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ESPECTROFOTOMETRIA Os mtodos fotomtricos compreendem os mtodos analticos baseados na medida da energia radiante transmitida pelas solues, emitidas pelas

solues fluorescentes ou, transmitidas ou refletidas pelas suspenses. A energia radiante formada de radiaes eletromagnticas com comprimento de onda ou freqncia, que cobrem uma extensa faixa que constitui o espectro eletromagntico total.
Raios gama Raios X Ultravioleta Espectro visvel Infravermelho Radar TV Rdio

ANGSTRONS () NANMETROS (nm) MICRMETROS (m) CENTMETROS (cm)

1 -

10 -

1800 180 -

3800 380 -

7000 700 0,7 -

0,1

103

106

Regies espectrais - Ultravioleta (UV) = 200 < < 380-400 nm - Visvel (Vis) = 380-400 nm < < 700-800 nm - Infravermelho (IF) = 800 nm < < 3300 nm Espectro visvel cores Uma soluo se apresenta corada quando absorve radiaes cujos comprimentos de onda se situam na regio visvel do espectro. Assim, uma soluo, na mistura de todas as cores menos a amarela, se apresenta como tal por absorver as radiaes do espectro visvel com exceo daquelas de comprimento de onda correspondentes a poro do amarelo. Em outros termos, a colorao de um meio complementar da luz absorvente. Nem todas as cores so absorvidas igualmente, a cor mais absorvida a cor complementar. FAIXA DE COMPRIMENTO DE ONDA () COR TRANSMITIDA COR COMPLEMENTAR 380 a 420 nm Violet Laranja a 420 a 490 nm Azu Amarel l o 490 a 540 nm Verd Vermelho e 540 a 580 nm Amarelo Azul 580 a 620 nm 620 a 800 nm Laranja Vermelho Violeta Verde

Os instrumentos que utilizam a medida da absoro e energia radiante por solues e que tem maior aplicao em laboratrio clnico so:

1-

Colormetro: aparelhos que se utilizam de filtros compostos para selecionar pores o espectro a serem utilizadas como cromadores. 2- Espectrofotmetros: aparelhos que se utilizam de redes de difrao ou primafiltro na seo da poro desejada do espectro com cromadores. Conceitos: - Luz: forma de energia radiante que se propaga atravs de ondas, cujo comprimento determina sua cor. - Luz Policromtica: luz branca emitida pelo sol ou pelas lmpadas de incandescncia que contm todos os comprimentos de onda visveis. - Luz Monocromtica: o resultado da passagem de luz branca por um monocromador, e que contm apenas uma faixa de comprimento de onda, sendo caracterizada por apresentar cor. - Cor: resultado do fenmeno fsico a absoro da luz. Espectrofotmetro O espectrofotmetro empregado para medir a quantidade de luz que uma amostra absorve ou a quantidade de luz que transmitida atravs da soluo quando se incide luz sobre a mesma. O princpio da espectrofotometria passar um feixe de luz atravs da amostra e medir a intensidade da luz que atinge o detector. Portanto, espectrofotmetros em geral, so instrumentos compostos por um conjunto de componentes do seguinte tipo: uma fonte de radiao eletromagntica, um conjunto de componentes pticos que levam esta radiao at a amostra, um compartimento de amostra e um ou mais detectores que medem a intensidade de radiao emitida. Segue abaixo o esquema de um espectrofotmetro.

a. Luz Fonte de energia radiante capaz de emitir uma mistura de comprimento de onda b. Fenda de entrada c. Prisma ptico d. Fenda de sada b + c + d = Monocromador usado para isolamento da poro desejada do espectro e. Porta cubeta recipiente onde se coloca a cubeta contendo a soluo a ser medida f. Detector utilizado para receber a energia radiante transmitida atravs da soluo e transform-la em energia eltrica g. Circuito medidor ou Galvanmetro recebe energia eltrica emitida pelo detector apresentando-a ao operador sob uma forma til de medida.

Tipos de componentes - Fontes de Energia Radiante: - Lmpada de tungstnio: utilizada para regio UV prximo e visvel - Lmpada de deutrio: utilizada para a regio do UV - Lmpada de xennio: utilizada para a regio do IV Monocromadores: - Filtros de vidro: transmite faixa ampla de comprimento de onda - Prismas: transmite pequena faixa de onda - Redes de difrao: transmite pequena faixa de comprimento de onda Cubetas: - Vidro: utilizada para a regio do visvel - Quartzo: usada para a regio do UV - Plstico: usada para a regio do visvel e UV

- Detectores: Foto clulas ou Foto multiplicadores

Lei de Lambert-Beer Quando uma radiao monocromtica passa atravs de uma soluo, ,uma parte da energia absorvida pelo meio, enquanto a parte restante transmitida. Atravs da espectrofotometria, podemos verificar duas grandezas: 1- Transmitncia: quantidade de energia radiante transmitida pela soluo. A transmitncia dada pela relao entra a intensidade da radiao transmitida (I) e a intensidade da radiao incidente (Io), ou seja, T = I/Io. Seu valor varia de zero a 1 (ou 0 a 100%), sendo que, quando T=O, toda a luz incidente absorvida (I=O); quando T=1 toda a luz incideente transmitida (I=o). 2- Absorbncia: quantidade de energia radiante absorvida pela soluo. A absorbncia ou densidade ptica (DO) diretamente proporcional concentrao da amostra. Para se determinar a concentrao de uma determinada soluo, geralmente utiliza-se um Fator de Proporcionalidade (ou Fator de Calibrao), o qual obtido atravs da relao entre a concentrao e a absorbncia de uma soluo padro de concentrao exatamente conhecida (no caso de uma anlise bioqumica, a soluo padro vem juntamente com o kit industrializado comprado, e sua concentrao vem impressa no rtulo). Uma vez conhecido o Fator de proporcionalidade, fica fcil se descobrir a concentrao da soluo teste. Basta realizar a seguinte equao: [soluo teste] = F x absorbncia da soluo teste Exemplo: Determinao da [Hb] de uma amostra. [padro] = 13,6 g/dL abs. padro = 0,412

abs. amostra = 0,390 13,6 F= 0,412 Realizao de Anlise Bioqumica Manual por Espectrofotometria (Colorimetria) Para se realizar qualquer anlise colorimtrica manual, utiliza-se, no mnimo, 3 tubos de ensaio: Tubo Branco (B): dever conter apenas o reagente de uso (cromgeno ou reagente de cor) utilizado para a reao. Esse tubo tem a finalidade de zerar o aparelho, e deve ser o primeiro a passar pelo aparelho. Tubo Padro (P): dever conter o reagente de uso e o padro (do kit). A reao que ocorrer entre esses dos reagentes dever obter um resultado de absorbncia e concentrao conhecidos. Esse tubo serve para se obter um Fator de Calibrao, alm de servir como um meio de se saber se a pipetagem dos reagentes est sendo feita corretamente. Tubo Teste (T): dever conter o reagente de uso e a amostra a ser analisada. A absorbncia obtida atravs dessa anlise dever ser multiplicada pelo Fator obtido, afim de se obter a concentrao final da mesma. = 33 [Hb amostra] = 0,390 x 33 [Hb amostra] = 12,87 g/dL