Kolegij Genetiko inenjerstvo

Animacije i zadaci
doc. dr. sc. Gordana Maravi Zavod za biokemiju i molekularnu biologiju Farmaceutsko-biokemijskog fakulteta
GM2005

Bioloke animacije
http://www.rvc.ac.uk/review/DNA_1/Index.cfm http://bcs.whfreeman.com/lodish5e/ http://www.dnalc.org/cloning.html http://en.sciencegeneration.com/biotkit.php?biokit_id=1&i=1# http://www.mhhe.com/biosci/genbio/maderhuman 6/student/olc/vrl_animation-quizzes.html http://www.colostate.edu/programs/lifesciences/T ransgenicCrops/animation.html
GM2005

Zadatak 1
Razgradnja fragmenta DNA veliine 15 kb trima restrikcijskim enzimima daje fragmente veliina navedenih u tablici. Odredite poloaj restrikcijskih mjesta u fragmentu DNA!
BamHI EcoRI 14 1 12 3 PstI 8 7 BamHI EcoRI 11 3 1 BamHI PstI 8 6 1 EcoRI PstI 7 5 3 BamHI EcoRI PstI 6 5 3 1

GM2005

Rjeenje zadatka 1
0 3 6 9 12 15 kb

14 kb 12 kb 3 kb 12 kb 3 kb

1 kb

BamHI

EcoRI
BamHI

EcoRI 3 kb EcoRI 3 kb 5 kb 11 kb PstI 6kb

EcoRI + BamHI
1 kb BamHI

EcoRI + BamHI + PstI

1 kb

GM2005

Zadatak 2
Linearni fragment DNA veliine 100 kb obraen je polinukleotid-kinazom uz dodatak radioaktivnog ATP. Razgradnja s EcoRI daje fragmente veliina: 8*, 10, 15, 23 i 44* kb. Razgradnja s BamHI daje fragmente veliina: 11*, 14, 16, 24.5 i 34.5* kb. Razgradnja istovjetnog neradioaktivnog fragmenta s oba enzima daje fragmente veliina 3, 4.5, 5.5, 7, 8, 9.5, 10.5, 17.5 i 34.5 kb. Odredite poloaj restrikcijskih mjesta u fragmentu DNA!
EcoRI 8
8 3

10
7

23
17.5 5.5

15
10.5 4.5 9.5

44
34.5

11 BamHI

24.5

16

14

34.5

GM2005

Zadatak 3: Koliko je pojedinanih klonova potrebno za izradu genomske knjinice ljudskog genoma u razliitim vektorima ako je vjerojatnost pojavljivanja svakog gena u knjinici 99%?
N = ln (1-P) / ln (1-f) Za ljudski genom i standardni plazmidni vektor: P 99% ili 0.99 f 5 kb/4,400,000 kb = 1.14 x 10-6 N = [ln 0.01]/[ln 0.99999886] = -4.6/-1.14 x 10-7 = 40 350 877 pojedinanih klonova

Plazmidni vektori stabilni inserti do 5 kb

GM2005

Za ljudski genom i standardni kozmid: P 99% ili 0.99 f 35 kb/4,400,000 kb = 7.95 x 10-6 N = [ln 0.01]/[ln 0.99999205] = -4.6/-7.95 x 10-6 = 578 616 pojedinanih klonova
Inserti 20 35 kb
GM2005

Za ljudski genom i standardni YAC: P 99% ili 0.99 f 500 kb/4,400,000 kb = 1.4 x 10-4 N = [ln 0.01]/[ln 0.999886] = -4.6/-1.4 x 10-4 = 40 350 pojedinanih klonova

GM2005

Zadatak 4
elite prouavati izozim piruvat-kinaze specifian za jetru. Enzim je proien (Mw 62 000) i dobiven je peptidni slijed amino-kraja proteina. Razgradnjom kimotripsinom dobiven je krai oblik enzima vrlo sline veliine (Mw 60 000), kao i slijed jo jednog oligopeptida. Koristei navedene informacije predloite sondu koja bi se mogla koristiti za pretraivanje knjinice i nalaenje gena za piruvat-kinazu. Objasnite va izbor.
Peptid 1 : Met-Ala-His-Val-Arg-Arg-Ala-Ser-Val Peptid 2: Glu-Ser-Arg-Trp
GM2005

Rjeenje zadatka 4
Peptid 1 : Br. kodona: Peptid 2: Br. kodona: Met-Ala-His-Val-Arg-Arg-Ala-Ser-Val 1 4 2 4 6 6 4 4 4 Glu-Ser-Arg-Trp 2 4 6 1

Dio peptida 1 - manji broj moguih kombinacija za odabir oligonukleotida

GM2005

Zadatak 5
Koimunoprecipitacijom elite istraiti koji dio molekule imunoglobulina (Ig) stupa u interakciju s ciljnim proteinom te ste stoga izradili nekoliko delecijskih mutanata molekule Ig uz dodatak Flag epitopa na Nkraj proteina. Koja je svrha dodavanja Flag epitopa? Zato ne koristiti samo anti-Ig protutijela za koimunoprecipitaciju?
GM2005

Rjeenje zadatka 5
Flag epitop omoguava specifino prepoznavanje rekombinantnih mutantnih oblika molekule Ig Anti-Ig protutijela bi se mogla vezati na epitope koji stupaju u interakciju s ciljnim proteinom te tako onemoguiti stvaranje kompleksa lani negativni rezultat Delecijom pojedinih dijelova molekule Ig gube se pojedini epitopi pa postoji mogunost da anti-Ig protutijela ne prepoznaju neki od mutanata
GM2005

Zadatak 6
Nedavno ste klonirali Idh gen iz laboratorijskog takora i pokuavate identificirati isti gen u vrsti divljeg glodavca iz june Amerike. Kojim ete redoslijedom provesti sljedee postupke?
A. B. C. D. E. F.

Odabrati klon koji hibridizira sa sondom koja se temelji na nukleotidnom slijedu takorskog gena Idh Uzgojiti transformirane stanice na selektivnom mediju Povezati genomsku i vektorsku DNA uporabom DNA ligaze Pokidati genomsku i vektorsku DNA restrikcijskim enzimom Hibridizirati klonove obiljeenom sondom koja se temelji na nukleotidnom slijedu tskorskog gena Idh transformirati bakterijske stanice rekombinantnim plazmidima

Odgovor: D-C-F-B-E-A

GM2005

Zadatak 7
Plazmid pBR322 esto se koristi kao vektor za kloniranje. Sadri gene za rezistenciju na ampicilin i tetraciklin kao selektivne biljege. U jednom je pokusu gen ubaen u restrikcijsko mjesto unutar gena za rezistenciju na ampicilin i stanice E. coli su transformirane rekombinantnim vektorom. Da bi se odredilo koje stanice sadre vektor s kloniranim genom kolonije su uzgajane na mediju sa i bez antibiotika. Dobiveni su sljedei rezultati:

bez antibiotika

+ tetraciklin

+ tetraciklin+ampicilin GM2005

Zadatak 7
Koje kolonije ne sadre ni prazni niti plazmid s ugraenim genom? Zato?
Kolonije 3, 5 i 7 jer rastu iskljuivo na podlozi bez antibiotika to ukazuje na nedostatak gena za rezistenciju na antibiotike, a time i na nedostatak plazmida.

Koje kolonije sadre samo prazni plazmid? Objasnite!

Kolonije 2, 4, 8 i 9 jer im gen za ampicilin nije inaktiviran ugradnjom strane DNA pa mogu rasti na podlozi s oba antibiotika.

Koje kolonije sadre plazmid s ugraenim genom? Zato?

Kolonije 1 i 6 jer rastu na podlozi s tetraciklinom dok na podlozi s oba antibiotika ne mogu rasti jer im je gen za rezistenciju na ampicilin inaktiviran ugradnjom strane DNA.
GM2005

Zadatak 8
Plazmid je razgraen restrikcijskim enzimima EcoRI i HindIII. Razgradnja s EcoRI daje fragmente veliine 30, 15 i 5 kb, razgradnja s HindIII daje fragment veliine 50 kb, a razgradnja s oba enzima daje fragmente veliine 20, 15, 10 i 5 kb. Odredite poloaj restrikcijskih mjesta na plazmidu.
2 mogunosti:

GM2005

Zadatak 9
Na slici je prikazana restrikcijska mapa za EcoRI gena X:
1 kb 0.7 kb 2 kb 1.7 kb 0.3 kb mutB

Nacrtajte obrazac dobiven elektroforezom u agaroznom gelu

za mutantni gen kojem nedostaje EcoRI mjesto koje daje fragmente veliine 1 i 0.7 kb (mutA) Za mutantni gen koji sadri novo EcoRI mjesto unutar fragmenta od 2 kb kao to je oznaeno na slici (mut B) GM2005

Rjeenje zadatka 9
2.0 1.7 1.0 0.7 gen X mutA mutB 0.3

MutA ima samo jedno EcoRI mjesto i daje dva fragmenta veliine 2 i 1.7 kb MutB daje 4 fragmenta veliine 1.7, 1, 0.7 i 0.3 kb zbog dodatnog EcoRi mjesta
GM2005

Zadatak 10
Koje od restrikcijskih endonukleaza navedenih u tablici kreiraju tupe krajeve? Koje su od njih izoshizomeri (enzimi koji imaju isto mjesto prepoznavanja, ali ne kidaju nuno na istom mjestu)? koje su od njih izokaudameri (kreiraju identine krajeve)?
GM2005

Rjeenje zadatka 10
Tupe krajeve kreiraju:
AluI, EcoRV, HaeIII, MspI, PvuII

Izoshizomeri:
HpaII i MspI

Izokaudameri:
BamHi i BglII HpaII i TaqI SalI i XhoI
GM2005

Zadatak 11
Fragment DNA dobiven razgradnjom genomske DNA restrikcijskim enzimom EcoRI zdruen je s plazmidnim vektorom lineariziranim istim RE tako da moe doi do spajanja ljepljivih krajeva. Smjesi je dodana T4 DNA ligaza. Navedite sve mogue produkte ligacijske reakcije! Odgovor:
Linearne molekule DNA nastale povezivanjem iskljuivo fragmenta, iskljuivo vektora te kombinacijom vektora i fragmenta svaka u dvije mogue orijentacije Krune molekule DNA nastale povezivanjem iskljuivo fragmenta, iskljuivo vektora te kombinacijom vektora i fragmenta svaka u dvije mogue orijentacije

GM2005

Zadatak 12
Slijed nukleotida u viestrukom mjestu za kloniranje sadri mjesta prepoznavanja RE BamHI, EcoRI, PstI i SalI. Oznaite poloaj ovih mjesta na nukleotidnom slijedu: -GAATTCGGATCCGTCGACCTGCAGEcoRI BamHI SalI PstI

GM2005

Zadatak 13
Genom kvasca Saccharomyces cerevisiae velik je 13.5x106 pb. Ako je genomska knjinica izraena u fagu koji moe primiti inserte veliine 16 kb, koliko individualnih klonova je potrebno pretraiti da bi se sa sigurnou od 99% naao odreeni fragment? Odgovor: N=ln(1-P)/ln(1-f); P=0.99; f=16 kb/13.5x103kb N=3838-3883
GM2005