PRACTICA1.PREPARACINDEMATERIALDE LABORATORIOPARASUESTERILIZACIN PRACTICA1.

Materia:Laboratoriode TcnicasMicrobiolgicas

PREPARACINDEMATERIALDELABORATORIOPARASUESTERILIZACIN OBJETIVO El alumno aprender a esterilizar el material de vidrio, instrumental de laboratorio y mediosdecultivoparasuposteriorusoenellaboratorio INTRODUCCIN. El laboratorio de microbiologa, al igual que cualquier laboratorio requiere mantenerse constantemente limpio, sin embargo debido a que en este se manejan cultivos microbianos, requiereademsqueelmaterialeinstrumentalqueesteencontactoconlosmicroorganismosse encuentre estril o se mantenga as hasta su uso por lo que deben de estar protegidos adecuadamentedecualquierposiblecontaminacin. Para comprobar la esterilidad de los medios de cultivo se recomienda incubarlos 24 h a 28Cinmediatamentedespusdequepasaronporelprocesodeesterilizacin,despusdeesta incubacinslopodrnusarsesinoseobservancambiosenlaturbidezencasodemediosslidos osinoseobservancoloniasencasodemediosslidos. El trmino estril se aplica en microbiologa a cualquier ambiente, material o reactivo que se encuentralibredecualquierformadevida,losprocesosparapodergenerarunambienteestril conducen, entonces a la eliminacin de todo tipo de organismos, lo cual se consigue utilizando agentes qumicos en concentraciones adecuadas o aplicando mtodos fsicos (como el calor o radiaciones),estosltimossonlosmsutilizadosenmicrobiologadebidoaqueporlogeneralno dejanresiduosynorequierendeungastoenreactivos. Elmtodoesterilizartefsicomenoscomplicadoymsbaratoeselcalorhmedo,yaqueinhibe irreversiblemente la actividad enzimtica de la mayora de los microorganismos as como otros compuestosproteicos.Elequipomsutilizadoparalaaplicacindelcalorhmedoeslaautoclave y consiste en una cmara doble cerrada hermticamente dentro de la cual el vapor de agua saturado permite la transferencia rpida del calor, los parmetros de operacin tpicos son 15 libras/pulgada2 de presin a 121 C durante 15 minutos. Este mtodo se recomienda para esterilizarmaterialyreactivostermoestables.

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Cuando el material a esterilizar es termoestable pero no debe de humedecerse se recomienda utilizarcalorseco,creandounaatmosferadeairecaliente(160Ca180C)duranteunperiodode tiempomsprolongado(2horas)paraloqueseutilizanhornosoestufas.

Instruccionesgeneralesparaelmanejodelautoclavevertical.
1. Comprobarqueelniveldeaguaseaadecuado,deacuerdoalindicadordelequipo 2. Sacarlacanastillaycolocarensuinteriorelmaterialparaesterilizar 3. Colocarlacanastilladentrodelautoclave 4. Cerraryatornillarlatapa,apretandolastuercasporparejasdiametralmenteopuestasde formaquelatapaseacopleperfectamente 5. Abrirlavlvuladeescapedevaporyprenderelautoclaveenmximo. 6. Unavezquesalgaelvaporporlavlvuladeseguridad,esperaralmenos3minutospara permitirquetodoelairedelinteriorseaexpulsado,posteriormentecerrarlavlvula 7. Vigilarelmanmetroylavlvuladeseguridad,alalcanzarlapresindeseadadisminuirla intensidaddecalentamientoparamantenerconstantelascondicionesrequeridas 8. Alfinalizareltiempodeesterilizacinapagarelautoclaveyesperaraqueelmanmetro descienda a cero para abrir la vlvula de seguridad y permitir que el vapor remanente salgalibremente 9. Abrir la tapa liberando las tuercas por parejas diametralmente opuestas y sacar el material MATERIAL,EQUIPO,REACTIVOSYCEPASMICROBIANASPOREQUIPO a)EQUIPO Autoclavea121C Hornoa170C Incubadoraa37Coa55C c)Materialporequipo 1rollodecintatestigo(maskingtapeindicador) 1rollodepapelaluminio 1metrodepapelKraft Algodnsuficienteparataponesdematraces Gasaoteladepaalina(3metros) 2pipetasgraduadasde10ml 2matracesErlenmeyerde125mlode250ml

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2matracesErlenmeyerde250mlcon50mldeaguadestilada 2cajasdePetrilavadasysecas 4tubosdeensayede13X100mm 3tubosdeensayecon3mldecaldonutritivoestril 1mecherodebunsen 1asabacteriolgica. MEDIOSDECULTIVO Caldonutritivo CEPASMICROBIANAS Unmatrazcon50mldeunasuspensinmicrobianadeEscherichiacoli. DESARROLLOEXPERIMENTAL 1.PREPARACINDEMATERIALPARAESTERILIZACIN 1.1Lavadodematerialdevidrioeinstrumental a)Utilizandoescobillonesparapipetas,tubosymatracesyunafibrasuaveparalascajasdePetri, el material plano y el instrumental metlico lavar el material que se va a esterilizar, utilizando extrn. b)Enjuagarsuficientementeconaguadelallave. c) Enjuagar con agua destilada, escurrir y secar en el horno o dejarlos secar a temperatura ambiente. 2.PREPARACINDEMATERIALPARAESTERILIZACINPORCALORHMEDO 2.1TUBOSDEENSAYO a)Tapar4tubosdeensayede13X100mmcontaponesdealgodnenvueltosengasasiguiendo lasindicacionesdelprofesor. b) Colocar los tubos en un bote de lmina, taparlos con papel Kraft y asegurarlos con una liga, anotarfecha,equipo,grupo,medidadelostubos.Colocarunpedazodemaskingtapeindicador. 2.2CAJASDEPETRI a)EnvolverlascajasdePetriconpapelKraftsiguiendolasindicacionesdelprofesor.Anotarenel papel,lacantidaddecajasenvueltas,fecha,equipo,nmerodeequipodelaboratorioygrupo.

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2.3PIPETAS a)Colocarenlaboquilladecadaunadelaspipetasuntapndealgodncuidandoquenoquede muy compactado, utilizar para ello una aguja de diseccin o un clip y flamear con mechero las boquillasdelaspipetasafindeeliminarelexcesodealgodn. b) Envolver de manera individual cada una de las pipetas con una tira de papel Kraft, fijar el extremoconmaskingtapeyanotarsobreelpapellacapacidaddelapipeta,lafecha,elgrupoyel nmerodeequipodelaboratorio.Conunaflechaindicarelextremoendondeestlapuntadela pipeta.

2.4MATRACESERLENMEYER a)Colocarenlabocadecadamatrazuntapncompactodealgodn,envueltocongasa,siguiendo lasinstruccionesdelprofesor,conpapelKraft,elaborarungorroligeramentemsgrandequeel tapndealgodn. b)Enunatirademaskingtapeanotarlafecha,grupoyequipo,adherirelMaskingtapealmatraz. Noanotarlosdatossobreelgorrodepapel.

2.5PINZASYTIJERAS a)EnvolverconpapelKraftunapinzaotijerayconlpizsealarconunaflechalapunta. b)Anotarenelpapellapiezadequesetrate,lafecha,grupoyequipo. 3.PREPARACINDEMATERIALPARAESTERILIZACINPORCALORSECO 3.1TUBOSDEENSAYE a) Colocar en 2 tubos de ensaye, una cubierta de papel aluminio y colocarlos en una canastilla metlica. b)AnotarenunatiradepapelKraftlafecha,grupoyequipo,sujetarelpapelconmaskingtape.

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3.2CAJASDEPETRI a)ColocarenelinteriordeuncilindrodeaceroinoxidableparacajasdePetridoscajasenposicin invertida perfectamente secas. (NUNCA ESTERILIZAR POR ESTE MTODO MATERIAL CONTAMINADO). b)AnotarenunatiradepapelKraftlafecha,elnmerodecajasquecontieneelcilindro,elgrupo ylafecha. c) En caso de no contar con un contenedor para esterilizar de esta forma, utilizar el mtodo descritoqueparacalorhmedo:envolverlascajasdePetriconpapelKraft.Anotarenelpapel,la cantidaddecajasenvueltas,fecha,equipo,nmerodeequipodelaboratorioygrupo. 3.3PIPETAS a)Ponerenlaboquilladecadaunadelaspipetasuntapndealgodncuidandoquenoquede compactado. b) Flamear las boquillas en la flama del mechero a fin de eliminar el exceso de algodn, antes colocar en el interior un poco de papel aluminio para evitar que las pipetas se despunten en el momentodeintroducirlas. c)Colocarenelinteriordeuncilindropipetero,laspipetaspreparadas. d)AnotarenunatiradepapelKraftlacantidaddepipetas,sucapacidad,fecha,grupoyequipo. Fijarlatiraentrelatapadelcilindropipetero. e)Sinosecuentaconcilindropipetero,envolverlaspipetasdelamismaformaqueparaesterilizar por calor hmedo: envolver de manera individual cada una de las pipetas con una tira de papel Kraft,fijarelextremoconmaskingtapeyanotarsobreelpapellacapacidaddelapipeta,lafecha, elgrupoyelnmerodeequipodelaboratorio.Conunaflechaindicarelextremoendondeestla puntadelapipeta. 3.4MATRACES a)Colocarenlabocadeunmatrazde125mlunatapadepapelaluminio. b) En una tira de papel Kraft anotar fecha, grupo y equipo. Fijar la tira al cuello del matraz sujetndoloconmaskingtapeoetiquetarsobreelmaskingtapeconunmarcadorindeleble. 3.5PINZASYTIJERAS a)Envolverenpapelaluminiounapinzaounatijera. b)Enunatirademaskingtape,anotarfecha,grupoyequipo.Fijarelmaskingtapealaenvoltura. 4.ESTERILIZACINPORCALORHMEDO a)Colocarelmaterialpreparadoparaesterilizarporcalorhmedo. b)Preparar3tubosdeensayede13X100mmcon3mldecaldonutritivoestrilyetiquetarcada unodeelloscomotubo1,2y3.(Adicionaralaetiquetalasiguienteinformacin:grupo,equipo, mtododeesterilizacinyfecha). c) El tubo 1, utilizarlo como testigo positivo (inocular en forma estril las esporas con Bacillus stearothermophilus, mantenerlo sin esterilizar). El tubo 2 ser utilizado como bioindicador de esterilidad (inocular en forma estril las esporas de Bacillus stearothermophilus, someterlo a esterilizacin).Eltubo3seutilizarcomotestigonegativo(mediodecultivosininocularesporas, meterloaesterilizar). d)Incubarlostrestubosa55oC2Cyregistrardiariamentelaaparicinonodeturbidez.

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f) En caso de no contar con las esporas de B. stearothermophilus, trabajar con un inculo de Escherichiacolieincubara37C. 5.ESTERILIZACINPORCALORSECO a) Colocar el material preparado para esterilizar por calor seco y encender el horno. Cuando la temperaturaestea160oCtomareltiempode1h. b)Enuntubodeensayesinesterilizaryvaco,colocarunaasadadeBacillussubtiliso1mLdeE. coli.,cubrirlabocadeltuboconpapelaluminioycolocarlojuntoconelmaterialindicadoen(a). Esterilizara160oCdurante1h. c) Despus de transcurrido el tiempo de esterilizacin, apagar el horno y esperar a que el termmetroindiquelatemperaturaambiente.Abrir,retirarelmaterialyeltubodeensayeconla tiradeesporas. d)Conayudadeunapinzaestril(flamearconalcohol)ybajocondicionesdeesterilidad,colocar unaasadadeBacillussubtiliso1mLdeE.coli.auntubodeensayequecontenga3mldecaldo nutritivoestrilyetiquetado. e)Teneradisposicinotrosdostubosdeensayequefuncionencomotestigopositivo(conesporas sinesterilizar)ynegativo(mediodecultivosinesporas,esterilizado). f)Incubarlostrestubosa55oC2Cyregistrardiariamentelaaparicinonodeturbidez.

CUESTIONARIO
1. Defina los siguientes trminos: Desinfectante, bactericida, microbiosttico, antisptico, estril,gnotobiotico,agnotobiotico. 2. Qu otros mtodos fsicos se utilizan para esteriliza medios de cultivo o soluciones inestablesalcalor? 3. 4. Elcaldonutritivoesunmediodecultivosintticoonosinttico. Mencionealmenos10causasdecontaminacinenuncultivorecinsalidodelautoclave.

Referencias.
1. Breach,M.R.Esterilizacin,mtodosdecontrol.ElmanualModerno,S.A.Mxico 2. Brock, D.T. Madigan, T.M. and Martinko, M.J. Biology of microorganisms. 7th edition, PrenticeHall,NewJerses 3. Jhonson, T.R. and Case, C.L. Laboratory experiments in microbiology. 4th edition. The Benjamin/CummingsPublishingCompany,Inc.California.