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Nmero, 127

ISSN 0104-6187

Dezembro/2000

Pseudomonas spp. Fluorescentes - Bactrias Promotoras de Crescimento de Plantas e Biocontroladoras de Fitopatgenos em Sistemas de Produo Agrcola

Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria Agrobiologia Ministrio da Agricultura e do Abastecimento

Repblica Federativa do Brasil Presidente Fernando Henrique Cardoso Ministrio da Agricultura e do Abastecimento Ministro Marcus Vinicius Pratini de Moraes Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria - Embrapa Diretor Presidente Alberto Duque Portugal Diretores Elza ngela Battaggia Brito da Cunha Dante Daniel Giacomelli Scolari Jos Roberto Rodrigues Peres

Embrapa Agrobiologia Chefe Geral Maria Cristina Prata Neves Chefe Adjunto de Pesquisa e Desenvolvimento Sebastio Manhes Souto Chefe Adjunto Administrativo Vanderlei Pinto

DOCUMENTO N 127

ISSN 0104-6187
Dezembro/2000

Pseudomonas spp. Fluorescentes - Bactrias Promotoras de Crescimento de Plantas e Biocontroladoras de Fitopatgenos em Sistemas de Produo Agrcola

Valria C.P. Zago Helvcio De-Polli Norma G.

Seropdica - RJ 2000

Exemplares desta publicao podem ser solicitadas : Embrapa Agrobiologia Caixa Postal: 74505 23851-970 Seropdica RJ Telefone: (021) 682-1500 Fax: (021) 682-1230 e-mail: sac@cnpab.embrapa.br

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Tiragem: 50 exemplares Comit de Publicaes: Sebastio Manhes Souto (Presidente) Jos Ivo Baldani Norma Gouva Rumjanek Jos Antonio Ramos Pereira Robert Michael Boddey Dorimar dos Santos Felix (Bibliotecria)

ZAGO, V.C.P.; DE-POLLI, H.; RUMJANEK, N.G. Pseudonomas spp. Fluorescentes Bactrias promotoras de crescimento de plantas e biocontroladoras de fitopatgenos em sistemas de produo agrcola. Seropdica: Embrapa Agrobiologia, dez. 2000. 32p. (Embrapa-CNPAB. Documentos, 127).

ISSN 0104-6187 1. Pseudomonas spp. 2. Produo Agrcola. 3. Bacteria. 4. Crescimento. 5. Planta. I. De-Polli, H., colab. III.. Embrapa. Centro Nacional de Pesquisa de Agrobiologia (Seropdica, RJ). IV. Ttulo. V. Srie.

CDD 579.332

Embrapa

SUMRIO
1. INTRODUO .................................................................................... 2 2. TAXONOMIA DE PSEUDOMONAS ................................................ 4 3. COLONIZAO DA RIZOSFERA ................................................... 4 4. PROMOO DE CRESCIMENTO ................................................... 6 5. MECANISMOS DE AO................................................................. 7
5.1 PRODUO DE ANTIBITICOS .............................................................................. 7 5.2 SIDERFOROS .................................................................................................... 9 5.3 PRODUO DE CIDO HICROCINICO (HCN).................................................... 11 5.4 PRODUO DE REGULADORES DE CRESCIMENTO.............................................. 11 5.5 COMPETIO POR SUBSTRATO E EXCLUSO DE NICHO ..................................... 12 5.6 MINERALIZAO DE NUTRIENTES ...................................................................... 12 5.7 PARASITISMO .................................................................................................... 13 5.8 AUMENTO DA NODULAO DE RIZBIOS ............................................................ 13 5.9 INDUO DE RESISTNCIA ................................................................................. 13

6. CARACTERIZAO FENOTPICA E GENOTPICA .................. 14 7. MELHORAMENTO GENTICO...................................................... 15 8. CONSIDERAES FINAIS ............................................................ 16 9. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ............................................. 16

Pseudomonas spp. Fluorescentes - Bactrias Promotoras de Crescimento de Plantas e Biocontroladoras de Fitopatgenos em Sistemas de Produo Agrcola
Valria Cristina Palmeira Zago1 Helvcio De-Polli2 Norma Gouvea Rumjanek2

1. Introduo
Dentre os grupos de bactrias mais estudados e de grande potencial para utilizao na agricultura encontram-se as rizobactrias promotoras de crescimento de plantas (RPCPs), representando um subgrupo diverso de bactrias que colonizam as razes. O estudo desses microrganismos vem merecendo destaque nos ltimos anos. Devido grande demanda por tecnologias limpas, ou seja, a viabilizao da agricultura sustentvel, pode-se esperar que futuramente, uma percentagem maior destas bactrias seja usada na produo de alimentos. O termo Rizobactrias Promotoras de Crescimento em Plantas (RPCPs) foi adotado por Schroth & Hancock (1982) para descrever bactrias benficas bem adaptadas s razes das plantas, e para diferenci-las das bactrias do solo que no as colonizam ou no o fazem to agressivamente (Botelho, 1996). Historicamente, as pesquisas com rizobactrias no simbiticas, como na rea de tratamento biolgico de sementes, foram iniciadas h um sculo, com o objetivo de aumentar o crescimento e o rendimento das plantas. Essas investigaes com sistemas no rizobiais comearam na Rssia e na Ucrnia, em 1885, usando Azotobacter chroococcum, Bacillus megaterium e outras espcies de Bacillus (Mishustin, 1963; citado por Luz, 1996). Entretanto, os primeiros inoculantes usados na agricultura foram os rizbios (Rhizobium e Bradyrhizobium), que fixam o nitrognio em simbiose com leguminosas. Somente nos anos 50 que microrganismos no rizobiais foram utilizados na agricultura. Em 1958, mais de 35 milhes de hectares de
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Bolsista de Doutorado da Embrapa Agrobiologia. Pesquisadores da Embrapa Agrobiologia, Caixa postal 74505, Cep: 23.851-970, Seropdica-RJ.

terras cultivadas foram tratadas com inoculantes no rizobiais na Rssia, aumentando o rendimento agrcola em 10 a 20%. Estes foram chamados de fertilizantes bacterianos (Luz, 1996). Nas dcadas de 60 e 70, investigadores da ndia tambm usaram inoculantes produzidos na Rssia e Ucrnia e isolados indianos de Beijerinckia e de Pseudomonas (Balasundaram & Sem, 1971; citado por Luz, 1996). Embora o reconhecimento de que certas bactrias poderiam estimular o crescimento das plantas j estivesse estabelecido, somente com os trabalhos de Burr et al. (1978), em batata, e de Kloepper & Schroth (1978) em rabanete, iniciou-se um grande interesse por parte da indstria americana, quando estes dois ltimos cientistas estabeleceram o conceito de rizobactrias promotoras de crescimento de plantas (RPCPs). Esses investigadores utilizaram estirpes especficas de Pseudomonas fluorescens e de P. putida e obtiveram aumentos significativos no rendimento da cultura da batata e do rabanete. Aps esses trabalhos, as RPCPs passaram a ser investigadas numa grande amplitude de espcies de plantas. Estes trabalhos evidenciaram, conclusivamente, a capacidade das RPCPs em promover o crescimento e a bioproteo de plantas (Luz, 1996). Os efeitos benficos exercidos pelas RPCPs so realizados atravs do estmulo ao crescimento da planta ou atravs da proteo microbiolgica. Nos ltimos anos, tm-se tornado aparente que no h uma clara separao entre promoo de crescimento e controle biolgico induzido por inoculantes de bactrias. Alguns trabalhos iniciais de Kloepper e colaboradores, mostravam que a resposta da planta esteve relacionada ao controle dos microrganismos deletrios nativos, ao invs da promoo direta de crescimento. A promoo direta de crescimento ocorre quando uma rizobactria produz metablitos que promovem diretamente o crescimento das plantas sem a interao com a microflora nativa do solo. Em contraste, antibiticos, siderforos e cido hidrocinico (HCN), que decrescem a atividade de patgenos e/ou microrganismos deletrios, consequentemente, aumentam o crescimento das plantas e so exemplos de promoo indireta pelo controle biolgico (Kloepper, 1993). Uma padronizao dos termos empregados na ampla literatura envolvendo estas bactrias sugerido, pois os diversos termos empregados

como rizobactrias promotoras de crescimento de plantas, bactrias benficas as plantas, RPCPs diretas e indiretas, dentre outros menos comuns, tem gerado confuso entre os pesquisadores. Os autores sugerem os termos Bactrias promotoras de crescimento de plantas-BPCPs (englobaria tambm as bactrias habitantes da filosfera) e BPCPs-biocontroladoras (bactrias com mecanismos de ao de promoo de crescimento e de supresso de patgenos (Bashan & Holguin, 1998). A maioria das estirpes de RPCPs documentadas at ento, pertence aos gneros Pseudomonas (gram-negativas) e Bacillus (gram-positivas). Sendo que, dentre o gnero das Pseudomonas, o maior nmero das espcies referese ao grupo das fluorescentes. Pseudomonas spp. fluorescentes tambm esto envolvidas na

conservao do ambiente. Seus metabolismos de carbono e energia so responsveis pela dissimilao de nitrato e degradao de compostos xenobiticos. A diversidade metablica das Pseudomonas spp. fluorescentes, d estas bactrias uma grande habilidade para adaptao a vrios

ambientes, tais como solo e rizosfera (Latour & Lemanceau, 1997).

2. Taxonomia de Pseudomonas
O gnero Pseudomonas compreende um taxon de organismos muito versteis metabolicamente, capazes de utilizar uma grande variedade de compostos orgnicos simples ou complexos. Consequentemente, eles esto distribudos por solos e gua, sendo importantes como patgenos de plantas, animais e humanos, com algumas estirpes relacionadas promoo de crescimento de plantas e biocontrole de fitopatgenos. O gnero Pseudomonas Migula 1894 foi originalmente estabelecido baseado em caractersticas morfolgicas e metabolismo celular. O

reconhecimento de que trata-se de um gnero bastante heterogneo e as subsequentes reorganizaes taxonmicas, so resultados de estudos moleculares por muitos anos. Reconhece-se, atualmente, como Pseudomonas (stricto sensu), apenas as espcies que se agrupam com P.aeruginosa e P. fluorescens no grupo I de homologia DNA-rRNA (Pallleroni et al., 1973) e

subclasse das Proteobacteria (Woese, 1987), com pelo menos 30 espcies validadas. Com base nas caractristicas fenotpicas, as espcies do gnero Pseudomonas do grupo I DNA-rRNA, so divididas em dois grupos distintos, segundo suas propriedades de produzir pigmentos fluorescentes (pioverdinas) ou de acumular nas clulas incluses de poli--hidroxibutirato (nofluorescentes) (Kimura & Ribeiro, 1994). No entanto, muitas dvidas ainda permanecem quanto taxonomia deste gnero.

3. Colonizao da rizosfera
A influncia das razes e as modificaes bioqumicas e fsicas ocasionadas pela presena destas, promovem habitats especializados para os microrganismos do solo. A rizosfera, como definido por Hiltner (1904) e citado por Lynch (1990), a regio do solo sob influncia das razes. Alguns autores a dividiram em: endorrizosfera (vrias camadas dos tecidos da raiz); rizoplano (superfcie bidimensional da raiz) e ectorrizosfera (representando o solo adjacente raiz) Kloepper, 1996). Uma extensiva colonizao essencial para alcanar um eficiente controle biolgico e estimular o crescimento das plantas. A colonizao da rizosfera deve-se a uma maior disponibilidade de nutrientes em relao ao solo no-rizosfrico. Esta disponibilidade resultado da translocao de

fotosssintatos da parte area das plantas, via floema, para as razes, onde sustentam os processos biossintticos, sendo uma parte liberada para o solo rizosfrico. A quantidade de fotossintatos rizodepositados varivel em funo da espcie vegetal e dos fatores ambientais, sendo os valores mais comuns entre 10 e 100 mg de carbono/grama de raiz seca ou, aproximadamente, 20% dos fotossintatos (Whipps, 1985). O efeito da rizosfera sobre as bactrias no especfico, havendo a presena de diferentes grupos morfolgicos, fisiolgicos e taxonmicos. Entretanto, as bactrias gram-negativas compem uma grande percentagem da rizosfera, devido suas altas taxas de crescimento, respondendo a adio

de cidos aminados e acares solveis, produzindo cido por adio de glicose e sendo resistentes antibiticos ( Alexander, 1977). Os microrganismos colonizam apenas 7 a 15% da superfcie das razes e se localizam, principalmente, nas regies de ramificaes e partes mais velhas da raiz. Ecologicamente so agrupados em: oportunistas (predominando nas razes mais novas, com crescimento rpido, alta capacidade competitiva e populao de pequeno tamanho) e estrategistas (com maior tamanho de populao, alta longevidade, baixa mortalidade e crescimento lento, so muito especializados e predominam nas razes mais velhas) (Siqueira & Franco, 1988). A quimiotaxia contribui para o estabelecimento da colonizao da rizosfera de Pseudomonas (Scher et al., 1985, De Weger et al. 1987). Alguns pesquisadores tambm mostraram a influncia de aglutininas, quando uma linhagem de P. putida aderiu-se s razes de feijo e pepino, atravs de seu complexo de glicoprotenas. Essas evidncias foram comprovadas com a obteno de mutantes negativos para aglutinao. Comparados linhagem nativa, os mutantes negativos aderiram-se s razes em menor extenso, colonizando-as moderadamente e levando a uma menor proteo de plantas de pepino contra Fusarium oxysporum (Tari & Anderson, 1988). Algumas estirpes de Pseudomonas possuem polissacardeos com longas cadeias laterais de O-antignico. Observaram-se que mutantes no produtores destas cadeias laterais, no diferiram das linhagens selvagens com relao ao ataque partculas de sefadex ou razes esterilizadas de batata. Enquanto outros pesquisadores observaram resultados contrrios acertiva acima (Broek & Vanderleyden, 1995). Estes achados conflitantes podem ser atribudos a possveis diferenas nos isolados bacterianos, na espcie de planta e nas condies fsicas do solo, particularmente a umidade (De Weger et al., 1987; Melo, 1998b). A motilidade foi uma caracterstica essencial para a colonizao competitiva nas razes, quando um mutante no-mvel de Pseudomonas putida, inoculado em razes de espinafre, juntamente com a estirpe selvagem, demonstrou que a sua populao no rizoplano foi muito inferior a da estirpe mvel (Sakai et al., 1996). No entanto, em outros trabalhos constatou-se que mutantes imveis foram capazes de colonizar as razes de forma semelhante

as linhagens nativas, de onde se concluu que a motilidade no foi essencial neste processo (Howie et al., 1987; Scher et al., 1988). V-se, portanto, necessidade de maior aprofundamento neste tema. Para prover um efetivo biocontrole, a bactria da rizosfera precisa estar presente nas razes no lugar certo (abaixo da coifa), no tempo certo (antes do patgeno causar dano extensivo) e em quantidade suficiente. Como exemplo, pode-se citar a habilidade de estirpes de Pseudomonas fluorescens em supressionar a doena takeall em trigo que foi diretamente proporcional sua densidade populacional (Raaijmakers et al, 1999, mencionado por Haas et al., 2000).

4. Promoo de crescimento
Nos referimos aqui, ao crescimento e desenvolvimento das plantas de forma geral, incluindo os efeitos benficos na germinao de sementes, emergncia de plntulas, comprimento de ramos e tamanho e produo de gros e frutos. Assim, como exemplo dos efeitos de RPCPs na produtividade, podemos citar aumentos de 33% na produo de ervilha e de at 150% em plantas de rabanete com inoculao de Pseudomonas spp. (Parke et al., 1991; Kloepper & Schorth, 1981). Sementes de arroz, amendoim e quiabo foram inoculadas com espcies de Pseudomonas spp. fluorescentes isoladas do rizoplano de arroz e pimento, respectivamente. A germinao das sementes aumentou com a inoculao da espcies, sendo maior em amendoim. O comprimento dos ramos e razes, crescimento das plntulas e produo das culturas tambm aumentou com a inoculao (Dileep et al.;1998). Experimentos em condies controladas e em condies de campo mostraram aumento da emergncia de plntulas em at 100% ocasionadas por P. fluorescens e P. putida. Essas bactrias, tm aumentado a emergncia de plntulas, principalmente em condies de baixa temperatura do solo (Kloepper et al., 1986). Uma linhagem de P. aeruginosa e uma de P. fluorescens induziram aumento na germinao de sementes que haviam sido submetidas por 10 dias condies de baixa temperatura. Plantas originadas de sementes

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bacterizadas com Pseudomonas, submetidas a um perodo de frio, tiveram um contedo de matria seca superior ao controle. A promoo da emergncia de plntulas foi atribuda a produo de antibiticos por estas bactrias (Hofte et al., 1991). Rizobactrias isoladas do rizoplano de milho de inverno, cv. Pirano de inverno ESALQ, ou seja, variedade com antocianina nas folhas, plantada sob condies de baixa temperatura (16oC), foram selecionadas visando obter bactrias que aumentassem a germinao de sementes, por ocasio do plantio de inverno. Observou-se que cerca de 72% dos isolados bacterianos, principalmente do gnero Pseudomonas spp., aumentaram a germinao de sementes em 31% (Melo & Lucon, 1995). Trs isolados de P. aeruginosa, quando aplicados em bacterizao do substrato e da semente, mostraram aumento da emergncia e peso seco das plntulas, alm de antagonismo P. solanacearum. Porm, por serem patognicas homens e animais no se recomenda o seu uso em controle biolgico de doenas (Peixoto et al., 1995). Porm, nem sempre os efeitos benficos da utilizao destas estirpes reflete-se em melhoria no crescimento e produo das culturas. Pseudomonas spp. fluorescentes obtidas da rizosfera de algodo, milho, soja e tomate, foram inoculadas em sementes de algodo, por bacterizao. Alguns isolados diminuram significativamente a porcentagem de sementes portadoras de Fusarium spp., sendo que agerminao e emergncia das plntulas no diferiram da testemunha (Pizzinatto & Freitas, 1996). Os mecanismos de ao responsveis pela produo de crescimento em plantas, podem estar ligados inicialmente inibio do patgeno, ou seja, beneficiando o crescimento vegetal de forma indireta. Muitas vezes difcil reconhecer os mecanismos e relacion-los promoo direta de crescimento, visto que mais de um mecanismo produzido pela bactria.

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5. Mecanismos de ao
Compostos como siderforos, reguladores de crescimento e centenas de diferentes metablitos secundrios, incluindo antibiticos e HCN so produzidos por Pseudomonas spp. fluorescentes. Mas em que condies as molculas precursoras so canalizadas para a biossntese de metablitos secundrios ao invs de direcion-las ao metabolismo primrio? O termo idiofase refere-se a uma peculiar fase onde os microrganismos produzem os metablitos secundrios e distingue-se da trofofase (nutricional), quando os microrganismos devotam seus metabolismos sntese mxima de componentes celulares e ao crescimento. A idiofase caracterizada pelo crescimento noexponencial, tipicamente causada por limitaes nutricionais do ambiente e alta densidade de clulas (Haas et al., 2000). Quando tais limitaes se fazem presentes, estes mecanismos de ao, que estimulam o crescimento direto ou indireto, so produzidos. 5.1 Produo de antibiticos

A antibiose a produo de compostos bactericidas, fungicidas ou micostticos e nematicidas. Substncias produzidas pelas RPCPs j foram isoladas e algumas identificadas. Os antibiticos so compostos orgnicos de baixo peso molecular que, em baixas concentraes, so deletrios ao crescimento ou atividades metablicas de outros organismos ( Fravel, 1988). Existe uma grande diversidade de antibiticos produzidos pelas diferentes estirpes de Pseudomonas. Compostos como fenazinas,

pioluteorinas, pirrolnitrinas, tropolonas, piocianinas e 2,4 diacetilfloroglucinol tm sido isolados de Pseudomonas spp. do solo. Estes, juntamente com os siderforos e HCN, parecem ser derivados do cido corsmico, um intermedirio da rota do cido chiqumico (Campbell et al., 1993). Alguns compostos, como as tropolonas, tem amplo espectro de ao, o que pode no ser desejvel por eliminar outros organismos benficos (Botelho, 1996).

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Embora o mecanismo pelo qual o composto 2,4 diacetilfloroglucinol (Phl) inibe o crescimento de fungos no esteja claro, vrias hipteses so cogitadas. Certas espcies de plantas produzem floroglucinis, que so depositados externamente nas superfcies dos tecidos das plantas e podem estar envolvidos na defesa da planta contra a invaso de patgenos. O 2,4 diacetilfloroglucinol um membro da classe de compostos floroquinolina e pode atuar na ruptura da membrana do fungo. Por outro lado, a produo de 2, 4 diacetilforoglucinol por bactrias pode ativar a induo de resistncia sistmica. Esta hiptese baseada na observao de que a presena de Phl na rizosfera inibiu a podrido preta de raiz, causada por Thielaviopsis basicola, sem reduo drstica da populao do fungo (Pierson, 1998). A produo de Phl por P.aureofaciens Q2-87 seu principal mecanismo de inibio patognica. Um mutante negativo na produo de Phl (Phl-) foi criado por mutao Tn5 e, subsequentemente, mostrou ter perdido a habilidade de inibir Gaeumannomyces gramicis var. tritici in vitro. A regio do genoma de Q2-87 que contm a insero Tn5 foi subclonada e usada para identificar trs cosmdeos contendo DNA homlogo de uma biblioteca genmica de Q2-87. Dois dos trs cosmdeos foram hbeis para complementar vrios mutantes Phl para a produo de Phl e a inibio ao fungo voltou a ser observada (Vicent et al., 1991). No entanto, a pirronitrina (Prn), sintetizada a partir do triptofano, inibi o crescimento, mas no mata o organismo alvo, provavelmente, interferindo na funo normal da membrana (Pierson, 1998). Mutagnicos qumicos foram usados para criar mutantes de P. fluorescens BL915 negativos para a produo de pirrolnitrina. Um dos mutante (2-1), foi inbil inibio de R. solani in vitro. Um fragmento 4,9 kb HindIIIEcoRI do cosmdeo pANT9 de uma biblioteca genmica de BL915 restaurou a produo de Prn e a supresso da doena para o mutante 2-1 (Gaffney et al., 1994). Outros compostos tm mostrado diferentes graus de especificidade e podem ser efetivos contra alguns organismos fitopatognicos, como por exemplo, a pioluteorina de Pseudomonas spp. fluorescentes, que foi efetiva no controle de damping-off de algodo, causado por Phytium, enquanto a pirrolnitrina, de outra Pseudomonas, foi mais eficiente contra Rhizoctonia solani

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(Howell & Stipanovic, 1980). Isolados de Pseudomonas spp. produzindo 2,4 diacetilfloroglucinol (Phl), foram superiores no controle de Fusarium em tomate e Pythium, causando dampping off em pepino, do que aqueles produzindo pioluteorina (Plt) em adio ao 2,4 diacetilfloroglucinol (Phl) (Sharifi-Tehrani, et al.; 1998). Fenazinas so molculas heterocclicas contendo nitrognio, das quais mais de 60 diferentes derivados tm sido identificados. A produo de fenazina por P.aureofaciens 30-84 contribui para sua competitividade ecolgica com outros microrganismos nativos (Mazzola et al., 1992). Baseado na anlise funcional dos genes phz de algumas espcies, sugerido que espcies diferentes de Pseudomonas spp. fluorescentes tem sistemas genticos similares que conferem a habilidade para sintetizar fenazina-1- carboxilato (PCA) (Mavrodi et al., 1998). A inibio do crescimento de Phoma betae (Pleospora betae) e R. solani, isoladas de sementes e razes de beterraba, foi obtida atravs de inoculao com Pseudomonas spp. fluorescentes, associadas produo de fenazina (Lovic et al.; 1993). A frequncia de Pseudomonas spp. fluorescentes produzindo

floroglucinol e fenazina foi determinada em razes de trigo crescido em 3 solos supressivos para a doena take-all (causada por Gaeumannomyces graminis var. tritici) e em 4 solos condutivos. Estirpes produzindo fenazina no foram detectadas em razes de nenhum dos solos. Todavia, Pseudomonas spp. fluorescentes foram isoladas de todos os trs solos supressivos densidades variando de aproximadamente 5x105 to 2x106 unidades formadoras de colnias/g de raiz. Nos solos condutivos, Pseudomonas spp. produzindo Phl no foram detectados ou foram detectados em densidades pelo menos 40 vezes menor que aqueles nos solos supressivos. Isto sugere que as Pseudomonas spp. fluorescentes produtoras de Phl tm um importante papel na natureza supressiva desses solos para take-all de trigo. Anlises de PCR e hibridizao por southern blot demonstraram que genes especficos dentro dos loci biossintticos para Phl e fenazina so conservados entre vrias estirpes de Pseudomonas largamente distribudas (Raaijmakers et al.; 1997). Observou-se em estudo com isolados de Pseudomonas spp

fluorescentes da rizosfera de beterraba, o envolvimento de viscosinamida, um

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antibitico lipopeptdico, alm do 2,4 diacetilfloroglucinol e endoquitinase, na ao antagonista de algumas estirpes damping-off (Phytium ultimum e Rhizoctonia solani) (Nielsen et al., 1998). Vrias Pseudomonas spp. fluorescentes importantes no controle biolgico produzem sinais N-acil-homoserinas-lactonas (N-acil-HSL) que regulam genes, que por sua vez, codificam produtos envolvidos na supresso de patgenos. Esses sinais regulam a expresso da amplitude de vrias caractersticas bacterianas envolvida nas interaes entre microrganismos e hospedeiro-microrganismo. Todavia, para bactrias patognicas, pouco conhecido a respeito da regulao do gene mediado por N-acil-HSL em bactrias do controle biolgico. O papel do N-acil-homoserina lactonas (N-acilHSL) considerada na regulao do antibitico fenazina, no controle biolgico por Pseudomonas spp. fluorescentes (Pierson et al., 1998). 5.2 Siderforos

Os siderforos so compostos de baixo peso molecular, queladores de ferro, produzidos pela maioria das bactrias e fungos sob condies limitantes desse elemento. Embora o ferro seja abundante em solos aerados (1-6%), frequentemente indisponvel para as plantas devido a sua solubilidade, que dependente do pH e controlada pela baixa solubilidade dos xidos de ferro. A disponibilidade do ferro para as razes das plantas pode assim, depender de quelantes orgnicos que manteriam um adequado suprimento de ferro por difuso e fluxo de massa em concentraes to baixas como 10-8 M (Powell et al., 1980). medida em que o pH do solo decresce, a disponibilidade de ferro aumenta e os siderforos se tornam menos efetivos. O nvel crtico de ferro, necessrio para provocar a supresso do crescimento de um patgeno fngico por parte de uma linhagem de P. putida, menor que 10-6 mol m-3 (Simeoni et al., 1987, citado por Melo, 1998b). Um aspecto comum a todos os siderforos que formam complexos octadricos com o Fe+++ e so agrupados pelo tipo estrutural (hidroximatos e fenolatos/catecolatos). De fato, quase todas as bactrias aerbias e anaerbias

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facultativas produzem siderforos, diferindo, contudo, na eficincia de produo. As espcies pertencentes ao grupo das Pseudomonas spp. fluorescentes produzem siderforos verde-amarelados, fluorescentes, solveis em gua, como a pioverdina, cujo nome comum pseudobactina, que apresenta alta afinidade com Fe+++ e transporta esses elemento para o interior das clulas. Dessa maneira, os microrganismos fixam Fe+++ , tornando-o menos disponvel a outros incapazes de produzir agentes similares de transporte de ferro, ou cuja produo comparativamente menor, ou ainda que produzam siderforos que tm menos afinidade por ferro que as RPCPs. Assim a populao destes microrganismos reduzida e um ambiente mais favorvel para o crescimento das razes criado (Kloepper et al., 1980a; Luz, 1996). Outros siderforos, alm da pioverdina, atuando na supresso de damping-off em tomate, como o derivado de salicilato, pioquelina e cido saliclico (Buysens et al., 1996). Um estudo sobre os mecanismos pelos quais a expresso gnica controla o ferro, envolvido no metabolismo de pioverdina em Pseudomonas aeruginosa mostrou que a transcrio desses genes foi reprimida pela presena de ferro no meio de crescimento. Trs promotores desses genes foram clonados e a atividade desses promotores mostrou-se dependente da quantidade de ferro no meio de cultura (Rombel et al.; 1995). Foi observado tambm homologia do DNA entre os genes de sntese de siderforos no patgeno oportunista animal Pseudomonas aeuruginosa, e 3 espcies associadas plantas, P. siringae, P. putida e Pseudomonas sp. B10, sendo consistente com a hiptese de que os genes de sntese de diferentes siderforos tem o envolvimento de um mesmo conjunto ancestral de genes (Rombel & Lamont; 1992). Estudos para comprovar se a supresso de doenas era causada pela produo de siderforos e/ou antibiticos j foram bem documentados. Kloepper et al. (1980b) demonstraram em experimentos controlados, que a adio de ferro, na forma de etilenodiamina tetracetato de Fe+++ (Fe EDTA), aboliu a ao antagonstica in vitro. Observaram, tambm, que o siderforo pseudobactina, purificado de P. fluorescens. B-10, exibiu atividade

bacteriosttica contra Erwinia carotovora, fato que no ocorreu com a pseudobactina-frrica, siderforo complexado com ferro. Observaram tambm,

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que o siderforo pseudobactina induziu um aumento significativo no crescimento de plantas de batata, enquanto que o siderforo complexado com FeEDTA no foi capaz. Evidenciando assim, um mecanismo de ao atravs da produo de siderforos, demonstrando a sua capacidade de sequestrar o Fe +++ da rizosfera (Kloepper et al., 1980a). O complexo Fe-siderforo pode ser especfico para o organismo que o produziu. Desta forma, pode ser restringido o crescimento de fungos e bactrias, havendo controle das populaes microbianas pelo organismo produtor. Entretanto, sabe-se que algumas estirpes de Rhizobium meliloti so capazes de utilizar siderforos produzidos por outras. Os siderforos produzidos so idnticos ou suficientemente similares em estrutura para serem transportados pelo sistema de transporte de membranas de cada estirpe e a utilizao de um siderforo est correlacionada com a presena de protenas especficas da membrana externa (Reich & OConnell (1993), citados por Botelho, 1996). Entretanto, muito pouco conhecido sobre os efeitos causados na

obteno de ferro pela planta. Um grande nmero de trabalhos mostra que os vegetais superiores so capazes de obter ferro dos siderforos de microrganismos (Cline et al., 1984). A planta tambm pode contribuir com siderforos, dos quais se beneficiaria os microrganismos da rizosfera. Um fitosiderforo foi estudado como uma fonte de ferro para Pseudomonas spp. fluorescentes na rizosfera. O 55Fe suprido como Fe-fitosiderforo foi absorvido por isolados de

Pseudomonas putida, crescendo sob condies de deficincia de ferro. A adsoro diminuiu quando as bactrias foram crescidas em presena de ferro. Todavia, nenhuma diferena na absoro foi observada quando um mutante deficiente em siderforo foi testado (Marschner & Crowley, 1998). 5.3 Produo de cido hicrocinico (HCN)

A produo de HCN pelas RPCPs parece ser um fenmeno bastante comum. Este metablito, derivado da glicina, alm de apresentar propriedades inibidoras de patgenos, tambm pode promover o crescimento das plantas diretamente, aumentando o desenvolvimento dos plos radiculares (Luz, 1996).

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As Pseudomonas spp. fluorescentes da rizosfera diferem em suas habilidades de produzir HCN. De 30 isolados testados, apenas um isolado de Pseudomonas putida foi produtor de HCN, promovendo a acumulao de fenlicos e fitoalexinas em cotildones de Phaseolus vulgaris (Zdor & Anderson; 1991). Aproximadamente 12% dos isolados de Pseudomonas spp.

fluorescentes, de rizosfera de Lotus cornicutatus avaliadas in vitro contra os fungos fitopatgenos Pythium ultimum e Rhizoctonia solani,. inibiram um ou ambos os fungos. Dos isolados selecionados in vitro, trs estirpes de Pseudomonas fluorescens produziram HCN e siderforos, mas a adio de ferro ao meio no afetou a atividade antagnica, alm disso enzimas lticas tais como quitinases e beta 1,3 glucanase tambm no foram detectadas, sugerindo como principal mecanismo de ao a produo de HCN (Bagnasco et al., 1998). Por outro lado, alguns investigadores tm postulado que a produo de HCN pode ser realizada tambm, por rizobactrias deletrias, que podem, assim, restringir o crescimento das razes de batata, sendo, portanto, responsveis pelo decrscimo de rendimento da cultura com rotaes curtas. De acordo com esta teoria, a produo de HCN pelas rizobactrias deletrias realizada atravs da competio por Fe+++, mediada por siderforos, requerido para a produo de HCN (Bakker et al., 1989; Schippers et al., 1991). 5.4 Produo de reguladores de crescimento

Reguladores de crescimento de plantas so substncias orgnicas que influenciam os processos fisiolgicos de plantas em baixas concentraes. A produo de reguladores de crescimento como metablitos microbianos no solo est diretamente ligada disponibilidade de substratos, incluindo

exsudatos de plantas e resduos de animais. Os microrganismos produtores exercem um importante papel no controle de seu prprio ambiente, afetando o metabolismo da planta. Os microrganismos, por sua vez, afetam a composio qumica de exsudatos liberados e, consequentemente, seu suprimento nutricional (Melo, 1998b).

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A maioria dos trabalhos da literatura sobre a influncia das RPCPs, no crescimento das plantas, atribui esse fenmeno a um efeito indireto associado ao controle biolgico de patgenos secundrios (Kloepper et al., 1980b, Kloepper & Schroth, 1981). No entanto, em alguns trabalhos, observou-se que a promoo de crescimento de plantas, por RPCPs, tambm tem sido relacionada a produo de giberilinas (Holl et al., 1988), auxinas (Boronin et al., 1993) e cidos ltico e succnico (Yoshikawa, 1993). Observou-se tambm, estmulo de crescimento e produo de vrias culturas em casa de vegetao e em experimentos de campo em resposta inoculao de Pseudomonas fluorescens, que foram atribudos aos efeitos da produo de fitohormnios por parte do inoculante (Hflich, 1992). Tambm foi observado produo de substncias tipo AIA (cido indol actico) in vitro e na rizosfera das plantas de trigo em vaso de Leonard (Freitas & Germide, 1992). As Pseudomonas spp. fluorescentes produziram AIA em resposta aos exsudatos de raiz de milho (Benizri et al., 1998; Pan et al., 1999).

5.5 Competio por substrato e excluso de nicho

A excluso competitiva de organismos deletrios por Pseudomonas na rizosfera, um dos modos de ao de supresso de doenas deste gnero. Este mecanismo tem sido apontado como sendo o responsvel pelo biocontrole de Phytium e Fusarium (Rovira et al., 1990; Elad & Chet, 1987). O fenmeno da excluso de nicho verificado com espcies de Pseudomonas, j que estas, por suas altas variabilidades metablicas predominam sobre os microrganismos que colonizam nichos especficos nas razes, fenmeno observado em batata e em beterraba aucareira (Burr et al., 1978; Kloepper et al., 1980b).

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5.6 Mineralizao de nutrientes

A elevao da disponibilidade de fsforo tem sido creditada a certas RPCPs, aumentando o crescimento por estmulo da absoro desses elemento. Verificou-se, em estudo onde a hidroxiapatita foi usada para avaliar o efeito da inoculao de sementes com Pseudomonas spp., que a quantidade de hidroxiapatita dissolvida pela bactria no diferiu significativamente do controle no inoculado. Em outro trabalho, no entanto, observou-se a absoro de fsforo pela inoculao das sementes com P.putida (Lifishitz et al., 1987). Rodrigues & Fraga (1999) citam que estirpes do gnero Pseudomonas, Bacillus e Rhizobium esto entre as bactrias com maior potencial de solubilizao de fsforo. 5.7 Parasitismo

A lise por enzimas hidrolticas excretadas pelos microrganismos um aspecto do micoparasitismo. Quitinase e -1,3 glucanase (laminarinase) so enzimas importantes no controle de fungos, devido s suas habilidades de degradar os componentes das paredes celulares daqueles microrganismos. Algumas RPCPs tm sido mostradas como produtoras de enzimas lticas, como quitinases (Ordentlich et al., 1987). Foi verificado em experimento em condies de casa de vegetao, que Burkholderia cepacia (Pseudomonas cepacia), produzindo -1,3 glucanase, diminuiu a incidncia de doenas causadas por Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii e Phytium ultimum em 85, 48 e 71%, respectivamente (Fridlender et al, 1993).

5.8 Aumento da nodulao de rizbios

Algumas estirpes de RPCPs tm sido apresentadas como promotoras da nodulao simbitica por espcies de rizbios fixadores de nitrognio em leguminosas em experimentos de campo (Burns et al., 1981; Turner & Backman, 1991).

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Os mecanismos propostos pelos quais as RPCPs podem aumentar a nodulao de Rhizobium so: produo de protenas de ligao na membrana celular (Burns et al., 1981), produo de agentes antimicrobianos (Li & Alexander, 1988), estmulo da colonizao de razes por fungos micorrzicos, que resultam em mudanas nas morfologia das razes (Meyer & Linderman, 1986). A coinoculao de RPCPs e Bradyrhizobium apresentou um aumento na nodulao e fixao de nitrognio em soja temperatura subtima da zona radicular. O efeito das diferentes estirpes variou com a temperatura da zona radicular. O aumento na nodulao da soja devido RPCPs foi atribudo, em grande parte, melhor performance fisiolgica das plantas ( Zhang et al., 1997).

5.9 Induo de resistncia

A induo de resistncia pode ser definida como um processo de defesa ativa da planta, em que esta utiliza mltiplos mecanismos induzidos sistemicamente por agentes biticos e abiticos, e que se apresenta eficiente contra uma variedade de patgenos de plantas (Luz, 1996). Embora a competio por Fe parea ser o principal modo de ao de Pseudomonas spp. fluorescentes contra Fusarium oxysporum, observou-se que a competio no poderia levar em conta todos os dados experimentais de controle da murcha de fusarium em cravo. Os autores consideraram a hiptese de que a estirpe WCS417 de P. fluorescens poderia melhorar a resistncia da planta hospedeira (Van Peer et al.,1990). Com a separao fsica da estirpe de Pseudomonas spp. fluorescentes na raiz, e o patgeno F. oxysporum sendo inoculado no caule, no possvel atribuir os efeitos benficos observados interao microbiana. Alm disso, uma acumulao aumentada e acelerada de fitoalexina no caule de cravo pr-inoculado com a bactria foi observado (Van Peer et al., 1991). A induo de resistncia sistmica (IRS) por Pseudomonas putida e outras RPCPs. foi observada tambm promovendo crescimento em plantas de pepino e reduzindo significativamente a severidade de

Pseudomonas syringae pv. lacrrymans e Colletotrichum orbiculare (Wei et al., 1996).

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A induo de resistncia sistmica tambm foi observada em pepino e em tomate contra Vrus do Mosaico do Pepino por Pseudomonas spp. fluorescentes e outras RPCPs (Raupach et al., 1996). Os mecanismos propostos para induo de resistncia sistmica das plantas pelas RPCPs incluem vrios processos bioqumicos, tais como: aumento da produo das protenas solveis em cido (Zdor & Anderson, 1992), acmulo de fitoalexinas (Van Peer et al., 1991), lignificao (Hoffland & Bik, 1993), cido saliclico em baixa concentrao de ferro (Leeman, 1995a), estmulo da atividade da peroxidase (Wei et al.,1996) e cadeia lateral antignica-O de lipossacardeos de membrana externa (Leeman et al, 1995c). A induo por resistncia parece ser dependente da estirpe, j que as P. fluorescens WCS417 e WCS374 induziram resistncia em rabanete, enquanto P. putida WCS358 foi ineficiente em rabanete (Leeman et al., 1995b) e em cravo (Diujff et al., 1993). Trabalhos recentes mostram que a induo de resistncia sistmica mediada por RPCPs apresenta-se bastante parecida com os trabalhos clssicos. Neste caso, os sistema de resistncia sistmica (SRI) requeriria induo via pr-inoculao com patgenos fracos, o que, em ltima anlise, dificultaria o desenvolvimento de formulaes comerciais. J o SRI mediado por RPCPs poder ser utilizado via produo de inoculantes para o controle efetivo de doenas de plantas (Melo, 1998b). A maioria das RPCPs, apresenta vrios mecanismos de ao. Mecanismos mltiplos foram observados em P. putida e em P. fluorescens. Uma das estirpes testada de P. putida apresentou capacidade de solubilizar fosfato, produziu siderforo, estimulou a germinao de sementes e aumentou o crescimento das plantas em condies estreis, alm de produzir um nvel baixo de AIA (Boronin et al., 1993). A estirpe BK8661 de Pseudomonas putida, que produz siderforos, antibiticos e HCN suprimiu o crescimento de Septoria tritici e Puccinia recondita f. sp. tritici in vitro e em folhas de trigo (Flaishaman et al.; 1996). Ainda outros mecanismos so citados na literatura, como: detoxificao do solo em volta das razes (Walton & Anderson, 1990), aderncia das RPCPs s hifas dos patgenos por interao de lectinas que inibem o crescimento

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adicional do fungo (Nelson et al., 1986) e a inativao de estimulantes de propgulos de fungos presentes no exsudato das razes (Van Dijk, 1995).

6. Caracterizao fenotpica e genotpica


Diversos esforos tm sido feitos para conhecer a diversidade das populaes nativas de Pseudomonas spp. fluorescentes no ambiente rizo e filosfrico das culturas agrcolas. Esses estudos visam a um aprofundamento sobre as interaes entre microrganismos, entre microrganismos-plantas e sobre a interferncia dos fatores biticos e abiticos, para ento, viabilizar a utilizao do potencial natural das RPCPs. A abundncia e a composio de espcies de Pseudomonas spp. fluorescentes saprofticas foram estudadas na rizosfera de milho, girassol e alfafa (Emnova et al.; 1995); arroz (Zeigler & Alvarez; 1990); filosfera de beterraba (Rainey et al; 1994) e outras culturas (Tzeng et al.; 1994). Na verdade, estes so os primeiros passos para a seleo de microrganismos com potencial de utilizao na agricultura ou em

biorremediao. Aps testes bioqumicos, fisiolgicos e de patogenicidade, os isolados microbianos mais promissores como RPCPs e biocontroladores so inoculados em plantas, via semente (bacterizao), tratamento das razes ou injeo no caule ou razes (Chen et al.; 1992) ou manipulados geneticamente, objetivando aprofundamento sobre os mecanismos de ao ou introduo destes microrganismos geneticamente modificados no ambiente.

7. Melhoramento gentico
A maioria dos agente de controle biolgico e biorremediao, que tm sido descritos at ento, so de ocorrncia natural, ou seja, microrgansimos indgenos. Estes continuaram por algum tempo a ser a fonte principal de agentes de biocontrole potencialmente efetivos. Todavia, no futuro, a

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manipulao gentica e o melhoramento das estirpes selvagens, traro muitos avanos no controle biolgico. Uma vez que uma estirpe seja selecionada, possvel produzir estirpes superiores por modificaes genticas. Tais modificaes so mutaes noespecficas (com induo por irradiao, qumicos ou insero de plasmdeos), recombinao sexual ou assexual do genoma das duas estirpes parentais, ou transformao stio- especfico (Harman & Lumsden, 1990). As recombinaes sexuais ou assexuais permitem a recombinao dos genomas de duas estirpes. Quando as estirpes so identificadas com atividades complementares especficas (habilidade para controlar diferentes patgenos ou melhorar a habilidade de competir eficazmente com a microflora nativa), uma estratgia utl pode ser combinar essas estirpes e gerar um microrganismo com caractersticas desejavis (Harman & Lumsden, 1990). As mutaes de insero tm sido bastante usadas para inativar genes especficos nas bactrias. Usando os mutantes negativos para a produo de antibiticos fenazinas e pirrolnitrina, foi possvel demonstrar a ao destes no antagonismo fitopatgenos (Thomashow & Weller, 1988; Gaffney et al., 1994). A recombinao de DNA j est sendo utilizada para a introduo de genes que codificam endotoxinas (genes TOX-cry) de Bacillus thuringiensis, em Pseudomonas fluorescens, para superar as limitaes econmicas e biolgicas no controle de insetos que so pragas de solo, mostrando at ento, bons resultados (Botelho, 1996).

8. Consideraes finais
Muito se tem avanado nestas ltimas dcadas, nos estudos sobre a utilizao de RPCPs e seus mecanismos de ao, graas s tcnicas de biologia molecular. Sabemos, no entanto, que muito h ainda a se compreender das interaes microrganismo- hospedeiro -ambiente.

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Devido complexidade dos fatores biticos e abiticos envolvidos e a necessidade imperativa de conservar-se os recursos naturais, o emprego das RPCPs deve ser criteriosamente orientado por estudos ecolgicos. Desta forma, um dos meios mais racionais de controle biolgico seria o manejo da microflora epfitica associada s plantas. Isto se d pela utilizao de prticas agrcolas conservacionistas, aumentando o teor de matria orgnica, melhorando a estrutura, aerao e teores de umidade dos solos, ou seja, proporcionando ao agroecossistema, condies para exercer um controle biolgico natural.

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