PLANTAS TRANSGENICAS METODOS

1. El mtodo con Agrobacterium, que se describe a continuacin. La transformacin empleando Agrobacterium ha sido practicada con xito en dicotiledneas (plantas de hojas anchas como la soya y el tomate) durante muchos aos, pero slo recientemente ha sido efectuada en monocotiledneas (gramneas y sus parientes). En general, el mtodo con Agrobacterium es considerado preferible a la pistola de genes porque es mayor la frecuencia de inserciones en un solo sitio del ADN extrao, lo cual facilita la vigilancia. El mtodo de transformacin de plantas con Agrobacterium Agrobacterium tumefaciens es una notable especie de bacterias que viven en el suelo y tienen la capacidad de infectar las clulas de las plantas con un fragmento de su ADN. Cuando el ADN bacteriano se integra en un cromosoma de la planta, se apodera efectivamente de la maquinaria celular de sta y la usa para asegurar la proliferacin de la poblacin bacteriana. Muchos jardineros y propietarios de huertos estn por desgracia familiarizados con A. tumefaciens porque ste causa enfermedades caracterizadas por agallas de la corona en muchas plantas ornamentales y frutales.

Diagrama de la clula de Agrobacterium tumefaciens El ADN de una clula de A. tumefaciens est contenido en el cromosoma bacteriano y en otra estructura llamada plsmido Ti (inductor de tumores). El plsmido Ti contiene:

un segmento de ADN llamado ADN-T (~20 kb de largo) que es transferido a la clula de la planta en el proceso de la infeccin. una serie de genes vir (de la virulencia) que dirigen el proceso de la infeccin.

La bacteria A. tumefaciens slo puede infectar a una planta a travs de lesiones. Cuando la raz o el tallo de una planta sufre una lesin, emite ciertas seales qumicas. En respuesta a esas seales los genes vir de A. tumefaciens se activan y dirigen una serie de acontecimientos necesarios para la transferencia del ADN-T desde el plsmido Ti al cromosoma de la planta. Distintos genes vir:

Copian el ADN-T. Unen un producto a la hebra del ADN-T copiado para que acte como lder. Agregan protenas a lo largo del ADN-T, posiblemente como mecanismo de proteccin.

Abren un canal en la membrana celular bacteriana a travs del cual pasa el ADN-T.

El ADN-T entra entonces en la clula de la planta a travs de la lesin. No est claro cmo el ADN bacteriano se traslada desde el citoplasma al ncleo de la clula de la planta, ni cmo el ADN-T se integra en el cromosoma de la planta. Recuerde que la mayora de las veces el ADN de la planta no existe como una hebra expuesta sino que est envuelto con las protenas histonas y tiene una estructura superarrollada. Una hiptesis es que el ADN-T espera hasta que el ADN de la planta est siendo replicado o transcripto y entonces se inserta en el ADN expuesto de la planta (Galun and Breiman, 1997). Para utilizar A. tumefaciens como vector del transgen, los cientficos han eliminado la seccin de ADN-T inductora de tumores y han conservado las regiones fronterizas del ADN-T y los genes vir. El transgen es insertado entre las regiones fronterizas del ADN-T, desde donde es transferido a la clula de la planta para integrarse en los cromosomas de sta (Wong, 1997).

Transferencia gentica con protoplastos Como la formacin de agallas no se produca en prcticamente ninguna monocotilednea, se investigaron al mismo tiempo otros mtodos que permitiesen generar plantas transgnicas en este grupo que abarca a las gramneas, tan importantes en la nutricin humana. Los protoplastos son clulas de cualquier tejido vegetal a las que se les ha liberado de la pared celular que es la barrera que impide el paso de grandes molculas como el ADN. La pared celular se elimina digirindola con un enzima. El gen que se ha de transferir se adiciona al medio de cultivo del protoplasto. Si se somete un protoplasto a descargas elctricas creamos diminutos poros en la membrana por los cuales puede penetrar el ADN. A este mtodo se le denomina electroporacin. Tambin podemos ayudar a introducir ADN en un protoplasto empleando sustancias como el polietilenglicol que desestabiliza la membrana celular. Otro mtodo consiste en emplear liposomas que contengan el ADN a transferir. La dificultad principal que plantea este mtodo estriba en el escaso desarrollo de las plntulas generadas a partir de protoplastos. En 1988 se obtuvo por primera vez cereales transgnicos a partir de la regeneracin de protoplastos con genes exgenos en medio de cultivo para clulas vegetales. Transferencia gentica con el "can de partculas" (Biobalstica) Sanford, bilogo molecular de la Universidad de Cornell (EEUU) a principios de los aos ochenta estaba buscando el mtodo definitivo para transformar cualquier tipo de plantas. En 1984 estableci contacto con E. Wolf director del centro de fabricacin de micropartculas de su misma universidad. Entre ambos surgi la idea de bombardear clulas vegetales con ADN y como ste es una molcula flexible y frgil decidieron enganchar ADN a micropartculas metlicas. En presencia de cloruro de calcio y espermidina el ADN queda adherido a las micropartculas metlicas por interacciones no covalentes. En las primeras pruebas se emple micropartculas de tungsteno de cuatro micrmetros de di metro. Las partculas se proyectan sobre el tejido vegetal por el impulso de un chorro de aire comprimido o la explosin de una carga de plvora (fig. 4). Una vez dentro del tejido vegetal el ADN se desprende de las micropartculas debido a las modificaciones del entorno inico. Cuando la cantidad de partculas en una clula era superior a once haba pocas probabilidades de que la clula sobreviviera. Se pens que el tungsteno podra ser

ligeramente txico y por este motivo se emplearon posteriormente micropartculas de oro. Una vez probada la penetracin de ADN quedaba por demostrar la transferencia gentica. Adhirieron a las micropartculas metlicas ARN del genoma del virus del mosaico del tabaco. Tres das despus del bombardeo de clulas de cebolla se observaron partculas vricas, lo que demostraba que el material gentico introducido segua siendo funcional.

A partir de numerosos experimentos se cambiaron muchos factores para mejorar el rendimiento: el tamao de las microbolas, su velocidad, la inmovilizacin de las clulas vegetales y la cantidad de ADN transportado. Un problema que plantea esta tcnica es que se generan dos tipos de clulas: las transformadas y las no transformadas dentro de un mismo rgano. Aparecen entonces competiciones entre los dos tipos celulares disminuyendo la eficacia del mtodo. Pero por otra parte se evita el problema mayor que supone la regeneracin de plantas a partir de protoplastos.
Transformacin por bombardeo con partculas. El ADN se introduce en protoplastos (clulas desprovistas de la pared celulsica por medios enzimticos o qumicos) utilizando el polietilenglicol o la electroporacin. Tambin se puede introducir el ADN en las clulas por bombardeo con microproyectiles (biobalstica). La biobalstica es una tcnica basada en principios fsicos que permite literalmente disparar genes a las plantas. Para ello, el cido nucleico que codifica los genes de inters se deposita en minsculas partculas de oro u tungsteno, las que posteriormente son impulsadas por una fuerte columna de un gas (generalmente helio), hasta impactar los tejidos blanco de la especie a transformar. De esta manera, al penetrar las micropartculas la clula blanco, estas alcanzan el ncleo y depositan el ADN que portan transformando la clula con un nuevo gen. Las ventajas del bombardeo de partculas, adems de la sencillez y velocidad comparativas del proceso, podemos mencionar que se ha logrado introducir hasta 12 plsmidos separados y 600 kilobases de ADN. Algunos problemas asociados con la biolstica como mtodo para la transformacin vegetal, incluyen la frecuente integracin de mltiples copias de los transgenes y la dificultad de superar la etapa de expresin transiente y lograr integracin estable. (Ver imagen B) Ambos procedimientos de transformacin Agrobacterium o biobalstica se realizan sobre pequeas secciones de plantas, que luego de transformadas deben ser regeneradas a plantas completas en un medio cultivo apropiado. Transformacin vegetal Una tcnica para la transformacin de una planta debe permitir la creacin de organismos que incorporen y expresen una secuencia extraa de ADN dentro de su genoma. Ms especficamente, el sistema de transformacin deber permitir:

Introduccin de la(s) secuencia(s) e integracin estable al genoma.

Seleccin eficiente de las clulas transformadas. Regeneracin completa de plantas que expresen los genes deseados.

Actualmente se utilizan mtodos de transformacin con un sistema de introduccin de ADN por vectores biolgicos, principalmente Agrobacterium tumefaciens, o directamente, por bombardeo con partculas, ya sea por microinyeccin, electroporacin o mediada por glicol polietilnico (PEG). Transformacin por Agrobacterium. Agrobacterium tumefaciens es una bacteria presente en el suelo que causa la enfermedad conocida como agalla, caracterizada por el crecimiento de tumores en los tejidos vegetales. Agrobacterium tumefaciens es el nico organismo natural capaz de transformar genticamente una clula vegetal, utilizando un sistema para la trasferencia e integracin de genes altamente evolucionado. Se sabe que los crecimientos tumorosos son el resultado de la integracin estable en el genoma vegetal de un segmento de ADN, denominado ADN-T (ADN transferido), proveniente de un plsmido, el plsmido Ti (tumor-inducing), el cual est presente en un pequeo porcentaje de las poblaciones naturales de A. tumefaciens. El ADN-T est delimitado por repeticiones directas de 25 pares de bases, y cualquier ADN entre estos bordes ser transferido al ADN de la clula vegetal. Este ADN puede integrarse en diferentes lugares en el cromosoma vegetal y cuando se usa con fines prcticos para lograr la transformacin arbitraria de una planta, es deseable que esta integracin sea de un bajo nmero de copias. El ADN-T contiene genes que codifican para las hormonas vegetales auxina y citocinina, reguladores de crecimiento responsables del fenotipo tumoroso, y para metabolitos conocidos como opinas, los cuales son usados por Agrobacterium como fuente de carbono y nitrgeno. Para lograr esta transcripcin, el ADN-T contiene secuencias eucariticas de control como las cajas TATA y CAAT y sealas vegetales de poliadenilacin. La transferencia del ADN-T al ADN vegetal est mediada por una regin grande del plsmido Ti conocida como el locus vir (por virulencia). La protena virA detecta los compuestos fenlicos secretados por las clulas heridas y provoca la fosforilacin de la protena virG, la cual a su vez provoca una cascada de transcripcin de las dems protenas vir, que se encargan, a travs de un proceso an no completamente caracterizado, de la transferencia e integracin del ADN-T. (Ver imagen A) Plantas transgnicas En un sentido amplio, podra decirse que la Mejora de Plantas se remonta a los tiempos ms antiguos mediante la aplicacin intuitiva de procesos de seleccin. (Ejemplo 1) Los orgenes de la Gentica estn ntimamente relacionados con la investigacin de los hibridistas experimentales de plantas. A partir del redescubrimiento de las leyes de Mendel, la aplicacin de los conocimientos genticos impuls el desarrollo de la Mejora. La Mejora Gentica de Plantas tiene como fin ltimo obtener los genotipos que produzcan los fenotipos que mejor se adapten a las necesidades del hombre en unas circunstancias determinadas. Aspectos parciales de ese objetivo final son: Aumentar el rendimiento:

Mejora de productividad, aumentando la capacidad productiva potencial de los individuos. Mejora de resistencia, obteniendo genotipos resistentes a plagas, enfermedades y condiciones ambientales adversas. Mejora de caractersticas agronmicas, obteniendo nuevos genotipos que se adaptan mejor a las exigencias y aplicacin de la mecanizacin de la agricultura.

Aumentar la calidad:

Mejora de calidad, atendiendo, por ejemplo, al valor nutritivo de los productos vegetales obtenidos. Extender el rea de explotacin, adaptando las variedades de las especies ya cultivadas a nuevas zonas geogrficas con caractersticas climticas o edafolgicas extremas. Domesticar nuevas especies, transformando a especies silvestres en cultivadas con utilidad y rentabilidad para el hombre.

Los mtodos convencionales de la Mejora han sido los cruzamientos y la seleccin complementados en ocasiones con tcnicas citogenticas y de mutagnesis artificial. Sin embargo, mediada la dcada de los ochenta se inici la aplicacin de la ingeniera gentica molecular en la Mejora mediante la utilizacin de plantas transgnicas. La ingeniera gentica molecular ha sido considerada como una poderosa herramienta adicional para la agricultura, ya que en 1983 se demostr por primera vez que era posible transferir un gen extrao al cromosoma de las clulas vegetales de plantas intactas, siendo as plantas transgnicas, por que se les introdujo un nuevo gen que constituye parte de su genoma. Este nuevo gen les confiere una caracterstica que antes no posean, la que puede ser transmitida a las generaciones siguientes. Esta tcnica se ha refinado y constantemente se perfecciona, para permitir trabajar en distintos grupos y lograr una transformacin ms estable. Es posible hoy introducir en una planta genes provenientes no slo de otras plantas, sino de cualquier otro organismo, virus, bacteria, animal o levadura.