Sigma Fisher Fisher Quincaillerie Fisher Fisher Labcor Fisher V.W.R.Canlab quicaillerie Sigma
10-198-52A Plastic/autoclave 10-198-52C Plastic/autoclave 10-198-52F 10-198-52G P 7924 02-540-P 02-540-R 02-923-14H 03-409-10D P 08277-62 04-245-AA 32900-000 50/bte F-4642
$17.97 $19.33 $28.84 $37.00 $22.00 $6.88 $13.61 $18.72 $3.15 $4.40 $7.95 $8.50 $30.00 $62.40
Jauger les liquides (sol-mres; milieux) Jauger les liquides Jauger les liquides Jauger les liquides Pipetter les liquides Cuisson des milieux sur plaque Cuisson des milieux sur plaque Contenants culture ou eau strile Obturer les pots Mason pour culture ou eau strile Rincer les nacelles leau distille Rvlateur de strilisation Strilisation des instruments sous la hotte Travail sous la hotte Travail sous la hotte Manipulation des explants Manipulation des explants Manipulation des explants Dissection des explants Pots culture Obturation pour pots bb Support tubes Rapporteur barre aimante Agitation sur plaque Contenants pour peses
S-M-G 12 po.
48 tubes 12 po. petites
2 100 100 1 1 6 (set) 500
Sigma Sigma Sigma Carolina Sigma Sigma Sigma
F-3767 V-8630 V-8648 D8-19-9337 Z10-569-4 Z11-534-7 W2751
$89.40 $46.20 $49.30 $23.17 US $11.10 $30.20 $34.90
40
p.41
Nacelles Cylindre gradu Gants isolants GA7 GA4 Couvercles GA7 ouGA4 Ratelier MAGENTA Pulvrisateur plastique PH mtre (style crayon) PH mtre Autocuiseur Dispensette Brinkman Bacti-cinerator Plaque chauffante & agitation Hotte flux laminaire commerciale Hotte flux laminaire conomi que du CIDES Autoclave conventionnel Produits chimiques Ac. Indole actique (A.I.A.) Ac. Indole butyrique (A.I.B.) Ac Naphtalene actique (A.N.A.) Ac. Nicotinique Adnine sulfate Biotine Benzylaminopurine (BAP) Chlorure de calcium (CaCl 2-2H2O) Chlorure de cobalt (CoCl 2-6H2O) 2iP Na2EDTA-2H2O Glycine Inositol Iodure de potassium (KI) Kintine (Kin)
grandes 1000 ml
500 1 25 25 25 1 1
Sigma Carolina Sigma Sigma Sigma Sigma quincaillerie Carolina Hanna Canadian Tire Fisher Sigma Cole-Parmer
W2876 D8-72-1606 V-8505 V-8380 C-0542 T-8654 D8-19-9410 8417 MIRRO 13-688-83 S-3398 P-84303
$58.90 $8.50 $81.60 $77.00 $32.50 $6.50 $2.50 $68.23 US $130.00 $309.00 $355.00 $410.00
1/36 tubes 1 litre
2 10 ml 10 X 10 Individuelle
Contenants pour peses Mesurer les liquides (Javel, alcool) Manipulation des liquides chauds Contenants culture Contenant culture Obturation des GA7 ou GA4 Support tubes Vaporisation lalcool Ajustement du pH du milieu Ajustement du pH du milieu Strilisation Distribution des milieux Strilisation des instruments Cuisson des milieux Travail en asepsie Travail en asepsie Strilisation
CIDES Cole-Parmer Format Quantit 5g 1g 25 g 25 g 5g 100 mg 1g 500 g 25 g 100 mg 100 g 100 g 100 g 100 g 100 mg Fournisseur Sigma Sigma Sigma Sigma Aldrich Sigma Sigma Sigma Sigma Sigma Sigma Sigma Sigma Sigma Sigma No. Catalogue I-2886 I-5386 N-0640 N-0765 14,581-5 B-3399 B-9395 C-2536 C-2911 D-7674 E-6635 G-6143 I-3011 P-8166 K-0753
$1 700.00
Prix 1999 $15.80 $10.00 $14.70 $7.70 $24.80 $17.50 $16.00 $34.30 $20.40 $15.10 $24.60 $18.80 $40.40 $34.10 $1121.00
Utilisation Rgulateur Rgulateur Rgulateur Vitamine Facteur de croissance Vitamine Rgulateur Sel Sel Rgulateur Chlatl Acide amin Vitamine / sucre Sel Rgulateur
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p.42
Molybdate de sodium Na2MoO42H2O Nitrate damonium NH4NO3 Nitrate de potassium KNO 3 Panthotnate de calcium Phosphate de potassium KH2PO4 Phosphate de sodium NaH2PO4 Pyridoxine HCl Sulfate de cuivre CuSO4-5H2O Sulfate de fer FeSO 4-7H2O Sulfate de magnsium MgSO47H2O Sulfate de zinc ZnSO4-7H2O Acide borique H3BO3 Acide folique Ac. Gibberellique Sucrose Agar Gelrite Phytagel MS salts MS medium Anderson PH mtre (style crayon) PH mtre Autocuiseur Dispensette Brinkman Bacti-cinerator Plaque chauffante & agitation Hotte flux laminaire commerciale Hotte flux laminaire conomique du CIDES Autoclave conventionnel
100 g 500 g 500 g 5g 100 g 100 g 25 g 250 g 50 g 500 g 100 g 100 g 1g 500 mg 1 kg 500 g 250 g 250 g 1L 1L 1L
Sigma Sigma Sigma Sigma Sigma Sigma Sigma Sigma Sigma Sigma Sigma Sigma Sigma Sigma Sigma Sigma Sigma Sigma Sigma Sigma Sigma Carolina Hanna Canadian Tire Fisher Sigma Cole-Parmer
M-1651 A-3795 P-8291 P-6045 P-8416 S-5515 P-8666 C-3036 F-8263 M-7774 Z-1001 B-9645 F-8890 G-7645 S-5391 A-1296 G-1910 P-8169 M-5524 M-5519 A-2670 D8-19-9410 8417 MIRRO 13-688-83 S-3398 P-84303
$33.80 $30.20 $38.00 $11.40 $17.70 $17.70 $27.00 $22.00 $7.20 $31.10 $21.00 $14.90 $11.60 $21.90 $17.80 $93.50 $52.80 $50.80 $2.00 $2.70 $2.70 $68.23 US $130.00 $309.00 $355.00 $410.00
Sel Sel Sel Vitamine Sel Sel Vitamine Sel Sel Sel Sel Sel Vitamine Rgulateur Sucre Glose Glose Glose Milieu de culture Milieu de culture Milieu de culture Ajustement du pH du milieu Ajustement du pH du milieu Strilisation Distribution des milieux Strilisation des instruments Cuisson des milieux Travail en asepsie Travail en asepsie Strilisation
sachet sachet sachet
2 10 ml 10 X 10 Individuelle
CIDES Cole-Parmer
$1 700.00
42
p.43
10. Glossaire des termes

Adnine : Compos azot constituant des acides nucliques et utilis sous forme de sulfate dans les milieux de culture. Adventif : Adjectif utilis pour dcrire les racines, tiges ou autres organes qui se dveloppent des endroits inusits sur la plante, par exemple, des tiges se dveloppant sur des racines, des feuilles ou des cals ou un embryon se dveloppant partir dune cellule autre quun zygote. Apex de tige : Mristme apical en plus des primordium foliaires sous-jacents. Apical, ale : Qui se porte au sommet, lapex, lextrmit. Aseptique : Adjectif signifiant exempt de microorganismes. Autoclave : Appareil permettant de faire la strilisation avec de la vapeur sous pression. Axillaire : Plac laisselle dune feuille, dun rameau, par exemple, dun bourgeon. Cal, callus : Tissu issu de la prolifration dsorganise de cellules in vivo ou in vitro. Chimres : Plantes dont les tissus nont pas tous la mme composition gntique. Clones : Plants produits de faon asexue partir dun seul plant. Dionise : Dpourvue dions. Dominance apicale : Phnomne par lequel la croissance des bourgeons axillaires est inhibe en prsence dun bourgeon apicale sur le rameau. EDTA : Agent chlateur, lacide thylenediamine ttraactique. Prvient la prcipitation. Exciser : Enlever en coupant. Explant ou Explantat : Partie de la plante-mre utilise pour initier une culture. Hormones : Compos organique (naturel) qui faible concentration commande une rponse physiologique chez la plante. Ex. Auxines, cytokinines, gibberellines. Hybride : Plante issue dun croisement entre deux cultivars diffrents habituellement par reproduction sexue. Indexage : Mthode par laquelle on peut tester des plantes en regard de pathognes ou de contaminants. Inositol : (C6H6 (OH)6) : Vitamine du complexe B. In vitro : Littralement en verre . Maintenant utilis pour culture de tissu ou micropropagation. In vivo : Littralement : en vie . Utilis dans le cas de processus qui se produisent dans un tre vivant, donc qui se produisent naturellement. Juvnilit : Phase de la croissance dune plante graines caractrise par limmaturit et linaptitude fleurir. Mristme : Groupe de cellules indiffrencies se divisant activement et donnant lieu aux diffrents systmes (tige, racine, feuille, fleur). Les principaux sont : mristmes apicaux (extrmit des tiges et des racines), Mristmes intercalaires (rgion des n uds, base des feuilles), Mristmes latraux (cambiums)
43
p.44
Mristme Apical : Rfre seulement au dme mristmatique situ au-del des primordium foliaires. Phnols : Composs organiques qui sont souvent des produits secondaires du mtabolisme et qui sont parfois toxiques (exsudats phnoliques) Polysaccharides Polyoside : Groupe dhydrates de carbone compos de plusieurs units de sucres diffrents. Primordium : Organe vgtal dans son tout premier stade de diffrenciation (singulier : primordia). Produits Secondaires : Produits du mtabolisme vgtal qui ne sont pas relis directement la croissance ou la reproduction, tels les saveurs, les colorations, les pesticides, etc. Prolifration : Multiplication rapide. Protoplaste : Une cellule dpourvue de sa paroi cellulaire mais entoure dune membrane. Rgulateur de Croissance : Compos organique qui influence la croissance et la multiplication, telles les cytokinines et les auxines. Il est dorigine naturelle ou synthtique. Totipotence : Cellule indiffrencie capable de se dvelopper en plante entire. Vgtatif : Somatique, non-sexuel. Vitrification : Phnomne indsirable qui apparat parfois en cours de culture donnant aux tissus une apparence succulente, cassante, gorge deau ou vitreuse.
44

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Micropropagation pour lentreprise serricole

Cah ier d e r fr ences techniques

Table des matires

La prparation dun milieu de culture ________________________________________ 9

3.8 Matriel et quipement requis ____________________________________________ 19

Les constituants des milieux nutritifs ________________________________________ 21

4.4 Les sucres ____________________________________________________________ 26 4.5 Les gloses ___________________________________________________________26

Les contenants __________________________________________________________30

Prparation des solutions strilisantes _______________________________________32

Strilisation de la hotte ___________________________________________________34 Manipulations des vgtaux sous la hotte_____________________________________ 34

Inventaire global du matriel et des quipements ______________________________39

10. Glossaire des termes ______________________________________________________43

Micropropagation en entreprise Cahier de rfrences techniques dition 1999

Micropropagation en entreprise Cahier de rfrences techniques dition 1999

2. Les phases de la micropropagation

Micropropagation en entreprise Cahier de rfrences techniques dition 1999

Micropropagation en entreprise Cahier de rfrences techniques dition 1999

Micropropagation en entreprise Cahier de rfrences techniques dition 1999

3. La prparation dun milieu de culture

Micropropagation en entreprise Cahier de rfrences techniques dition 1999 q

Vitamines (MS) (10 X, voir tableau 1 : Milieu MS)

Solution mre (mg par litre)

Micropropagation en entreprise Cahier de rfrences techniques dition 1999

22.3 8.6 6.2 0.83 0.25 0.025 0.025

2.0 0.5 0.5 0.1 100 30 000 10 000

Micropropagation en entreprise Cahier de rfrences techniques dition 1999 q

Micropropagation en entreprise Cahier de rfrences techniques dition 1999

1 000 ml X 32,7 mg 32 700 32 700 3 270 = ?

Micropropagation en entreprise Cahier de rfrences techniques dition 1999

1 000 ml 1 000 ml X 0.01 % 0,01 % = =

Rponse :10ml 3.4 Prparation du milieu MS pour un volume de 1 000 ml

3.5 Prparation du milieu MS pour un volume de 500 ml

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4. Les constituants des milieux nutritifs

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Balance hormonale vs rponse physiologique

Formation de tiges auxiliaires

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KIN 2 iP Additifs CH CW EDTA ADE ou Ad Formulations MS B5 ER WH

Hydrolysat de casine Coconut water Acide thylnedinitrilo-ttraactique Adnine

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Gels synthtiques (Substituts dagar)

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Clair Translucide Clair

Oui Oui Non

Non Non Non

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6. Prparation des solutions strilisantes

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8. Manipulations des vgtaux sous la hotte

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4.4 Les sucres __ 26 4.5 Les gloses _26

Strilisation de la hotte _______________34 Manipulations des vgtaux sous la hotte_ 34