Tesis Normal

Especies vegetales y microorganismos rizosfricos tolerantes a metales pesados de un ecosistema contaminado.
2008
I. Introduccin. La composicin qumica de la roca madre y los procesos de meteorizacin condicionan, de forma natural, la concentracin de diferentes metales pesados en los suelos. Esto hace que los mrgenes de concentracin naturales de los metales puedan ser muy amplios y dependan, en gran medida, de la zona de estudio, de forma tal que puede existir una importante variabilidad espacial en la concentracin de metales en los suelos (Ross, 1995). Los metales pesados pueden ser transferidos a los cultivos desde el suelo, elemento clave en la regulacin de la dinmica de los mismos. Este hecho, muchas veces olvidado, hace que sea importante conocer la concentracin y dinmica de metales pesados en ellos para evaluar si son o no adecuados para la agricultura (Martn, 2002). As, preservando la calidad de estos puede garantizarse la calidad de los cultivos. Una produccin sostenible se deriva del balance apropiado de los suelos, cultivos, nutrientes, luz solar, humedad y de los sinergismos entre organismos existentes. El agroecosistema es productivo cuando este balance y las condiciones ptimas prevalecen y cuando las plantas cultivadas son adaptables para tolerar el estrs y las adversidades a las que son sometidas comnmente (Altieri, 1999). Actualmente, la Agroecologa como ciencia necesaria a aplicar para alcanzar dicha produccin sostenible, adquiere una gran relevancia para contrarrestar la actual crisis de los alimentos, promovida por los pases desarrollados como los EEUU que se empean en la elaboracin de biocombustibles a partir del empleo de los cereales, lo cual necesitar de una mayor disponibilidad de reas productivas para la generacin de alimentos. No todos los suelos necesarios para una mayor produccin se encuentran aptos para su explotacin ya que aos de intensa actividad industrial, uso de agroqumicos, falta de tratamientos en las aguas residuales, han provocado la degradacin y contaminacin de los mismos. Los efectos negativos producidos por los metales pesados en las diferentes partes de los agroecosistemas, suelos, cultivos y agua, as como, en los seres humanos, desde hace dcadas, despert el inters de muchos investigadores. La sociedad, as como decisores y gobiernos que han logrado tomar conciencia de este problema medioambiental, desde la dcada de los 90 han adoptado, a nivel internacional, algunas polticas para garantizar una mayor proteccin medioambiental y un desarrollo sostenible. Dentro de estas polticas, en la cumbre de Ro de Janeiro (1992) los diferentes Estados participantes firmaron una serie de declaraciones relacionadas con la proteccin de los suelos que son an aspiraciones a lograr. Como resultado de algunas investigaciones, especies vegetales con caractersticas especficas son cultivadas en las reas afectadas para acelerar su restauracin (Mazzeo, 2002). Estas plantas pueden ser usadas para remover, transferir, estabilizar y degradar metales pesados. Las mismas poseen mecanismos estructurales y adaptativos para la acumulacin y tolerancia a las altas concentraciones del contaminante en la rizosfera. Mediante una tecnologa conocida como Biorremediacin, tcnica ambientalmente ms saludable, potencialmente ms barata y que ofrece la posibilidad de la biorrecuperacin de los metales pesados, las propiedades biolgicas y fsicas del suelo pueden ser mantenidas (Becerril et al., 2002). La fitorremediacin como tcnica incluida en la Biorremediacin por tanto, constituye un mtodo competitivo y sencillo de limpiar las cada vez ms abundantes reas contaminadas en todo el mundo. La identificacin de plantas que germinan en ambientes muy contaminados presenta, frente a otros sistemas complejos de limpieza, un gran inters en la recuperacin de suelos y/o aguas (Cmara, 2002). La actividad de los microorganismos propicia la degradacin de compuestos qumicos y orgnicos en la rizosfera, estimula la produccin de exudados radicales y enzimas y favorece la produccin de carbono orgnico en el suelo, todo lo cual posibilita el enriquecimiento de la microbiota. Tambin influyen directamente en el proceso de fitorremediacin, aumentando la biodisponibilidad de los metales en las rizosferas de las plantas (Schnnor, 1999).
Especies vegetales y microorganismos rizosfricos tolerantes a metales pesados de un ecosistema contaminado. 2008
El rea objeto de estudio, ubicada frente a la industria de cermica blanca Adalberto Vidal y enclavada en el Municipio San Jos de las Lajas, Provincia La Habana, ha sido identificada por el CEDAR (2004) como uno de los focos contaminantes del municipio, el cual cuenta con un gran asentamiento industrial y poblacional, detectndose el vertimiento indiscriminado de grandes volmenes de aguas y lodos residuales por parte de las industrias, poblacin e instituciones cientficas que provocan en muchas ocasiones daos irreparables en los ecosistemas (FITOPLANT, 2007). En dicha rea se identificaron un total de 32 especies agrupadas en 22 familias que se desarrollan sin mostrar signos de toxicidad, mantenindose a lo largo de los cuatro muestreos las especies Glycine habanica L., Acacia farnesiana L. (Willd), Dichantium caricosus L. Pers., Cynodon dactylon L. Pers., Cyperus gigantus L., Panicum maximum Jacq., Rivea corymbosa (L) Hall, Bursera sumaruba y Typha dominguensis (Pers). Kunth., de las familias botnicas Fabaceae, Mimosaceae, Poaceae, Cyperacae, Convolvulaceae, Burseraceae y Typhaceae, respectivamente; lo cual est relacionado con las caractersticas perennes de estas especies que son utilizadas como pastos y plantas medicinales (Quevedo, 2006). Por esta razn proponemos el siguiente problema cientfico: La empresa de Cermica Blanca contamina el ecosistema donde son vertidos los desechos de su produccin, por lo que se hace necesario investigar la presencia de plantas acumuladoras de metales pesados y microorganismos tolerantes a los niveles de toxicidad existentes, para poder aplicar las tcnicas de Biorremediacin. Surgiendo as como Hiptesis: En el rea donde son vertidos los desechos de la Empresa Cermica Blanca de San Jos de las Lajas, existen plantas acumuladoras de metales pesados y microorganismos especficos tolerantes a los niveles de contaminacin que tienen las rizosferas de estas especies. Por tanto, para dar cumplimiento a lo planteado el Objetivo general es: Identificar especies de plantas acumuladoras de metales pesados y microorganismos rizosfricos tolerantes con potencialidades para aplicar la biorremediacin en el rea estudiada. Objetivos especficos: Determinar la concentracin pseudo-total de los metales pesados en las rizosferas de las especies vegetales seleccionadas, de acuerdo a su abundancia en el rea experimental. Determinar el contenido de metales pesados totales en la parte rea y radical de las especies vegetales seleccionadas para identificar las que son acumuladoras de metales pesados con posibilidades a ser utilizadas en un sistema de recuperacin de los suelos a travs de la fitorremediacin. Aislar poblaciones de bacterias, hongos y actinomicetos de la rizosfera de las especies definidas como acumuladoras con ms posibilidades a ser empleadas en sistemas de remediacin de suelos. Seleccionar morfotipos aislados con potencialidades para su empleo en tcnicas de recuperacin ecolgica (Biorremediacin).
Novedad Cientfica: A partir del establecimiento de protocolos de trabajo que constituyen estudios pioneros en nuestro pas relacionados con la interaccin suelo contaminado-microorganismos tolerantes-plantas acumuladoras, se aportan los primeros resultados que permiten encaminar la aplicacin de las tcnicas de Biorremediacin en ecosistemas urbanos contaminados por la actividad antrpica acumuladora en el tiempo.
II. Revisin Bibliogrfica. 2.1. Contaminacin por metales Pesados. 2.1.1. Origen de los metales pesados en los suelos. Los metales pesados estn presentes en suelos y acuferos como componentes naturales o resultados de la actividad humana, por lo tanto su procedencia puede ser variada, asocindose las fuentes de contaminacin a componentes naturales como resultado de la actividad humana (Garbisu et al., 2002a). La procedencia de metales pesados en los suelos puede ser: a) origen natural y b) de origen antropognico: De origen natural: Provenientes de erupciones volcnicas y de los metales pesados contenidos en el material original, que al meteorizarse, se concentran en los suelos. Estas concentraciones naturales de metales pueden llegar a ser txicas para el crecimiento de las plantas, as por ejemplo, el nquel puede aparecer en concentraciones txicas en suelos derivados de rocas ultra bsicas. De origen Antropognico: Las actividades generadas por el hombre proveniente del desarrollo industrial que han ejercido un efecto considerable en la concentracin y movilidad de los metales en suelos. Las siguientes actividades como generadoras de contaminacin de origen Antropognico Lenntech (2004) y Nern (2004): Productos qumicos agrcolas y lodos residuales. Generacin de electricidad y otras actividades industriales. Residuos domsticos. El transporte automotriz. Fabricacin de sanitarios y azulejos. Por lo tanto, el desarrollo de determinadas actividades industriales puede constituir un riesgo moderado de contaminacin ambiental. Dicho riesgo no es solo debido a las emisiones atmosfricas sino tambin a mala gestin de sus residuos o a un deficiente almacenamiento de las materias primas y productos, que pueden ocasionar fugas de componentes que se acumulan en el suelo (Vullo, 2004). Situacin por la cual en la actualidad la mayora de las actividades industriales son consideradas como "actividades potencialmente contaminantes de los suelos (Nern, 2004). 2.1.2. Transporte y dispersin de los contaminantes. A partir de un contaminante en el suelo se pueden desencadenar una serie de procesos de movilizacin del mismo, cuya accin efectiva depender de una parte de la composicin y caractersticas fsicos-qumicas de la sustancia y por otra de las caractersticas geoqumicas de ese suelo (Peris, 2006). De forma general, el suelo por s mismo no es un vector importante de dispersin de contaminantes, pero en combinacin con otros factores ambientales se revela como un foco emisor de contaminacin de gran importancia. El agua, y en menor medida el aire, son los agentes dispersantes de la contaminacin presente en un suelo. Tambin, hay que tener en cuenta el papel depurador de ciertos componentes del suelo, como son los coloides, dentro del material slido inorgnico los materiales
hmicos y los microorganismos. La retencin de los contaminantes se lleva a cabo por medio de fenmenos de absorcin fsica, interaccin qumica o bien los transforman por medio de reacciones qumicas (Kabata-Pendias y Pendias, 2001). 2.1.3. Las arcillas y la industria cermica como generadora de contaminacin. Las arcillas son constituyentes esenciales de los suelos y sedimentos debido a que son mayoritariamente productos finales de la meteorizacin de los silicatos que formados a mayores presiones y temperaturas, en el medio exgeno se hidrolizan. Se consideran arcillas todas las fracciones con un tamao de grano inferior a 2 mm (Domnguez y Schifter, 2005). Lo que normalmente se entiende por arcilla es, desde un punto de vista geolgico, una roca arcillosa que contiene cuarzo y varios filosilicatos del grupo de la arcilla, como ilita, caolinita, clorita, esmectitas. Lo ms frecuente es que sea de tipo iltico o iltico-caolintico. Tambin puede contener feldespato, carbonatos (que actan ambos como fundentes en la coccin de la arcilla) y yeso. En la arcilla refractaria, predomina la caolinita, que es el nombre genrico de un grupo de filosilicatos de la familia de las kanditas. Y en las arcillas especiales, las esmectitas, la sepiolita o la paligorskita, segn el tipo de roca arcillosa (Novelo et al., 2003). Segn esto todos los filosilicatos pueden considerarse verdaderas arcillas si se encuentran dentro de dicho rango de tamaos; incluso minerales no pertenecientes al grupo de los filosilicatos (cuarzo, feldespatos, etc.) pueden ser considerados partculas arcillosas cuando estn incluidos en un sedimento arcilloso y sus tamaos no superan los 2 mm (Domnguez y Schifter, 2005). Los filosilicatos presentan una estructura basada en el apilamiento de planos de iones oxgeno e hidroxilos. Los grupos tetradricos (SiO)4 se unen compartiendo tres de sus cuatro oxgenos con otros vecinos formando capas, de extensin infinita y frmula (Si2O5)2-, que constituyen la unidad fundamental de los filosilicatos. En ellas, los tetraedros se distribuyen formando hexgonos. El silicio tetradrico puede estar, en parte, sustituido por Al3+ o Fe3+. Estas capas tetradricas se unen a otras octadricas. En ellas algunos cationes Al3+ o Mg2+, pueden estar sustituidos por Fe2+ o Fe3+ y ms raramente por Li1+, Cr3+, Mn2+, Mn3+, Ni2+, Ni3+, Cu2+ o Zn2+. El plano de unin entre ambas capas est formado por los tomos de oxgeno de los tetraedros que se encontraban sin compartir con otros tetraedros (oxgenos apicales) y por grupos (OH)- de la capa octadrica, de forma que, en este plano, quede un grupo (OH)- en el centro de cada hexgono formado por 6 oxgenos apicales (Lpez et al., 2003). Como roca industrial, la propiedad ms importante de la arcilla comn, y la que determina muchas veces su posible uso, es la plasticidad una vez amasada con agua. El contenido en Hierro, Titanio y Manganeso determina el color de la arcilla cocida, distinguindose dos grandes grupos: arcillas de coccin roja y arcillas de coccin blanca. Otras propiedades importantes son la resistencia mecnica en crudo, la temperatura de sinterizacin y la contraccin de secado y durante la coccin (Cabo et al., 2006). Las arcillas pueden tener diferentes trminos en funcin de su uso, segn Bravo (2004): -Desde el punto de vista mineralgico, engloba a un grupo de minerales arcillosos, filosilicatos en su mayor parte, cuyas propiedades fsicoqumicas dependen de su estructura y de su tamao de grano, muy fino (inferior a 2 mm). -Desde el punto de vista petrolgico la arcilla es una roca sedimentaria, en la mayor parte de los casos de origen detrtico, con caractersticas bien definidas. Para un sedimentlogo, arcilla es un trmino granulomtrico, que abarca los sedimentos con un tamao de grano inferior a 2 mm.
-Para un ceramista una arcilla es un material natural que cuando se mezcla con agua en la cantidad adecuada se convierte en una pasta plstica. -Desde el punto de vista econmico las arcillas son un grupo de minerales industriales con diferentes caractersticas mineralgicas y genticas y con distintas propiedades tecnolgicas y aplicaciones, todas relacionadas con la actividad ceramista (construccin de cermicas artsticas, lozas de pisos, azulejos, sanitarios, talcos, cementos y materias primas de fertilizantes, industria qumica, farmacutica, entre otros. En especfico la industria de fabricacin de productos cermicos utiliza como materia prima bsica todo tipo de arcillas y caolines, as como arcilla cocida, feldespatos, arenas y otros muchos xidos resistentes a altas temperaturas, por ejemplo, corindn (Al2O3), xido de circonio (ZrO2) o carburo de silicio (SiC). Debido al origen de cada arcilla, esta contiene diversos elementos trazas asociados, por tanto, su uso continuo genera contaminacin (De Zeeuw y Lock, 2000) Segn Sisti (2002) la industria de fabricacin de productos cermicos puede dividirse para su mejor entendimiento: a) por el tipo de planta que genera la contaminacin y b) por el vehculo de contaminacin. Segn el tipo de planta que genera la contaminacin estn las Plantas productoras de cermica sin esmaltado donde los productos contaminantes son bsicamente productos de la combustin, polvo de materias primas y productos de la descomposicin de estas materias primas. Las plantas de cermicas esmaltadas, los contaminantes tienen la caracterstica de que adems de los contaminantes producto de la combustin y de la descomposicin de las arcillas se les debe agregar los elementos qumicos en forma de xidos, sales, gases, etc., comenzando la contaminacin desde el inicio del proceso productivo, durante la produccin de los pigmentos, esmaltes y las operaciones propias de molienda y aplicacin de esos esmaltes y hasta durante su uso. Por el vehculo de los elementos contaminantes producidos por la industria cermica estn los efluentes gaseosos (gases, vapores lquidos, slidos subliminales, polvo), lquidos (lquidos disueltos o en suspensin, sales solubles, slidos en suspensin coloidal) y slidos (barros o polvos de arcillas o de esmaltes, descarte de productos sin esmaltar, descarte de productos esmaltados). 2.1.4. Efectos de la contaminacin. Una vez que el elemento ha llegado al suelo puede seguir diversas vas en el mismo. Las principales son aquellas que afectan a su difusin a diversos medios por ser las que afectan a la salud humana. El ingreso en las cadenas trficas puede hacerse mediante la absorcin por las plantas o el lavado hacia las aguas freticas en las que tiene mucho que ver su solubilidad (Vullo et al., 2003). De forma general, la presencia de contaminantes en el suelo se refleja de forma directa sobre la vegetacin induciendo su degradacin, la reduccin del nmero de especies presentes en ese suelo, abandono de la actividad agropecuaria, desaparicin de la fauna, prdida del valor agrcola y econmico del suelo y ms frecuentemente la acumulacin de contaminantes en las plantas, sin generar daos notables en estas (Tarrach, 2001). 2.1.4.1. Impacto de los metales pesados en las comunidades microbianas. Los metales pesados provocan grandes efectos en procesos importantes de fertilizacin de suelo pues afectan la estructura y la funcin de las comunidades microbianas (Gonzlez, 2000). Funciones claves en estos procesos la mineralizacin de la materia orgnica y la fijacin biolgica del nitrgeno pueden ser inhibidos por concentraciones mnimas por debajo del lmite permisible (Madigan et al., 1998).
La contaminacin con metales pesados puede llevar a una reduccin parcial as como total en la poblacin de la masa microbiana, o bien provocar disminuciones efectivas en poblaciones de microorganismos como Rhizobium (Chaudri et al., 1999) o micorrizas, as como alterar la composicin en la estructura microbiana de los suelos. Estudios sobre el dominio Archea, realizados en suelos contaminados con metales pesados demuestran una reduccin en el porcentaje de especies comparadas con un suelo no contaminado, demostrndose adems diferencias cualitativas en la estructura de esas (Enger y Torsvik, 1999; Castrillo, 2004). Varios estudios han concluido que los metales influyen sobre los microorganismos afectando su crecimiento, morfologa y actividades bioqumicas (Reber, 1992). A pesar de estos efectos txicos de los metales pesados, los microorganismos han desarrollado mecanismos de resistencia que permiten su supervivencia: entre los que se encuentran la volatilizacin, precipitacin extracelular y exclusin, ligazn en la superficie celular y secuestro intracelular (Shuttleworth y Unz, 1993). 2.1.5. Mecanismos de Interaccin Metal-Microorganismo. Los microorganismos han coexistido con los metales desde un principio, hecho este que se refleja en el ancho espectro de divalentes de metales o de transicin encontrados en los centros activos de muchas enzimas. Se han usado las propiedades qumicas de los metales en las reacciones bioqumicas ms importantes y en el mantenimiento de la estructura de las protenas. Estos metales son, necesarios, en cantidades mnimas (microelementos) para el metabolismo celular normal y su recepcin es llevada a cabo por un mecanismo de homeostasia que garantiza efectivamente una adquisicin nunca excesiva del metal. Muchos otros metales parecen no tener ninguna funcin biolgica importante como el Pb (plomo). Al contrario, causan graves daos y perjuicios a la salud, principalmente debido a su avidez por los agrupamientos sulfhdricos de las protenas que bloquean e inactivan (Gadd, 2000). Diferentes organismos muestran variadas respuestas a los iones txicos de un metal del ello deben ser el resultado de mecanismos intrnsecos o inducidos. Se define la tolerancia como la capacidad que tiene un organismo de vivir junto con la toxicidad de los metales a travs de las propiedades intrnsecas del mismo. La resistencia, por otro lado, es la habilidad de vivir con los metales txicos a travs de mecanismos del detoxificacin producida en respuesta directa a la presencia del metal (Labrenz et al., 2000). Los Eucariontes son ms sensibles a la toxicidad de los metales que las bacterias y su mecanismo tpico de regulacin. La concentracin de iones metlicos es intracelular, y se realiza a travs de la expresin del metalotionenas, una familia de quelatos de metal de protenas. En este caso, las metalotionenas bacterianas que son funcionalmente homlogas a las eucariticas las cuales ya fueron demostradas Blindauer et al. 2001, citado por Kamnev (2003). Las bacterias reductoras de sulfatos demuestran un cierto grado de tolerancia a los metales como consecuencia de su metabolismo, son anaerobios que producen sulfatos e inmovilizan iones txicos como los sulfitos metlicos (Labrenz et al., 2000). 2.2. Mtodos Biolgicos para la Remediacin de suelos contaminados por metales pesados. El trmino restauracin ecolgica implica la restauracin o rehabilitacin de ecosistemas o hbitats que han sido alterados especficamente por el hombre, esta restauracin ecolgica se vale de diferentes mtodos tales como: restauracin, rehabilitacin, reacondicionamiento, recuperacin ecolgica y biorremediacin (UACh, 2003).
La utilizacin de mtodos biolgicos para remediar un ambiente contaminado ofrece una alta especificidad en la remocin del metal de inters con flexibilidad operacional tanto en sistemas in situ como ex situ (Vullo et al., 2003). La remediacin in situ de ambientes contaminados por metales pesados, pretende encontrar una solucin definitiva que proteja la salud humana y del ecosistema, constituyendo por lo tanto sus objetivos fundamentales (Martn y Ruby, 2004): Reducir los niveles del metal. Reducir la Biodisponibilidad de metales a seres humanos y dems receptores ecolgicos. Restablecer la vegetacin. Todos los programas de remediacin in situ, siguen una estrategia para la contencin del contaminante, estabilizacin o reduccin, Puede que no sea posible una limpieza total del rea, ms es posible disminuir los riesgos de daos a la salud humana y al ambiente. De forma tal que, la carga contaminante disminuya a niveles aceptables para una manipulacin fsica o qumica del rea en cuestin. Las estrategias de reduccin in situ incluyen a la actividad microbiana. 2.2.1. Biodegradacin mediada por microorganismos. En el caso del petrleo, en realidad son los microorganismos asociados a las races de las plantas los que se encargan de degradarlo. Los vertidos de petrleo son un blanco perfecto para los fitorremediadores, ya que una vez vertido en el suelo, el petrleo posee escasa movilidad, y forma una delgada capa en la superficie del suelo, donde puede estar en contacto directo con las races. Las plantas aceleran la accin de los microbios, proporcionando ms oxgeno al suelo y gran cantidad de preciados nutrientes a travs de las races. Este mecanismo ha servido para descontaminar con xito diversos vertidos de petrleo crudo, y otros productos petrolferos, en los Estados Unidos (Wangensteen, 2002). Los microorganismos pueden reducir la toxicidad de los metales por la incorporacin de estos en sus clulas o por precipitacin en la superficie de ellas en unin no especfica (Gadd y Griffiths, 1978). Igualmente pueden contribuir a reacciones de metilacin de elementos traza como As, Hg, Pb y Tl, incrementando su toxicidad (Gonzlez, 2000). Las principales interacciones extracelulares entre bacterias y metales son: la movilizacin, e inmovilizacin; la produccin de polmeros extracelulares y la liberacin de siderforos. La movilizacin e inmovilizacin de metales es motivo de inters por sus aplicaciones industriales, principalmente en la minera. Los microorganismos son sensibles tanto a las deficiencias como a excesivas concentraciones de elementos, aunque son capaces de adaptarse a ellas. Los metales pesados son txicos para la microbiota, reduciendo el crecimiento as como la actividad enzimtica (Kabata-Pendias y Pendias, 2001). Dependiendo del estado de oxidacin que se presente un metal y la especie en que est conformando un microorganismo puede realizar dos transformaciones posibles. Una correspondera a la movilizacin del metal, es decir el pasaje de un estado insoluble inicial metales asociados a suelos, sulfuros u xidos metlicos, por ejemplo) correspondiente a una fase slida, a un estado soluble final, en fase acuosa. Este proceso se conoce con el nombre de lixiviacin microbiana. El otro corresponde a la inmovilizacin del metal, es decir el paso de un estado soluble inicial en fase acuosa a uno insoluble final en fase
slida. A su vez, existen en la naturaleza diferentes mecanismos por los cuales la inmovilizacin del metal puede llegar a ocurrir (Vullo, 2004). Nuevas tcnicas de tratamiento han aparecido, teniendo su gnesis en la capacidad de diferentes organismos (plantas y microorganismos) para degradar, extraer o inmovilizar los contaminantes orgnicos o inorgnicos del suelo o el agua. Estas tcnicas han sido denominadas Biorremediacin y como un caso particular al emplear diferentes plantas la Fitorremediacin (Becerril et. al., 2002). 2.2.2. Biorremediacin. La biorremediacin un proceso que utiliza las habilidades catalticas de los organismos vivos para transformar contaminantes en productos inocuos, o en su defecto, menos txicos, que pueden entonces integrarse a los sitios bioqumicos naturales, tanto en ecosistemas terrestres como acuticos, presentando un enorme potencial en la mitigacin de la contaminacin ambiental (Garbisu et al., 2002b). Es una tecnologa que tiene como objetivo acelerar la biodegradacin natural de los compuestos orgnicos mediante la optimizacin de las condiciones limitantes del proceso. En este proceso influye la composicin, concentracin y disponibilidad de los contaminantes, o las caractersticas fsicas y qumicas del lugar contaminado. En muchos casos, una o varias de estas condiciones no se encuentran presentes, de forma que la biodegradacin se produce a velocidades tan bajas que impiden conseguir rendimientos de depuracin satisfactorios (Montrs y Vincent, 2002). Lo que hace sobresaliente a esta tcnica frente a los mtodos convencionales de limpieza ambiental, es que se basa en medidas y aplicaciones que permiten potenciar la actividad metablica de ciertos microorganismos nativos capaces de transformar contaminantes orgnicos en compuestos qumicamente ms sencillos, que la naturaleza puede aprovechar (Vsquez, 2002). Constituye una tcnica muy segura, ya que depende de microbios que existen normalmente en los suelos. Esos microbios son tiles y no representan un peligro para los seres humanos en el sitio o la comunidad. Adems, no se emplean sustancias qumicas peligrosas. Los nutrientes que se aaden para que las bacterias crezcan son fertilizantes de uso corriente en el csped o el jardn (ITGE, 1995). En conclusin el uso de tcnicas biolgicas puede reducir fuertemente los costos de remediacin de sitios contaminados (Lodewyckx y Mergeay, 2002). La biorremediacin constituye una alternativa biolgica, econmica y socialmente aceptable por su bajo costo y eficiencia, en el tratamiento de suelos y acuferos contaminados por metales pesados e hidrocarburos (Vsquez, 2002). Las estrategias de descontaminacin basadas en el empleo de plantas se encuentran entre las tcnicas ms recientemente usadas para la reduccin de contaminantes 'in situ' (Kan et. al., 2000). 2.2.3 Fitorremediacin. La utilizacin de plantas para la descontaminacin de los suelos se denomina en forma genrica fitorremediacin, siendo una tcnica que utiliza las plantas acumuladoras e hiperacumuladoras para extraer e inmovilizar los contaminantes del suelo y las aguas (Becerril et al., 2002). Esta tcnica in situ, sin levantamiento de la zona contaminada, permite tratar: suelos afectados, lodos, sedimentos, adems de las aguas y tambin las zonas hortcolas, a travs de, supresin, degradacin o estabilizacin del contaminante (Kaemmerer, 2003).
La fitorremediacin es una tecnologa que deriva de mtodos botnicos y biogeoqumicos, y utiliza a diversas especies (plantas y microorganismos) para degradar, extraer, inmovilizar y recuperar los suelos contaminados y cualquier otro tipo de material que contenga contaminantes (Evanko y Dzombak, 1997) citados por Flocco (2004). La idea de utilizar plantas con alta capacidad de acumular metales, para removerlos selectivamente del suelo cuando se encuentran en exceso, fue propuesta por R. Chaney y otros autores en 1983, pero a partir de 1990 tuvo aceptacin (Higueras, 2004). La fitorremediacin como tcnica de tratamiento de sitios contaminados es econmica y representa otras ventajas como la conservacin del suelo superficial, previene la migracin y lixiviacin de los compuestos txicos por el movimiento del agua en el suelo, puesto que la secrecin o sntesis de exudados por la rizosfera motivan el crecimiento de diversos microorganismos como hongos y bacterias que desdoblan contaminantes (Castrillo, 2004). 2.2.3.1. Tcnicas de Fitorremediacin. Las tcnicas clsicas para la descontaminacin de metales pesados son muy limitadas y prcticamente inexistentes para su eliminacin selectiva (Becerril et al., 2002). La Fitorremediacin comprende diferentes modalidades, aplicables bajo distintas circunstancias. Se pueden distinguir seis vas de accin: Fitoextraccin (fitoacumulacin), Fitoestabilizacin (fitorestauracin), Rizofiltracin, Fitovolatilizacin, Fitodegradacin (fitotransformacin), Fitoestimulacin (rizodegradacin). a) Fitoextraccin La fitoextraccin de metales pesados es una de las tecnologas ms prometedoras por su relativa efectividad y la gran dimensin ambiental y social de la contaminacin. Las plantas hiperacumuladoras tienen la habilidad de tomar y tolerar altos niveles de metal en sus tallos, por lo que ellas constituyen las herramientas potenciales para la fitoextraccin (McGrath et al., 1993; Baker et al., 1994; McGrath, 1998; Schwartz y Morel, 1998) citados por Perronet (2003). Segn Garbisu et al. (2002b), las caractersticas de una planta empleada en la fitoextraccin pueden resumirse en: Tolerancia a niveles elevados de metales pesados. Acumulacin razonablemente elevada de niveles de metales pesados. Rpido rango de crecimiento. Alta produccin de biomasa en campo. Sistema radical profuso.
b) Fitoestabilizacin La fitoestabilizacin es el uso de determinadas especies de plantas para inmovilizar contaminantes en suelos y aguas subterrneas mediante la absorcin y acumulacin de estos en las races, o a travs de la precipitacin de estos en la rizsfera, y estabilizacin fsica de los suelos. Estos procesos reducen la
movilidad de los contaminantes y previenen la migracin de los mismos hacia las aguas subterrneas y la superficie. Estas tcnicas pueden ser usadas para restablecer la vegetacin de cobertura en sitios donde la vegetacin natural ha sido eliminada por las altas concentraciones de metales pesados (ITRC, 2001). c) Rizofiltracin La rizofiltracin consiste en la adsorcin o precipitacin de contaminantes en las races de las plantas o la absorcin de contaminantes circundantes en la zona radical. La rizofiltracin puede aplicarse como una tcnica de Fitorremediacin ex situ, dnde el tratamiento consiste en proporcionar el agua contaminada a ser tratada hacia el rea donde las plantas son cultivadas similares a un sistema de hidropona donde las plantas se siembran sobre un lecho artificial. Una vez que las plantas han desarrollado su sistema de races, el agua contaminada se desva del sitio desechado hacia las plantas. Cuando las races de las plantas se saturan con los contaminantes las plantas se cosechan y se reemplazan por un nuevo cultivo (EPA, 2000). d) Fitovolatilizacin La fitovolatilizacin consiste en la captacin y transpiracin de un contaminante por la planta, con la subsiguiente liberacin del contaminante modificado hacia la atmsfera. Esta tiene lugar en rboles y otras plantas que toman agua y contaminantes orgnicos e inorgnicos. Algunos de estos contaminantes pueden pasar a travs de las plantas hacia las hojas y volatilizarse en la atmsfera a concentraciones relativamente bajas, muchos de los componentes orgnicos transpirados por la plantas son posteriormente fitodegradados (ITRC, 1999; EPA, 2000). e) Fitodegradacin La fitodegradacin comnmente llamada fitotransformacin consiste en la separacin de los contaminantes que son tomados por la planta durante los procesos metablicos, o la separacin de contaminantes externos mediante efectos sinrgicos, a travs de enzimas producidas por las plantas. Los contaminantes son degradados y usados como nutrientes e incorporados a los tejidos vegetales. En algunos casos en forma de metabolitos secundarios o productos finales son reincorporados al ambiente dependiendo del tipo de contaminante y la especie de planta (Suresh y Ravishankar, 2004). f) Fitoestimulacin (Rizodegradacin)
La fitoestimulacin llamada tambin rizodegradacin, o biodegradacin rizosfrica, consiste en la captacin del contaminante en el suelo gracias a la elevada actividad microbiana de los microorganismos rizosfricos (algas hongos y bacterias) que consumen y degradan o transforman sustancias orgnicas. Ciertos organismos pueden degradar sustancias orgnicas como gasolina o solventes que son peligrosos para los humanos y eco-receptores y convierten estos en productos menos peligrosos. Las sustancias naturales liberadas por las races de la planta como azcares, alcohol y cidos contienen carbn orgnico que acta como fuente de nutrientes para los microorganismos del suelo, estos nutrientes adicionales estimulan su actividad (EPA, 2000). La fitorremediacin puede ser aplicada en grandes superficies con un costo relativamente bajo con respecto a otras tecnologas de remediacin. Se puede limpiar y reducir dramticamente los niveles de contaminacin junto con la preservacin de la superficie del suelo. La utilizacin de las tecnologas de fitorremediacin resultan tiles para el reciclado de los metales extrados. Es una tecnologa que se puede aplicar para un amplio rango de metales, radionucletidos y orgnicos. La necesidad de excavar el suelo puede ser minimizada o eliminada (Perronet, 2003).
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2.2.3.2. Plantas Hiperacumuladoras. El caso ms representativo y til para las tcnicas de fitorremediacin, lo constituyen las plantas denominadas hiperacumuladoras, capaces de tolerar, tomar y acumular en sus tejidos areos, elementos esenciales para los cultivos (Fe, Mn, Zn, Cu, Mg, Mo, Ni) y elementos no esenciales o con funciones biolgicas an por determinar (Cd, Cr, Pb, Ag, Se, Hg) alcanzando elevadsimas concentraciones que resultan txicas para la mayora de las plantas (Garbisu y Alkorta, 2001). Las plantas que hiperacumulan metales han llamado la atencin desde hace tiempo como indicadoras geobotnicas de depsitos de minerales. Actualmente se estudia la posibilidad de extraer metales del suelo y concentrarlos en las partes areas de las plantas, lo que proporciona una aplicacin prctica de la fitorremediacin. Estas plantas representan un modelo para estudiar los mecanismos de acumulacin de metales como tambin su tolerancia y detoxificacin (Garbizu et al., 2003). Se habla de plantas acumuladoras e hiperacumuladoras cuando determinadas especies toleran 10-100 veces ms los valores normales de un determinado elemento, o sea (0,1 y 1 ppm respectivamente) en tejidos vegetales en base a materia seca. En condiciones experimentales, se alude a valores de absorcin diez veces superiores a los alcanzados por las mismas plantas utilizadas como testigo. La hipertolerancia es esencial para que el fenotipo hiperacumulacin aparezca en plantas hiperacumuladoras naturales, logrndose por detoxificacin interna y probablemente incluya la compartimentacin y acomplejacin (McGrath y Zhao, 2003). Segn Berazan (1999), entre los mecanismos que definen la capacidad de acumular metales pesados se encuentran aquellos que estn ligados a cierto nivel taxonmico como es el inter-especfico; por ejemplo, las subespecies o variedades de una especie que crezcan sobre rocas serpentinitas se comportan similarmente, es decir todos estos niveles tienen un comportamiento igual, o son acumuladores o no lo son. Se definen como posibles mecanismos fisiolgicos que fundamentan la hiperacumulacin, los siguientes (Boominathan y Doran, 2003): Como las vacuolas vegetales son los mayores depsitos de cidos orgnicos, las asociaciones de stos con los metales sugieren la existencia de la detoxificacin metlica por secuestracin vacuolar, enlazamiento con la pared celular y localizacin en el apoplasto. Los mayores inconvenientes que presentan las plantas nativas hiperacumuladoras de metales son sus relativamente bajas biomasas, lentas tasas de crecimiento y el desconocimiento que hay de plantas hiperacumuladoras de determinados contaminantes metlicos como el arsnico y el plomo (Vsquez, 2002). Las plantas hiperacumuladoras de metales son un grupo pequeo de especies (hay unos 400 identificadas de momento) capaces de absorber a travs de las races y transportar a sus partes areas concentraciones muy elevadas de metales. Hasta la fecha se han estudiado, de forma detallada, slo un nmero muy reducido de estas (Garbisu et al., 2003). 2.3. Biodisponibilidad. La capacidad de absorcin de las plantas con respecto a metales pesados es variable, lo que abre la posibilidad de adaptar la eleccin de cultivos segn el grado y tipo de contaminacin. Por lo general, las cantidades mayores de metales pesados se acumulan en las hojas, mientras que los contenidos ms bajos se encuentran en las semillas. La absorcin de metales pesados en las plantas (especialmente
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cadmio y plomo) vara segn la biodisponibilidad del suelo y otros factores segn (Iretskaya y Chien, 1999) citados por De Zeeuw y Lock (2000). El concepto de biodisponibilidad se encuentra ntimamente relacionado con las condiciones fisicoqumicas del ambiente, que determinan la especiacin y por lo tanto la concentracin de metal libre y lbil (Magnarelli, 2002). Esta biodisponibilidad de elementos qumicos en el suelo depende tanto de la concentracin del elemento como de su movilidad respecto a la actividad de la planta. Esto es a su vez funcin del pH, la capacidad de cambio de bases, y la presencia de agentes acomplejantes. Las races, adems de captar las sales disueltas pueden absorber material unido a la superficie de partculas plsticas, en parte debido al efecto de microambientes cidos generados por la races y en parte por fenmenos de cambio de bases. 2.3.1. Bacterias Diazotrficas. Las bacterias fijadoras asociativas colonizan la rizosfera y/o el interior de las clulas corticales de las plantas hospederas, penetran la endodermis colonizando los vasos conductores. Estas bacterias pertenecen principalmente al grupo de las Beta-proteobacterias y estn incluidas en diferentes gneros. Las plantas hospederas de estas bacterias son generalmente monocotilednias (Kennedy et al., 2004). Dentro de estas bacterias, pueden ser citados algunos gneros que pueden establecer relaciones de tipo endfitas con las gramneas: Azospirillum Gluconacetobacter, Herbaspirillum, y Burkholderia (Baldani, 2004). La primera especie de Azospirillum fue descrita por Beijerinck en 1925. En 1976 J. Doberreiner y JM Day aislaron esta bacteria y fueron los primeros en relatar que la misma estaba presente en las rizosferas de diversas gramneas tropicales (Bashan et. al., 2004). Posterior a este redescubrimiento, se impulsaron una serie de estudios en todo Brasil y el mundo, siendo actualmente uno de los temas investigativos ms abordados; en la actualidad se han identificado otros gneros y otras especies fijadoras de nitrgeno, en el cultivo del arroz, en la caa de azcar, en plantas forrajeras, pastos (Eckert et al., 2001). Resultado obtenidos por diversos investigadores demuestran que la inoculacin de diazotrficos es capaz de promover el crecimiento de la planta hospedera por mecanismos actualmente desconocidos, pero se ha estudiado que predominan aumentos en la biomasa foliar y en el desarrollo radical. El concepto de PGPR comprende bacterias colonizadoras de las rizosferas, originalmente se llamaron Rizobacterias Promotoras de Crecimiento de Plantas (RPCP). El gnero Azospirillum ha sido ampliamente estudiado como bacteria PGPR (Klopper, 2003). 2.4. Caracterizacin de las especies seleccionadas.
1. Especie: Cyperus gigantus L.

Nombre comn: Farolito chino, quitasol chino, paraguita. Familia: Cyperaceae. Descripcin botnica y distribucin: Planta herbcea, tallos de 50-150 cm de alto y 5-20 mm de grosor en la base. Brcteas 18-20, iguales en longitud, de 20-50 mm de ancho. Hojas reducidas a
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vainas; radios (18-20) ramificados de hasta 10 cm de largo. Es una planta oriunda de frica o Madagascar, introducida en los trpicos como ornamental en fuentes y jardines (Len, 1946). Hbitat y usos: Se encuentra a orillas de ros y zonas inundadas, pueden comerla los animales (Roig, 1965).
2. Especie: Cynodon dactylon (L.) Pers.

Nombre comn: Grama, hierba fina, bermuda. Familia: Poaceae. Descripcin botnica y distribucin: extensamente rastrera; vainas pelosas en el extremo; espigas 3-5, delgadas, de 2.5-5 cm, espiguillas de 2 mm; lemma ms larga que las glumas. Se encuentra en toda Cuba y regiones clidas y templadas (Len, 1946). Hbitat y usos: Muy comn en terrenos abiertos; se usa como csped y como pasto. Su polen puede producir reacciones alrgicas y los rizomas se usan como diurticos (Roig, 1965).
3. Especie: Xanthosoma cubense (Rich.) Schott.

Nombre comn: Malanga cimarrona, malanguilla. Familia: Araceae. Descripcin botnica y distribucin: Hierba grande; hojas pedatisectas de 25 cm y 39 cm de ancho, los 5 lbulos enteros, brevemente acuminados y estrechados en la base, dejando los senos visibles. Peciolo craso de unos 26 cm sin la vaina, esta de 15 cm o ms. Pednculos basales libres en la vaina. Espdice de unos 10-12 cm, enteramente envuelto en la espata, el limbo de esta de longitud doble del tubo. Es una planta endmica que se distribuye naturalmente en toda Cuba (Len, 1946). Hbitat y usos: Silvestre en terrenos hmedos de todo el pas y al pie de sierras calcreas y entre rocas (Roig, 1965).
4. Especie: Typha dominguensis (Pers.) Kunth.

Nombre comn: Maco, espadaa, vela de sabana, pelusa. Familia: Typhaceae. Descripcin botnica y distribucin: Hierba de 1-2 m de alto. Hojas lineares, planas, alargadas y esponjosas. Inflorescencia en una densa espiga de color castao de 15-40 cm. Distribuida en toda Cuba, Antillas y Amrica del Sur hasta la Patagonia (Len, 1946). Hbitat y usos: Abundante en lugares pantanosos, ros y caadas. Con los pelos sedosos de las espigas se pueden confeccionar almohadas (Roig, 1965).
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2.5. El enfoque agroecolgico en la investigacin. La Agroecologa sugiere la aplicacin de principios ecolgicos en el diseo de agroecosistemas sustentables, as como tomar en consideracin no slo estas dimensiones ecolgicas y tcnicas, sino tambin las econmicas, sociales y culturales asociadas a la produccin agrcola (Hecht 1997, Altieri, 1999 y Naredo 2001; citados por lvarez, 2005). En su versin fuerte la Agroecologa, asume el compromiso tico socio-ambiental a favor de los agricultores campesinos, como actores sociales protagonistas del necesario proceso de transicin hacia una agricultura sostenible. La adopcin de tcnicas basadas en principios ecolgicos depende decisivamente de la percepcin que los campesinos tienen de los problemas, as como de su saber, sus expectativas, intereses y prioridades, en la medida que se encuentran inscritos en una determinada matriz de accin comunitaria, asociativa o cooperativa, y en el contexto de una determinada poltica de desarrollo agrario (Sevilla, 2002). El grado de resistencia y estabilidad de los agroecosistemas no est estrictamente determinado por factores de orgenes biticos o ambientales, sino que intervienen tambin factores sociales. Por tanto, los factores sociales (internos y externos) de los agroecosistemas, influyen condicionan y determinan su funcionamiento y desarrollo y de manera potenciada depender el desarrollo sostenible (Freyre, 1997), la problemtica agroecolgica considerando la significacin de las Ciencias Sociales nos llevar a reconocer la unidad del sistema productivo en sus mltiples interacciones de dismiles factores. Si bien se reconoce que la biodiversidad es tal vez el atributo ms importante de la sustentabilidad ecolgica del agroecosistema, la Ciencia Social en base a la Agroecologa, realiza una contribucin destacada a la sustentabilidad agrcola convencida de que esta ltima, est indisolublemente vinculada a procesos econmicos, sociales, y culturales, adems de los ecolgicos (Freyre, 1997). 2.5.1. Los mtodos participativos en la investigacin cientfica. La perspectiva de la investigacin participativa (IP) propone que diferentes grupos de personas con diferentes intereses sobre una misma tecnologa estn involucradas en su desarrollo y participen piensen y reaccionen en funcin de ella (Hecht, 1997). Los enfoques de investigacin participativa estn basados en nociones de aprendizaje interactivo, donde el conocimiento generado por la ciencia formal y de los usuarios locales se va construyendo uno sobre otro, en un proceso de retroalimentacin continua. Como resultado, las estrategias utilizadas para "hacer" la investigacin participativa evolucionan de manera diferente a las utilizadas para la investigacin formal. Los procesos de investigacin participativa involucran a usuarios de tecnologas, personas que tienen diferentes intereses, perspectivas, acceso a recursos por gnero, objetivos y necesidades especficas. La IP que enfatiza sobre estas diferencias tiene una mejor oportunidad de lograr los objetivos de incrementar la equidad, influencia y capacidad de innovacin (Hagmann et al., 1998 citado por Pinzn, 2006). Usos de la Investigacin Participativa. Generar conciencia del estado de un recurso. Movilizar a las personas hacia la accin comunitaria. Evaluar las necesidades y desarrollar micro-planes. Agregar valor a las soluciones locales. Incorporar las preferencias y perspectivas locales. Monitorear las iniciativas tomadas. Evaluar los impactos de las acciones e innovaciones.
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La evaluacin del impacto de la Investigacin Participativa y Anlisis de Gnero (IPAG) requiere de innovacin en los procedimientos, de mtodos, indicadores y procesos acordes a la tarea. De herramientas que "ayuden a entender" procesos que estn normalmente escondidos o que tienen lugar en escalas espaciales o temporales que no estn accesibles a la experiencia humana". Las herramientas desarrolladas para evaluar las iniciativas de la IPAG en el desarrollo de tecnologa deben ser tan claras para los usuarios de las tecnologas e innovadores locales como lo son para los agricultores (lvarez, 2005). Los mtodos participativos facilitan espacios para la socializacin e intercambio de conocimiento as como las experiencias entre los grupos de actores sociales Sin embargo, todava existe preocupacin, debido a que algunos mtodos participativos desarrollados y utilizados por los agentes de investigacin y desarrollo (I&D) tienden a propiciar sociedades desiguales (Hecht, 1997). Conforme pasa el tiempo y conforme los agentes obtienen experiencia en los procesos participativos, se deben poner a disposicin ms mtodos e instrumentos efectivos para motivar y facilitar la participacin y el aprendizaje interactivo. Estos mtodos deben ser efectivos y apropiados para situaciones y culturas especficas y adaptadas en forma diferenciada a las necesidades de los gneros, grupos generacionales, tnicos y a su nivel de ingreso (hombres, mujeres, adultos mayores, jvenes, agricultores a pequea y gran escala). Una realidad comn a muchos espacios rurales es la interculturalidad, dimensin que tiene que ser incorporada tanto en la perspectiva de trabajo como en los instrumentos a ser usados, es decir, tener siempre presente que la realidad no es homognea (Hagmann et al., 1998 citado por Pinzn, 2006). III. Materiales y Mtodos. 3.1. Caractersticas del rea experimental. El rea experimental se encuentra ubicada en Ave 47, circunscripcin 25 del consejo popular Jamaica, municipio San Jos de las Lajas, La Habana. La misma recibe los vertimientos de los residuales de la produccin de la Empresa Cermica Blanca Adalberto Vidal caracterizada por la presencia de metales txicos debido a que en ella, son vertidos diariamente, desechos de la produccin que provocan contaminacin (FITOPLANT, 2007). Se tom como referencia la seleccin del rea de estudio establecida por el grupo interdisciplinario de investigacin FITOPLANT de la Facultad de Agronoma, de la Universidad Agraria de la Habana (UNAH). Se emplearon mtodos participativos para el diagnstico del rea la cual presenta una extensin aproximada de una hectrea (10000m2) con una pendiente de 1-1,5% (Guzmn 2006). El suelo es, Ferraltico lixiviado amarillento tpico etrico profundo arcilloso (Hernndez, 1999). 3.2. Anlisis de las Rizosferas (suelo). Durante el muestreo de plantas (epgrafe 3.3) se tomaron muestras de rizosferas (suelo con radio 5 cm alrededor de las rizosferas incluyendo esta) en el rea experimental, a dos distancias de la fuente de contaminacin (50 y 200 m), utilizando como punto de referencia la carretera central. En cada una de ellas se seleccionaron dos puntos aleatorios para el muestreo (Robert y Henry, 2000) a dos profundidades (020 y 2040 cm). Las muestras fueron procesadas en el laboratorio de qumica de la Facultad de Agronoma (UNAH). Se secaron a temperatura ambiente durante siete das y se tamizaron empleando un tamiz de 2 mm.
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De las muestras tamizadas de cada punto de muestreo, se tomaron 0,5 g y se maceraron. Posteriormente se procedi a realizar una digestin en cido clorhdrico, cido perclrico y cido ntrico (3:1:1) segn procedimientos descritos por Alloway (1995). La solucin mineral obtenida se utiliz para determinar la presencia de metales seudototales, mediante espectrometra de absorcin atmica, en un equipo SP9, en la Universidad Central de las Villas. 3.2.1 Anlisis estadstico del los metales pseudo-totales procedentes de las rizosferas. En el procesamiento estadstico de 8 (Fe, Pb, Zn, Cu, Ni, Co, Mn, Cr) metales provenientes de las rizosferas de las plantas, se emple como base de los anlisis a Statgraphics Plus 5.1 (2001), en anlisis Factorial con diseo 2:2 totalmente aleatorizado donde los factores fueron la profundidad y la distancia, as como su interaccin y las variables respuestas los metales. Se analiz adems mediante una regresin multifactorial los factores principales para Pb y Zn y se emple un anlisis de correlacin entre los metales para verificar relaciones de influencia. En las determinaciones se emplearon tres rplicas y el nmero de muestras fue 12, y para la comparacin de las medias se utiliz la prueba de Tukey al 5% de probabilidad. 3.3. Anlisis del material vegetal. A partir de un inventario de vegetacin del rea realizado por Quevedo (2006), se seleccionaron para su estudio las cuatro especies predominantes: Cynodon dactylon (L.) Pers., Cyperus gigantus L., Typha domiguensis (Pers.) Kunth. y Xanthosoma cubense (Rich.) Schott. El muestreo se realiz en octubre de 2007. Se colectaron 4 muestras para cada especie, aproximadamente un kilogramo de raz, tallo y hoja respectivamente. Las muestras fueron lavadas con abundante agua destilada y se secaron a 60 0C por 96 horas. Se tomaron 0,5 g de cada muestra, se maceraron y se digirieron en cido clorhdrico, cido perclrico y cido ntrico (3:1:1) (Alloway, 1995). El contenido de metales pesados en las plantas se determin de igual forma que para el anlisis de suelo. 3.3.1. Anlisis estadstico de muestras vegetales. Para el procesamiento estadstico de los resultados en el anlisis de las muestras vegetales se emple como base de estos anlisis a Statgraphics Plus 5.1 (2001) en un diseo experimental que estimar los efectos de 2 factores categricos. El diseo es un anlisis factorial estndar y analiza todas las combinaciones de los niveles de los factores. Hay un total de 32 ejecuciones en el diseo totalmente aleatorizado, donde los factores fueron las especies y las partes de las plantas. En las determinaciones se emplearon cuatro rplicas y para la comparacin de las medias se utiliz la prueba de Tukey al 5% de probabilidad. 3.4. Aislamiento de microorganismos rizosfricos. Debido a la predominancia de C. dactylon sobre el resto de las especies vegetales estudiadas y de acuerdo con los resultados obtenidos en la determinacin de metales pesados en las hojas as como su importancia econmica, esta especie fue seleccionada para realizar el aislamiento de microorganismos rizosfricos. Al realizar el lavado de las muestras de races de esta especie, posterior a la colecta (epgrafe 3.3) se reserv el material residual para analizar la poblacin microbiana de la rizosfera. Las muestras se colocaron en erlenmeyers que contenan 500 mL de agua destilada y se sometieron a agitacin en zaranda durante una hora y treinta minutos.
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Para el aislamiento de los microorganismos rizosfricos, se utiliz el mtodo de las diluciones cuantitativas y la siembra en placas Petri segn Novo (1983) y Atlas y Bartha (2002). Los medios de cultivo empleados fueron: Saboroud Dextrosa (10 g peptona micolgica; 40 g dextrosa; 15 g/l agar) Agar Almidn Amoniacal (1g K2HPO4; 0,5 g Mg SO47H2O; 2,0 g (NH4)2SO4; 0,5 g KCl; 0,01 g FeSO4; 15 g/l agar; pH 7,6-7,8) y Agar Nutriente (5,0 g peptona bacteriana; 1,0 g extracto de carne; 2,0 g extracto de levadura; 5,0 g cloruro de sodio; 15 g agar) para el aislamiento de hongos, actinomicetos y bacterias, respectivamente. Se prepararon diluciones a concentraciones de 10-2,10-4,10-6 y se tom 0,1 mL de cada una, para la siembra en placas Petri que contenan 20 mL de los medios de cultivo descritos anteriormente. La siembra se realiz por extensin con esptula de Diwralsky. Las placas fueron incubadas a 37 0C durante 120 hrs., para bacterias y de 1 semana hasta 10 das para hongos a 280C. Se aislaron los diferentes grupos microbianos segn las caractersticas de la colonia. Las colonias fueron agrupadas segn su morfotipo y grupo microbiano, purificadas y replicadas. Se realiz la descripcin morfolgica. Para ello se emplearon las tcnicas descritas en el Manual de Prcticas de Laboratorio de Microbiologa (Novo, 1983 y Atlas y Bartha, 2002). Las colonias aisladas fueron conservadas a 4 0C para su posterior uso mediante su liofilizacin. 3.5 Seleccin de morfotipos bacterianos ms resistentes a niveles de concentracin de metales pesados en condiciones controladas. Los liofilizados bacterianos, fueron trasladados hasta los Laboratorios de Gramneas de Embrapa Agrobiologa, Ro de Janeiro, Seropdica, Brasil. Donde se continu estudios. Todas las colonias bacterianas fueron inoculadas en erlenmeyers de 250 mL que contenan 50 mL de caldo nutriente suplementado con metales pesados. Previamente preparado con una solucin de agua destilada y bidesionizada, estril, y de soluciones separadas de los cationes ZnCl2, PbCl2, en las concentraciones 0,5 mM, 1 mM, 2 mM, respectivamente. El pH fue ajustado previamente hasta 6,5 adicionando HCl diludo, para no interferir con las soluciones de los diferentes cationes. Estas soluciones fueron tomadas de soluciones de reserva de cada metal con una concentracin de 3 mM. Los erlenmeyers con las bacterias fueron incubados durante 24 hrs a 200 rpm en zaranda a una temperatura de 30 0C. Las colonias que lograron desarrollarse en estas condiciones fueron determinadas por la turbidez, frente a un control el cual solo contena medio de cultivo lquido sin inculo. Luego fueron aisladas nuevamente aquellas que se desarrollaron similarmente en los tres tratamientos, y se conservaron en refrigeracin en agar nutriente a 4 0C. 3.6 Seleccin de diazotrficos. Con el objetivo de seleccionar de los morfotipos resistentes a metales pesados, aquellos que pudieran vincularse a C. dactylon en un sistema planta-microorganismo. Se determin para primeros ensayos, la bsqueda de bacterias diazotrficas (Baldani et al., 1999 y Baldani, 2008). Las bacterias aisladas fueron inoculadas en recipientes de vidrio que contenan 5ml de los medios semislidos: -JMV (5g Manitol, 6ml sol. 10% (K2HPO4),18ml sol. 10% (KH2PO4), 2ml sol. 10% (MgSO4.7H2O),1ml sol. 10% (NaCl), 2ml sol. 1% (CaCl2. 2H2O), 2ml Azul de bromotimol sol. 0,5% (0,2N de KOH), 4ml sol. 1,64% FeEDTA, 2ml Sol. de micronutrientes para medios de cultivos, 1ml de sol. de vitaminas para medios de cultivos, 100 mg Extrato de levedura), adicionar 1,6 g de agar por litro y ajustar el pH 5,0 a 5,4 (Baldani et al., 2000). -LGI (sacarosa, 5ml sol. 10% K2HPO4, 2ml Sol. 10% KH2PO4, 6ml sol. 10% MgSO4.7H2O, 2ml sol. 1% CaCl2.2H2O, 2ml sol. 10%; Na2Mo4.2H2O, 0,002 mL soluo de azul de bromotimol (0,5% 0,2 KOH), 5;
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solucin de FeEDTA (solucin 1,64%), 4; solucin de vitaminas 1ml; pH 6 (Dbereiner et al., 1995 citado por Baldani, 1996). -LGI-P 100g azcar cristal, 2ml sol. 10% K2HPO4, 6ml sol. 10% KH2PO4, 2ml sol. 10% MgSO4.7H2O, 2ml sol. 1% CaCl2.2H2O, 1ml sol. 1% FeCl3.6H2O, 2ml sol. 0,1 % Na 2MoO4. 2H2O, 5ml Azul de bromotimol sol. 0,5% (0,2 N de KOH), 1ml de sol. de vitaminas para medios de cultivos, ajustar el pH a 5,5 com cido actico sol. 10 % (Baldani, 1996). -JNF-b 5 g cido Mlico, 6 ml sol.10%K2HPO4, 18 ml sol.10% KH2PO4, 2 ml sol.10% MgSO4.7H2O, 1ml sol.10% NaCl, 2ml sol.1% CaCl2.2H2O, 4ml (sol.1 1, 64%) FeEDTA, 2ml Azul de bromotimol 0,5% (0,2N de KOH), 1ml de sol. de vitaminas para medios de cultivos, 2ml de sol. de micronutrientes para medios de cultivos, 4,5g KOH, adicionar 2,5 g de Agar y ajustar el pH a 5,8 (Baldani, 1996). -NFB 5 g cido mlico, 5 ml sol. 10% (K2HPO4), 2 ml sol. 10% (MgSO4.7H2O), 1 ml sol. 10% (NaCl), 2 ml sol. 1% (CaCl2.2H2O), 4 ml sol. 1,64% FeEDTA, 2 ml Azul de bromotimol 0,5% (0,2N de KOH), 2 ml Sol. de micronutrientes para medios de cultivos, 1 ml Sol. de vitaminas para medios de cultivos, 4,5 g KOH, adicionar 2,5 g de agar y ajustar el pH 6,5 (Baldani,1996). - medio mnimo como control (Baldani, 1996). 1 ml sol.10%K2HPO4, 4 ml sol.10% KH2PO4, 2 ml sol.10% MgSO4.7H2O, 1ml sol.10% NaCl, 0,1 ml (sol.1 1, 64%) FeEDTA, 0,286g NH4NO3, 5ml Azul de bromotimol 0,5% (0,2N de KOH), 1ml de sol. de vitaminas para medios de cultivos, 2ml de sol. de micronutrientes para medios de cultivos, 4,5g KOH, adicionar 2,5 g de Agar y ajustar el pH a 6,7 Los cultivos fueron incubados a una temperatura de 35 0C, durante 7 das, conforme lo descrito por Dbereiner (1980) y Baldani (1996) luego se seleccionaron los recipientes donde se observ el desarrollo de una pelcula por debajo de la superficie, la misma, indicadora de caractersticas diazotrficas. Los microorganismos fueron aislados nuevamente y sembrados en placas Petri que contenan los mismos medios descritos pero slidos. Se comprob el desarrollo de colonias idnticas a los aislamientos iniciales a travs de la descripcin morfolgica y empleando tincin de Gram. IV. Resultados y Discusin. 4.1- Contenido pseudo-total de metales pesados en las rizosferas de las plantas. En la Figura 1 se muestran los valores pseudo-totales de los metales determinados en las rizosferas de las plantas muestreadas tanto en profundidad como en distancia.
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Figura 1. Niveles pseudo-totales de metales pesados en las rizosferas de las plantas muestreadas. En la figura Datos transformados Log10, a y b Letras desiguales difieren significativamente segn Tukey para valores con un 95% de confianza. (NS) sin diferencias significativas. (**) Escala real de valores de concentracin (Fe, Pb, Zn) independientes, (Co, Cr, Mn) y (Cu y Ni) comparten las mismas escalas y se corresponden con los valores de (MG), media geomtrica de la concentracin a 50 y 200 metros de la fuente de contaminacin. CV% coeficiente de variacin, Sx error estndar de la media, muestra diferencias significativas segn las letras en figura, en al menos uno de los factores analizados. Como se observa, los niveles de concentracin de los metales es muy variable, esto se encuentra relacionado con el origen de cada metal en el lugar analizado, ya sea por las caractersticas naturales del suelo o por la influencia antrpica (Kabata-Pendias y Pendias, 2001). Los metales pesados analizados en las rizosferas en el rea de estudio presentaron diferentes concentraciones medias y mostraron el siguiente orden Pb>Zn>Fe>Co>Cr>Mn>Ni>Cu. La concentracin de Pb (104288.33) se encontr 16 veces mayor que el Zn (9536.68), y este est 3.15 veces ms concentrado que el Fe (2156.75). Los niveles de Co, Cr, Mn (128.33, 112.67, 106.34) respectivamente, duplican a los contenidos de Cu y Ni (67.83 y 54.75), estos ltimos los de menor concentracin; todos los valores medios estn expresados en mgKg-1 de MS de suelo. De los tres elementos mayoritarios (Pb, Fe, Zn) al Pb no se le conoce alguna funcin especfica en el metabolismo, por tanto su presencia en valores muy pequeos por encima de los niveles permisibles provoca un efecto txico en el ecosistema (Ross, 1995). Por otra parte el Fe y el Zn son micronutrientes y su toxicidad est dada cuando estos son acumulados por encima de los niveles en que normalmente se acumulan en las plantas (Alloway, 1995).
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Teniendo en cuenta los diferentes criterios a nivel mundial (Anexo1) de acuerdo a los niveles de concentracin de los elementos traza analizados, los valores medios de Pb y Zn se encontraron muy elevados en ambas distancias estudiadas, pues estos son mayores en varios ordenes segn los valores obtenidos por Soares (2004), Souza (2006) y Peris (2006) para suelos agrcolas, residencial, industrial y con influencia de lodos, los cuales pueden ocasionar efectos fitotxicos a las plantas, adems de causar graves daos al ecosistema en general. Para el caso del Fe, las concentraciones se encontraron en valores normales debido a que es uno de los elementos que presenta mayor concentracin en el horizonte A de los suelos Ferralticos, con valores que pueden variar de 2800 a 3000 mgKg-1 MS de suelo (Hernndez et al., 2004). De manera general, las concentraciones de los elementos Mn, Cu, Cr, y Ni se encontraron en valores normales segn los valores permisibles propuestos por la literatura (Anexo1). Para el Mn, la concentracin de 106.34 mgkg-1 MS de suelo puede considerarse como normal teniendo en cuenta que la presencia de ste elemento segn un estimado realizado por Kabata-Pendias y Pendias (2001) para una amplia variedad de suelos se encuentra en el rango de 20 a 3000 mgkg-1. Los contenidos de Cu, Cr (Figura1) se encontraron en niveles de concentracin normales para valores de suelos Agrcolas, residenciales, industrial, y con influencia de lodos, teniendo en cuenta los criterios de niveles aceptables de Soares (2004), Souza (2006) y Peris (2006) (Anexo1). Es de destacar en el caso particular del Ni que estos valores medios se consideran algo elevados para los suelos agrcolas de acuerdo con Soares (2004), mientras que para suelos residenciales, industriales, otros suelos y con influencia de lodos residuales segn Souza (2006) y Peris (2006) el mismo valor es considerado como normal. En el caso del Co (128.33 mgkg-1 MS de suelo), la concentracin media de este elemento se determin fuera del rango aceptable (Anexo1). El mismo es un micronutriente que generalmente se encuentra deficiente en los suelos, segn Vzquez et al. (2002) los niveles varan en funcin del material originario; algunos resultados han indicado que generalmente tiene origen litognico, y por tanto, pudiera encontrarse como metal acompaante unido con los xidos de Fe dada su afinidad con el mismo, adems, se parece a l en muchas propiedades. De color gris o blanco rojizo, y algunos de sus derivados de color azul (azul cobalto) se usan como colorantes en la fabricacin de vidrios, esmaltes y pinturas (Adriano, 2001). Pudiera ser que sea usado como parte de los pigmentos empleados en el revestimiento de pisos en la planta No2, lo cual habra que estudiar con mayor profundidad. Teniendo en cuenta que el rea en estudio se encuentra afectada por los residuos de la Empresa Cermica Alberto Vidal, y de acuerdo a los resultados obtenidos, se hace necesario establecer valores de referencia para los suelos del municipio y la provincia (los mismos no existen actualmente en el pas) de manera tal que se pueda conocer el posible origen de cada metal, para delimitar si este proviene de la actividad antrpica o forma parte de la composicin minerolgica de los suelos. Como los elementos Pb y Zn fueron detectados como los principales metales contaminantes en esta rea, se realiz un anlisis ms detallado de cada uno en funcin de la distancia y la profundidad. Segn el anlisis estadstico (Figura 2) de factores principales, tanto en distancia como en profundidad, existen diferencias significativas en la variacin de la concentracin del Pb en el rea estudiada. Los mayores valores de concentracin altamente significativos (P=0.0000) se encontraron a los 50 metros de la fuente de contaminacin, por tanto, a medida que nos alejamos de dicha fuente hasta llegar a los 200 metros de distancia, los niveles de Pb seudo-totales disminuyen.
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Smith (1996) y Mahvi et al. (2005) estudiaron la variacin en la concentracin de diferentes elementos pesados a diferentes distancias de una fuente contaminante, y determinaron que para el Pb estos niveles de concentracin disminuan a medida que se alejaban de la fuente. Comportamiento similar a lo observado en este estudio, que tiene explicacin debido a la baja movilidad que presenta este elemento en el suelo.
Figura 2. Efectos principales de la distancia y la profundidad sobre la concentracin de Pb para valores de concentracin con un nivel de confianza de 95% y R2=0.9705 Con respecto a la profundidad los mayores valores significativos (P=0.0187) se encontraron de 20 a 40 cm, valor que corresponde a una distancia de 50 m de la fuente (Figura1). En sentido general, los niveles de concentracin de Pb son elevados, siendo mayores de 20 a 40 cm, en ambas distancias analizadas. Estos resultados no se corresponden con los obtenidos por Alloway (1995) y Becerril et al. (2002) quienes comprobaron que en reas contaminadas el Pb se encuentra generalmente ms concentrado en la superficie, debido a que es un elemento de baja movilidad, sin embargo: Con relacin a la profundidad y a la gnesis del suelo estudiado, segn Martn (2002) este es un suelo Ferraltico amarillento lixiviado etrico profundo arcilloso, el cual posee un horizonte AP (profundidad de 0 a 20 cm, su color en seco es 5YR 4/6 rojo amarillento) y otro A (profundidad de 20 a 60 cm, su color en seco es 2.5YR 3/6 rojo oscuro), presenta una textura arcillosa, estructura granular y se observan races. Por tanto, de acuerdo con este criterio la profundidad de 20-40 cm puede considerarse tambin como superficial. Como ya se ha dicho, debido a las caractersticas qumicas del plomo, este se encuentra concentrado en las capas superficiales (Alloway, 1995; Kabata-Pendias y Pendias, 2001; Peris 2006). Esto es muy favorable porque si las races de las plantas alcanzan la profundidad de 20 a 60 cm, sera posible a travs de un sistema de fitorremediacin la extraccin de los metales disponibles que se encuentran a esta profundidad. Tambin se encontraron diferencias significativas en la interaccin entre ambos factores (P=0.0484). Es por ello que debemos tener en cuenta adems, fenmenos particulares que influyen en la distribucin de los coloides del suelo, como es el fuerte carsismo presente en la zona y el efecto de la pendiente (Figura 5). Los anlisis de estos efectos se encuentran al final de este captulo, el mismo pudiera influir para todos los metales. Para el caso del Zn, a continuacin se muestra en la Figura 3 el anlisis de factores principales. Los valores de concentracin altamente significativos (P=0.0000) fueron encontrados a los 200 metros de la
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fuente, por tanto, proporcionalmente las mayores concentraciones se encuentran lejos de la fuente de contaminacin, aunque los niveles de Zn se mantienen elevados en ambos lugares. El Zn a diferencia del Pb, frente a cambios del pH en los suelos presenta una mayor movilidad; sobre ste pueden ejercer influencias positivas la actividad de los microorganismos de las rizosferas, as como los cidos hmicos, flvicos, cido ctrico, mlico, y exudados del metabolismo celular de las plantas. Es sensible a la accin de las aguas, aumentando su lixiviacin y es retenido superficialmente por la materia orgnica dada su afinidad para formar quelatos con esta (Ross, 1995).
Figura 3. Efectos principales de la distancia y la profundidad sobre la concentracin de Zn para valores de concentracin con un nivel de confianza de 95% y R2=0.9793 Segn estudios de clculo de disponibilidad de Zn en funcin del pH en suelos contaminados, realizados por Alloway (1990) citado por Kabata-Pendias y Pendias (2001), se observ que en pH<8 el cinc se encontraba predominando en forma de Zn2+, y que en esta forma era absorbido por las plantas, sin embargo, los niveles disponibles del metal con incrementos del pH en niveles prximos a la neutralidad disminuan hasta 0.07mgL-1. Con relacin a este criterio, se deber esperar que la disponibilidad de Zn en el rea cercana a las rizosferas se encuentre baja, dependiendo del pH. Segn los estudios de Guzmn (2006) el pH se mantiene con valores de 7.3 a 7.7 a lo largo del perfil. Con esto se veran afectados los niveles de remocin del metal en un sistema de fitorremediacin. Sin embargo, este sistema se pudiera potenciar empleando microorganismos en un sistema suelo-planta-microorganismo, que contribuyan con la disponibilidad del metal en la rizosfera. Harrison y Chiargawi (1989) comprobaron que el Zn se acumulaba lejos de las fuentes de contaminacin al analizar los contenidos de metales en las hojas de las plantas a medida que se alejaban de la fuente contaminante. Igualmente a lo observado en este estudio, el Zn se ha concentrado lejos de la fuente de contaminacin, lo cual representa un gran peligro, porque no se sabe hasta donde pudieran llegar los efectos acumulativos del metal en los suelos, y a diferencia del plomo, un mayor nmero de reas podran estar afectadas por la acumulacin de Cinc. Por tanto, se hace necesario aumentar los anlisis en las reas ms alejadas de la fuente de contaminacin aguas abajo. Los niveles de Pb y Zn presentes en el suelo estudiado representan un grave peligro para el agroecosistema analizado, pues pueden afectar los procesos de mineralizacin en el suelo, la microbiota caractersticas y las plantas (Ross, 1995). Por lo que, toda planta y microorganismo encontrado en esta rea, pudiera estar sometido a una situacin estresante, y su persistencia segn Van Hoewyk et al. (2005) presupone cierta tolerancia a los niveles de concentracin del metal. En el Anexo 3 se presentan los coeficientes de correlacin entre las concentraciones de los metales pseudo-totales, obtenidos mediante los Rangos de Sperman.
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Estas correlaciones son positivas y negativas y entre todas existen diferencias significativas con coeficientes de correlacin entre 0.550 y 0.960, lo cual indica la fuerza de las correlaciones, por tanto, la estrecha relacin existente entre los agrupamientos formados segn este anlisis (Marn et al., 2000). Estas correlaciones pudieran estar relacionadas debido a que los metales tengan un mismo origen litognico o al aporte antropognico como resultado del proceso de produccin de la empresa. Lo cual pudiera justificar el agrupamiento existente entre Mn con Cu, Ni y Cr contra el alejamiento de Zn, Pb, Fe y Co (Figura 4). Chen (2000) y Marn et al. (2000) en similares modelos de anlisis definieron las relaciones entre cada metal, estableciendo en funcin de los valores de concentraciones cules tenan origen antropognico.
Figura 4. Representacin de las interacciones entre los metales pesudo-totales del anlisis de correlacin de componentes principales. En la Figura anterior se muestran las relaciones entre cada metal, Co-Fe (0.5149) puede ser explicado debido a que el Co es siderfilo (Kauffman, 1997). Los siderfilos son aquellos metales que tienen afinidad por Ni-Fe, igualmente se pudo comprobar las relaciones entre Ni-Mn (0.9085), esta relacin superior a 0.800 es muy fuerte, seguramente debido al comportamiento geoqumico que indica, que el Ni pudiera estar fuertemente absorbido por xidos de Mn (Madrid et al., 2004), igualmente se correlacionaron positivamente Cr-Mn, Zn-Mn, Ni-Cu para los cuales se sigue el mismo principio. La relacin entre Cu-Zn, fue descrita por Ma et al. (1997) sugiriendo que la misma se produca debido a que ambos presentan radios inicos similares, pudiendo estar absorbidos por las arcillas y algunos xidos, en este caso con los de manganeso, segn se observa en la figura de este anlisis, mientras que el Pb, present solo dos correlaciones positivas Pb-Co y Pb-Fe, ambas pudieran explicarse debido a que tengan un mismo origen antrpico contenido en los xidos que conforman los pigmentos que utiliza la cermica o bien porque estn formando parte de las arcillas y estructuras en los xidos de Fe (Navas y Machn 2002) o ambas (Peris, 2006). La relacin entre Pb-Zn sin embargo fue negativa, lo que podra estar relacionado con los carbonatos presentes en el suelo, que son elevados (Anexo 4) (Marn et al., 2000) o que en los suelos contaminados donde predominan ambos metales la relacin generalmente que se establece entre ellos es la siguiente Pb/Zn (Ross, 1995). De acuerdo con este anlisis de correlaciones se pudo comprobar adems que efectivamente son el Zn y el Pb los elementos mayoritariamente de origen antrpico y no se descarta la posibilidad de que otros elementos tengan similar origen, por ejemplo el Co.
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Peris (2006) en la regin de LAlcora, Castelln en Valencia, Espaa, en similar estudio de metales pseudo-totales determin la presencia de elevadas concentraciones de Pb y Zn en parcelas de hortalizas. La contaminacin de dicha rea con estos metales ya haba sido estudiada por Roig et al. (1997) el cual identific como fuente contaminante de ese municipio a una industria de azulejos, o lo que es lo mismo de cermica blanca, la cual debido al empleo de pinturas, arcillas bsicas y al proceso de fabricacin incorpora al suelo a travs de los residuos vertidos grandes volmenes de lodos cargados de estos elementos trazas. Resultados similares describi Quevedo (2006) al caracterizar el proceso productivo de la Empresa Cermica Blanca de San Jos de las Lajas, explicando que en las arcillas que llegan a la fbrica de acuerdo su origen pedogentico, transportan gran cantidad de metales pesados que son concentrados como resultado del mismo proceso productivo. Una vez que las arcillas se encuentran transformadas en lodos, las mismas son dirigidas a travs del sistema de trampas al rea de vertimientos (50m de la fuente) y adems en esta rea las arcillas y sedimentos no llegan solamente con los vertidos lquidos a travs del sistema de trampas, sino que cada cierto tiempo estos sedimentos son extrados de las trampas cercanas encargadas de retener dicho material y son depositados fuera de estas sobre el suelo (labores de limpieza de las trampas), por lo que la superficie pasa a ser sepultada por una capa nueva, pudiendo haber diferencias en la concentracin de los metales entre las capas. Como se observa en la Figura 5, la superficie del suelo a 200 metros de la fuente contaminante recibe deposiciones desde lugares ms elevados (50 m) donde hay recubrimientos de la superficie por materiales que puedan traer una concentracin mineral diferente cambiante en el tiempo, lo cual depende del lugar de origen de la materia prima.
Figura 5. Esquema de los procesos erosivos en el rea de estudios donde se observa el fuerte carsismo, y los procesos de arrastre superficial del material contaminante desde los 50 metros de la fuente de contaminacin hasta los 200 metros, as como la infiltracin del agua cargada de elementos contaminantes a travs de un ponor alcanzando al manto fretico que se encuentra muy prximo de la superficie. Esquema modificado del original, tomado de Febles (2006). El rea se encuentra adems, bajo la influencia de una pendiente de aproximadamente 1.5% Guzmn (2006), la cual est ubicada en una posicin intermedia dentro del meso relieve teniendo la influencia aluvial de los suelos Pardos Sialticos ubicados en una posicin ms alta, esta es una fuente proveedora de carbonatos, razn por la cual se encuentran tan elevados en el rea (Anexo 4), los mismos segn el anlisis de correlaciones entre los metales pudieran estar influyendo en la
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inmovilizacin de los elementos Pb y Zn, con lo cual se justificaran las correlaciones negativas entre ambos metales y la relacin Pb/Zn. Esta influencia se hace ms significativa segn Martn (2001 y 2002) durante los eventos ciclnicos ya que los volmenes de agua bajan de las reas superiores arrastrando altos contenidos de coloides y de sales solubles. Se observa adems que en esta rea se produce un movimiento superficial e intrasuelo de las aguas cargadas de elementos txicos, ya que en esta zona se desarrolla un proceso de carsismo muy fuerte donde existen muchas dolinas y ponores que evacuan el agua directamente al manto fretico (Martn, 2000), en funcin de los cambios en el pH del suelo se puede movilizar el Zn y otros elementos de comportamiento similar, mientras que el Pb pudiera ser arrastrado con los coloides del suelo, por lo que se puede acumular lejos de la fuente de contaminacin, como fue detectado en este estudio. Como resultado de la actividad productiva son generados grandes volmenes de lodos arcillosos y aguas saturadas de elementos pesados, que fueron determinados y analizados estadsticamente en este estudio, todos vertidos en el rea analizada. Estos se depositan en las reas ms cercanas a la fuente de contaminacin (valores correspondientes a 50 m) y son arrastrados luego por las aguas durante el perodo lluvioso a favor de la pendiente, contaminando otros suelos (valores correspondientes a 200 metros de la empresa), la contaminacin adems puede estar pasando al manto fretico debido a los procesos erosivos crsicos existentes, como se hizo referencia. 4.2 Acumulacin de metales pesados totales en las cuatro especies de plantas seleccionadas. Las plantas han desarrollado mecanismos altamente especficos para absorber, traslocar y acumular nutrientes, sin embargo algunos metales y metaloides no esenciales son absorbidos, traslocados y acumulados en ellas debido a que presentan un comportamiento electroqumico similar a los elementos nutritivos requeridos (Lasat, 2000). En la Tabla 1 se observan los niveles de concentracin de metales totales en las cuatro especies. Los mismos segn los valores permisibles mostrados en la propia tabla, con excepcin de Mn, se encuentran por encima de los valores establecidos como normales para las plantas, y tolerantes para los cultivos agrcolas de hojas, y pudieran considerarse valores excesivos o txicos con excepcin de Cu en C. dactylon, y de Mn en todas las especies (Kabata-Pendias y Pendias, 2001). Tabla 1. Concentracin total de metales pesados acumulados por las especies vegetales en sus tejidos. (mg Kg-1. de MS)
*1 Modificado de Kabata-Pendias y Pendias (2001). (S) Niveles de concentracin suficientes o normales en plantas, (T) Niveles tolerables en cultivos agrcolas (E) Concentraciones excesivas o txicas.
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Los metales (Ni, Cu, Co, Mn, Zn) son micronutrientes esenciales para los seres vivos y se encuentran acumulados en las plantas en dependencia de los requerimientos de cada especie en concentraciones muy pequeas (Ross, 1995). Sin embargo en este estudio se observ una tendencia a acumular estos elementos en concentraciones superiores a los niveles propuestos por Kabata-Pendias y Pendias (2001); inclusive el Pb que no est considerado como nutriente result ser el elemento de mayor valor de acumulacin en C. dactylon (50939 mg.Kg-1 MS), y tambin se determinaron acumulados elevados en C. gigantus (15 499 mg.Kg-1) y T. domiguensis (11 016 mg.Kg-1) las cuales mostraron diferencias significativas en la acumulacin para este elemento. Los valores totales de Pb obtenidos en las plantas se corresponden con los resultados de las determinaciones de metales pseudo-totales presente en las rizosferas donde se identific al mismo metal como el de mayor concentracin. Prez et al. (2002) plantea que algunas plantas pueden volverse tolerantes al Pb frente a elevadas concentraciones del metal en los suelos, especialmente gramneas de pastizales, lo cual les permite colonizar toda un rea contaminada, y germinar sus semillas concluyendo que en algunos casos se ha mostrado hiperacumulacin. De acuerdo con este planteamiento se justifican entonces los niveles elevados de acumulacin para las plantas analizadas destacndose la gramnea C. dactylon. Para el caso del Zn, igualmente la especie C. dactylon mostr los mayores niveles de acumulacin (1090 mg.Kg-1MS), seguido de T. dominguensis existiendo entre ellas diferencias significativas en los valores acumulados. Como el Zn es un microelemento que generalmente existe en bajas concentraciones en los suelos, numerosas plantas muestran especial sensibilidad a las deficiencias de Zn, con el que establecen cierta relacin de dependencia, si se tienen en cuenta los niveles acumulados por las cuatro especies, pudiera esto estar asociado a los mecanismos de acumulacin y tolerancia observados (Prez et al., 2002) con gran significacin en C. dactylon y T. dominguensis, donde el elemento no se encuentra deficiente ni en las partes de la planta (area y raz) ni en los suelos. Una vez ms, se puede comprobar el origen antrpico de este elemento. Hittiarachchi y Pierzyndki, (2002), plantean que los suelos contaminados con Pb se encuentran comnmente asociados con Zn, comportamiento similar observado en nuestros resultados, porque son estos dos metales los que se encontraron en concentraciones ms elevadas en las rizosferas de estas plantas y en sus hojas y races. A pesar que las mismas acumulan elevadas concentraciones de metales pesados, se observ que no mostraban en el momento de la colecta signos de toxicidad. Resultados similares observ Quevedo (2006) en la misma rea durante un estudio de muestreo realizado en cuatro etapas, en igual ao, donde estas especies resultaron las ms predominantes, por lo que pudieran existir mecanismos bioqumicos fisiolgicos que les permiten la supervivencia en estas condiciones, existiendo cierta afinidad por la acumulacin de un metal en mayor cuanta sobre otro (Ross, 1995; Kabata-Pendias y Pendias, 2001) acorde con los resultados obtenidos. Debido a que la contaminacin en el rea de estudio es principalmente por acumulacin de Pb y Zn, la especie que mayores niveles totales acumul de ambos metales result ser C. dactylon, seguido de T. dominguensis la cual adems se destac por presentar los mayores niveles totales de acumulacin de Fe, Cu, Co y Mn. Estos datos no son suficientes para sealar que las especies son hiperacumuladoras, pero muestran caractersticas acumuladoras y tolerantes a los niveles de metales del suelo. En la Tabla 2, se muestra el coeficiente de transferencia de cada planta para cada metal analizado. Esta relacin (PA/PR) nos indica de manera general hacia donde existe una tendencia de las plantas a
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movilizar los iones metlicos. En este estudio, los metales tienden a ser traslocados mayoritariamente desde las races hacia las partes reas, dando como resultado un coeficiente mayor que uno. Aunque en menor proporcin y de manera particular algn que otro metal en cada especie es acumulado en mayor proporcin en las races, en este caso el coeficiente es menor que uno, por lo que la planta pudiera establecer alguna barrera para que estos metales no sean movilizados hacia las zonas areas. Tabla 2. Coeficiente de transferencia de cada planta. Plantas mgKg-1 MS C. gigantus C. dactylon T. dominguensis X. cubense ND. No detectado. Como muestra la tabla, para el Fe excepto en C. gigantus, la tendencia de las plantas es a acumular este metal en las races (coeficientes menores que 1), lo mismo ocurre para Pb, Co, Zn en la misma especie, esto pudiera deberse a que existan mecanismos que controlen la traslocacin de estos metales hacia las hojas, como ha sido sealado por Becker (2000) el cual plantea que una especie al limitar la entrada en las hojas de algunos metales se comporta como excluidora de estos, por tanto, C. gigantus se comporta como una planta excluidora de Pb, Co, y Zn, lo cual pudiera representar uno de los mecanismos le permitan su adaptabilidad en el rea contaminada sin mostrar sntomas de toxicidad. La especie X. cbense present el mayor coeficiente para Cu, T. dominguensis lo hizo para Co, Cr y Mn, Mientras que C. dactylon se sobresale entre las especies por presentar el ndice de traslocacin mayor, lo cual indica que la mayor cantidad de metal est siendo movilizado para las hojas. Para el caso de T. dominguensis, los niveles de Mn y Co acumulados en la planta superan el 0.1 % de su peso seco y los coeficientes de traslocacin (PA/PR) son mayores que uno, por tanto segn Yang et al. (2005) la misma se comporta como hiperacumuladora de ambos metales. Esto concuerda con los resultados obtenidos por Quevedo (2006) para Mn en la misma rea y por Horne (2000), el cual la refiere como una especie que crece sobre sustratos con elevada carga contaminante que posee caractersticas para la fitorremediacin de suelos contaminados por Manganeso. La especie C. dactylon present el mayor coeficiente de traslocacin para Zn y Pb, este ltimo el nico mayor que uno. La misma adems de poseer concentraciones de ambos metales que superan el 0.1% de su peso seco, necesita segn Brooks et al. (1977) y reafirmado por Yang et al. (2005) presentar concentraciones de Pb (50939 mg.Kg-1) mayores que 10000 ppm y Zn (1696 mg.Kg-1) mayores de 1000 ppm, ambos requisitos indispensables para que una planta se comporte como hiperacumuladora, como ocurre en este caso. Por tanto, la especie C. dactylon en nuestras condiciones se comporta como hiperacumuladora de Pb y Zn. Resultados similares para Zn fueron obtenidos por Beber (2000) e igualmente Madejn et al. (2001) la cataloga como acumuladora de este metal y la recomienda como remediadora de suelos degradados y contaminados con metales pesados. 5.3 0.3 0.6 0.3 1.7 3.2 1.4 11.0 1.4 1.3 1.0 1.9 0.05 21.1 0.1 0.8 0.6 1.9 2.3 1.6 0.5 3.1 1.2 1.1 1.0 3.7 2.7 1.0 Fe Cu Ni Pb Co Zn Mn
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Desde el punto de vista ecolgico, estos resultados permiten tener una panormica de las respuestas de estas especies frente a los niveles de contaminacin. En trminos agronmicos si efectivamente los metales son traslocados desde las races hasta las hojas (Tabla 2) otras especies como los cultivos de inters econmico de las mismas familias pudieran tener la misma capacidad para remover estos metales del suelo, segn cierto carcter interespecfico entre especies de la misma familia tal como seala (Berazan, 1999) lo que pudiera ser el paso de entrada en la cadena trfica poniendo en riesgo la seguridad alimentaria de los pobladores en las reas vecinas a la de estudio. Si tenemos en cuenta que la especie C. dactylon es una planta empleada para la alimentacin animal y a esto sumamos el hecho de que el Pb se trasloque a las partes reas lo hace muy peligroso, debido a su gran toxicidad y la importancia que presenta la misma para la ganadera cubana comnmente conocida como bermuda y hierba fina, es uno de los pastos presentes en las zonas ganaderas de todo el territorio nacional (Prez et al., 2002). T. dominguensis y C. dactylon en las partes reas mostraron los mayores niveles de concentracin de metales Co, Mn y Zn y Pb y Zn respectivamente, por tanto, con estas especies sera posible establecer un sistema de recuperacin de suelos (Becerril et al., 2002) a travs del empleo de las tcnicas de Fitorremediacin. En este caso se selecciona a C. dactylon para continuar estudios, por ser hiperacumuladora de Pb y Zn lo cual se corresponde con el objetivo planteado en este trabajo. 4.3 Microorganismos aislados de la rizosfera de C. dactylon. Los microorganismos aislados de un ambiente contaminado se pueden caracterizar como tolerantes a los niveles de contaminacin cercanos a ellos, al igual que las plantas, el hecho de encontrarse en estos suelos donde hasta ahora se han encontrado los elevados niveles de contaminacin por Pb y Zn existentes, pudiera significar que poseen mecanismos adaptativos que les permiten la supervivencia. Segn Atlas y Bartha (2002) dentro de la complejidad de los ecosistemas y sus respuestas a los contaminantes, las comunidades microbianas por su diverso metabolismo son capaces de utilizar estos compuestos como fuentes de energa. Los microorganismos aislados de la rizosfera de C. dactylon, pertenecen a los tres grupos microbianos fundamentales del suelo, de los cuales 36 morfotipos corresponden a bacterias, cuatro a hongos y dos a actinomicetos. Las caractersticas bacterianas predominantes fueron: colonias circulares, planas, de bordes enteros y apariencia lisa; de color amarillo, rojo, naranja y blanco, como los dos ejemplos que se muestran en la Figura 6.
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Figura 6. Dos cultivos predominantes A-19 (amarilla) y A-4 (roja) de bacterias aisladas de la rizosfera de Cynodon dactylon L. Siembra en estras por agotamiento para la obtencin de colonias puras. El hecho de encontrar 36 morfotipos bacterianos sobre los 4 de hongos, y 2 de actinomicetos podra deberse a que la poblacin fngica y de actinomicetos se ve ms afectada por la accin txica de los metales Pb y Zn, los que se encontraron en concentraciones elevadas, mientras que las bacterias al aparecer se afectan menos. Segn Ross (1995) las bacterias se afectan muy poco porque estas desarrollan mecanismos que le permiten la supervivencia. Surez y Reyes (2002) han descrito interacciones entre las bacterias y los metales pesados; este planteamiento confirma que al parecer la diversidad de morfotipos microbianos encontrados en la rizosfera de C. dactylon pudiera deberse a mecanismos de interaccin y al empleo de estos metales como fuente de energa por alguno de estos microorganismos. Estos morfotipos aislados se describen en la Tabla 3 donde se observa que existe un predominio de bacterias con respecto a los de hongos y de actinomicetos. Como normalmente ocurre en los suelos (Gadd, 2000; Atlas y Bartha, 2002). Tabla. 3 Descripcin cultural de todos los morfotipos microbianos aislados de la rizosfera de C. dactylon. Grupo microbiano morfotipo A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 Bacterias A9 A10 A11 A12 A13 A14 A15 A16 A17 A18 A19 A20 A21 A22 Caractersticas culturales de la colonia circular circular circular circular ameboide circular irregular circular ameboide ameboide rizoide circular circular circular ameboide circular ameboide circular circular circular circular rizoide plana plana convexa elevada plana difusa convexa convexa baja plana plana plana plana elevada convexa difusa plana cncava plana plana cncava levantada plana lisa lisa lisa lisa lisa lisa opaco traslcida liso muy seco opaca lisa lisa lisa lisa lisa lisa seca lisa lisa lisa lisa entero entero entero entero ondulado entero ondulado ondulado entero rugoso ondulado irregular entero entero ondulado irregular entero entero irregular entero irregular ondulado amarillo crema amarillo rojo amarillo blanco crema crema crema blanco blanco naranja fuerte naranja crema crema crema crema crema amarilla fluorescente blanco blanco
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A23 A24 A25 Bacterias A26 A27 A28 A29 A30 B01 B03 B07 B11 B12 B13 H01 hongos H02 H03 H04 T01 T02 circular circular circular ameboide circular circular rizoide ameboide rizoide circular rizoide circular ameboide circular plana elevada elevada plana cncava plana plana plana plana plana plana cncava plana plana opaca muy hmeda opaca opaca lisa lisa lisa lisa opaca lisa lisa lisa seca traslcido ondulado irregular entero ondulado lobulado entero ondulado entero ondulado entero ondulado irregular ondulado ondulado crema fluorescente amarilloverde crema claro amarillo cremoso naranja-claro carmelita amarilloclaro crema borde blanco fluorescente blanco rosado blanco crema claro
micelio blanco, algodonoso, crecimiento circular abundante micelio amarillo, verdoso hacia los bordes y blanco al centro, apariencia arenosa, esporulacin temprana. micelio arena, crecimiento radial, con formacin de abundantes estras y pliegues hacia adentro. micelio blanco, crecimiento elevado que va oscureciendo hacia el centro. Blanco, levantado sobre el medio de cultivo, presenta una coloracin amarillenta en el centro y es antagonista de hongos. Crema, seco, levantado sobre el medio de cultivo.
actinomicetos
Los procedimientos desarrollados para la caracterizacin morfocultural de los microorganismos fueron similares a los descritos por Novo (1983), Athlas y Bartha (2002) y Araujo et al. (2006) quienes demostraron la importancia de este mtodo para agrupar bacterias y otros microorganismos aislados del suelo. Los mismos permitieron conocer la diversidad existente en un ambiente contaminado con metales pesados como el de la rizosfera analizada en el presente estudio. Similares resultados describi Khan (2005) en la rizosfera de plantas que crecen igualmente en suelos contaminados con metales pesados. 4.3.1 Seleccin de morfotipos bacterianos ms resistentes a niveles de concentracin extremas en condiciones controladas. En general, los 36 morfotipos bacterianos se desarrollaron en la concentracin de 0,5 mM de PbCl2 y ZnCl2 (Tabla 4 a y b) segn estaba previsto, por ser microorganismos aislados de un sitio contaminado con metales pesados que presenta niveles de concentracin superiores, por tanto, algn mecanismo les permite la supervivencia, as mismo la asociacin con esta especie vegetal pudiera influir tambin en la supervivencia de estos.
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En las concentraciones 1mM y 2mM de PbCl2 se desarrollaron 14 morfotipos (38,88% del total), y para ZnCl2 16 morfotipos (44,44% del total) respectivamente, lo cual evidencia que no todas las bacterias toleran las mismas concentraciones de metales fuera de la rizosfera donde existen otras condiciones de humedad, temperatura, pH e interacciones microbianas entre otras. Similar anlisis plante Wu et al. (2006) quien estudi la absorcin de metales entre los que se encontraban Pb y Zn con diferentes bacterias en soluciones de suelo, con la influencia de la rizosfera y sin ella, encontrando diferencias en la capacidad de absorcin de manera general y en la absorcin de cada metal entre ambos tratamientos. Siendo mayor esta absorcin en la solucin preparada a partir del suelo rizosfrico, donde tambin se observ el mayor desarrollo celular. Tabla 4 a y b. Desarrollo microbiano a diferentes concentraciones de Pb y Zn. a)
b)
(+) Desarrollo celular, (-) No se observ desarrollo Finalmente los morfotipos que mostraron mayor crecimiento de clulas fueron: en PbCl 2 (Tabla 4a) A4, A6, A9, A10, A13, A14, A16, A19, A20, A21, A24, A27, B06, B12, y en ZnCl 2 (Tabla 4b) A4, A8, A9, A10, A12, A13, A14, A16, A19, A20, A24, A27, A30, B06, B12, B13.
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Del total, se seleccionaron solo aquellos morfotipos que coincidieron para ambas soluciones utilizadas, estos fueron: A4, A9, A10, A13, A14, A16, A19, A20, A24, A27, B06, y B12, para un total de 12 morfotipos lo que representa 33,33% del total encontrado. Los mismos mostraron mayor tolerancia a los incrementos de las concentraciones de Pb y Zn. Segn los resultados obtenidos en los experimentos, se pudo comprobar que existen diferencias en cuanto a los mecanismos de tolerancia entre los microorganismos que lograron su desarrollo en las tres concentraciones estudiadas de Pb y Zn. Rasmussen y Sorensen (2001) sealan que la mejor forma de evaluar los efectos de los metales sobre la comunidad microbiana pudiera estar en los estudios de tolerancia de la misma al metal en cuestin. Mediante los resultados obtenidos se ha podido comprobar este planteamiento (Tabla 9 a y b), teniendo en cuenta que diversos grupos bacterianos aislados de ambientes contaminados con metales pesados demuestran una variedad de respuestas a los iones metlicos (Gadd, 2000) y capacidad para desarrollarse mejor en presencia de un metal u otro (Crowe et al. 2004). De acuerdo con los objetivos planteados, un estudio de los mecanismos mediante los cuales los 12 morfotipos seleccionados, interactan con Pb y Zn u otro metal, pudieran constituir prximos trabajos a desarrollar de manera tal que sea posible emplear un sistema de biorremediacin en el rea estudiada. 4.3.2 Seleccin de diazotrficos. Se seleccionaron los 12 aislamientos de bacterias ms tolerantes a las concentraciones de metales pesados evaluadas, de ellos solo 8 se desarrollaron en diferentes medios de cultivo especficos para microorganismos diazotrficos Baldani (2008) (Tabla 5) . Tabla 5. Relacin de morfotipos con caractersticas diazotrficas. Morfotipos Medios de cultivo JMV LGI-P LG I A-4 Estreptobacilos grandes Gram + (-) ABacilos cortos y gruesos Gram + 10 (+) BBacilos Gram (-) + 12 ABacilos Gram (-) + 14 ABacilos Gram (-) + + 16 ABacilos Gram (-) + 19 ABacilos Gram (-) + 24 ABacilos Gram (-) + 27 ABacilos Gram (-) + 13 A* A*(A-9, A-20 y B-06) No crecieron en ninguno de los medios.
JNF-b + + -
NFb + -
mnimo -
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De los morfotipos evaluados, mostraron especificad A-10, A-24, A-27 y A-13 para el medio LGI-P y A19 para JMV, mientras que A-4 creci en LGI-P y JNF-b, A-12 en JMV y JNF-b, A-14 en JMV y NFb, A16 en JMV y LGI-P. En el medio mnimo no se observ desarrollo de ninguno de estos morfotipos, esto indica la selectividad de cada aislamiento para utilizar diferentes fuentes de carbono y para fijar el nitrgeno ausente en los medios evaluados. Los resultados sugieren que los 8 morfotipos que se desarrollaron en los diferentes medios semislidos, poseen algn mecanismo para obtener el nitrgeno atmosfrico. En todos los medios semislidos donde creci alguno de los ocho morfotipos bacterianos se observ el desarrollo de una pelcula aerotxica blanca por debajo de la superficie, mientras que en los mismos medios slidos crecen en la superficie, lo que sugiere que estas bacterias son microaerfilas facultativas. Adems, se observ el viraje de la coloracin caracterstica del medio a azul cuando este era verde, y a verde cuando este era amarillo, esto indica un cambio de pH en el medio segn el indicador contenido. Segn el criterio de Baldani (2004) el medio JNFb es semiselectivo para Herbaspirillum, NFb es semiselectivo para Azozpirillum y JMV es semiselectivo para Burkholderia, sin embargo en estos medios pueden crecer otros diazotrficos igualmente que los especficos y la misma colonia en varios de los medios, como se observ en este estudio. Una parte pequea de los organismos procariotas consiguen convertir o reducir el N atmosfrico en amonio el cual puede ser incorporado para el crecimiento y manutencin de las clulas (Maria et al., 2002). Teniendo en cuenta los resultados obtenidos y segn el planteamiento anterior, todas las caractersticas observadas en el desarrollo de los 8 morfotipos en el estudio realizado se corresponden segn lo planteado por Baldani (2004) con organismos diazotrficos. Con estos resultados no es posible la determinacin exacta de los gneros y especies de microorganismos diazotrficos encontrados, an cuando slo hayan crecido en uno de los medios especficos. De acuerdo a lo sealado por Magalhes y Dbereiner (1984); Baldani et al. (1999) y Melloni (2004) las bacterias del gnero Azospirillum han sido aisladas de la superficie de la raz de una amplia variedad de plantas y de su rizosfera, incluyendo cereales como maz, trigo, arroz, sorgo, avena pastos forrajeros como Cynodon dactylon, Poa pratensis, Festuca arundinacea, de diferentes especies de Pennisetum y Panicum (Caballero-Mellado et al. 2004). Teniendo que los aislamientos bacterianos proceden de la rizosfera de C. dactylon y considerando las caractersticas fisiolgicas y morfolgicas observadas es probable que alguno de los 8 morfotipos se correspondan con bacterias del gnero Azospirillum. Este estudio, a pesar de no determinar los gneros aislados tiene gran importancia, porque ha permitido conocer la presencia de bacterias tolerantes a metales pesados con caractersticas diazotrficas, las cuales pudieran ser empleadas conjuntamente con las gramneas como el C. dactylon en un sistema de biorrremediacin para la recuperacin de suelos contaminados con metales pesados con lo cual se cumple el ltimo objetivo planteado para este estudio. VI. Conclusiones. 1. De los ocho metales determinados en las rizosferas de las plantas estudiadas, se encontraron concentraciones pseudo-totales en intervalos que pueden ser considerados elementos contaminantes en los metales Pb y Zn.
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Especies vegetales y microorganismos rizosfricos tolerantes a metales pesados de un ecosistema contaminado. 2008 2. En las especies ruderales Cynodon dactylon L. Pers., Cyperus gigantus L., Typha
dominguensis (Pers). Kunth., Xanthosoma cubense (Rich.) Schott. se detectaron los ocho metales pesados evaluados, destacndose el Pb y el Zn como los de mayor concentracin en hojas y races.
3. La especie C. dactylon (Bermuda) se defini como hiperacumuladora de Pb y Zn y T.

dominguensis (Maco) como acumuladora de Mn y Co.
4. De la rizosfera de C. dactylon se aislaron 36 morfotipos de bacterias, 4 de hongos y 2 de

actinomicetos, comprobndose que existe diversidad de microorganismos tolerantes que pudieran potenciar en las plantas de esta especie sus capacidades hiperacumuladoras.
5. De los 12 morfotipos ms tolerantes a diferentes niveles de concentracin de Pb y Zn, ocho

presentaron caractersticas diazotrficas, lo que pudiera estar relacionado con el posible sistema de interaccin suelo contaminado-microorganismos tolerantes-plantas acumuladoras. VII. Recomendaciones.
1. Continuar estudios con C. dactylon (Bermuda) y T. dominguensis (Maco) para su empleo en

tcnicas de fitorremediacin con vistas a descontaminar el ecosistema estudiado.
2. Continuar los estudios con C. dactylon y los ocho microorganismos diazotrficos en un sistema
de biorremediacin (suelo-planta-microorganismos) a travs de la fitoextraccin, potenciado con actividad microbiana. 3. Determinar los gneros y especies de microorganismos diazotrficos encontrados. 4. Dada la significacin y alcance de los resultados, propiciar la divulgacin de los mismos tanto con los actores sociales relacionados al rea de estudio, como con la formacin agronmica del pregrado y postgrado.
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IX. Anexos
Anexo1. Criterios mundiales sobre valores aceptables y/o permisibles del contenido pseudototal en suelos agrcolas.
Elemento Pb Co Cu Ni Zn Cr Agrcola1 200 40 100 50 300 300 Residencial1 Industrial1 Otros2 -1 mgKg MS de suelo 350 1200 0.5-135 80 100 1.0-70 500 700 0.3-495 700 300 0.7-269 200 1500 1.5-264 1000 1000 18.7-269 CE3 100-400 50 100-125 100 250-300 50-100 Lodos3 (500)1-(1000)2 (100)1-(200)2 (50)1-(200)2 (300)1-(600)2 200-(500)2
Fuente: 1valores citados por Soares (2004) orientadores para diferentes metales pesados en ambientes distintos a ser empleados como referencia para monitorear niveles de contaminacin, segn el centro holands CETESB (2001) propuestos para el estado de So Paulo, el cual posee el 33 % de los suelos de tipo Ferraltico y un clima tropical. Otros2 valores citados por Souza (2006) segn diferentes criterios a nivel mundial en funcin de la variabilidad de los metales segn su origen pedogentico. CE3 valores de referencia mximos aceptables en suelos agrcolas, considerados como fitotxicos en el rango para toda la comunidad Europea (Peris, 2006). Los valores entre parntesis son concentraciones obligatorias por reglamentacin contenidos en Lodos con influencia en los suelos 1tolerable y obligatorio, 2 considerado txico.
Anexo 2 Conclusiones de los dos ltimos talleres de Biorremediacin realizados por el grupo FITOPLANT. II Taller de Biorremediacin III Taller de Biorremediacin
Estos talleres tuvieron como fin contribuir con la educacin ambiental de los vecinos del lugar, productores y trabajadores de la Empresa Cermica. En ellos se detectan problemas que muchas veces no son recogidas en las encuestas. Como salida se proponen soluciones y medidas que son llevadas a la Empresa y al gobierno local. El grupo de investigacin da respuesta de las investigaciones que realiza y recoge las inquietudes, estas sirven como punto de partida para nuevos procesos investigativos o para darle continuidad a los que ya estn trazados. Los resultados de este trabajo investigativo, dan respuesta a alguna de las interrogantes planteadas en ambos talleres.
Conclusiones
1) 1) El contenido total de Metales Pesados (plomo, nquel, cromo, cobre, hierro, zinc, manganeso, cobalto) en el suelo y en las especies vegetales, los cuales superan los lmites permisibles, permiten caracterizar al rea de estudio como contaminada. 2) El estado degradativo del rea afecta sustancialmente el paisaje y limita su explotacin con fines comunitarios, pues la vegetacin presente (plantas medicinales y pastos naturales) afecta directamente la cadena trfica influyendo en su seguridad alimentaria. 3) Para lograr la recuperacin de dicha rea agrcola se impone el establecimiento de una poltica encaminada a: a. Favorecer la contencin qumica. Importancia de los resultados mostrados y analizados, as como su impacto comunitario, lo cual ratifica la significacin del proyecto ejecutado. 2) Se alerta sobre enfermedades adquiridas por trabajadores de la Empresa Cermica (2 se pusieron de ejemplo), que refleja el posible efecto del proceso productivo 3) Aunar an ms los esfuerzos (grupo cientficoEmpresa) para ampliar las soluciones al fenmeno estudiado. Necesidad de que el Consejo de Direccin de la Empresa concientice estos problemas y vaya a la bsqueda de soluciones. 4) Se resalta que un primer problema EVITABLE por parte de las Empresas es NO CONTAMINAR. 5) Necesidad de que la empresa evale y caracterice los residuales que se obtienen del proceso productivo, y para ello es posible establecer cooperacin con el Centro de Investigaciones del
b.
Implementar las tcnicas de fitorremediacin (fitoextraccin) empleando: Verbesina alata L.
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(Asteraceae) (Botoncillo), Cynodon dactylon L. (Poaceae) (Bermuda), Typha dominguensis (Pers) Kunth (Thyphaceae) (Maco) y Lipidium virginicum L. (Cruciferaceae) (Mastuerzo). Proponer un grupo de medidas para no incrementar los efectos de la contaminacin: a. Mantener el suelo y/o sustrato con cobertura vegetal de tal forma que se extraigan una parte de los metales presentes. b. No cultivar especies vegetales con fines alimenticios en el rea estudiada, contribuyendo a la no afectacin de la seguridad alimentaria. c. No emplear los residuos vegetales como abonos orgnicos. Revisar en detalle el proceso productivo de la Empresa Cermica Blanca Adalberto Vidal (incluyendo trampas y canales). Priorizar la Educacin Ambiental, favoreciendo diferentes vas de capacitacin con todos los actores sociales involucrados (Gobierno, pobladores, OACE, empresas). Proponer a la Empresa se revise el proceso de produccin de forma tal que se disminuya la carga contaminante, para contribuir con las producciones ms limpias. Proponer por parte del gobierno y la UNAH a la direccin de la agricultura del territorio alternativas de produccin, comercializacin y redistribucin de los productos frescos. d. Petrleo. Se impone el anlisis por parte de la empresa para lograr ir gradualmente introduciendo soluciones hacia la implementacin de TECNOLOGIAS MAS LIMPIAS. 7) Se impone evaluar la calidad de las aguas en el pozo de abasto de las Empresas. 8) Posibilidad de que el grupo FITOPLANT preste el servicio de diagnstico a otras reas del municipio (por ejemplo la EMI, que abarca reas relacionadas con Empresas Pecuarias). 9) Insistir en la participacin de otros sectores especficos e indispensables en estos anlisis (por ejemplo Centro de Higiene). 10) Lograr una mayor vinculacin de los consultorios mdicos del Consejo Popular con los resultados surgidos de la implementacin del proyecto, para lograr un diagnstico clnico atemperado a la situacin ambiental. 11) Socializar estos resultados mostrados (enfatizando en las medidas) con TODOS los actores sociales (preferiblemente por sectores). Priorizar la capacitacin con lenguajes especficos para cada sector. 12) Lograr mayor energa en los decisores sociales con medidas para orientar la poltica emanada de la Educacin Ambiental. 13) Posibilidad de que el grupo FITOPLANT emplee incineradores que existen en el municipio, para procesar los desechos de las muestras evaluadas. 14) Proponer al CITMA que siga priorizando esta temtica de investigacin, amplindola en los casos requeridos a otras reas agrcolas. 6)
4)
5)
6)
7)
Anexo 3. Matriz de los coeficientes de correlacin entre los niveles de concentracin pseudo-totales de los metales pesados.
Pb Pb Zn Fe Mn Co Cr Ni Cu -0.6993 0.5524 -0.6902 0.8862 -0.8462 -0.8112 -0.6643 -0.7273 0.6479 -0.8881 0.7063 0.7273 0.6993 0.8169 -0.5149 -0.7762 -0.8042 -0.7273 -0.6385 0.9366 0.9085 0.8733 -0.7636 -0.7496 -0.6410 0.9510 0.8531 0.8322 Zn Fe Mn Co Cr Ni Cu
43
ndice
I. Introduccin................................................................................................................................1 II. Revisin Bibliogrfica..............................................................................................................3 2.1. Contaminacin por metales Pesados...................................................................................3 2.1.1. Origen de los metales pesados en los suelos...............................................................3 2.1.2. Transporte y dispersin de los contaminantes.............................................................3 2.1.3. Las arcillas y la industria cermica como generadora de contaminacin. ..................4 2.1.4. Efectos de la contaminacin........................................................................................5 2.1.4.1. Impacto de los metales pesados en las comunidades microbianas..........................5 2.1.5. Mecanismos de Interaccin Metal-Microorganismo. ..............................................6 2.2. Mtodos Biolgicos para la Remediacin de suelos contaminados por metales pesados...................................................................................................................................6 2.2.1. Biodegradacin mediada por microorganismos.........................................................7 2.2.2. Biorremediacin..........................................................................................................8 2.2.3 Fitorremediacin...........................................................................................................8 2.2.3.1. Tcnicas de Fitorremediacin..................................................................................9 2.2.3.2. Plantas Hiperacumuladoras....................................................................................11 2.3. Biodisponibilidad.........................................................................................................11 2.3.1. Bacterias Diazotrficas.............................................................................................12 2.4. Caracterizacin de las especies seleccionadas. ............................................................12 2.5. El enfoque agroecolgico en la investigacin..............................................................14 2.5.1. Los mtodos participativos en la investigacin cientfica.........................................14 III. Materiales y Mtodos.............................................................................................................15 3.1. Caractersticas del rea experimental...........................................................................15 3.2. Anlisis de las Rizosferas (suelo). ...............................................................................15 3.2.1 Anlisis estadstico del los metales pseudo-totales procedentes de las rizosferas......16 3.3. Anlisis del material vegetal.........................................................................................16 3.3.1. Anlisis estadstico de muestras vegetales.................................................................16 3.4. Aislamiento de microorganismos rizosfricos..............................................................16
44
Especies vegetales y microorganismos rizosfricos tolerantes a metales pesados de un ecosistema contaminado. 2008 3.5 Seleccin de morfotipos bacterianos ms resistentes a niveles de concentracin de metales pesados en condiciones controladas. .....................................................................17 3.6 Seleccin de diazotrficos.............................................................................................17 IV. Resultados y Discusin..........................................................................................................18 4.1- Contenido pseudo-total de metales pesados en las rizosferas de las plantas................18 4.2 Acumulacin de metales pesados totales en las cuatro especies de plantas seleccionadas.......................................................................................................................25 4.3 Microorganismos aislados de la rizosfera de C. dactylon.............................................28 4.3.1 Seleccin de morfotipos bacterianos ms resistentes a niveles de concentracin extremas en condiciones controladas...................................................................................30 4.3.2 Seleccin de diazotrficos..........................................................................................32 VI. Conclusiones..........................................................................................................................33 VII. Recomendaciones.................................................................................................................34 VIII. Bibliografa.........................................................................................................................35 IX. Anexos...................................................................................................................................42 ndice ..........................................................................................................................................44 A mis padres y mis abuelos, .......................................................................................................45
A mis padres y mis abuelos, Dedico. Agradecimientos A mis familiares a quienes dedico este trabajo: A mi madre Josefina Elas Armas (fifi) y su esposo Tony e Hijos, a mi padre Juan R. Snchez Durand y su esposa Barbarita e hijas, a mis abuelos todos, a Carmencito, abey y los ballate por el apoyo de siempre. Gracias por todo el amor y por los aos que han dedicado en mi formacin. A mi tutora Dra. Mara Irene Balbn Arias, y Dr. Ramiro Valds Carmenate por la confianza ayuda e inters mostrado. A Ambar, su amistad y ayuda de tantas veces, A Dariellys (lely), Huelva, Satur, Guridi por la preocupacin, los debates, las ideas, por dejarme sentir en su colectivo como el mo propio. A Evelyn, Yoannis, Sandra y Daymara por el equipo que hacemos, sin dudas muchas cosas buenas para el futuro. A la Dra Mara Teresa Npoles, Guianneya, Belkis, del INCA por el apoyo y las horas de trabajo en ese laboratorio, donde comenzaron estos ensayos. A los profesores y tcnicos del Instituto de Agronoma de la Rural (UFRRJ) que me recibieron y brindaron su apoyo, muy especial al profesor Dr. Nelson Moura Brasil do Amaral Sobrinho, mi orientador en brasil, y al Dr. Ricardo Luis Louro Berbara, por dejarme trabajar en su laboratorio y dejarme acompaar sus investigaciones. A la Dra. Vera Luca Divan Baldani por recibirme bajo su orientacin en los laboratorios de gramneas de la EMBRAPA Agrobiologa, RJ.
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A la Dra. Fabiana Soares y Flia, por su apoyo y amistad y los ratos de dedicacin en la rural. A MSc Fabiana Dias y esposo Dr. Ednaldo por recibirme en el alojamiento de la Pos Graduacin, ofrecerme su amistad y acompaarme durante toda mi estancia en la rural. Por la ayuda inmensa con el idioma portugus, tambin gracias. A todos los amigos del alojamiento con quienes compart durante esos cuatros meses de trabajo en la rural. A Teresinha Pascielo, quien cuid de m, y que fue como una madre, por todo ese amor, gracias. A Mnica Malheiros, por su compaa, ayuda y amistad los cuales siempre voy a tener presentes. A mis perros siberianos Zim, Gron y Tumn por ayudarme a salir del estrs. A todos, gracias
Resumen La zona de estudio pertenece a un ecosistema que recibe desde hace ms de 50 aos los desechos de la Empresa de Cermica Blanca de San Jos de las Lajas, el mismo se encuentra afectado por contaminacin con metales pesados. El Presente trabajo tiene como objetivo general la identificacin de especies vegetales acumuladoras de metales pesados y microorganismos rizosfricos tolerantes con potencialidades para aplicar la biorremediacin en dicha rea. Para ello, durantes el mes de octubre de 2007, se recogieron muestras vegetales y suelo rizosfrico de las especies ruderales: Cynodon dactylon L Pers., Cyperus gigantus L., Typha dominguensis (Pers.) Kunth., Xanthosoma cubense (Rich.) Schott., fue determinada la concentracin de ocho metales pesados presentes en cada una de las muestras. Se obtuvo como resultado del anlisis en las rizosferas, que los niveles pseudo-totales de Pb y Zn se encuentran en intervalos que pueden ser considerados elementos contaminantes. Mientras que en las muestras vegetales (hojas y races), consecutivamente el Pb y Zn resultaron los metales ms concentrados. De acuerdo con estos niveles de concentracin, C. dactylon (Bermuda grass) se defini como hiperacumuladora de Pb y Zn, y T. dominguensis (maco) como acumuladora de Mn y Co. De la rizosfera de C. dactylon, se aislaron 36 morfotipos de bacterias, 4 de hongos y 2 de actinomicetos, comprobndose que existe diversidad de microorganismos tolerantes a los niveles de concentracin de los metales pesados determinados. De 12 morfotipos ms tolerantes a diferentes niveles de Pb y Zn, ocho presentaron caractersticas diazotrficas, lo cual pudiera potenciar en esta planta su capacidad acumuladora.
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Especies vegetales y microorganismos rizosfricos tolerantes a metales pesados de un ecosistema contaminado.

1. Especie: Cyperus gigantus L.

2. Especie: Cynodon dactylon (L.) Pers.

3. Especie: Xanthosoma cubense (Rich.) Schott.

4. Especie: Typha dominguensis (Pers.) Kunth.

3. La especie C. dactylon (Bermuda) se defini como hiperacumuladora de Pb y Zn y T.

4. De la rizosfera de C. dactylon se aislaron 36 morfotipos de bacterias, 4 de hongos y 2 de

5. De los 12 morfotipos ms tolerantes a diferentes niveles de concentracin de Pb y Zn, ocho

1. Continuar estudios con C. dactylon (Bermuda) y T. dominguensis (Maco) para su empleo en

10. 11. 12.

24. 25. 26.

28. 29. 30.

32. 33. 34. 35.

42. 43. 44. 45.

53. 54. 55. 56. 57.

71. 72. 73. 74. 75. 76. 77.

86. 87. 88. 89.

94. 95. 96.

111. 112. 113.

114. 115. 116. 117.

Implementar las tcnicas de fitorremediacin (fitoextraccin) empleando: Verbesina alata L.

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