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149-159, dezembro 2011

PRODUO DE CIDO CTRICO POR ASPERGILLUS nIgER: AVALIAO
DE DIFEREnTES FOnTES DE nITROgnIO E DE COnCEnTRAO DE
SACAROSE
Neivair Sponchiado Pastore
1
Salah Mahmud Hasan
2
Denize Aparecida Zempulski
3
Resumo: Neste trabalho objetivou-se a produo de cido ctrico por fermentao submersa utilizando
meio sinttico enriquecido com sacarose utilizando o fungo Aspergillus niger alm de diferentes fontes
de nitrognio como o sulfato de amnio, a uria e a peptona. A fermentao foi conduzida em frascos
erlenmeyer e em estufa bacteriolgica. Atravs dos resultados obtidos, constatou-se a produo de cido
ctrico em todos os meios fermentados testados. O uso de peptona associado ao uso do sulfato de amnio
para o meio sinttico de Prescott & Dunn, apresentou melhor produo (62,9 g/L.dia de cido ctrico) sob
as condies estudadas. Em relao ao tempo para a fermentao, foi constatado que o tempo de 24h o
ideal para maior produtividade no processo.
Palavras chave: cido ctrico, fermentao submersa, Aspergillus niger
Abstract: Te aim of this work was the production of citric acid by submerged fermentation in a synthetic
medium enriched with sucrose using the fungus Aspergillus niger under diferent nitrogen resources like
ammonium sulfate, urea and peptone. Te fermentation was carried out in Erlenmeyer fasks and in
bacteriological incubator. It was observed the production of citric acid in all the fermented mediums. Te
use of peptone associated to the utilization of ammonium sulfate in the Prescott & Dunn synthetic medium
showed higher production (62.9 g/L.day of citric acid) under the studied conditions. It was also concluded
that the fermentation time of 24h was ideal for the higher process productivity.
Keywords: citric acid, submerged fermentation, Aspergillus niger
1. InTRODUO
O cido ctrico ou citrato de hidrognio, de nome
ofcial cido 2-hidroxi-1,2,3-propanotricarboxli-
co, um cido orgnico fraco, que se pode en-
contrar nos citrinos. usado como conservante
natural (antioxidante), sendo conhecido tambm
como acidulante INS 330, dando um sabor cido
e refrescante na preparao de alimentos e de be-
bidas. Em bioqumica, importante o seu papel
como intermedirio do ciclo do cido ctrico, de
forma que ocorre no metabolismo de quase todos
os seres vivos. O cido ctrico obtido na inds-
tria graas fermentao da sacarose realizada por
um micro-organismo chamado Aspergillus Nger.
O processo de obteno apresenta vrias fases
como a preparao do substrato de melao, a fer-
mentao aerbica da sacarose pelo Aspergillus, a
separao do cido ctrico do substrato por pre-
cipitao ao adicionar hidrxido de clcio, ou cal
apagada, para formar citrato de clcio e, depois,
adicionado cido sulfrico para decompor o citra-
to de clcio. A eliminao das impurezas realiza-
da com carvo ativado ou resinas de troca inica,
continuando com a cristalizao do cido ctrico,
secagem ou desidratao e o empacotamento do
produto (SOCCOL et al., 2006). A produo de
cido ctrico depende principalmente do poten-
1
Departamento de Bioengenharia da Universidade Federal do Paran
2
Departamento de Engenharia Qumica, rea Bioengenharia da Universidade Estadual do Oeste do Paran
3
Departamento de Engenharia Qumica, rea Bioengenharia da Universidade Estadual do Oeste do Paran
150 ENGEVISTA, V. 13, n. 3. p. 149-159, dezembro 2011
cial de sntese do micro-organismo utilizado, po-
rm as condies do processo e a composio do
meio fermentativo so variveis importantes que,
quando otimizadas, podem promover um acrsci-
mo no rendimento (MILLIS, 1985).
Aproximadamente 70 % do cido ctrico
produzido utilizado na indstria alimentcia e
de bebidas, 12 % na farmacutica e 18 % desti-
nado a outros usos industriais (LEONEL & CE-
REDA 1995).
Desde 1930, existe a preocupao sobre os
mecanismos bioqumicos que provocam a acumu-
lao de cido ctrico no meio de cultivo com mi-
cro-organismos. O cido ctrico s se acumula de
duas maneiras: ou quando vrios nutrientes esto
presentes em altas concentraes (acar, acidez,
oxignio) ou quando esto em nveis abaixo do
timo (ons metlicos, nitrognio, fosfato). Vrias
situaes bioqumicas parecem cooperar na pro-
dutividade em cido ctrico. Por causa disso, nem
sempre a infuncia de fatores individuais pode
ser determinada sem que haja infuncia sobre ou-
tros fatores. Atualmente, o cido ctrico quase
que exclusivamente obtido atravs de processos
de biossntese utilizando como agente biolgico
o fungo imperfeito Aspergillus niger. Dois proces-
sos so utilizados na biossntese deste cido, o de
superfcie e o submerso, que se diferenciam essen-
cialmente pelo modo de crescimento do micro-
-organismo (LEONEL & CEREDA, 1995). Exis-
tem muitos fungos produtores de cido ctrico:
Penicillium citrinum, Mucor piriformis, Ustilina
vulgaris, Penicillium luteum, Aspergillus clavatus.
So de interesse industrial as espcies que permi-
tem altos rendimentos de produo de cido ctri-
co, entre estes os fungos do gnero Aspergillus so
muito empregados para este propsito (LIMA et
al., 2001).
Para que a obteno do cido ctrico seja vi-
vel comercialmente, vrios fatores devem ser le-
vados em considerao no processo fermentativo,
como por exemplo, os constituintes do meio de
cultivo, o pH, a aerao, a temperatura e o micro-
-organismo empregado (KOLICHESKI, 1995).
Os fungos flamentosos alm de sintetizar o cido
ctrico, tambm secretam uma grande variedade
de enzimas extracelulares como protease, amilase,
celulases, lpases entre outras.
O nitrognio constituinte essencial do
tecido fngico, j que est presente em todas as
molculas de aminocidos e conseqentemente
nas protenas. Tanto os substratos naturais como
os substratos sintticos e semi-sintticos utilizados
no cultivo de fungos deve conter uma fonte de
nitrognio, no entanto observa-se que os fungos
apresentam diferenas na habilidade para a utili-
zao das diversas fontes de nitrognio. Nenhum
fungo conhecido fxa nitrognio atmosfrico.
Fontes de nitrognio so requeridas para a sntese
de aminocidos, vitaminas, purinas e pirimidinas
dos cidos nuclicos e para sntese de glicosami-
na para montagem de quitina (polmero que o
principal componente estrutural do exoesquele-
to de invertebrados e da parede celular fungica)
(TRABULSI, 2005).
Dependendo da espcie do fungo, o ni-
trognio pode ser obtido nas formas de nitra-
to, nitrito, amnia ou nitrognio orgnico. A
maioria dos fungos usa nitrato que reduzido
a nitrito com mediao da enzima nitrato redu-
tase e depois a amnia. A determinao da fon-
te de nitrognio essencial, pois o nitrognio
est intimamente relacionado ao metabolismo
dos micro-organismos. Das vrias formas de ni-
trognio encontradas na natureza, os micro-or-
ganismos assimilam mais facilmente a amnia.
Porm, micro-organismos que possuem enzimas
nitrato redutase e nitrito redutase apresentam a
capacidade de assimilar, respectivamente, nitrato
ou nitrito, reduzindo nitrato nitrito, e nitrito
amnia (PUTZKE, 2002).
Como fonte de nitrognio so freqente-
mente utilizados o sulfato de amnio (o qual cos-
tuma provocar reduo signifcativa do pH e, em
alguns casos, fenmenos de inibio pelo sulfato),
uria (a qual permite reduzir problema de contro-
le de pH) e peptona (a qual costuma ser bastan-
te dispendiosa, inviabilizando seu uso industrial)
(SCHMIDELL, 2001). Aps defnir qual o mi-
cro-organismo e as condies de nutrientes neces-
srias para o seu desenvolvimento, defne-se qual
o processo fermentativo a ser utilizado, levando
em considerao o tipo de substrato a ser utiliza-
do. Os substratos a serem utilizados podem estar
tanto na forma natural como na forma sinttica,
dependendo do processo que se deseje realizar, da
facilidade de se obter a matria prima ou dos re-
sultados que se desejam obter. Levando isto em
considerao, o objetivo deste trabalho foi avaliar
a produo de cido ctrico de Aspergillus niger
por fermentao submersa em meio sinttico de
Prescott & Dunn suplementado por fontes de ni-
151 ENGEVISTA, V. 13, n. 3. p. 149-159, dezembro 2011
trognio (uria, peptona e sulfato de amnio) e
sacarose.
2. MATERIAIS E MTODOS
2.1 MICRO-ORGANISMO
O micro-organismo utilizado neste traba-
lho foi o fungo Aspergillus niger, cedido pelo la-
boratrio de Bioqumica do Centro de Cincias
Biolgicas e da Sade, UNIOESTE Cascavel.
Foi conservado sob refrigerao a 4C em meio
inclinado BDA (Batata Dextrose Agar), sendo re-
picado a cada dois meses. O preparo do inoculo
foi feito com 800 mL de meio BDA inclinado, e
incubando o fungo Aspergillus niger por um per-
odo de 9 dias a 30C. Aps, foi feita raspagem dos
esporos na superfcie com 200 mL de gua estril
e uma gota de Tween 80. Em seguida, a suspenso
de esporos foi fltrada em algodo estril, a fm de
remover o miclio e gar, e feita a contagem de
esporos em cmara de Neubauer de onde se obje-
tivou obter a concentrao padro de 10
8
esporos/
mL de substrato na fermentao.
2.2 SUBSTRATO
O meio sinttico utilizado foi o de Prescott
& Dunn (1959), que foi distribudo em erlen-
meyers de 250 mL na proporo de 80 mL por
frasco e esterilizados a 121C por 15 minutos. O
meio sinttico utilizado no experimento para a
fermentao submersa constitudo de carboidra-
tos e sais orgnicos, contendo sacarose (g/L), 50;
NH
4
NO
3
, 1; KH
2
PO
4
, 1; MgSO
4
.7H
2
O, 0,23.
2.3 PRODUO DE CIDO CTRICO
POR FERMENTAO SUBMERSA
Aps a esterilizao, o meio foi resfriado,
inoculado com 1,5 mL da suspenso com 10
8
es-
poros/mL e incubado a 30C e 100 rpm em shaker,
por 6 dias. A coleta de amostras ocorreu a cada
24h sendo utilizadas para anlises de cido ctrico,
pH e acar redutor. Os ensaios de fermentao
submersa (FSm) foram conduzidos em frascos er-
lenmeyer de 250 mL. O extrato bruto coletado foi
fltrado e centrifugado (10.000g por 5 min), para
remoo dos slidos suspensos e, posteriormente,
acondicionado em freezer para serem analisados.
2.4 MTODOS ANALTICOS
A determinao de cido ctrico foi reali-
zada seguindo o mtodo de Safran & Denstedt
(1948), neste mtodo pequenas quantidades de
cido ctrico so determinadas baseando-se na
formao da cor amarela na presena de cido tri-
cloroactico (TCA), anidrido actico e piridina.
Para a curva padro foi utilizada uma soluo de
cido ctrico dissolvendo 4 g de cido ctrico em
100 mL de TCA a 15 %.
O mtodo de determinao da concentra-
o de acar redutor usado neste trabalho foi ba-
seado no mtodo proposto por Miller (1959), o
qual utiliza o reagente DNS (cido 3,5-dinitrosa-
liclico) e possui sensibilidade na faixa de 0,1 a 1,0
g/L de acar redutor expresso como glicose. A
curva padro de glicose foi construda nas mesmas
condies para a determinao de cido ctrico,
utilizando sacarose como padro.
O fuxograma (Figura1) mostra de maneira
simplifcada as principais etapas realizadas neste
trabalho.
Figura 1. Fluxograma de trabalho
152 ENGEVISTA, V. 13, n. 3. p. 149-159, dezembro 2011
2.5 PLANEJAMENTO EXPERIMEN-TAL
Para a avaliao do processo de produo de
cido ctrico, executou-se o planejamento expe-
rimental fatorial 2
4
com seis repeties no ponto
central, totalizando 22 ensaios. As variveis estu-
dadas foram a concentrao de sacarose e a con-
centrao de diferentes fontes de nitrognio (uria,
peptona e sulfato de amnio), cujos nveis esto
apresentados na Tabela 1. O meio sinttico possui
em sua composio 5 % de sacarose, sendo esta a
concentrao mnima inicial de sacarose nos meios
utilizados neste trabalho, correspondendo ao nvel
-1 apresentado na Tabela 1. Nesta tabela os nveis
dos fatores referem-se a suplementao dos ensaios,
e no a concentrao inicial nos meios.
Tabela 1: Nveis dos fatores utilizados no
planejamento fatorial 2
4
.
Varivel
Nvel
-1 0 1
Uria (g/L) 0 2,5 5
Peptona (g/L) 0 2,5 5
S. de Amnio (g/L) 0 2,5 5
Sacarose (g/L) 0 50 100
Os resultados obtidos na produo de cido
ctrico foram analisados no programa Statistica
TM

(v. 8.0) onde foi realizada uma estimativa dos efei-
tos das variveis sobre a resposta analisada. Os ex-
perimentos foram monitorados atravs da anlise
da produo de cido ctrico (g/L), variao de
pH e concentrao de acares redutores (g/L).
A anlise do planejamento experimental do tipo
2
4
gera valores de coefcientes para um modelo
matemtico linear conforme a equao (1),
) 1 ........( . . . . . .
. . . . . .
. . . .
4 3 34 4 2 24 3 2 23
4 1 14 3 1 13 2 1 12
4 4 3 3 2 2 1 1 0
x x x x x x
x x x x x x
x x x x y



+ +
+ + +
+ + + + + =

onde y a varivel resposta e corresponde a
produtividade de cido ctrico em 24h de fermen-
tao, x
1
, x
2
, x
3
e x
4
so as variveis estudadas cor-
respondentes aos nveis das concentraes de uria,
peptona, sulfato de amnio e sacarose, respectiva-
mente, os demais parmetros da equao referem-
-se a interao de duas variveis e os diferentes
so os coefcientes calculados para cada termo da
equao, sendo
0
o termo independente o qual
corresponde ao intercepto da reta no eixo y.
3. RESULTADOS E DISCUSSO
Visando avaliar a produo de cido ctrico com
A. niger fez-se um estudo com o meio sinttico de
Prescott & Dunn variando-se a concentrao de
diferentes fontes de nitrognio (uria, peptona e
sulfato de amnio) alm da concentrao da fonte
de carbono (sacarose). Para tanto foi utilizada a
matriz de planejamento fatorial completo 2
4
com
sextuplicata no ponto central, conforme Tabela 2.
Assim, para cada um dos 22 ensaios do pla-
nejamento foram coletadas amostras ao longo do
tempo, sendo uma amostra a cada 24 h, durante 6
dias, para analisar e verifcar o comportamento da
produo de cido ctrico, do pH e do consumo
de acar redutor. Posteriormente, foi realizada a
anlise estatstica considerando-se o melhor tem-
po para a produo de cido ctrico.
Verifcou-se, mediante anlise das curvas
cinticas dos 22 ensaios, que o tempo de fermen-
tao de 24h apresentava os maiores nveis de pro-
dutividade para o cido ctrico. Assim, a Tabela 2
apresenta, para cada ensaio o resultado de produ-
tividade em 24h de produo. Uma anlise inicial
da tabela indica que o ensaio nmero 7 apresenta
maior resultado de produtividade (62,9 g/L.dia)
de cido ctrico, correspondente aos nveis infe-
riores para a uria e sacarose e aos nveis superiores
de peptona e sulfato de amnio.
Os piores resultados foram obtidos no n-
vel central (ensaios 17 22), com baixos valores
de produtividade. Normalmente, no ponto central
so fxados os nveis onde se espera obter os me-
lhores resultados para ento se fazer uma anlise
do processo nos demais nveis. Assim, os resultados
obtidos indicam que o ponto central est situado,
ou prximo a uma regio de mnimo, onde qual-
quer variao, para menos ou para mais nos nveis
dos quatro fatores resulta no acrscimo da produ-
tividade em cido ctrico. Apesar, dos valores infe-
riores de produo de cido ctrico, verifca-se nas
repeties no nvel zero que houve um alto grau de
reprodutibilidade dos ensaios, o que diminui signi-
fcativamente a incerteza na anlise estatstica.
Atravs de anlise estatstica preliminar veri-
fcou-se que o modelo linear (equao 1) resultan-
153 ENGEVISTA, V. 13, n. 3. p. 149-159, dezembro 2011
te do tipo de planejamento fatorial utilizado no
apresentou ajuste aos resultados experimentais de
produtividade em cido ctrico, o que implica na
necessidade da insero de um ou mais termos
quadrticos na equao, gerando assim um mo-
delo no linear. Portanto, a Tabela 3 apresenta os
valores dos coefcientes calculados para o modelo
linear (equao 1) originalmente proposto, acres-
cido do termo de curvatura necessrio para a ge-
rao de um modelo quadrtico. O baixo p-valor
indica que todos os parmetros so signifcativos
no modelo (incluindo a curvatura) e infuenciam
no processo (p-valor < ), considerando-se o nvel
de signifcncia de 5% ( = 0,05). A anlise de
varincia dos dados (Tabela 4), por sua vez indica
que um modelo linear no adequado para re-
presentar o comportamento do processo, ou seja,
originalmente um modelo quadrtico ajustaria
Tabela 2: Matriz do planejamento fatorial experimental 2
4
com resultados de produtividade de cido
ctrico (AC) para o tempo de 24h de fermentao.
Ensaio Uria (x
1
) Peptona (x
2
)
Sulfato de
Amnio (x
3
)
Sacarose (x
4
)
Produtividade AC (g/L.dia)
em 24h (y)
1 -1 -1 -1 -1 57,2
2 1 -1 -1 -1 58,3
3 -1 1 -1 -1 56,3
4 1 1 -1 -1 45,9
5 -1 -1 1 -1 61,4
6 1 -1 1 -1 58,4
7 -1 1 1 -1 62,9
8 1 1 1 -1 56,4
9 -1 -1 -1 1 60,1
10 1 -1 -1 1 57,4
11 -1 1 -1 1 57,7
12 1 1 -1 1 58,3
13 -1 -1 1 1 47,5
14 1 -1 1 1 60,3
15 -1 1 1 1 60,5
16 1 1 1 1 40,0
17 0 0 0 0 8,1
18 0 0 0 0 8,1
19 0 0 0 0 8,1
20 0 0 0 0 7,8
21 0 0 0 0 8,1
22 0 0 0 0 8,1
melhor os dados experimentais obtidos. Isso fca
mais evidenciado pelo termo relativo a curvatura
(Tabela 3) determinada como parmetro a ser in-
serido no modelo. Observa-se o elevado grau de
infuncia da curvatura no modelo pelo p-valor
que resultou em zero.
A anlise de varincia, ANOVA, (Tabela 4)
foi feita considerando no resduo a infuncia da
falta de ajuste do modelo, a qual fcou fortemente
evidenciada pelo p-valor igual a zero, indicando a
real necessidade da insero da curvatura no mode-
lo atravs de um ou mais termos quadrticos. O va-
lor da mdia quadrtica (MQ) para o erro puro est
relacionada a varincia global do processo em ter-
mos de erros sistemticos e aleatrios. Dessa forma,
seu baixo valor obtido indica a boa reprodutibilida-
de do processo, o que foi corroborado pelos ensaios
em sextuplicata no planejamento experimental.
154 ENGEVISTA, V. 13, n. 3. p. 149-159, dezembro 2011
Tabela 3: Coefcientes do modelo linear gerado pelo planejamento 2
4
( = 0,05)
Parmetro Coefciente Erro padro do coefciente p-valor
Intercepto
0
= 56,1625 0,030619 0,000000
Curvatura -48,1125 0,058630 0,000000
UR
1
= -1,7875 0,030619 0,000000
PEP
2
= -1,4125 0,030619 0,000000
SAM
3
= -0,2375 0,030619 0,000570
SAC
4
= -0,9375 0,030619 0,000001
Interao x1.x2
12
= -2,8125 0,030619 0,000000
Interao x1.x3
13
= -0,3625 0,030619 0,000076
Interao x1.x4
14
= 0,5625 0,030619 0,000009
Interao x2.3
23
= 0,4375 0,030619 0,000030
Interao x2.x4
24
= 0,3125 0,030619 0,000155
Interao x3.x4
34
= -2,9125 0,030619 0,000000
R
2
= 0,98
Tabela 4: Anlise de varincia do planejamento fatorial 2
4
( = 0,05)
Fonte de variao SQ GL MQ
F p-valor
Modelo com curvatura 10473,09 11 952,10
44,70 -
Falta de ajuste (a) 212,95 5 42,59
4259 0,00000
Erro puro (b) 0,07 5 0,01
Resduo (a+b) 213,02 10 21,30
Total 10686,11 21
SQ = soma quadrtica; GL = graus de liberdade; MQ = mdia quadrtica; F = estatstica F
Os valores negativos dos coefcientes do
modelo (Tabela 3) indicam que para alcanar-se
maiores produtividades de cido ctrico deve-
-se procurar trabalhar com nveis mais baixos de
concentrao dos quatro nutrientes (entre 0 e -1).
Assim, pretende-se, numa etapa posterior, im-
plementar um novo delineamento do tipo com-
posto central rotacional (DCCR) para viabilizar
um ajuste no linear s variveis estudadas. No
DCCR as 4 variveis seriam avaliadas nos nveis
-2, -1, 0, +1 e +2.
A diferena entre da utilizao de diferentes
meios j havia sido observada por Adham (2002),
que utilizou meio sinttico e meio contendo me-
lao de beterraba em diferentes concentraes de
leos vegetais e diferentes tipos de fermentaes,
neste caso, o autor chegou a concluso que o
fungo apresenta diferentes respostas para os ons
metlicos e minerais presentes nos meios de fer-
mentao.
Foram feitas as curvas cinticas de produ-
o de cido ctrico, consumo de acar redutor
para o ensaio nmero 7 do planejamento fatorial
(Figura 2).
Qualquer aumento ou diminuio na con-
centrao de nitrognio no meio de fermentao
faz com que ocorram oscilaes na produo de
cido ctrico (SIKANDER et al., 2004). Seguin-
do a observao dos autores, pode-se verifcar na
Figura 1 a ocorrncia desta oscilao, sendo que
a maior concentrao de cido ctrico foi de 62,9
g/L para o primeiro dia. No meio de fermentao
do ensaio 7, utilizou-se a peptona e o sulfato de
amnio como fontes de nitrognio o que suporia
155 ENGEVISTA, V. 13, n. 3. p. 149-159, dezembro 2011
uma rpida metabolizao do sulfato de amnio
pelo fungo, produzindo acido ctrico.
0 1 2 3 4 5 6
0
10
20
30
40
50
60
70
80
A
R

(
g
/
L
)
,


A
C

(
g
/
L
)
Tempo de fermentao (dias)
AR (g/L)
AC (g/L)

Figura 2. Perfs cinticos de concentrao do
cido ctrico (AC) e acar redutor (AR) obtidos
para o ensaio n 7 do planejamento fatorial 2
4
.
Entretanto como o meio tambm possui
peptona como fonte de nitrognio, e a assimila-
o desta lenta devido a necessidade da decom-
posio da mesma para a liberao do nitrognio,
conseqentemente durante o processo de decom-
posio tambm pode ocorrer uma degradao do
cido ctrico j produzido. Neste caso pode-se ob-
servar que no intervalo de tempo entre o segundo
e o terceiro dia de fermentao o fungo poderia
voltar a apresentar uma nova fase de germinao,
isso porque peptona fonte de nitrognio orgni-
co e contem algumas vitaminas e/ou carboidratos,
dependendo do material protico digerido para a
sua produo. Isso faz com que ocorra um aumen-
to da biomassa, com diminuio ou consumo dos
acares redutores presentes no meio e posterior-
mente voltando a produzir o cido ctrico.
As oscilaes observadas na produo de
cido ctrico durante a fermentao podem ocor-
rer tambm em funo da produo de dixido de
carbono, que apesar deste parmetro no ser ana-
lisado neste experimento, coincide com os resul-
tados obtidos por Priede & Tomas (1999), que
tambm observaram estas oscilaes ao estudarem
a relao entre a morfologia e a produo de cido
ctrico por Aspergillus niger em fermentao sub-
mersa utilizando meio sinttico.
Com base nos resultados obtidos neste traba-
lho pode-se afrmar que o pH do meio de fermen-
tao sinttico de Prescott & Dunn, que inicial-
mente na faixa entre 4 e 6 (pelo fato de no estar
tamponado), apresentou diminuio signifcativa
(Figura 3), sendo este um parmetro importante
que foi observado no decorrer do tempo, pois in-
dica que durante a fermentao do meio, ocorreu
a formao de cidos orgnicos, entre eles o cido
ctrico, contribuindo para seu abaixamento.
Fontes de carboidrato tambm so necess-
rias para a produo de cido ctrico, sendo que
a presena de carboidrato prontamente metabo-
lizvel essencial para uma boa produo de ci-
do ctrico. A maltose, sacarose, manose, glicose e
frutose so os acares mais apropriados para a
produo de cido. Neste trabalho foi utilizado a
sacarose como fonte de carboidrato, entretanto o
meio que apresentou melhor resultados (ensaio 7)
no foi suplementado com a sacarose, utilizando
apenas a concentrao inicial de 50 g/L no meio
sinttico (prpria do meio). Observa-se que a va-
riao temporal do acmulo do cido ctrico cor-
responde exatamente com a diminuio do pH
assim que se inicia a produo do cido ctrico,
conforme observado na Figura 1. Bonatelli Jr. et
al. (1982), realizando fermentao em meio sint-
tico Prescott & Dunn, por um perodo de 7 dias,
obtiveram uma produo mxima de 92 g/L a
partir de uma cepa de fungo Aspergillus niger mu-
tante, aps 48 h de incubao.

0 1 2 3 4 5 6
1
2
3
4
5
6
7
p
H
Tempo de fermentao (dias)
Figura 3. Variao do pH com o tempo de
fermentao obtida para o ensaio n 7 do
planejamento fatorial 2
4
.
156 ENGEVISTA, V. 13, n. 3. p. 149-159, dezembro 2011
Dorouneh et al (2009), obtiveram uma
produtividade de 13,4 g/L.dia em fermentao
submersa, aps um perodo de 10 dias, utilizando
o meio sinttico, entretanto ao utilizar um meio
enriquecido com melao de cana de acar obteve
uma produtividade de 12 g/L.dia aps 10 dias.
Um fator importante que deve ser levado
em considerao durante o perodo de fermenta-
o o pH, no ensaio 7, observa-se um pH inicial
de 6,2 e fnal de 1,3. Segundo Papagianni (2007),
valores de pH baixo inibem a produo de cidos
orgnicos indesejveis (cido glucnico e cido
oxlico), tornando a recuperao de cido ctrico
mais simples a partir do meio de fermentao. Sa-
be-se tambm que nenhum fungo conhecido con-
segue fxar nitrognio atmosfrico, desta forma,
fontes de nitrognio so requeridas para a sntese
de aminocidos, vitaminas, purinas e pirimidinas
dos cidos nuclicos e para sntese de glicosamina
para montagem de quitina (principal componente
da parede celular do fungo). A fermentao ctrica
submersa requer tambm uma concentrao de
fonte de nitrognio de 0,1 a 0,4 g/L. Em elevada
quantidade, este composto propicia o crescimento
fngico e o consumo de substrato, diminuindo o
acmulo de cido ctrico (SOCCOL et al., 2006).
Os compostos de sais de amnio (sulfato de am-
nio e nitrato de amnio) so os mais empregados,
pois ao serem consumidos, diminuem o pH do
meio, o que essencial para obteno de cido
ctrico (YIGITOGLU, 1992). Isso justifca a re-
duo de pH observada no ensaio 7.
Dependendo da espcie do fungo, o nitro-
gnio pode ser obtido nas formas de nitrato, nitri-
to, amnia ou nitrognio orgnico. A maioria dos
fungos usa nitrato que reduzido a nitrito com
mediao da enzima nitrato redutase e depois a
amnia. Esta a forma na qual ocorre a capta-
o de amnia no meio de fermentao no inicio
da germinao dos esporos do fungo e provocam
liberao de prtons o que contribui para a redu-
o do pH a nveis adequados para que ocorra a
total germinao destes esporos. Se durante essa
fase ocorrer um aumento de pH acima de 4,5 a
produo de cido ctrico pode ser reduzida em
at 80% (PAPAGIANNI, 1995).
O controle de pH tambm pode ser crti-
co nos processos de fermentao (NAGEL et al.,
1999), pois como conseqncia da degradao dos
acares ou matria orgnica presente no meio,
ocorre a formao de cidos orgnicos que baixam
o pH, assim como o consumo de sais de amnio.
Por outro lado, se cidos orgnicos presentes no
substrato so assimilados, o pH aumenta, assim
como a hidrlise de uria resulta na alcalinizao
do meio (RAIMBAULT, 1998).
A amnia tambm bastante utilizada
como nutriente pelos fungos, porm, quando o
meio bsico, ela se torna txica para estes micro-
-organismos e o Aspergillus niger necessita de fon-
te de nitrognio para a produo de cido ctrico
(HAQ et al., 2005). De acordo com Esposito &
Azevedo (2004), os fungos podem utilizar amnia
por difuso simples atravs da membrana celular,
entretanto os ons amnio presentes no atraves-
sam a parede celular. Porm, Roukas & Harvey
(1988) explicaram que no interior da clula, ni-
trato convertido a nitrito e este ao on amnio
que ento utilizado pelo fungo. Para que isto
ocorra, o pH timo deve estar entre 4 e 6 e o on
amnio no ser metabolizado intracelularmente
se o pH for inferior a 4 (GRIFFIN, 1994).
As mudanas de pH, ao longo do cultivo,
dependem principalmente do micro-organismo
e do substrato e para amenizar o efeito de uma
variao brusca do pH a adio de sais de amnio
ou uria tambm pode ser usada. De um modo
geral, na fermentao submersa os valores iniciais
de pH so baixos, favorecendo o crescimento de
fungos e leveduras e difcultando o crescimento de
bactrias (DEL BIANCHI et al., 2001). Porm,
no h consenso na literatura sobre um pH inicial
timo para o acmulo de cido ctrico. Yigitoglu
et al. (1992), indicam que um pH de 2,5 seria o
ideal para a concentrao do produto. Papagianni
(1995) afrma que um pH de 4,5 durante a fase
de produo reduz o rendimento do cido ctrico,
no entanto para que haja o desenvolvimento de
esporos necessrio um pH em torno de 5,5.
Ainda que o pH mais favorvel ao desenvol-
vimento dos fungos esteja entre 5, 6 e 7, a maio-
ria dos fungos toleram amplas variaes de pH.
Os fungos flamentosos podem crescer na faixa
entre 1,5 e 11, entretanto algumas leveduras no
toleram pH alcalino. Os meios com pH entre 5
e 6, com elevadas concentraes de acar e alta
presso osmtica, tais como gelias, favorecem o
desenvolvimento dos fungos nas pores que es-
tiverem em contato com o ar. Desta forma, neste
trabalho utilizou-se um pH inicial na faixa entre
5 e 7, sendo que os meios no foram tamponados,
assim pode-se observar uma variao natural no
157 ENGEVISTA, V. 13, n. 3. p. 149-159, dezembro 2011
valor de pH durante o perodo de fermentao,
embora os constituintes normais, como a peptona
e os aminocidos, presentes nos meios de fermen-
tao, possam funcionar como tampes, em virtu-
de de sua prpria natureza.
Foi observado neste trabalho um decaimen-
to no pH nos ensaios 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14 e
16, isto ocorre, segundo Lehninger et al. (1995),
devido produo de algumas molculas cidas
pelo fungo Aspergillus niger quando cultivado na
presena de meios contendo fontes de nitrognio.
Com exceo do ensaio 7 os demais ensaios foram
suplementados com sacarose, o decaimento de
pH pode estar relacionado com a decomposio
da matria orgnica presente nos meios. Outro fa-
tor que pode infuenciar no decaimento do pH
a presena da peptona que tambm pode ser utili-
zada como matria orgnica, uma vez que o meio
possui sulfato de amnio, como fonte de nitrog-
nio, favorecendo o desenvolvimento fungico e o
acmulo do cido ctrico. Os demais meios no
foram suplementados com sacarose apenas com
as fontes de nitrognio inorgnico (uria e sulfato
de amnio) e orgnico (peptona), nos meios 1,
5, 6, 17, 18, 19, 20, 21 e 22 o pH manteve-se
estvel, como citado anteriormente a variao do
pH no ocorre devido a presena de alguns cido
orgnicos e a hidrlise da uria presente no meio
de fermentao inclusive podem torn-lo alcalino
como ocorreu nos ensaios 2, 4, 8 e 15.
Outro fator analisado o consumo de a-
car redutor presente no meio fermentativo. Em
geral, apenas os acares que so assimilados rapi-
damente por fungos so utilizados como fonte de
carbono na fermentao ctrica (sacarose, frutose,
glicose) (YIGITOGLU, 1992). Segundo Kubi-
cek & Rohr (1986), a principal fonte de carbono
empregada a sacarose, seja na forma pura ou na
forma presente em melaos de cana-de-acar ou
beterraba.
No ensaio 7 a concentrao de acar re-
dutor inicial foi de 41,3 g/L e fnal de 22,7 g/L.
A concentrao e o tipo de fonte de carbono so
importantes para o acmulo de cido ctrico. Em
fermentao submersa a faixa tima de concen-
trao de sacarose 10 a 14%, sendo que abaixo
de 2,5% no h produo de cido ctrico (XU
et al., 1989). Segundo Penna (2001), as baixas
concentraes de acares facilitam o acmulo de
cido oxlico, e, conseqentemente, diminuem a
produo de cido ctrico. O meio sinttico pos-
sui em sua composio 5 % de sacarose, sendo
esta a concentrao mnima inicial de sacarose nos
meios utilizados neste trabalho, correspondendo
ao nvel -1 apresentado anteriormente na Tabela
1. Nesta tabela os nveis dos fatores referem-se a
suplementao dos ensaios, e no a concentrao
inicial nos meios.
4. COnCLUSO
Foi possvel observar neste trabalho que a associa-
o de uma ou mais fontes de nitrognio ao meio
de cultivo proporciona maiores rendimentos, sen-
do que a adio de peptona associada ao sulfato de
amnio resultou, no tempo de fermentao de 24
h, uma maior produtividade de cido ctrico (62,9
g/L.dia). O pH em que se obteve o maior rendi-
mento foi o de 5,3 sem que se houvesse utilizado
qualquer tipo de correo no meio de fermentao.
Com relao sacarose pode-se afrmar que
com concentraes de 50 g/L no meio de fermen-
tao (composio original do meio sinttico de
Prescott & Dunn) obtm-se valores de acmulo
de cido ctrico expressivos.
Como o cido ctrico possui uma gama de
utilizaes e o mercado consumidor crescente, a
busca de fontes alternativas e de baixo custo para
a sua produo torna-se relevante, pois o cido
ctrico compete diretamente no mercado de aci-
dulantes com o cido ltico, fumrico e forfrico.
Para a melhor quantifcao e qualifcao
do cido ctrico e do acar redutor, em trabalho
futuro, sero feitas anlises de cromatografa lqui-
da e gasosa e desta forma defnir qual o mtodo de
purifcao mais adequado e qual o uso fnal deste
cido ctrico.
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