A N E XO S

Anexo I:

Protocolo de Extrao de RNA

PROTOCOLO DE EXTRAO DE RNA TOTAL

(Otimizado pelo Dr. Celso E. Benedetti, Laboratrio Nacional de Luz Sncrotron LNLS)

1. Coletar 4mL de sangue e manter a temperatura ambiente (TA); 2. Adicionar 4mL de soluo salina 0,9% (NaCl 0,9%) em tubo estril de 15mL; 3. Depositar cuidadosamente esta mistura (8mL) sobre 6mL de Ficoll-PaqueTM Plus (Amersham Biosciences) j aliquotados em outro tubo esteril de 15mL, de forma que as duas fases no se misturem; 4. Centrifugar a 400xg por 30 minutos (min.) 18oC, com a utilizao de rotor tipo ngulo livre (swinging-bucket); 5. Remover as clulas brancas para um novo tubo de 15mL com o auxlio de pipeta pasteur e completar o volume do mesmo com soluo salina em TA; 6. Centrifugar a 100xg por 10 min. 18oC; 7. Descartar o sobrenadante, ressuspender o pellet em 1mL de TrizolTM (Invitrogen) e incubar TA por 5 min. 8. Adicionar 0,2mL de clorofrmio, agitando-se o tubo vigorosamente por 15 segundos. 9. Incubar por 3 min. em TA e centrifugar a 12000xg por 15 min. a 18oC. 10. Transferir a fase aquosa (sobrenadante) para novo tubo e adicionar 0,5mL de lcool isoproplico 100%, deixando em TA por 10 min. 11. Centrifugar a 12000xg por 10 min a 5oC. 12. Descartar o sobrenadante e, em seguida, lavar o pellet com 1mL de etanol 75%. Desse modo, o RNA em soluo de etanol deve ser centrifugado a 7500xg por 5 min a 5oC, o sobrenadante descartado com auxlio de pipeta e aguardar at que o pellet esteja seco. 13. Ressuspender o RNA em 30L de gua DEPC e incubar por 10 min. a 55oC. Armazenar no freezer -80oC em pequenas alquotas.

Anexo II:

Sequncias, oligos e localizao do trato poli-Q para as diferentes protenas em estudo

II.1.) Gene MJD1: protena Ataxina-3 (formas Normal e Expandida)

ORF FINDER (NCBI): NM_004993 [gi:13518018]
oligo direto 59 atggagtccatcttccacgagaaacaagaaggctcactttgtgct M E S I F H E K Q E G S L C A 104 caacattgcctgaataacttattgcaaggagaatattttagccct Q H C L N N L L Q G E Y F S P 149 gtggaattatcctcaattgcacatcagctggatgaggaggagagg V E L S S I A H Q L D E E E R 194 atgagaatggcagaaggaggagttactagtgaagattatcgcacg M R M A E G G V T S E D Y R T 239 tttttacagcagccttctggaaatatggatgacagtggttttttc F L Q Q P S G N M D D S G F F 284 tctattcaggttataagcaatgccttgaaagtttggggtttagaa S I Q V I S N A L K V W G L E 329 ctaatcctgttcaacagtccagagtatcagaggctcaggatcgat L I L F N S P E Y Q R L R I D 374 cctataaatgaaagatcatttatatgcaattataaggaacactgg P I N E R S F I C N Y K E H W 419 tttacagttagaaaattaggaaaacagtggtttaacttgaattct F T V R K L G K Q W F N L N S 464 ctcttgacgggtccagaattaatatcagatacatatcttgcactt L L T G P E L I S D T Y L A L 509 ttcttggctcaattacaacaggaaggttattctatatttgtcgtt F L A Q L Q Q E G Y S I F V V 554 aagggtgatctgccagattgcgaagctgaccaactcctgcagatg K G D L P D C E A D Q L L Q M 599 attagggtccaacagatgcatcgaccaaaacttattggagaagaa I R V Q Q M H R P K L I G E E 644 ttagcacaactaaaagagcaaagagtccataaaacagacctggaa L A Q L K E Q R V H K T D L E 689 cgagtgttagaagcaaatgatggctcaggaatgttagacgaagat R V L E A N D G S G M L D E D 734 gaggaggatttgcagagggctctggcactaagtcgccaagaaatt E E D L Q R A L A L S R Q E I 779 gacatggaagatgaggaagcagatctccgcagggctattcagcta D M E D E E A D L R R A I Q L 824 agtatgcaaggtagttccagaaacatatctcaagatatgacacag S M Q G S S R N I S Q D M T Q 869 acatcaggtacaaatcttacttcagaagagcttcggaagagacga T S G T N L T S E E L R K R R 914 gaagcctactttgaaaaacagcagcaaaagcagcaacagcagcag E A Y F E K Q Q Q K Q Q Q Q Q 959 cagcagcagcagcagggggacctatcaggacagagttcacatcca Q Q Q Q Q G D L S G Q S S H P 1004 tgtgaaaggccagccaccagttcaggagcacttgggagtgatcta C E R P A T S S G A L G S D L 1049 ggtgatgctatgagtgaagaagacatgcttcaggcagctgtgacc G D A M S E E D M L Q A A V T 1094 atgtctttagaaactgtcagaaatgatttgaaaacagaaggaaaa M S L E T V R N D L K T E G K 1139 aaataa oligo reverso K *

361 aa

Oligo ATX-3Q

II.1.1.) Oligos usados para a ATX-3:

- Oligos utilizados para clonagem:
ATX-3 direto (Nde I) 5'- CA*T ATg gAg TCC ATC TTC CAC gAg -3' ATX-3 reverso (BamH I) 5'- ggA TCC TTA TTT TTT TCC TTC TgT TTT CAA ATC -3'

- Oligos utilizados para seleo e sequenciamento dos clones ATX-3E:

ATX-3 direto (NdeI): MJD25a (reverso): 5'- CA*T ATg gAg TCC ATC TTC CAC gAg -3' 5- ggC Tgg CCT TTC ACA Tgg AT -3

- Oligos utilizados para fragmentao da ATX-3:

ATX-3 direto (NdeI): ATX-3Q (BamHI): 5'- CA*T ATg gAg TCC ATC TTC CAC gAg -3' 5'- ggA TCC CgA gAA gCC TAC TTT gAA AAA -3'

PoliQ-D (EcoRI): PoliQ-R (SalI):

5'- AAA gAA TTC ATg Cgg AAg AgA Cg -3 5'- TTT gTC gAC TTA Tgg ATg TgA ACT CTg T -3 5- CAT ATg gAA gAT TgA ggA ggA TTT gCA -3 5- ggg ggA TCC TTC CAT gTC AAT TTC TTg gCg -3 5- CAT ATg gAT gAg gAA gCA gAT CTC CgC -3 5- ggg ggA TCC gTT TCT ggA ACT ACC TTg CAT A -3 5- CAT ATg AgT gAA gAA gAC ATg CTT CAg -3 5- ggA TCC ATC ATT TCT gAC TgT TTC TAA -3

Uim1F[NdeI]: Uim1R[BamHI]: Uim2F[NdeI]: Uim2R[BamHI]: Uim3F[NdeI]: Uim3R[BamHI]:

II.2.) Gene SCA7: protena Ataxina-7 (forma Normal)

ORF FINDER (NCBI): [gi:2370154:562-3240] 892 aa

1 atgtcggagcgggccgcggatgacgtcaggggggagccgcgccgc M S E R A A D D V R G E P R R 46 gcggcggcggcggcgggcggagcagcggccgcggccgcccggcag A A A A A G G A A A A A A R Q 91 cagcagcagcagcagcagcagcagcagccgccgcctccgcagccc Q Q Q Q Q Q Q Q Q P P P P Q P 136 cagcggcagcagcacccgccaccgccgccacggcgcacacggccg Q R Q Q H P P P P P R R T R P 181 gaggacggcgggcccggcgccgcctccacctcggccgccgcaatg E D G G P G A A S T S A A A M 226 gcgacggtcggggagcgcaggcctctgcccagtcctgaagtgatg A T V G E R R P L P S P E V M 271 ctgggacagtcgtggaatctgtgggttgaggcttccaaacttcct L G Q S W N L W V E A S K L P 316 gggaaggacgggacagaattggacgaaagtttcaaggagtttggg G K D G T E L D E S F K E F G 361 aaaaaccgcgaagtcatggggctctgtcgggaagacatgccaata K N R E V M G L C R E D M P I 406 tttggtttctgtccagcccatgatgatttctacttggtggtgtgt F G F C P A H D D F Y L V V C 451 aacgactgtaatcaggttgtcaaaccgcaggcatttcaatcacat N D C N Q V V K P Q A F Q S H 496 tatgaaagaagacatagctcatccagcaagccgcctttggccgtt Y E R R H S S S S K P P L A V 541 cctcccacttcagtattttccttcttcccttctctgtccaaaagc P P T S V F S F F P S L S K S 586 aaaggaggcagtgcaagtggaagcaaccgttcttccagtggaggt K G G S A S G S N R S S S G G 631 gttcttagcgcatcctcatcaagttccaagttgttgaaatcaccc V L S A S S S S S K L L K S P 676 aaagagaaactgcagctcagggggaacaccaggccaatgcatccc K E K L Q L R G N T R P M H P 721 attcagcaaagtagagttccccatggtagaatcatgacaccctct I Q Q S R V P H G R I M T P S 766 gtgaaagtggaaaagattcatccgaaaatggatggcacactactg V K V E K I H P K M D G T L L 811 aaatctgcggtggggccaacctgtcctgctactgtgagttcctta K S A V G P T C P A T V S S L 856 gtcaagcctggccttaactgcccctcaataccaaagccaaccttg V K P G L N C P S I P K P T L 901 ccttcacctggacagattctgaatggcaaagggcttcctgcaccg P S P G Q I L N G K G L P A P 946 cccactctggaaaagaaacctgaagacaattccaataataggaaa P T L E K K P E D N S N N R K 991 tttttaaataagagattatcagaaagagagtttgatcctgacatc F L N K R L S E R E F D P D I 1036 cactgtggggttattgatctcgacaccaagaagccctgcacccgg H C G V I D L D T K K P C T R 1081 tctttgacatgcaagacacattccttaacccagcgcagggctgtc S L T C K T H S L T Q R R A V 1126 cagggtagaagaaaacgatttgatgtgttattagccgagcacaaa Q G R R K R F D V L L A E H K 1171 aacaaaaccagggaaaaggaattgattcgccatccggactctcag N K T R E K E L I R H P D S Q 1216 caaccaccgcagcctctcagggacccgcatcccgcccctcctaga Q P P Q P L R D P H P A P P R 1261 acgtcacaggagccgcaccaaaaccctcacggagtgattccttcc

T S Q E P H Q N P H G V I P S 1306 gaatcaaagccttttgtagctagtaaacctaaacctcacaccccc E S K P F V A S K P K P H T P 1351 agtcttccaaggcctccaggctgccctgctcagcaaggtgggagt S L P R P P G C P A Q Q G G S 1396 gcccccattgaccctcctccagtccatgaatctccacaccctccc A P I D P P P V H E S P H P P 1441 ctgcctgccactgagccagcttctcggttatccagtgaggagggc L P A T E P A S R L S S E E G 1486 gaaggcgatgacaaagaagagtctgttgaaaaactggactgtcat E G D D K E E S V E K L D C H 1531 tattcaggtcatcatcctcagccagcatctttttgcacatttggg Y S G H H P Q P A S F C T F G 1576 agccggcagataggaagaggctattacgtgtttgactccaggtgg S R Q I G R G Y Y V F D S R W 1621 aatcgacttcgctgcgccctcaacctcatggtggagaagcatctg N R L R C A L N L M V E K H L 1666 aatgcacagctatggaagaaaatcccaccagtgcccagtaccacc N A Q L W K K I P P V P S T T 1711 tcacccatctccacacgtattcctcaccggacaaactctgtgccg S P I S T R I P H R T N S V P 1756 acatcacaatgtggagtcagctatctggcagcagccaccgtctct T S Q C G V S Y L A A A T V S 1801 acatccccagtcctgctctcatctacctgcatctccccaaatagc T S P V L L S S T C I S P N S 1846 aaatcggtaccagctcatggaaccacactaaatgcacagcctgct K S V P A H G T T L N A Q P A 1891 gcttcaggggcgatggatcctgtgtgcagtatgcaatccagacaa A S G A M D P V C S M Q S R Q 1936 gtgtcctcttcatcctcatccccttccacgccctctggcctttcc V S S S S S S P S T P S G L S 1981 tcggttccttcctcccccatgtccaggaaacctcagaaattgaaa S V P S S P M S R K P Q K L K 2026 tccagcaaatctttgaggcccaaggagtcttctggtaacagcact S S K S L R P K E S S G N S T 2071 aactgtcaaaatgccagtagcagtaccagtggcggctcaggaaag N C Q N A S S S T S G G S G K 2116 aaacgcaaaaacagttccccactgttggttcactcttcctcctcc K R K N S S P L L V H S S S S 2161 tcttcctcctcctcctcttcttctcattccatggagtcttttagg S S S S S S S S H S M E S F R 2206 aaaaactgtgtggctcactctgggcctccctacccctcaacggta K N C V A H S G P P Y P S T V 2251 acatcttcccatagcatcggcctcaactgtgtgacgaataaagca T S S H S I G L N C V T N K A 2296 aatgcggtgaacgtccggcatgaccagtcagggaggggccccccc N A V N V R H D Q S G R G P P 2341 accgggagccctgctgaatccatcaagaggatgagtgtgatggtg T G S P A E S I K R M S V M V 2386 aacagcagtgattctactctttctcttgggccattcattcaccag N S S D S T L S L G P F I H Q 2431 tccaatgaactgcctgtcaactcccacggcagtttttcccactca S N E L P V N S H G S F S H S 2476 cacactcctctagacaaactcataggaaagaaaagaaagtgctca H T P L D K L I G K K R K C S 2521 cccagctcgagcagcatcaacaacagcagcagcaaacccacaaag P S S S S I N N S S S K P T K 2566 gttgccaaagtgccagccgtgaacaatgtccacatgaaacacaca V A K V P A V N N V H M K H T 2611 ggcaccatcccaggggcacaaggactgatgaacagttccctcctt G T I P G A Q G L M N S S L L 2656 catcagccaaaggcacgtccctga 2679 H Q P K A R P *

II.2.) Oligos usados para a ATX-7

- Oligos utilizados para clonagem:

ATX-7 direto (Nde I): ATX-7 reverso (BamHI):

5'- CAT ATg TCg gAg Cgg gCC gCg gAT -3 5'- ggA TCC TCA ggg ACg TgC CTT Tgg CTg -3

- novos oligonucleotdeos, desenhados para a fragmentao da ATX-7 (contendo stios direto EcoRI e reverso NotI.) SEN1: 5- ggA ATT CAT gTC ggA gCg ggC CgC g -3 ANS1: 5- TTg Cgg CCg CTC AAg gAA gCC CTT TgC CAT TC -3

SEN2: 5- ggA ATT CCT TAC CTg CCC CTC AAT ACC 3 ANS2: 5- TTg Cgg CCg CTT AAT AgC TgA CTC CAC ATT g 3

SEN3: 5- ggA ATT CTC CAC ACg TAT TCC TCA CCg g 3 ANS3: 5- TgC ggC CgC TCA ggg ACg TgC CTT Tgg 3

II.3.) Gene SCA1: protena Ataxina-1 (forma Normal)

ORF FINDER (NCBI): NM_000332. [gi:4506792]
936 atgaaatccaaccaagagcggagcaacgaatgcctgcctcccaag M K S N Q E R S N E C L P P K 981 aagcgcgagatccccgccaccagccggtcctccgaggagaaggcc K R E I P A T S R S S E E K A 1026 cctaccctgcccagcgacaaccaccgggtggagggcacagcatgg P T L P S D N H R V E G T A W 1071 ctcccgggcaaccctggtggccggggccacgggggcgggaggcat L P G N P G G R G H G G G R H 1116 gggccggcagggacctcggtggagcttggtttacaacagggaata G P A G T S V E L G L Q Q G I 1161 ggtttacacaaagcattgtccacagggctggactactccccgccc G L H K A L S T G L D Y S P P 1206 agcgctcccaggtctgtccccgtggccaccacgctgcctgccgcg S A P R S V P V A T T L P A A 1251 tacgccaccccgcagccagggaccccggtgtcccccgtgcagtac Y A T P Q P G T P V S P V Q Y 1296 gctcacctgccgcacaccttccagttcattgggtcctcccaatac A H L P H T F Q F I G S S Q Y 1341 agtggaacctatgccagcttcatcccatcacagctgatcccccca S G T Y A S F I P S Q L I P P 1386 accgccaaccccgtcaccagtgcagtggcctcggccgcaggggcc T A N P V T S A V A S A A G A 1431 accactccatcccagcgctcccagctggaggcctattccactctg T T P S Q R S Q L E A Y S T L 1476 ctggccaacatgggcagtctgagccagacgccgggacacaaggct L A N M G S L S Q T P G H K A 1521 gagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcatcag E Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q H Q 1566 catcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcag H Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q 1611 cagcacctcagcagggctccggggctcatcaccccggggtccccc Q H L S R A P G L I T P G S P 1656 ccaccagcccagcagaaccagtacgtccacatttccagttctccg P P A Q Q N Q Y V H I S S S P 1701 cagaacaccggccgcaccgcctctcctccggccatccccgtccac Q N T G R T A S P P A I P V H 1746 ctccacccccaccagacgatgatcccacacacgctcaccctgggg L H P H Q T M I P H T L T L G 1791 cccccctcccaggtcgtcatgcaatacgccgactccggcagccac P P S Q V V M Q Y A D S G S H 1836 tttgtccctcgggaggccaccaagaaagctgagagcagccggctg F V P R E A T K K A E S S R L 1881 cagcaggccatccaggccaaggaggtcctgaacggtgagatggag Q Q A I Q A K E V L N G E M E 1926 aagagccggcggtacggggccccgtcctcagccgacctgggcctg K S R R Y G A P S S A D L G L 1971 ggcaaggcaggcggcaagtcggttcctcacccgtacgagtccagg G K A G G K S V P H P Y E S R

816 aa

10

2016 cacgtggtggtccacccgagcccctcagactacagcagtcgtgat H V V V H P S P S D Y S S R D 2061 ccttcgggggtccgggcctctgtgatggtcctgcccaacagcaac P S G V R A S V M V L P N S N 2106 acgcccgcagctgacctggaggtgcaacaggccactcatcgtgaa T P A A D L E V Q Q A T H R E 2151 gcctccccttctaccctcaacgacaaaagtggcctgcatttaggg A S P S T L N D K S G L H L G 2196 aagcctggccaccggtcctacgcgctctcaccccacacggtcatt K P G H R S Y A L S P H T V I 2241 cagaccacacacagtgcttcagagccactcccggtgggactgcca Q T T H S A S E P L P V G L P 2286 gccacggccttctacgcagggactcaaccccctgtcatcggctac A T A F Y A G T Q P P V I G Y 2331 ctgagcggccagcagcaagcaatcacctacgccggcagcctgccc L S G Q Q Q A I T Y A G S L P 2376 cagcacctggtgatccccggcacacagcccctgctcatcccggtc Q H L V I P G T Q P L L I P V 2421 ggcagcactgacatggaagcgtcgggggcagccccggccatagtc G S T D M E A S G A A P A I V 2466 acgtcatccccccagtttgctgcagtgcctcacacgttcgtcacc T S S P Q F A A V P H T F V T 2511 accgcccttcccaagagcgagaacttcaaccctgaggccctggtc T A L P K S E N F N P E A L V 2556 acccaggccgcctacccagccatggtgcaggcccagatccacctg T Q A A Y P A M V Q A Q I H L 2601 cctgtggtgcagtccgtggcctccccggcggcggctccccctacg P V V Q S V A S P A A A P P T 2646 ctgcctccctacttcatgaaaggctccatcatccagttggccaac L P P Y F M K G S I I Q L A N 2691 ggggagctaaagaaggtggaagacttaaaaacagaagatttcatc G E L K K V E D L K T E D F I 2736 cagagtgcagagataagcaacgacctgaagatcgactccagcacc Q S A E I S N D L K I D S S T 2781 gtagagaggattgaagacagccatagcccgggcgtggccgtgata V E R I E D S H S P G V A V I 2826 cagttcgccgtcggggagcaccgagcccaggtcagcgttgaagtt Q F A V G E H R A Q V S V E V 2871 ttggtagagtatcctttttttgtgtttggacagggctggtcatcc L V E Y P F F V F G Q G W S S 2916 tgctgtccggagagaaccagccagctctttgatttgccgtgttcc C C P E R T S Q L F D L P C S 2961 aaactctcagttggggatgtctgcatctcgcttaccctcaagaac K L S V G D V C I S L T L K N 3006 ctgaagaacggctctgttaaaaagggccagcccgtggatcccgcc L K N G S V K K G Q P V D P A 3051 agcgtcctgctgaagcactcaaaggccgacggcctggcgggcagc S V L L K H S K A D G L A G S 3096 agacacaggtatgccgagcaggaaaacggaatcaaccaggggagt R H R Y A E Q E N G I N Q G S 3141 gcccagatgctctctgagaatggcgaactgaagtttccagagaaa A Q M L S E N G E L K F P E K 3186 atgggattgcctgcagcgcccttcctcaccaaaatagaacccagc M G L P A A P F L T K I E P S
11

3231 aagcccgcggcaacgaggaagaggaggtggtcggcgccagagagc K P A A T R K R R W S A P E S 3276 cgcaaactggagaagtcagaagacgaaccacctttgactcttcct R K L E K S E D E P P L T L P 3321 aagccttctctaattcctcaggaggttaagatttgcattgaaggc K P S L I P Q E V K I C I E G 3366 cggtctaatgtaggcaagtag R S N V G K *

II.3.1.)Oligos e estratgias usadas para a ATX-1:

A) Oligos usados para amplificar a regio de 750pb do gene COM a poliQ: Direto Nde I: Reverso Xho I:
5- CCA CAT ATg AAA TCC AAC CAA gAg C -3 5- AAA CTC gAg CTA CTg gAA ATg Tgg ACg TAC T -3

B) Oligos usados para amplificar a regio de 1750 pb SEM o trato poliQ: Direto Nde I: Reverso Xho I:
5'- TTT CAT ATg CCA CAT TTC CAg TTC TCC -3' 5'- AAA CTC gAg CTA CTT gCC TAC -3'

Disposio dos oligos e tamanho dos fragmentos:

750 pb

Poli Q 0 pb
1750 pb

2451pb

12

C) Oligos e estratgia usados para amplificar o fragmento ntegro do gene: oligo reverso5:
5- ATC TCA CCg TTC Agg ACC T -3

Poli Q

0 3 Poro COM o poliQ (750pb) 5

2451 pb

Poro COM poliQ (986 pb)

Poro SEM a poliQ (1750 pb)

Oligos para sequenciamento:

F1 (568 a 586) TM= 53oC %GC= 47,4
5- CAT TCA gAC CAC ACA CAg T -3

F2 (1025 a 1045) TM= 59,7oC

%GC= 47,3

5- gAg CTA AAg AAg gTg gAA gAC -3

Oligo direto 2 [NdeI] (Tm: 58oC)

5- TTT CAT ATg CAC ATT TCC AgT TCT CCg C -3

Oligo reverso 1 [XhoI] (Tm: 58oC)

5- AAA CTC GAg CTA CTT gCC TAC ATT AgA CC -3

13

Oligos do Lab. DGM

- Direto (F_SCA1): 5- CAA CAT ggg CAg TCT gAg -3

- Reverso (R_SCA1): 5- AAC Tgg AAA TgT ggA CgT AC -3

Neste tipo de clonagem, teremos a his-tag apenas na poro N-terminal da protena: -Direto (NdeI): -Reverso (XhoI):
5- CCA CAT ATg AAA TCC AAC CAA gAg C -3

5-

AAA CTC gAg CTA CTg gAA ATg Tgg

ACg TAC T

-3

II.3.2.) (prxima pgina)

14

15

II.4.) Gene SCA2: protena Ataxina-2 (forma Normal)

ORF FINDER (NCBI): U70323.. [gi:1679683] 1312 aa

163 atgcgctcagcggccgcagctcctcggagtcccgcggtggccacc M R S A A A A P R S P A V A T 208 gagtctcgccgcttcgccgcagccaggtggcccgggtggcgctcg E S R R F A A A R W P G W R S 253 ctccagcggccggcgcggcggagcgggcggggcggcggtggcgcg L Q R P A R R S G R G G G G A 298 gccccgggaccgtatccctccgccgcccctcccccgcccggcccc A P G P Y P S A A P P P P G P 343 ggcccccctccctcccggcagagctcgcctccctccgcctcagac G P P P S R Q S S P P S A S D 388 tgttttggtagcaacggcaacggcggcggcgcgtttcggcccggc C F G S N G N G G G A F R P G 433 tcccggcggctccttggtctcggcgggcctccccgccccttcgtc S R R L L G L G G P P R P F V 478 gtcgtccttctccccctcgccagcccgggcgcccctccggccgcg V V L L P L A S P G A P P A A 523 ccaacccgcgcctccccgctcggcgcccgtgcgtccccgccgcgt P T R A S P L G A R A S P P R 568 tccggcgtctccttggcgcgcccggctcccggctgtccccgcccg S G V S L A R P A P G C P R P 613 gcgtgcgagccggtgtatgggcccctcaccatgtcgctgaagccc A C E P V Y G P L T M S L K P 658 cagcagcagcagcagcagcagcagcaacagcagcagcagcaacag Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q 703 cagcagcagcagcagcagcagccgccgcccgcggctgccaatgtc Q Q Q Q Q Q Q P P P A A A N V 748 cgcaagcccggcggcagcggccttctagcgtcgcccgccgccgcg R K P G G S G L L A S P A A A 793 ccttcgccgtcctcgtcctcggtctcctcgtcctcggccacggct P S P S S S S V S S S S A T A 838 ccctcctcggtggtcgcggcgacctccggcggcgggaggcccggc P S S V V A A T S G G G R P G 883 ctgggcagaggtcgaaacagtaacaaaggactgcctcagtctacg L G R G R N S N K G L P Q S T 928 atttcttttgatggaatctatgcaaatatgaggatggttcatata I S F D G I Y A N M R M V H I 973 cttacatcagttgttggctccaaatgtgaagtacaagtgaaaaat L T S V V G S K C E V Q V K N 1018 ggaggtatatatgaaggagtttttaaaacttacagtccgaagtgt G G I Y E G V F K T Y S P K C 1063 gatttggtacttgatgccgcacatgagaaaagtacagaatccagt D L V L D A A H E K S T E S S 1108 tcggggccgaaacgtgaagaaataatggagagtattttgttcaaa S G P K R E E I M E S I L F K

16

1153 tgttcagactttgttgtggtacagtttaaagatatggactccagt C S D F V V V Q F K D M D S S 1198 tatgcaaaaagagatgcttttactgactctgctatcagtgctaaa Y A K R D A F T D S A I S A K 1243 gtgaatggcgaacacaaagagaaggacctggagccctgggatgca V N G E H K E K D L E P W D A 1288 ggtgaactcacagccaatgaggaacttgaggctttggaaaatgac G E L T A N E E L E A L E N D 1333 gtatctaatggatgggatcccaatgatatgtttcgatataatgaa V S N G W D P N D M F R Y N E 1378 gaaaattatggtgtagtgtctacgtatgatagcagtttatcttcg E N Y G V V S T Y D S S L S S 1423 tatacagtgcccttagaaagagataactcagaagaatttttaaaa Y T V P L E R D N S E E F L K 1468 cgggaagcaagggcaaaccagttagcagaagaaattgagtcaagt R E A R A N Q L A E E I E S S 1513 gcccagtacaaagctcgagtggccctggaaaatgatgataggagt A Q Y K A R V A L E N D D R S 1558 gaggaagaaaaatacacagcagttcagagaaattccagtgaacgt E E E K Y T A V Q R N S S E R 1603 gaggggcacagcataaacactagggaaaataaatatattcctcct E G H S I N T R E N K Y I P P 1648 ggacaaagaaatagagaagtcatatcctggggaagtgggagacag G Q R N R E V I S W G S G R Q 1693 aattcaccgcgtatgggccagcctggatcgggctccatgccatca N S P R M G Q P G S G S M P S 1738 agatccacttctcacacttcagatttcaacccgaattctggttca R S T S H T S D F N P N S G S 1783 gaccaaagagtagttaatggaggtgttccctggccatcgccttgc D Q R V V N G G V P W P S P C 1828 ccatctccttcctctcgcccaccttctcgctaccagtcaggtccc P S P S S R P P S R Y Q S G P 1873 aactctcttccacctcgggcagccacccctacacggccgccctcc N S L P P R A A T P T R P P S 1918 aggcccccctcgcggccatccagacccccgtctcacccctctgct R P P S R P S R P P S H P S A 1963 catggttctccagctcctgtctctactatgcctaaacgcatgtct H G S P A P V S T M P K R M S 2008 tcagaagggcctccaaggatgtccccaaaggcccagcgacatcct S E G P P R M S P K A Q R H P 2053 cgaaatcacagagtttctgctgggaggggttccatatccagtggc R N H R V S A G R G S I S S G 2098 ctagaatttgtatcccacaacccacccagtgaagcagctactcct L E F V S H N P P S E A A T P 2143 ccagtagcaaggaccagtccctcggggggaacgtggtcatcagtg P V A R T S P S G G T W S S V 2188 gtcagtggggttccaagattatcccctaaaactcatagacccagg V S G V P R L S P K T H R P R 2233 tctcccagacagaacagtattggaaatacccccagtgggccagtt S P R Q N S I G N T P S G P V
17

2278 cttgcttctccccaagctggtattattccaactgaagctgttgcc L A S P Q A G I I P T E A V A 2323 atgcctattccagctgcatctcctacgcctgctagtcctgcatcg M P I P A A S P T P A S P A S 2368 aacagagctgttaccccttctagtgaggctaaagattccaggctt N R A V T P S S E A K D S R L 2413 caagatcagaggcagaactctcctgcagggaataaagaaaatatt Q D Q R Q N S P A G N K E N I 2458 aaacccaatgaaacatcacctagcttctcaaaagctgaaaacaaa K P N E T S P S F S K A E N K 2503 ggtatatcaccagttgtttctgaacatagaaaacagattgatgat G I S P V V S E H R K Q I D D 2548 ttaaagaaatttaagaatgattttaggttacagccaagttctact L K K F K N D F R L Q P S S T 2593 tctgaatctatggatcaactactaaacaaaaatagagagggagaa S E S M D Q L L N K N R E G E 2638 aaatcaagagatttgatcaaagacaaaattgaaccaagtgctaag K S R D L I K D K I E P S A K 2683 gattctttcattgaaaatagcagcagcaactgtaccagtggcagc D S F I E N S S S N C T S G S 2728 agcaagccgaatagccccagcatttccccttcaatacttagtaac S K P N S P S I S P S I L S N 2773 acggagcacaagaggggacctgaggtcacttcccaaggggttcag T E H K R G P E V T S Q G V Q 2818 acttccagcccagcatgtaaacaagagaaagacgataaggaagag T S S P A C K Q E K D D K E E 2863 aagaaagacgcagctgagcaagttaggaaatcaacattgaatccc K K D A A E Q V R K S T L N P 2908 aatgcaaaggagttcaacccacgttccttctctcagccaaagcct N A K E F N P R S F S Q P K P 2953 tctactaccccaacttcacctcggcctcaagcacaacctagccca S T T P T S P R P Q A Q P S P 2998 tctatggtgggtcatcaacagccaactccagtttatactcagcct S M V G H Q Q P T P V Y T Q P 3043 gtttgttttgcaccaaatatgatgtatccagtcccagtgagccca V C F A P N M M Y P V P V S P 3088 ggcgtgcaacctttatacccaatacctatgacgcccatgccagtg G V Q P L Y P I P M T P M P V 3133 aatcaagccaagacatatagagcagtaccaaatatgccccaacag N Q A K T Y R A V P N M P Q Q 3178 cggcaagaccagcatcatcagagtgccatgatgcacccagcgtca R Q D Q H H Q S A M M H P A S 3223 gcagcgggcccaccgattgcagccaccccaccagcttactccacg A A G P P I A A T P P A Y S T 3268 caatatgttgcctacagtcctcagcagttcccaaatcagcccctt Q Y V A Y S P Q Q F P N Q P L 3313 gttcagcatgtgccacattatcagtctcagcatcctcatgtctat V Q H V P H Y Q S Q H P H V Y 3358 agtcctgtaatacagggtaatgctagaatgatggcaccaccaaca S P V I Q G N A R M M A P P T
18

3403 cacgcccagcctggtttagtatcttcttcagcaactcagtacggg H A Q P G L V S S S A T Q Y G 3448 gctcatgagcagacgcatgcgatgtatgcatgtcccaaattacca A H E Q T H A M Y A C P K L P 3493 tacaacaaggagacaagcccttctttctactttgccatttccacg Y N K E T S P S F Y F A I S T 3538 ggctcccttgctcagcagtatgcgcaccctaacgctaccctgcac G S L A Q Q Y A H P N A T L H 3583 ccacatactccacaccctcagccttcagctacccccactggacag P H T P H P Q P S A T P T G Q 3628 cagcaaagccaacatggtggaagtcatcctgcacccagtcctgtt Q Q S Q H G G S H P A P S P V 3673 cagcaccatcagcaccaggccgcccaggctctccatctggccagt Q H H Q H Q A A Q A L H L A S 3718 ccacagcagcagtcagccatttaccacgcggggcttgcgccaact P Q Q Q S A I Y H A G L A P T 3763 ccaccctccatgacacctgcctccaacacgcagtcgccacagaat P P S M T P A S N T Q S P Q N 3808 agtttcccagcagcacaacagactgtctttacgatccatccttct S F P A A Q Q T V F T I H P S 3853 cacgttcagccggcgtataccaacccaccccacatggcccacgta H V Q P A Y T N P P H M A H V 3898 cctcaggctcatgtacagtcaggaatggttccttctcatccaact P Q A H V Q S G M V P S H P T 3943 gcccatgcgccaatgatgctaatgacgacacagccacccggcggt A H A P M M L M T T Q P P G G 3988 ccccaggccgccctcgctcaaagtgcactacagcccattccagtc P Q A A L A Q S A L Q P I P V 4033 tcgacaacagcgcatttcccctatatgacgcacccttcagtacaa S T T A H F P Y M T H P S V Q 4078 gcccaccaccaacagcagttgtaa A H H Q Q Q L *

II.4.1.) Oligos usados para a ATX-2

Direto (Kpn I):

5- AAA ggT ACC ACC ATg CgC TCA gCg gCC g -3

Reverso (Xba I): 5- CCT CTA gAg ACA ACT gCT gTT ggT ggT ggg -3

19

Anexo III:

Vetores

20

III.1.) Mapa do vetor de clonagem pGEM T Easy Vector System

Muito conveniente para clonagem de produtos de PCR. Apresenta a conveniencia de reconhecimento dos sitios para Eco RI e Not I flanqueando o sitio de insero para facilitar a remoo do inserto. Os promotores de RNA polimerase T7 e SP6 flanqueiam o sitio multiplo de clonagem (MCS) na regio codificante -peptide para -galactosidase. A inativao do -peptide permite aos clones recombinantes serem identificados diretamente como colonias brancas, enquanto que as colonias azuis no apresentam inserto. A origem de replicao f1 premite o preparo de ssDNA.

21

III.2) Mapa do vetor de expresso pET-28a.

O sistema pET (Novagen) um dos mais usados para expresso de protenas em E. coli. Os genes alvos so clonados sob fortes sinais de transcrio e traduo do bacterifago T7. O vetor possui caudas C e N-terminais de trombina, T7 e His, o que facilita a purificao da protena recombinante por cromatografia de afinidade. As enzimas de restrio que cortam o vetor apenas uma vez e suas respectivas posies esto indicadas no mapa. Informaes mais detalhadas podem ser encontradas no site http://www.novagen.com/SharedImages/TechnicalLiterature/7_tb055.pdf

22

III.3) Mapa do vetor pRARE.

O vetor pRARE (Novagen) contm o gene de resistncia ao cloranfenicol (Cam), o replicon (P15A
ori) e os tRNa correspondentes a codons raros em E. coli (setas em azul) e pode conter os genes que

codificam a lisozima T7 (LysS) ou o repressor lac (lacI)

23

Anexo IV:

Protocolos para Obteno de Clulas Competentes, Transformao por heat shock, PCR direto de colnias e Linhagens de E. coli

24

IV.1. ) Preparo das clulas competentes:

1. Inocular uma colnia isolada de E. coli

o

em 3mL de meio SOC (Sambrook & Russel, 2001) e

adicionar antibiotico especifico, caso necessrio; 2. Crescer o pr-inculo a 37 C por ~16h a 270 rpm; 3. Diluir o pr-inculo 1:1000 em 50mL de meio SOC; 4. Crescer a cultura de 50mL a 37 C / 270 rpm at atingir uma O.D.600 de 0,4-0,6; 5. Resfriar a cultura imediatamente em banho de gelo. A partir deste passo manter as clulas sempre em banho de gelo; 6. Transferir a cultura resfriada para tubos de centrfuga estreis, tambm resfriados e centrifugar a 8.000 rpm por 10 min a 4 C e descartar o sobrenadante; 7. Ressuspender as clulas com 50mL de TFB1 GELADO (em banho de gelo); 8. Incubar em gelo por 40 minutos 9. Centrifugar a 6.000 rpm por 10 min a 4 C em frasco pr-resfriado em banho de gelo e descartar o sobrenadante; 10. Ressuspender as clulas gentilmente em 10mL de TFB2 GELADO (em banho de gelo); 11. Aliquotar 100L de clulas em eppendorfs pr-resfriados em banho de gelo e congelar em nitrognio lquido imediatamente; 12. Estocar as alquotas a 80 C. Meio e solues para preparao de clulas competentes pelo mtodo de heat shock
TFB1 KOAc MnCl2 KCl CaCl2 Glicerol 0,03 M (2,94 g/l) 0,05 M (9,90 g/l) 0,10 M (7,46 g/l) 0,1 M (1,47 g/l) 15% Esterilizar por filtrao e estocar a 4 C
o

TFB2 MOPS pH 7,0 CaCl2 KCl Glicerol 0,010 M (02,04 g/l) 0,1 M (11,03 g/l) 0,010 M (00,75 g/l) 20% Triptona

Meio SOB 20,0 g/l 05,0 g/l 05,0 g/l

Extrato de levedura NaCl

Esterilizar por filtrao e estocar o a4 C

Autoclavar*

* - no momento do uso adicionar 5mL de MgCl2 2M estril (19g de MgCl2 em 90mL de H2O Milli-Q e
autoclavar por 20) para cada 1L de meio.

Meio SOC: Aps preparar o meio SOB, adicione 20mL de glicose 1M estril para cada 1L de meio.

25

IV.2.) Transformao de E. coli pelo Mtodo de heat shock:

1. Retirar as cls competentes do 80oC e descongelar em gelo por 5 2. Adicionar a ligao/DNA (aproximadamente 10L 1g/L) s cls. competentes 3. Incubar em gelo por 20-30 4. Incubar a 42oC por 90 e, em seguida, transferir para gelo por 2 5. Adicionar 900L de meio SOC e incubar a 37oC por 1h, sob agitao 6. Plaquear e levar a estufa ON a 37oC

26

IV.3.) PCR de colnias de bactrias

Colnias brancas frescas (no mximo 24h aps a transformao), isoladas, so selecionadas ao acaso das placas. A verificao da presena do fragmento clonado dentro de um vetor pode ser feita por meio da PCR. Os primers utilizados na reao podem ser oligos que reconhecem seqncias do fago M13 presentes na maioria dos vetores de clonagem, como por exemplo:

Oligo direto (M13 universal ou -20): Oligo direto (M13 -40): Oligo reverso (M13 R):

5'-CgACgTTgTAAA ACgACggCCAgT-3' 5'-gTTTTCCCAgTCACgAC-3' 5'-CAggAAACAgCTATgAC-3'

Podem ser usados, tambm, oligos de T7, dependendo do vetor (famlia pET). Estes iniciadores anelam-se em regies imediatamente adjacentes ao stio mltiplo de clonagem do vetor. Podem ser usados igualmente iniciadores especficos para o fragmento que est sendo clonado. O oligo direto sintetiza a fita negativa (extremidade 3' do cDNA) e o reverso sintetiza a fita positiva (extremidade 5' do cDNA). As colnias isoladas da placa de transformao (utilizando-se um palito estril) so lavadas diretamente em tubo tipo eppendorf contendo 20L de H2O milliQ estril. Em seguida, o palito deve ser depositado em um tubo de ensaio estril contendo 2mL de meio LB lquido, suplementado com o antibitico adequado (quando necessrio), que ento incubado por 16 horas a 37 sob agitao C constante de 200 rpm para preparo de culturas permanentes e/ou minipreps. As colnias que foram inseridas nos tubos contendo 20L de H2O milliQ estril, devem ser incubadas a 95 C por 5 min e, em seguida, centrifugadas por 5 min. a 14000rpm, aplicando-se 2L como molde na reao de PCR. Aps a reao, a amplificao ou no do fragmento clonado em cada clone verificada por eletroforese do produto da PCR em gel de agarose 1% corado com brometo de etdio usado na concentrao final de 0,1g/mL.
o

27

IV.4.) Linhagens de E.coli usadas para expresso das protenas recombinantes:

BL21(DE3)

BL21 a linhagem mais usada e apresenta a vantagem de ser deficiente nas proteases lon e ompT. As linhagens classificadas como DE3 so lisognicas para o profago que contem uma T7 RNA polimerase que induzida por IPTG. Assim, a designao DE3 indica que o hospedeiro um lisgeno de DE3, e, desse modo carrega uma cpia cromossomica do gene T7 RNA polimerase sob controle do promotor lacUV5. adequada para expresso de protenas no txicas

A tabela a seguir apresenta detalhes das outras linhagens utilizadas neste projeto, como caractersticas principais, gentipo e resistncia a antibiticos.

28

linhagem

caractersticas - mesmas caractersticas que a BL21(DE3). Adicionalmente, carrega o plasmdeo pLysS que produz a lisozima T7 que um inibidor natural da T7 RNA polymerase e usada para suprimir a expresso basal da T7 RNA polimerase antes da induo e, desse modo, estabilizar os recombinantes que codificam protenas que afetem o crescimento e viabilidade celular - adequada para a expresso de protenas txicas, mas pode tambm ser usada para protenas no-txicas gentipo: E. coli B F- dcm ompT hsdS(rB- mB-) gal (DE3) [pLysS Cam ] - mesmas caractersticas que a anterior, s que, neste caso carrega o plasmdeo pLysE que codifica o gene da lisozima T7 e produz maiores quantidades desta enzima do que a
r

Antibitico

BL21(DE3)pLysS

Cloranfenicol [34ug/mL]

BL21(DE3)pLysE

pLysS - fornece maior controle sobre a transcrio gentipo: E. coli B F- ompT hsdS(rB- mB-) gal (DE3) [pLysE Cam ] - derivadas da BL21(DE3) e obtidas por meio de mutaes espontneas no
r

Cloranfenicol [34ug/mL]

caracterizadas seguida de seleo fenotpica baseada na sobrevincia aps induo de expresso de protena recombinante txica. C41(DE3) e C43(DE3) gentipos: E. coli B F dcm ompT hsdS (rB mB) gal (DE3) e contendo ao menos uma mutao no caracterizada, no caso da C41(DE3) E. coli B F dcm ompT hsdS (rB mB) gal (DE3) e contendo ao menos duas mutaes no caracterizadas, no caso da C43(DE3) que derivada da C41 -

- derivada da clula Turner, que uma linhagem especial que apresenta mutantes de deleo de lacYZ de BL21 (induo por IPTG) - designada para melhoria da expresso de protenas de eucariotos que contenham codons Rosetta(DE3) raramente usados em E. coli pois supre tRNAs para os codons AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA partir de seus prprios promotores Gentipo: E. coli T F- ompT hsdSB (rb- mB-) gal dcm lacY1 (DE3) [pRARE6 Cam ] - caractersticas semelhantes a BL21(DE3) - esta linhagem carrega cpias extra dos tRNA genes argU, ileY e leuW. Os tRNAs codificados BL21(DE3)RIL para esses genes reconhecem os codons AGA/AGG (arginina), AUA Cloranfenicol [34ug/mL] (isoleucina) e CUA (leucina), respectivamente. - adequada para organismos com genoma rico em AT - adequada para a expresso de protenas extremamente txicas Gentipo: E. coli B F ompT hsdS(rB mB) dcm+ Tetr gal (DE3) endA Hte [argU ile YleuW Cam ] - caractersticas semelhantes a BL21(DE3) - esta linhagem carrega cpias extra dos tRNA genes argU e proL. Os tRNAs codificados para esses genes reconhecem os codons AGA/AGG (arginina) e CCC (prolina) BL21(DE3)RP - adequada para organismos com genoma rico em GC - adequada para a expresso de protenas extremamente txicas Gentipo: E. coli B F ompT hsdS(rB mB) dcm+ Tetr gal (DE3) endA Hte [argU proL Cam ]
r r r

Cloranfenicol [34ug/mL]

Cloranfenicol [34ug/mL]

30

Anexo V:

Relatrio SAXS

Anexo VI:

Anlises in silico:

32

VI.1. Anlise de codons raros

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VI.2. ProtParam tools

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VI.3.Anlise de estrutura secundria

35

Anexo VII:

Desdobramentos do projeto original:

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Sub-Projeto: Anlise estrutural da ATX-3 em soluo utilizando espalhamento de raios-X de baixo ngulo (projeto realizado em colaborao com a Profa. Dra. Iris Torriani do IF-UNICAMP e do LNLS).
Os experimentos de espalhamento de raios X esto sendo realizadas na linha de luz D11-SAS do LNLS em vrias configuraes para obter o intervalo angular mais adequado para anlise das curvas de Intensidade x vetor de espalhamento q (q = 4 sen/, onde 2 o ngulo de espalhamento e o comprimento de onda da radiao utilizada). As amostras em soluo para vrias concentraes da protena sero expostas a radiao de 8.33 KeV (que corresponde a um = 1.488 ), usando um porta amostras de 1 mm de espessura com temperatura controlada, mantendo a amostra a 10C. O detector a ser usado ser o sensvel posio unidimensional. Diversas medidas em concentraes diferentes permitiro o controle da monodispesidade da amostra e possvel efeitos de agregao. Sero realizadas exposies do solvente (buffer) para correo de cada um dos espectros obtidos com a protena, e medidas com albumina com o objetivo de calcular o peso molecular da ataxina-3 por mtodos de comparao. O tratamento de dados ser feito usando o software TRAT1D (Oliveira et al., 1997) disponvel na linha de SAXS do LNLS. A anlise das curvas de espalhamento permitir a obteno do raio de giro das molculas usando a aproximao de Guinier. Uma anlise mais criteriosa pode ser feita usando o programa de clculo GNOM (Svergun, 1991) que alem do raio de giro, permite obter a funo de distribuio de distncias intramoleculares P(r) e a dimenso mxima da protena, mostrando assim a forma que ela adota em soluo. O clculo de uma funo envelope tridimensional obtida a partir dos dados de espalhamento poder ser feito dependendo da qualidade dos dados, usando programas especialmente desenvolvidos para esse fim (Stuhrmann, 1970). At o momento dispomos de resultados obtidos para a ATX-3 normal fusionada com His-tag e estamos aguardando os resultados obtidos pelas medies da ATX-3 na forma expandida. Pretendemos obter amostras da ATX-3 normal sem a cauda de histidina para que sejam analisadas e, desse modo, complementar os dados para publicao. Pretendemos tambm dar continuidade ao projeto analisando as demais protenas deste projeto.

Sub-Projeto de Bioinformtica (realizado em colaborao com A EMBRAPA Bioinformtica, Campinas - Grupo coordenado pelo Prof. Dr. Goran Neshich)
A sequencia das proteinas ATX-3, ATX-1, ATX-7 e ATX-2 esto sendo utilizadas para a buscar sequencias homlogas aos respectivos genes no banco de dados GenBank com o programa BLASTx, considerando-se apenas scores superiores a 200. Sequencias de trato de 10 a 80 glutaminas esto sendo, tambm, utilizadas para buscar por sequencias depositadas no GenBank que contenham tratos de poliQ, para tal foi utilizado o programa BLASTx, e foram considerados scores acima de 80.

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At o momento, os resultados de BLASTx com as proteinas inteiras no revelaram homologias com quaisquer outra sequencia do banco de dados GenBank, ja o BLASTx feito com o trato de poliGln identificou as sequencias: gi|1729824|, gi|33286444|, gi|6166008|, gi|28828398|, gi|28924534|,

gi|18376358|, gi|28828398|, gi|27367908|, gi|23480318|, que apresentam poliGln nas sequencias de seus gene, tornando-os alvos interessantes para estudos de homologia e funo. Neste momento, esses resultados preliminares esto sendo verificados individualmente.

OUTROS desdobramento da clonagem da ATX-3 normal e expandida em nosso laboratrio foram:

- a possibilidade de utilizar tais clones em outros projetos, desses podemos citar o projeto de doutorado apoiado pelo FAPESP (processo FAPESP nr. 02/07752-3) Caracterizao de protenas que interagem com a Ataxina-3 em sua forma normal e mutante atravs do Yeast Two-Hybrid system (tal projeto conta com a colaborao do Prof. Dr. Jorg Kobarg do LNLS); - projeto colaborativo com a Profa. Dra. Anita Marsaioli do IQ-UNICAMP com o objetivo de caracterizar ligantes da ATX 3 de baixo peso molecular (processo FAPESP nr. 03/00670-4).

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