UNIVERSIDAD NACIONAL DE CHIMBORAZO

FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD

ESC. TECNOLOGIA MEDICA LABOROTORIO CLINICO E HISTOPATOLOGICO

LESLY MARCELA GUANANGA VASQUEZ EXAMEN DE MICROBIOLOGIA

3 B

TEMA: Identificacin de las diferentes bacterias. OBJETIVO GENERAL Identificar qu tipo de bacteria est presente en la muestra entregada en clases. OBJETIVOS ESPECIFICOS Preparar los medios adecuados para que la bacteria crezca. Realizar las pruebas necesarias para poder identificar las bacterias as determinar si son positivas y negativas.

MATERIALES Cajas Bipetri con agar sangre y mckonkey Mechero Azas Metlicas Placas Portaobjetos Tubos de ensayo

MARCO TEORICO La envoltura celular de las bacterias Gram-negativas est compuesta por una membrana citoplasmtica (membrana interna), una pared celular delgada de peptidoglicano, que rodea a la anterior, y una membrana externa que recubre la pared celular de estas bacterias.4Entre la membrana citoplasmtica interna y la membrana externa se localiza el espacio periplsmico relleno de una sustancia denominada periplasma, la cual contiene enzimas importantes para la nutricin en estas bacterias. La membrana externa contiene diversas protenas, siendo una de ellas las porinas o canales protecos que permiten el paso de ciertas sustancias. Tambin presenta unas estructuras llamadas lipopolisacridos (LPS), formadas por tres regiones: el polisacrido O (antgeno O), una estructura polisacrida central (KDO) y el lpido A (endotoxina). Las bacterias Gram-negativas pueden presentar una capa S que se apoya directamente sobre la membrana externa, en lugar de sobre la pared de peptidoglicano como sucede en las Gram-positivas. Si presentan flagelos, estos tienen cuatro anillos de apoyo en lugar de los dos de las bacterias Gram-positivas porque tienen dos membranas. No presentan cidos teicoicos ni cidos lipoteicoicos, tpicos de las bacterias Gram-positivas. Las lipoprotenas se unen al ncleo de polisacridos, mientras que en las

bacterias Gram-positivas estos no presentan lipoprotenas. La mayora no forma endosporas (Coxiella burnetti, que produce estructuras similares a las endosporas, es una notable excepcin). En microbiologa, se denominan bacterias Gram negativas a aquellas bacterias que NO se tien de azul oscuro o violeta por la tincin de Gram, y lo hacen de un color rosado tenue: de ah el nombre de "Gram-negativas" o tambin "gramnegativas".1 Esta caracterstica est ntimamente ligada a la estructura de la envoltura celular, por lo que refleja un tipo natural de organizacin bacteriana. Son uno de los principales grupos de bacterias y cuando se tratan como taxn se utiliza tambin el nombre 2 Las restantes son las bacterias Gram positivas. de Negibacteria. Las bacterias Gram-negativas presentan dos membranas lipdicas entre las que se localiza una fina pared celular de peptidoglicano, mientras que las bacterias Gram-positivas presentan slo una membrana lipdica y la pared de peptiglicano es mucho ms gruesa. Al ser la pared fina, no retiene el colorante durante la tincin de Gram.3 Muchas especies de bacterias Gram-negativas causan enfermedades. Los cocos Gram-negativos causan la gonorrea (Neisseria gonorrhoeae),meningitis (Neisseria meningitidis) y sntomas respiratorios (Moraxella catarrhalis), entre otros. Los bacilos Gram-negativos incluyen un gran nmero de especies. Algunos de ellos causan principalmente enfermedades respiratorias (Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae , Legionella pneumophila, Pseudomonas aeruginosa), enfermedades urinarias (Escherichia coli, Proteus mirabilis, Enterobacter cloacae, Serratia marcescens) y enfermedades gastrointestinales (Helicobacter pylori, Salmonella enteritidis, Salmonella typhi). Otros estn asociadas a infecciones nosocomiales(Acinetobacter baumanii). Muchas especies de bacterias Gram-negativas causan enfermedades. Una de las varias caractersticas nicas de las bacterias Gram-negativas es la estructura de la membrana externa. La parte exterior de la membrana comprende un complejo de lipopolisacridos cuya parte lpida acta como una endotoxina y es responsable de la capacidad patgena del microorganismo.1 Este componente desencadena una respuesta inmune innata que se caracteriza por la produccin decitocinas y la activacin del sistema inmunolgico. La inflamacin es una consecuencia comn de la produccin de citocinas, que tambin pueden producir toxicidad. Si la endotoxina entra en el sistema circulatorio, provoca una reaccin txica con aumento de la temperatura y de la frecuencia respiratoria y bajada de la presin arterial. Esto puede dar lugar a un shock endotxico, que puede ser fatal. Esta membrana externa protege a las bacterias de varios antibiticos, colorantes y detergentes que normalmente daaran la membrana interna o la pared celular de peptidoglicano. La membrana externa proporciona a

estas bacterias resistencia a la lisozima y a la penicilina. Afortunadamente, se han desarrollado otros tratamientos alternativos para combatir la membrana externa de proteccin de estos patgenos, tales como la lisozima con EDTA, y el antibitico ampicilina. Tambin pueden usarse otras drogas, a saber, cloranfenicol, estreptomicina y cido nalidxico. PRUEBAS BIOQUIMICAS Las pruebas bioqumicas consisten en distintos test qumicos aplicados a medios biolgicos, los cuales, conocida su reaccin, nos permiten identificar distintos microorganismos presentes. Su sistema de funcionamiento generalmente consiste en determinar la actividad de una via metablica a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer incorpora o no. En general el microorganismo se cultiva en medios que contienen una sustancia nutritiva especfica o sustrato y despus de la incubacin del cultivo se examina para verlos cambios qumicos que hayan ocurrido.

Aqu estn algunas de las Pruebas Bioqumicas ms frecuentes: Agar Hierro de Kliger (KIA) Prueba del Indol Citrato de Simmons Agar Hierro Lisina (LIA) Agar Urea de Christiansens Movilidad . PRUEBA DE KLIGER O TSI El agar Hierro de Kliger (KIA), es un medio slido y diferencial. El fundamento se basa en la capacidad de fermentacin de dos azucares (glucosa y lactosa), en la produccin de c. sulfhdrico y en la produccin de gas. Composicion g/l:

Extracto de carne 3.0 Peptona 20.0 Glucosa 1.0

Extracto de levadura 3.0 Lactosa 10.0 Cloruro sdico 5.0

Tiosulfato sdico 0.5 : fuente de azufre, las Citrato frrico amnico bacterias lo reducen produciendo c. sulfhdrico 0.5 (precipitado negro) Rojo de fenol 0.03 : indicador, si vira a rosceo , indica basicidad del medio, si es amarillo indica acidificacin (derivada de c. de la fermentacin) Interpretacin del Kliger: NC o SC: no cambio o sin cambio LC, Alk o K : alcalinidad

H2S o subndice s: si produce c. G: productora de gas Sulfhdrico Ejemplo: A/As indica que es fermentador de glucosa, lactosa y productor de sulfhdrico

PREUBA DE INDOL Pone de manifiesto la presencia de la encima Triptofanasa en nuestras bacterias, si esta presente degradar el triptofano y liberar al medio Indol, para revelar su presencia usaremos el reactivo de Kovac; si hay indol se formar un anillo rojo en la superficie, sino este ser amarillo. Para esto sembramos en caldo con triptfano

PREUBA DE CITRATO Se usa para determinar si el organismo es capaz de utilizar el citrato como nica fuente de carbono y compuesto amoniacales como nica fuente de nitrgeno. El medio contiene citrato sdico, fosfato de amonio y azul de bromotimol como indicador; este se tornar azul cuando el medio se basifica. Las bacterias que metabolizan el citrato liberan iones amonio al medio (degradacin del fosfato amnico) lo que provoca que este se alcalinice y el indicador vire azul

PRUEBA DE LISINA Este medio pone de manifiesto: - Si la bacteria posee la enzima descarboxilasa (LDC). el medio contiene como indicador Purpura de Bromocresol, cuando la lisina se descarboxila, el medio se acidifica y el indicador vira amarillo en el fondo. - Si es productora de c. sulfhdrico, en cuyo caso el precipitado negro nos impedir ver si es LDC + o -. - Si es productora de gas

PRUEBA DE UREA Pone de manifiesto la actividad de la enzima ureasa, para degradar la urea en dos molculas de amoniaco. El medio lleva como indicador Rojo fenol, que se torna amarillo cuando es negativo y rosa cuando es positivo. Hay que tener precaucin porque tambin puede ocurrir que no se produzca cambio de coloracin, en este caso es negativo, el medio posee un color rosceo (mucho menos intenso que los verdaderos positivos) lo que puede llevarnos a error (considerar falsos positivos)

MOVILIDAD Se realiza una siembra en picadura, y tras incubar 24 h. observamos si se ha producido crecimiento entorno a la zona inoculada

PROCEDIMIENTO Procedemos a realizar un estriado la muestra en dos planos en una caja bpetri, que contiene agar sangre y el otro agar mackonkey, despus colocamos despus colocamos en la estufa durante 24 horas. Transcurrido este tiempo vamos a observar el crecimiento y procedemos a realizar las diferentes pruebas para la identificacin de las bacterias. En mi caso crecieron en los dos medios por lo que proced a realizar una placa de gram para identificar sin son gam positivos o gram negativos. En una placa se coloca una gota de suero fisiolgico y con una aza tomamos una colonia del agar sangre y la mesclamos con el suero y dejamos secar. Una vez seca la placa procedemos a fijar en el mechero y llevamos a colorear. Colocamos dos gotas de violeta de genciana en cada muestra y dejamos por 1 minuto y lavamos con agua. Luego colocamos licor de gram por 30 segundos y lavamos con agua. Agregamos alcohol cetona por 30 segundos y lavamos. Por ltimo colocamos 2 gotas de safranina y lavamos Dejamos que se seque las placa. Despus observamos en el microscopio. En mi placa pude observar que eran bacterias gram negativas ya que su coloracin era rosada intensa. Procedemos a realizar las pruebas bioqumicas. Con una aza de punta de aguja procedemos a realizar la siembra en las pruebas bioqumicas: citrato, urea, TSI o kliger, SIM. Dejamos incubar por 24 horas y observamos si reacciona o no

1. 2. 3. 4. 5.

 Despus procedemos a realizar el antibiograma 1. Encendemos un mechero 2. Con un isopo tomamos tres colonias del agar con las bacterias aisladas y la estriamos por todo el agar muller. 3. Con una pinza colocamos los discos uno por uno y llevamos a la estufa para observar despus de 24 horas y observamos. Transcurridas las 24 hora procedemos a observer las pruebas bioqumicas: Resultados: Citrato: TSI: Gas de glucosa Lactosa Glucosa Urea: SIM: Motilidad Indol Y por ltimo procedemos respectivos discos.
SENCIBLE INTERMEDIO RESISTENTE Norfloxacina X Amikacina X

(positivo) (positivo) (negativo) (positivo) (negativo) (positivo) (negativo) a observar el antibiograma con sus
Kanamicina Penicilina Ceftazidima X X X X

Carbenicilina

CONCLUSIONES Despus de realizar todas las pruebas necesarias podremos determinar que la bacteria presente en la muestra es SALMONELLA CHOLERAESUIS y que adems esta es sensible al antibitico Norfloxacina. RECOMENDACIONES Realizar con mucho cuidado la inoculacin. Incubar los medios en temperatura adecuada para que las bacterias se puedan desarrollar. Realizar una tincin de gram con los tiempos adecuados.

BIBLIOGRAFIA:
http://www.scribd.com/doc/14778249/pruebasbioquimicas http://perso.wanadoo.es/microdominguez/a.htm http://depa.pquim.unam.mx/amyd/archivero/3c.PruebasBioquimicas_92 http://perso.wanadoo.es/microdominguez/index.htm.

ANEXOS

UNIVERSIDAD NACIONAL DE CHIMBORAZO

INFORME DE RESULTADOS LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

NOMBRE DEL PACIENTE: Fernanda Torres EDAD: 23 Aos CODIGO DE LA MUESTRA: N 45 RESPONSABLE: Lesly Guananga

GRAM: Se observaron bacterias bacilos gram positivos incontables. CONTAJE DE COLONIAS: Se observan un aproximado de 60 000 Unidades formadoras de colonias. ANTIBIOGRAMA:

SENCIBLE INTERMEDIO RESISTENTE

Norfloxacina X

Amikacina X

Carbenicilina

Kanamicina

Penicilina

Ceftazidima X

BACTERIA IDENTIFICADA: SALMONELLA CHOLERAESUIS