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Instituto Federal de Educao, Cincia e Tecnologia de Mato Grosso - Campus Cuiab Bela Vista Curso de Engenharia de Alimentos Disciplina:

: Anlise Instrumental Aplicada a alimentos

Prof Dr Elaine de A. Oliveira Coringa


Bacharel e Licenciada em Qumica (UFMT) Especialista em Processamento e Controle de Qualidade de Alimentos (UFLA-MG) Mestre em Agricultura Tropical (UFMT) Doutora em Agricultura Tropical / Qumica e Mineralogia do Solo (UFMT/Esalq)

Cuiab - 2012

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SUMRIO 1. Introduo aos mtodos instrumentais de anlise


1.1 Definio de anlise qumica 1.2 Escolha do mtodo analtico 1.3 Esquema geral da anlise qumica 1.4 Classificao dos mtodos analticos 1.5 O mtodo instrumental 1.6 O instrumento analtico

2.

Eficincia do mtodo analtico


2.1 Fontes de erros em anlise qumica 2.2 Validao de resultados analticos

3.

Calibrao em anlise instrumental


3.1 Tipos de Calibrao 3.2 Medidas da eficincia da anlise instrumental

4.

Tcnicas instrumentais aplicadas a alimentos:


4.1 Potenciometria 4.2 Condutimetria 4.3 Refratometria e Polarografia 4.4 Tcnicas espectrofotomtricas 4.4.1 Espectrofotometria UV/Visvel 4.4.2 Fluorescncia 4.4.3 Espectrofotometria IR 4.4.4 Espectrofotometria de Absoro Atmica 4.4.5 Espectrofotometria de Emisso 4.5 Cromatografia 4.5.1 Cromatografia Gasosa (GC) 4.5.2 Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (HPLC)

5.

Parte experimental (aulas prticas)

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1.

Introduo aos mtodos instrumentais de anlise

A anlise de alimentos uma rea muito importante no ensino das cincias que estudam alimentos, pois ela atua em vrios segmentos do controle de qualidade, do processamento e do armazenamento dos alimentos processados. Atualmente existe uma grande quantidade de mtodos analticos instrumentais para a anlise de substncias em alimentos (com limite de deteco cada vez mais baixo), tanto que rapidamente pode-se perder a viso geral dos mtodos aplicveis para determinadas questes analticas. A Qumica analtica (ou Anlise Qumica) envolve a separao, identificao e quantificao das espcies qumicas presentes em uma amostra. Quando aplicada a alimentos, avalia-o desde a produo, coleta, transporte da matria-prima, at a venda como alimento natural ou industrializado, verifica se o alimento se enquadra nas especificaes legais, detecta a presena de adulterantes, aditivos que so prejudiciais sade, se a esterilizao adequada, se existiu contaminao com tipo e tamanho de embalagens, rtulos, desenhos e tipos de letras e tintas utilizadas. Enfim, tem a ver com todos os diferentes aspectos que envolvem um alimento, com isso permitindo o juzo sobre a qualidade do mesmo. 1.1 Definio de anlise qumica: Aplicao de um processo ou uma srie de processos para identificar ou quantificar uma substncia, ou os componentes de uma soluo ou mistura ou, ainda, para determinar a estrutura de compostos qumicos Pra que serve a qumica analtica em alimentos? o Como caracterizar um alimento? Qual a concentrao de vitaminas ? H substncias nocivas (antibiticos, hormnios, pesticidas)? o Como est a qualidade da gua para consumo humano? o Concentrao de metais txicos nos alimentos?

Entretanto, a Qumica Analtica (ou Anlise Qumica) pode ser dividida em duas partes, de acordo com o que estamos buscando como resultado nessa anlise: Qumica Analtica Qualitativa quando se deseja determinar quais substncias esto presentes em determinada amostra. Ex.: essa amostra de carne bovina est contaminada com hormnios? H presena de chumbo nessa amostra de sardinha enlatada? O QUE TEM NA AMOSTRA? Qumica Analtica Quantitativa quando se deseja determinar a quantidade de cada componente ou de certos componentes, presentes na amostra. Ex.: Qual a concentrao de antibitico presente no leite tipo C? A quantidade de Ferro em leite em p corresponde quantidade descrita no rtulo? O QUANTO TEM?

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Quais so as aplicaes prticas da anlise qumica? Desenvolvimento de novos produtos: onde se determinar se a composio da mistura apresenta certas caractersticas que adquam sua finalidade. Controle de qualidade de rotina: utilizado tanto para checar a matria prima que chega, como o produto acabado que sai de uma indstria, alm de controlar os diversos estgios do processamento. Nestes casos, de anlises de rotina, costuma-se, sempre que possvel, utilizar mtodos instrumentais que so bem mais rpidos que os convencionais. Fiscalizao: utilizado para verificar o cumprimento da legislao, atravs de mtodos analticos que sejam precisos e exatos e, de preferncia, oficiais. Pesquisa: utilizada para desenvolver ou adaptar mtodos analticos exatos, precisos, sensveis, rpidos, eficientes, simples e de baixo custo na determinao de um dado componente do alimento

Figura 1- Relaes entre a qumica analtica, outras reas da qumica e outras cincias. A localizao central da qumica analtica no diagrama representa sua importncia e a abrangncia de sua interao com muitas outras disciplinas.

1.2 Escolha do mtodo analtico: Existem dois tipos bsicos de mtodos em anlise de alimentos: mtodos convencionais e mtodos instrumentais. Os primeiros so aqueles que no necessitam de nenhum equipamento sofisticado, isto , utilizam apenas a vidraria e reagentes, e geralmente so utilizados em gravimetria e volumetria. Os mtodos instrumentais, como o prprio nome diz, so

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realizados em equipamentos eletrnicos mais sofisticados. So utilizados, sempre que possvel os mtodos instrumentais no lugar dos convencionais. A escolha de um mtodo apropriado para a abordagem do problema analtico requer respostas para as questes: Que exatido e preciso so necessrias? Qual a quantidade de amostra disponvel? Qual o intervalo de concentrao do analito? Que componentes da amostra podero causar interferncia? Quais as propriedades fsicas e qumicas da matriz? Quantas amostras sero analisadas? Recursos disponveis (instrumentos, pessoal, etc.) A escolha do mtodo analtico vai depender de uma srie de fatores: Quantidade relativa do componente desejado: Os componentes podem ser classificados em maiores (mais de 1%), menores (0,01 1%), micros (menos de 0,01%) e traos (ppm e ppb) em relao ao peso total da amostra. No caso dos componentes maiores, so perfeitamente empregveis os mtodos analticos convencionais, como os gravimtricos e volumtricos. Para os componentes menores e micros, geralmente necessrio o emprego de tcnicas mais sofisticadas e altamente sensveis, como os mtodos instrumentais. Exatido requerida: Os mtodos clssicos podem alcanar uma exatido de 99,9%, quando um composto analisado se encontra em mais de 10% na amostra. Para componentes presentes em quantidade menores que 10%, a exatido cai bastante, e ento a escolha do mtodo deve recair sobre os instrumentais. Composio qumica da amostra: A presena de substncias interferentes muito constante em alimentos. A escolha do mtodo vai depender da composio qumica dos alimentos, isto dos possveis interferentes em potencial. Em anlise de materiais de composio extremamente complexa, o processo analtico se complica com a necessidade de efetuar a separao dos interferentes antes da medida final. Recursos disponveis: muitas vezes no possvel utilizar o melhor mtodo de anlise em funo do seu alto custo, que pode ser limitante em funo do tipo de equipamento ou at mesmo ao tipo de reagente ou pessoal especializado.

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1.3 Esquema Geral Da Anlise Qumica: As etapas gerais de uma anlise qumica so: a. b. c. d. e. f. g. Formulao da questo (problema) Obteno da amostra Preparao da amostra Seleo dos procedimentos analticos Anlise qumica (clssica e/ou instrumental) Tratamento e Interpretao dos resultados Concluses

OBTENO DA AMOSTRA: A amostra deve ser representativa do sistema; sua integridade deve ser mantida; seus dados de coleta devem ser documentados. PREPARAO DA AMOSTRA: Uma poro da amostra preparada para anlise por pesagem ou medida do seu volume, e por processos fsicos e/ou qumicos, como secagem, moagem, dissoluo, etc. PROCEDIMENTO ANALTICO: Obter peso ou volume da amostra preparada Preparao de solues padres do analito, necessrias para calibrao do instrumento ou para comparao ou reao com o analito da amostra. Padronizao de solues ou calibrao do equipamento. Execuo do procedimento de anlise. TRATAMENTO DOS DADOS: Requer a confeco de grficos de curvas de calibrao, da qual os resultados podem ser calculados. Mtodos estatsticos esto geralmente envolvidos, como desvio padro, mdia e coeficiente de variao dos resultados obtidos. CLCULO DOS RESULTADOS: Um clculo final pode ser necessrio para obter os resultados desejados, como por exemplo, a transformao de uma leitura instrumental em concentrao do analito (ppm, g/L, %, mol/L, etc.).

Assim, o analista precisa deter conhecimentos sobre as metodologias de anlise de todos os parmetros de interesse: - metais potencialmente txicos (Cr, Cd, Pb, As, Hg, etc.), - compostos orgnicos (pesticidas como DDT, solventes como benzeno), - gases (NOx, SO2, CO, CO2, H2S), - parmetros fsicos e fsico-qumicos de gua e solo ( DBO, DQO, pH, temperatura, turbidez, condutividade eltrica, teor de cloro, teor de fsforo, carbono total, etc.),

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1.4 Classificao Dos Mtodos Analticos:

Podemos dizer que existem dois tipos bsicos de mtodos em anlise qumica: MTODOS CONVENCIONAIS E MTODOS INSTRUMENTAIS.

Os mtodos convencionais so aqueles que no necessitam de nenhum equipamento sofisticado, isto , utilizam apenas a vidraria e reagentes, e geralmente so utilizados em gravimetria e volumetria. S para lembrar: gravimetria trabalha com a perda/ganho de massa de uma amostra, por reao qumica ou aquecimento. J a volumetria, mede a quantidade de reagente (em volume) gasta na titulao do componente desejado na amostra.

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Os mtodos instrumentais, como o prprio nome diz, so realizados em equipamentos eletrnicos, e so utilizados, sempre que possvel, no lugar dos mtodos convencionas, pelas seguintes vantagens: Menor tempo de anlise Maior preciso dos resultados Maior sensibilidade do mtodo No necessita preparao prvia da amostra Muitos so mtodos no-destrutivos Maior reprodutibilidade dos resultados Possibilidade de realizao de um maior n de anlises Menor gasto de reagentes analticos e vidrarias Mas, em alguns casos, os mtodos instrumentais apresentam desvantagens, tais como: A aparelhagem necessria para os procedimentos clssicos barata e encontra-se com facilidade em todos os laboratrios; muitos instrumentos, no entanto, so caros e a sua adoo s se justifica quando so muitas as amostras a analisar, ou quando se trata da determinao de substncias em quantidades diminutas (anlise de traos). Nos mtodos instrumentais necessrio efetuar uma operao de calibrao, em que se usa amostra do material com a composio conhecida como substncia de referncia. Enquanto um mtodo instrumental o ideal para a execuo de um grande nmero de determinaes de rotina, no caso de uma anlise episdica, fora da rotina, muitas vezes mais simples usar um mtodo clssico do que Ter o trabalho de preparar os padres indispensveis e calibrar o instrumento. Alto custo do equipamento e reagentes. Necessidade de treinamento especializado, em algumas tcnicas instrumentais. Ainda hoje os laboratrios empregam muitos mtodos clssicos de separao e determinao de compostos, mas sua aplicao est diminuindo em funo dos novos mtodos instrumentais.

1.5 O mtodo instrumental: Devido ao desenvolvimento tecnolgico a que os processos esto sujeitos, a anlise qumica tambm se desenvolveu e, atualmente, a maioria das anlises tanto qualitativas quanto quantitativas realizada atravs de instrumentos ou aparelhos prprios, desenvolvidos para realizar uma gama muito grande de anlises, surgindo, ento a Anlise Instrumental. A anlise instrumental no dispensa, entretanto, o conhecimento das anlises via mida tradicionais (qualitativa e quantitativa), nem os fundamentos bsicos da instrumentao utilizada, visto que o tcnico qumico no deve tornar-se um mero seguidor de receitas ou de roteiros e, muito menos, um leitor de manuais de aparelhos. Neste caso so utilizados equipamentos eletrnicos mais sofisticados.

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Mtodo clssico

Mas, para que um instrumento seja utilizado com eficincia, devemos observar os seguintes critrios: Ambiente adequado (limpo, seco, condicionado) Conhecimento do contedo de manual do equipamento Registros das manutenes e uso do equipamento Realizao de manutenes preventivas, peridicas, e programadas Calibrao do instrumento de acordo com padres certificados Realizao de anlises interlaboratoriais Os mtodos instrumentais podem ser classificados em: eletroanalticos (ou eltricos), de separao e espectroanalticos (ou ticos). Veja o esquema abaixo:

A natureza do sinal fornece o nome ao mtodo instrumental: Mtodo eletroanaltico: sinal medido eltrico Mtodo espectroanaltico ou tico: sinal medido do tipo tico (relacionado ao espectro eletromagntico) Mtodos de separao modernos, acoplados a detectores: cromatografia

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Os principais mtodos instrumentais empregados na anlise quantitativa de alimentos so: MTODOS INSTRUMENTAIS ELTRICOS (ou eletroanalticos): envolvem a medio de corrente eltrica, de voltagem (tenso), ou de resistncia, em funo da concentrao de certa espcie em soluo. As tcnicas que podem se includas nessa categoria so: o Potenciometria (medida do potencial de um eletrodo em equilbrio com um on a ser determinado); o Condutimetria (medida da condutividade eltrica de uma soluo); o MTODOS INSTRUMENTAIS TICOS (ou espectroanalticos): dependem ou da medio da quantidade de energia radiante de certo comprimento de onda que absorvida pela amostra (mtodos de absoro), ou da emisso de energia radiante e da medio da quantidade emitida com um certo comprimento de onda (mtodos de emisso). Podem ser divididos em: o Mtodos de absoro de luz: envolve a determinao da quantidade de luz absorvida pela amostra atravs de uma fonte de energia luminosa (lmpada) que emite radiao em determinadas freqncias do espectro eletromagntico. Espectrofotometria no visvel (colorimetria) Espectrofotometria no ultravioleta Espectrofotometria no infravermelho. Espectroscopia de absoro atmica Turbidimetria o Mtodos ticos de emisso de luz: envolvem o tratamento da amostra pelo calor ou pela eletricidade, de modo que os tomos so promovidos a estados excitados que proporcionam a emisso de energia; mede-se a intensidade desta energia emitida. Espectroscopia de emisso atmica; Fotometria de chama; MTODOS INSTRUMENTAIS DE SEPARAO: como a Cromatografia, um processo de separao empregado para separar as substncias de um mistura, amplamente utilizada para identificar componentes e determin-los quantitativamente. A mistura a ser separada se divide em duas fases (slida, liquida e/ou gasosa) e separa-se atravs da sua solubilidade ou afinidade qumica. Posteriormente, as fases so separadas e os componentes da mistura recuperados e quantificados. Pode ser dividida em: Cromatografia Lquida e Cromatografia Gasosa.

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TABELA 1 - Propriedades fsicas e qumicas empregadas nos mtodos instrumentais

Tabela 2 Critrios para seleo dos mtodos analticos Preciso dos resultados Sensibilidade do instrumento Seletividade do mtodo Habilidade requerida do operador Custo e disponibilidade do instrumento Limite de deteco do instrumento Faixa de concentrao do analito Velocidade de anlise Facilidade e convenincia Custo por amostra

1.6 O instrumento analtico: Um instrumento para anlise qumica converte a informao armazenada nas caractersticas fsicas e qumicas do composto em um determinado tipo de informao, que pode ser manipulada ou interpretada pelo homem. Como as tcnicas instrumentais acima apresentadas tm diferentes graus de complicao, sensibilidade, seletividade, custo e tempo, importante escolher a melhor tcnica para realizar uma determinao analtica. Para isso, necessrio levar em considerao: a) Tipo de anlise: elementar ou molecular, rotineira ou episdica.

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b) Problemas decorrentes da natureza do material investigado: substncias corrosivas, radioativas, afetadas pela gua, calor, etc. c) Interferncias de outros componentes do material. d) Intervalo de concentrao que precisa ser investigado. e) Exatido exigida. f) Facilidades disponveis (tipo de equipamento) g) Tempo necessrio para completar a anlise h) Nmero de anlises de mesmo tipo que devem ser efetuadas. i) Natureza da amostra j) Espcie de informao que se procura k) Quantidade da amostra disponvel

Como o instrumento consegue emitir um sinal da propriedade da substncia e convert-lo em um nmero? A funo do instrumento traduzir a composio qumica em uma informao diretamente observvel pelo operador. Os instrumentos transformam um sinal analtico que usualmente no diretamente detectvel ou entendido pelo ser humano em um sinal que pode ser medido.

Processo completo de uma medida instrumental

Qualquer que seja o mtodo instrumental, o sinal analtico ser sempre uma funo da concentrao do analito. A medida do sinal se fundamenta em uma propriedade fsico-qumica que se relaciona diretamente com a concentrao do analito.

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Tabela 3 Alguns exemplos dos componentes dos instrumentos

Como a seqncia de uma anlise instrumental?

Uma vez escolhida a tcnica analtica instrumental (potenciometria, condutimetria, espectrofotometria, etc.), a anlise dever ser realizada em rplicas (duplicata ou, preferivelmente, em triplicata), e o resultado final ser a mdia das replicatas. Para mtodos de anlise instrumentais, muitos instrumentos so acoplados a computadores e os resultados analticos podem ser expostos num monitor e registrados na impressora. Um clculo simples converter os dados experimentais na percentagem do componente presente na amostra. Veja na figura abaixo, o esquema geral de uma anlise instrumental:

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Obter a amostra

Preparar a amostra Executar a anlise instrumental: Pesar ou medir o volume da amostra preparada Preparar as solues padres do analito para calibrar o instrumento Calibrar o equipamento Obter os resultados para a amostra (leitura)

Tratar os dados
Tabular os dados e calcular as mdias das replicatas e o desvio padro;

Calcular os resultados
Fazer o grfico de calibrao e o ajuste estatstico da curva; Calcular a concentrao da amostra

Qual a dimenso quantitativa da anlise instrumental? Pode ser em escala de macro, meso, micro e ultramicroanlise, dependendo da concentrao detectvel no instrumento ou tcnica. Veja na figura abaixo a diferena entre essas escalas analticas:

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2 Eficincia do mtodo analtico


As medidas instrumentais e clssicas invariavelmente envolvem erros e incertezas. Apenas alguns deles ocorrem devido a equvocos cometidos pelo analista. Mais comumente, os erros so causados por padronizaes ou calibraes malfeitas ou variaes aleatrias e incertezas nos resultados. Calibraes freqentes, padronizaes e anlises de amostras conhecidas podem ser usadas, algumas vezes, para minimizar todos esses fatores, exceto os erros e as incertezas aleatrios. No limite, entretanto, os erros envolvidos nas medidas so uma parte inerente do mundo quantitativo em que vivemos. Por conta disso, impossvel realizar uma anlise qumica que seja totalmente livre de erros ou incertezas. Apenas podemos desejar minimizar os erros e estimar sua grandeza com uma exatido aceitvel.

2.2 Fontes De Erros Na Analise Qumica:

Amostragem Preparo de amostras Preparo de reagentes Material de referncia certificado inapropriado (padro) Calibrao do instrumento Durante a leitura Processamento dos dados Apresentao dos resultados Interpretao dos resultados

Tipos de erros:

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a) Erros determinados ou sistemticos: possuem um valor definido e podem ser medidos ou computados no final. Exemplos (na preparao da amostras): Contaminao o Pelo ar o Impurezas em reagentes o Materiais Perda de elementos o Por volatilizao o Por adsoro Decomposio incompleta das amostras b) Erros indeterminados ou aleatrios: no possuem valor definido, no so mensurveis e flutuam de um modo aleatrio. Ex.: resultados de replicatas:

Nesses casos, o valor mais provvel a mdia aritmtica de todos os valores. Resumidamente:

Erros determinados (sistemticos) e indeterminados ( incertezas) na anlise qumica:

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2.3 Validao dos resultados analticos: Existem critrios quantitativos para avaliar o funcionamento dos instrumentos analticos e a eficincia do mtodo, e que podem ser utilizados para decidir se um determinado mtodo instrumental o adequado para resolver um problema analtico. Estas caractersticas se expressam em termos numricos e estatsticos, chamados parmetros de qualidade instrumentais, e esto listados na tabela abaixo: Tabela 4 Critrios numricos para selecionar um mtodo analtico de acordo com a sua eficincia.
Critrio Preciso Parmetro de qualidade Desvio padro absoluto Desvio padro relativo Coeficiente de variao Significado Grau de concordncia mtua entre os dados que foram obtidos do mesmo modo, em uma serie de medidas (replicatas). Fornece uma medida do erro aleatrio, ou indeterminado, de uma anlise. A sensibilidade de um instrumento ou mtodo uma medida de sua habilidade em discriminar pequenas diferenas na concentrao de um analito. Concentrao ou massa mnima do analito que pode ser detectada em um nvel confivel no aparelho. Refere-se ao grau em que o mtodo esta livre de interferncia de outras espcies contidas na matriz da amostra. Infelizmente nenhum mtodo analtico est totalmente livre de interferncia de outras espcies e, assim, procura-se minimiz-las.

Sensibilidade

Sensibilidade de calibrao

Limite de deteco

Branco + 3x desvio padro do branco Coeficiente de seletividade

Seletividade

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2.3.1

Preciso x exatido:

A preciso descreve a reprodutibilidade das medidas em outras palavras, a proximidade entre os resultados que foram obtidos exatamente da mesma forma. Geralmente, a preciso de uma medida prontamente determinada simplesmente pela repetio da medida em rplicas da amostra. Trs termos so amplamente empregados para descrever a preciso de um conjunto de dados de rplicas: desvio-padro, varincia e o coeficiente de variao. Os trs so uma funo de quanto um resultado individual xi difere da mdia, o que denominado desvio em relao mdia, di.

A exatido indica a proximidade da medida do valor verdadeiro, ou aceito, e expressa pelo erro. A Figura 5-2 ilustra as diferenas entre exatido e preciso. Observe que a exatido mede a concordncia entre um resultado e o valor aceito. A preciso, por outro lado, descreve a concordncia entre os vrios resultados obtidos da mesma forma. Podemos determinar a preciso medindo as rplicas da amostra. A exatido com freqncia mais difcil de ser determinada porque o valor verdadeiro geralmente desconhecido. Ento, um valor aceito precisa ser utilizado em seu lugar. A exatido expressa em termos do erro absoluto ou erro relativo.

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Representao da preciso e exatido:

2.3.2

Tipos de erros em anlise qumica que afetam a preciso e a exatido do mtodo instrumental:

Erro Absoluto O erro absoluto E, na medida de uma quantidade x, dado pela equao: em que xv o valor verdadeiro, ou aceito, da quantidade. EXEMPLO:

Se retornarmos aos dados mostrados na Figura 5-1, o erro absoluto do resultado imediatamente esquerda do valor verdadeiro de 20,00 ppm de -0,2 ppm de Fe; o resultado 20,10 ppm apresenta um erro de +0,1 ppm de Fe. Observe que mantemos o sinal quando expressamos o erro absoluto. O sinal negativo, no primeiro caso, mostra que o resultado experimental menor que o valor aceito, enquanto o sinal positivo, no segundo caso, indica que o resultado experimental maior que o valor aceito.

Erro Relativo: Em geral, o erro relativo Er uma quantidade mais til que o erro absoluto. O erro relativo porcentual dado pela expresso:

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A preciso de uma medida prontamente determinada pela comparao dos dados de rplicas cuidadosas de experimentos. Infelizmente, uma estimativa da exatido no to fcil de ser obtida. Para determinar a exatido, temos de conhecer o valor verdadeiro, que geralmente o que se busca em uma anlise. Os resultados podem ser precisos sem ser exatos e exatos sem ser precisos. O perigo de considerar que resultados precisos tambm so exatos ilustrado na Figura 53, que resume os resultados obtidos na determinao de nitrognio em dois compostos puros. Os pontos mostram os erros absolutos de rplicas de resultados obtidos por quatro analistas. Observe que o analista 1 obteve preciso e exatido relativamente elevadas. O analista 2 teve uma preciso baixa, mas uma exatido boa. Os resultados do analista 3 so surpreendentemente comuns. A preciso excelente, mas existe um erro significativo na mdia numrica dos dados. Ambas, a preciso e a exatido, so baixas nos resultados do analista 4.

As Figuras 5-1 e 5-3 sugerem que as anlises qumicas so afetadas por pelo menos dois tipos de erros. Um tipo, chamado erro aleatrio (ou indeterminado), faz que os dados se distribuam de forma mais ou menos simtrica em torno do valor mdio. Veja novamente a Figura 5-3 e observe que a disperso dos dados, e conseqentemente o erro aleatrio, para os analistas 1 e 3 so significativamente inferiores, quando

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comparados com os dos analistas 2 e 4. Em geral, o erro aleatrio de uma medida refletido por sua preciso. Um segundo tipo de erro, denominado erro sistemtico (ou determinado), faz que a mdia de um conjunto de dados seja diferente do valor aceito. Por exemplo, a mdia dos resultados mostrados na Figura 5-1 tem um erro sistemtico de cerca de 0,2 ppm de Fe. Os resultados dos analistas 1 e 2, na Figura 5-3, tm erros sistemticos pequenos, mas os dados dos analistas 3 e 4 revelam erros sistemticos de cerca de 0,7% e 1,2% para o nitrognio. Geralmente, os erros sistemticos presentes em uma srie de rplicas de medidas fazem que os resultados sejam muito baixos ou muito altos. Um exemplo de um erro sistemtico a perda despercebida do analito durante o aquecimento de uma amostra. Um terceiro tipo de erro sistemtico o erro grosseiro. Os erros grosseiros diferem dos erros indeterminado e determinado. Ocorrem, normalmente, apenas de forma ocasional, so freqentemente grandes e podem causar resultados tanto altos quanto baixos. Esses erros so, com freqncia, resultado de erros humanos. Por exemplo, se uma parte de um precipitado for perdida antes da pesagem, os resultados analticos sero mais baixos. Tocar um pesa-filtro com os dedos quando sua massa vazia j foi determinada far a leitura da massa de um slido pesado no frasco contaminado ser mais alta. Os erros grosseiros levam ocorrncia de valores anmalos, resultados que diferem marcadamente de todos os outros dados de um conjunto de rplicas de medidas. Como os erros sistemticos fazem parte da anlise instrumental, vamos falar um pouco mais sobre eles. Os erros sistemticos tm um valor definido e uma causa identificvel e so da mesma ordem de grandeza para rplicas de medidas realizadas de maneira semelhante. Existem trs tipos de erros sistemticos: (1) Erros instrumentais causados pelo comportamento no ideal de um instrumento, por calibraes falhas ou pelo uso de condies inadequadas. (2) Erros de mtodo surgem do comportamento qumico ou fsico no ideal de sistemas analticos. (3) Erros pessoais resultam da falta de cuidado, falta de ateno ou limitaes pessoais do analista. Erros Instrumentais: Todos os dispositivos de medida so fontes potenciais de erros instrumentais sistemticos. Por exemplo, pipetas, buretas e frascos volumtricos podem conter ou dispensar quantidades levemente diferentes daquelas indicadas em suas graduaes. Os instrumentos eletrnicos esto sujeitos a erros instrumentais sistemticos. Esses erros podem ter inmeras origens. Por exemplo, os erros podem surgir devido ao decrscimo da voltagem de uma bateria, em decorrncia do seu tempo de uso. Os erros tambm podem ocorrer se os instrumentos no forem calibrados freqentemente, ou se forem calibrados incorretamente. As variaes de temperatura provocam alteraes em inmeros componentes eletrnicos, o que pode levar ocorrncia de modificaes nas respostas e a erros. Alguns instrumentos so suscetveis ao rudo induzido por fontes de corrente alternada (ca), e esse rudo pode influenciar a preciso e a exatido. Em muitos casos, erros desse tipo so detectveis e corrigveis. Erros de Mtodo: O comportamento qumico ou fsico no ideal de reagentes e de reaes nos quais uma anlise est baseada, muitas vezes, introduz erros de mtodo sistemticos.

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Essas fontes de no idealidade incluem a lentido de algumas reaes, a incompletude de outras, a instabilidade de algumas espcies, a falta de especificidade da maioria dos reagentes e a possvel ocorrncia de reaes laterais que interferem no processo de medida. Por exemplo, um erro de mtodo comum na anlise volumtrica resulta do pequeno excesso de reagente necessrio para provocar a mudana de cor do indicador que acusa o final da reao. A exatido dessa anlise ento limitada pelo prprio fenmeno que torna a titulao possvel. Os erros inerentes a um mtodo so, freqentemente, difceis de ser detectados e, conseqentemente, so os mais srios entre os trs tipos de erros sistemticos. Erros Pessoais: Muitas medidas demandam julgamentos pessoais. Os exemplos incluem a estimativa da posio de um ponteiro entre duas divises de uma escala, a cor de uma soluo no ponto final de uma titulao ou o nvel de um lquido em relao escala graduada de uma pipeta ou bureta. Julgamentos desse tipo so muitas vezes objeto de erros sistemticos, unidirecionais. Por exemplo, uma pessoa pode estimar a posio de um ponteiro de maneira consistentemente mais alta, outra pode ser ligeiramente lenta no disparo de um cronmetro e uma terceira pode ser menos sensvel a mudanas de cor. Um analista que insensvel a mudanas de cor tende a usar excesso de reagente em uma anlise volumtrica. Os procedimentos analticos sempre devem ser ajustados para que qualquer limitao fsica conhecida do analista no provoque erros pequenos e irrelevantes. Uma fonte universal de erros pessoais o prejulgamento, ou tendncia. A maior parte de ns, no importa quo honestos sejamos, tem a tendncia de estimar leituras de escalas na direo da melhoria da preciso em um conjunto de resultados. Alternativamente, podemos ter uma noo preconcebida do valor verdadeiro de uma medida. De forma inconsciente, fazemos que os resultados se mantenham prximos a esse valor. O vis numrico outra fonte de erros pessoais que varia consideravelmente de pessoa para pessoa. O vis numrico mais freqente encontrado na estimativa da posio de um ponteiro em uma escala a preferncia pelos nmeros 0 e 5. Tambm comum o prejulgamento favorecendo nmeros pequenos em relao aos maiores e os nmeros pares, em relao aos mpares.

2.3.3

Deteco dos erros sistemticos instrumentais e pessoais:

Alguns erros sistemticos instrumentais podem ser determinados e corrigidos pela calibrao. CALIBRAO: Processo que relaciona o sinal analtico medido (leitura) com a concentrao conhecida da substancia em uma soluo padro de referencia. PADRO OU SOLUO PADRO: soluo preparada em laboratrio de concentrao exatamente conhecida da substncia que se quer analisar na amostra. Contm todos os reagentes adicionados na amostra.

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Salvo poucas excees, as tcnicas instrumentais so denominadas de tcnicas secundrias, ou seja, necessrio que o analista fornea referncias ao equipamento para que este correlacione os dados para identificar a concentrao do componente de interesse (analito) na amostra. A forma mais usual de se executar a calibrao de um instrumento atravs da curva analtica (ou curva de calibrao), que consiste em preparar padres com concentraes conhecidas do analito e matriz (amostra menos o analito) o mais prximo da realidade da amostra em estudo. Na maioria das vezes, existir uma relao linear entre concentrao do analito e sinal de resposta do equipamento. Veremos mais adiante os tipos de calibrao instrumentais! A calibrao peridica de equipamentos sempre desejvel devido variao, com o tempo, da resposta da maioria dos instrumentos, resultante do desgaste, da corroso ou da manuteno inadequada. Muitos erros sistemticos instrumentais envolvem interferncias nas quais as espcies presentes na amostra afetam a resposta do analito. Uma simples calibrao no corrige esses efeitos. A maioria dos erros pessoais pode ser minimizada por meio de cuidado e disciplina. Um bom costume consiste em verificar sistematicamente as leituras de instrumentos, os registros no caderno de laboratrio e os clculos em geral. Os erros devido a limitaes do analista podem ser evitados pela escolha cuidadosa do mtodo analtico. 2.3.4 Deteco de erros sistemticos de mtodo:

O vis em um mtodo analtico particularmente difcil de ser detectado. Podemos adotar um ou mais entre os procedimentos a seguir para reconhecer e tentar livrar um mtodo analtico de um erro sistemtico. a) Anlise de Amostras Padro: A melhor maneira de estimar a tendncia de um mtodo analtico pela anlise de materiais de referncia padro, ou seja, materiais que contm um ou mais analitos em nveis de concentrao conhecidos. Os materiais de referncia padro so obtidos de vrias formas. Os materiais padro podem ser preparados por meio de sntese. Aqui, quantidades cuidadosamente medidas dos componentes puros de um material so misturadas de forma que produza uma amostra homognea cuja composio seja conhecida a partir das quantidades tomadas. A composio global de um material padro sinttico precisa ser muito prxima da composio da amostra que ser analisada. Cuidados extremos precisam ser tomados para garantir que a concentrao do analito seja exatamente conhecida. Infelizmente, um padro sinttico pode no revelar interferncias inesperadas, assim a exatido da determinao pode no ser conhecida. Alm disso, essa estratgia muitas vezes no prtica. Os materiais de referncia padro podem ser adquiridos a partir de inmeras fontes governamentais e industriais. Por exemplo, o Instituto Nacional de Padres e Tecnologia norte-americano, o NIST (antigo Bureau Nacional de Padres) oferece mais de 1.300 materiais de referncia padro, incluindo rochas e minerais, misturas de gases, vidros, misturas de hidrocarbonetos, poeira urbana, gua de chuva e sedimentos de rios.

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As concentraes de um ou mais componentes desses materiais foram determinadas por uma das trs maneiras que seguem: (1) pela anlise por meio de um mtodo de referncia previamente validado; (2) pela anlise por dois ou mais mtodos de medida independentes e confiveis; ou (3) pela anlise por intermdio de uma rede de laboratrios cooperados, que so tecnicamente competentes, com um conhecimento completo acerca do material a ser testado. b) Determinao do Branco: Um branco contm os reagentes e solventes usados na determinao, mas no o analito. Por vezes, vrios dos constituintes da amostra so adicionados para simular o ambiente do analito, freqentemente denominado matriz da amostra. Em uma determinao em branco, todas as etapas da anlise so desenvolvidas no material denominado branco. Os resultados so ento aplicados na correo das medidas feitas com a amostra. Determinaes em branco revelam erros que ocorrem devido a interferentes presentes nos reagentes e frascos usados na anlise. Os brancos tambm so usados para corrigir dados de titulaes, em funo do volume do reagente necessrio para provocar a mudana de cor do indicador. BRANCO (BR): Sinal do instrumento para matriz na ausncia do analito geralmente gua destilada ou o solvente utilizado em maior quantidade na amostra + reagentes que foram adicionados na amostra (indicadores, solues extratoras, cidos, lcalis, etc.). o sinal analtico (leitura) dever corresponder a ZERO.

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3 Calibrao em anlise instrumental


A calibrao uma operao comum na anlise instrumental, onde se relacionam concentraes conhecidas da substncia a ser determinada e os correspondentes sinais analticos (leitura do instrumento). Essas concentraes conhecidas devem ser fornecidas por SOLUES PADRO.

Iremos fazer uma observao importante acerca das solues padro: a sua preparao. Esse processo muito importante para o sucesso da calibrao, pois em muitos casos, os erros de preciso e exatido que ocorrem so devidos preparao errada das solues padres.

Preparao dos padres:

Uma srie de solues-padro da substncia a analisar pode ser preparada de vrias maneiras. Provavelmente a mais comum por meio de vrias diluies de uma soluo padro de reserva (soluo estoque). O padro de reserva pode ser preparado pelo analista ou comprado de um vendedor de produtos qumicos. Pode ser preparado por pesagem de uma quantidade do padro primrio da substncia (usando uma balana analtica) para um balo volumtrico e diluindo at marca desejada. Tambm pode ser um padro secundrio preparado diluindo uma soluo padro estoque principal, que foi comprado de um vendedor de produtos qumicos ou preparado em laboratrio. A srie de padres ento preparada por diluio de vrios volumes da soluo estoque a um volume menor, em bales volumtricos. Essas diluies exigem tcnicas corretas de transferncia, utilizando pipetas graduadas e calibradas para minimizar os erros indeterminados. Essa diluio pode ser feita em srie, como mostra o exemplo abaixo:
Preparao de 50 mL de cada serie de solues padres nas concentraes de 1,0 3,0 5,0 7,0 ppm de Pb, a partir de uma soluo estoque de Pb de 100 ppm:

Usando a equao de diluio em serie: Cb = concentrao da soluo padro diluda (das sries de padres) Vb = volume final da concentrao da soluo padro diluda (100 mL) Ca = concentrao da soluo padro estoque (100 ppm) Va = volume da soluo padro estoque (se quer determinar = ?)

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3.1 Tipos de calibrao: 3.1.1 Calibrao convencional ou com padro externo:

Nesse tipo de calibrao, prepara-se uma serie de solues padres (mnimo 5), cujo intervalo de concentrao da substncia inclui a concentrao presente na amostra. Construo da curva de calibrao: - Preparo de uma srie de solues-padro (contm a concentrao conhecida do analito) - Medida dos sinais dos padres e do branco no equipamento (leitura do branco e dos padres) - Construo da Curva de Calibrao eixo x = concentrao dos padres; eixo y = leitura dos padres.

A leitura correspondente de cada soluo relacionada com a concentrao da substancia no padro atravs de um grfico de disperso (xy). Esse grfico ajustado pela regresso linear, e uma equao da reta produzida (y = ax + b), que estabelece uma relao linear entre o sinal e a concentrao.
Concent. leitura

Vamos ver a seguir como construir a curva de calibrao no EXCEL:

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1 CONSTRUO DA TABELA DE DADOS (x = concentrao e y = leituras) no Excel, aps a leitura das solues padro: Construa a tabela com os dados das solues padro: Eixo x = concentrao dos padres Eixo y = leitura dos padres

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2 CONSTRUO DO GRFICO DE DISPERSO, com os dados da solues padro: Selecione a tabela que voc montou Clique no cone GRFICOS Selecione grfico de DISPERSO (XY) Clique em avanar nas prximas telas

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Clique em CONCLUIR.

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3. O GRFICO J EST PRONTO:

Depois de construdo o grfico, vamos agora AJUSTAR A RETA e determinar a EQUAO DA RETA: Clicar com o boto direito do mouse sobre os pontos da reta Clicar em ADICIONAR LINHA DE TENDNCIA

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Na palheta do quadro, selecionar OPES Marcar EXIBIR EQUAO E VALOR DE R-QUADRADO NO GRFICO.

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5. J aparecem no grfico a EQUAO DA RETA e o valor de R-Quadrado:

Parmetros da curva de calibrao:

Curva de calibrao da resposta, Smeans, versus a concentrao, CA. A inclinao da curva de calibrao a sensibilidade da calibrao (a = coeficiente angular).

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3.1.2

Calibrao com adio de padro:

Nesse mtodo, a amostra contaminada com uma quantidade ou quantidades conhecidas de uma soluo padro contendo o analito. No mtodo das adies de padro, uma quantidade conhecida da soluo padro contendo o analito adicionada a uma poro da amostra. As respostas antes e depois da adio so medidas e posteriormente usadas para obter a concentrao do analito. Alternativamente, as mltiplas adies so feitas a diversas pores da amostra. A adio de padro considera uma resposta linear. Isso deve ser sempre confirmado ou o mtodo das adies mltiplas deve ser empregado para se verificar a linearidade. Exemplo:

3.1.3

Mtodo do Padro Interno:

Um padro interno uma espcie de referncia, qumica ou fisicamente similar ao analito, que adicionada a amostras, padres e brancos. A razo entre as respostas do analito e a do padro interno representada em um grfico versus a concentrao do analito.

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No mtodo do padro interno, uma quantidade conhecida da espcie que atua como referncia adicionada a todas as amostras, padres e brancos. Ento o sinal de resposta no aquele do prprio analito, mas sim da razo entre o sinal do analito e o da espcie de referncia. preparada, como de maneira usual, uma curva de calibrao na qual o eixo y a razo entre as respostas e o eixo x, a concentrao do analito nos padres. A Figura abaixo ilustra o uso do mtodo do padro interno para respostas na forma de pico.

Ilustrao do mtodo do padro interno. Uma quantidade fixa da espcie contida no padro interno adicionada a amostras, padres e brancos. Os grficos da curva de calibrao contm a razo entre o sinal do analito e o do padro interno contra a concentrao do analito.

3.2 Medidas da eficincia da anlise instrumental: 3.2.1 Avaliar a preciso:

A preciso uma medida da reprodutibilidade de um resultado. Para se estabelecer a preciso de um mtodo analtico que est sendo utilizado para determinar algum parmetro em uma amostra, necessria a obteno de parmetros estatsticos bsicos, tais como:

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Tabela 4 Parmetros de qualidade para definir a preciso de um mtodo analtico

Em anlise quantitativa, considera-se uma preciso aceitvel quando o CV < 10%. Para anlise de resduos de pesticidas, por exemplo, consideram-se aceitveis coeficientes de variao (CV) de at 20%. Entretanto, a preciso sempre ter distores de medida, pois envolver sempre uma variedade de fatores para gerar erros: - corrente eltrica - formao de base do analista na forma de operao e interpretao - reagentes de lotes ou fabricantes diferentes - estado emocional do analista - iluminao do ambiente de trabalho - variabilidade intrnseca do equipamento (estabilidade ou tempo de estabilizao) - necessidade analtica para obter a destreza do primeiro resultado - diluies, derivaes, alquotas, temperatura ambiente e de armazenamento - transportes envolvidos at a realizao da amostra - limpeza do material analtico e de coleta

3.2.2

Avaliar a exatido:

Exatido a proximidade dos resultados obtidos pelo mtodo em estudo em relao ao valor de referncia aceito como convencionalmente verdadeiro. Quanto mais prximo for o valor obtido do valor terico, mais exato considerado o mtodo A checagem da Exatido (Validao) feita pela anlise de materiais certificados de referncia (CRMs) ou materiais referencia padro (descritos anteriormente). Outros procedimentos sugeridos para avaliar a exatido de um mtodo analtico incluem: - avaliao de amostras de concentrao conhecida comparando o valor medido com um valor tido como verdadeiro;

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- comparao dos resultados do novo mtodo com os resultados de um mtodo j validado; - recuperao de uma concentrao conhecida adicionada na amostra.

3.2.3

Avaliar a linearidade:

A linearidade corresponde capacidade do mtodo em fornecer resultados diretamente proporcionais concentrao do analito em amostras, dentro de uma determinada faixa de concentrao A quantificao requer que se conhea a dependncia entre a resposta medida e a concentrao do analito, atravs da Curva de Calibrao. A linearidade obtida por padronizao interna ou externa e formulada como expresso matemtica usada para o clculo da concentrao do analito a ser determinado na amostra real. Para isso, se faz o ajuste da reta por regresso linear.

Curva de calibrao y = resposta medida (leitura do instrumento: absorbncia, emisso, etc.); x = concentrao da amostra; sensibilidade; a = inclinao da curva de calibrao b = interseo com o eixo y, quando x=0. A lineraridade dada pelo valor do Coeficiente de correlao linear (r): indica o quanto a reta se aproxima do modelo ideal r 0,90 A qualidade da curva obtida avaliada assim: quanto mais o (r) for prximo de 1, menor a disperso do conjunto de pontos experimentais e menor a incerteza dos coeficientes de regresso estimados.

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A linearidade do grfico quando dada pelo coeficiente de correlao da reta obtida, e pode ser classificada em: R = 1 Correlao perfeita 0,91 < R < 0,99 Correlao fortssima 0,61 < R < 0,91 Correlao forte 0,31 < R < 0,60 Correlao mdia 0,01 < R < 0,30 Correlao fraca R = zero Correlao nula

3.2.4

Avaliar a sensibilidade:

A sensibilidade de um instrumento ou mtodo uma medida da sua capacidade de diferenciar pequenas variaes na concentrao do analito. Dois fatores limitam a sensibilidade: a inclinao da curva de calibrao (a) e a reprodutibilidade ou preciso do sistema de medio. Para mtodos de igual preciso, ser mais sensvel aquele que ter a maior inclinao da curva de calibrao. O mtodo mais sensvel quando pequenas variaes de concentrao resultam em maior variao na resposta, ou seja, maior inclinao (valor de a).

Por isso, podemos dizer que: o mtodo mais sensvel quando pequenas variaes de concentrao resultam em maior variao na resposta, ou seja, maior inclinao (valor de a da equao da reta).

3.2.5

Avaliar a seletividade:

Parmetro que indica o quanto o sinal analtico corresponde espcie qumica de interesse, sem interferentes. Os interferentes podem aumentar ou reduzir o sinal, e a magnitude do efeito tambm pode depender da concentrao.

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Grfico de absoro Seletividade: capacidade de diferenciar (selecionar) dois ou mais componentes de uma amostra

Como avaliar a seletividade? 1) Analisar um branco de reagentes, analisar o padro, analisar a amostra com e sem o analito de interesse (placebo). Caso o placebo no seja disponvel fazer acrscimo controlado de padro sobre a amostra. 2) Avaliar a amostra na presena de interferentes, ou seja, introduzir elementos que provoquem stress;

3.2.6

Determinar o Limite de deteco:

O limite de deteco (LD) a menor concentrao que pode ser distinguida com um certo nvel de confiana. Toda tcnica analtica tem um limite de deteco.

Sendo a a inclinao da curva de calibrao e s o desvio-padro de 10 medidas do branco. O limite de deteco geralmente expresso em unidade de concentrao.

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Exemplo:

Os parmetros exatido e preciso constituem a chave para o processo de validao. So requeridos para todos os estudos de validao de mtodos, exceto para aqueles com propsito qualitativo, que se destinam apenas a acusar a presena de um analito. Para a anlise quantitativa de elementos traos necessrio validar os limites de deteco e de quantificao. J para anlises qualitativas obrigatrio validar apenas o limite de deteco. A avaliao do parmetro da linearidade obrigatria para mtodos novos e anlises qualitativas de componentes majoritrios.

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