LABORATORIO N5 CINTICA ENZIMTICA I: EFECTO del pH y de la TEMPERATURA. 1. Aspectos tericos.

Las enzimas son protenas que presentan actividad cataltica especfica, esto es, aumentan la velocidad de reacciones especficas. La actividad cataltica de una enzima es una propiedad que se mide por el aumento de la velocidad de reaccin en presencia de la enzima con relacin a la reaccin no catalizada en un sistema qumico dado. La velocidad de las reacciones se determina de acuerdo al aumento de la concentracin del producto o la disminucin de la concentracin del sustrato de la reaccin en el tiempo.

v = - d[S]/dt = + d[P]/dt
Existen diferentes mtodos que permiten cuantificar la concentracin de reactantes y/o productos. Entre los mtodos analticos fsicos destacan los pticos, que se basan en la absorcin de radiacin electromagntica en la regin visible y ultravioleta. Determinando el coeficiente de extincin de un compuesto se estima la velocidad sobre la base de las medidas experimentales de absorbancia a un tiempo dado. Hay diferentes factores que afectan la actividad de las enzimas. Los factores ms importantes son: concentracin de enzima, concentracin de ligandos (sustratos, productos, inhibidores y activadores), pH, fuerza inica y temperatura. La actividad de las enzimas se ve notablemente afectada por el pH del medio. En general, son slo activas en un rango limitado de ste, observndose en la mayora de los casos una zona de pH ptimo y una disminucin de la actividad a ambos lados del pH ptimo. El efecto del pH en la actividad enzimtica se debe fundamentalmente a cambios en el estado de ionizacin de los componentes del sistema; esto puede darse en la enzima libre, en el complejo E-S o en el sustrato. En la zona de pH ptimo predomina la forma inica activa, a valores de pH menores y mayores su proporcin disminuye, aumentando la proporcin de formas inicas no activas; a causa de ello la curva de velocidad versus pH tiene aproximadamente la forma de una campana. El pH no slo afecta la actividad de las enzimas, sino que tambin la estabilidad, lo que contribuye a la disminucin de la actividad generalmente a valores extremos de pH. Las reacciones enzimticas estn fuertemente afectadas por la temperatura. Hay dos factores determinantes, el efecto de la temperatura en las constantes de velocidad de la reaccin y el efecto de la temperatura en la estabilidad de la enzima. Como es de esperar, un aumento de la temperatura aumenta la velocidad de la reaccin; sin embargo, sobre cierta temperatura hay inactivacin de la enzima que lleva a una disminucin en la velocidad. La zona de temperatura en la cual se observa mayor actividad se conoce como temperatura ptima, sta tiene slo valor operativo, ya que depende de una serie de factores, como el pH y el tiempo de reaccin.
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En este prctico se ver el efecto que produce en la actividad de la enzima -glucosidasa de almendra dulce los cambios de pH y temperatura. Se determinar la velocidad de la hidrlisis de un sustrato artificial, el p-nitrofenil--D-glucopiransido (pNPG), midiendo la formacin de un producto de la reaccin, el p-nitrofenolato, que en un medio alcalino es de color amarillo y presenta un mximo de absorcin alrededor de 405 nm. v = A Co t V v fd fe A Co 1 V fd fe ( UI/ml) t v Ecuacin 5.1

= Absorbancia = absorbancia del ensayo control = pendiente curva de calibrado = tiempo (minutos) = volumen de ensayo (ml) = volumen de enzima (ml) = factor dilucin en el ensayo enzimtico (en ensayos discontinuos) = factor de dilucin de la enzima previo al ensayo enzimtico.

Una unidad internacional (UI) de enzima se define como la cantidad que cataliza la formacin de 1 mol de producto por minuto en condiciones definidas de ensayo. 2. Objetivos. Estudiar el efecto del pH y de la temperatura en la velocidad de la hidrlisis del p-nitrofenil--D-glucopiransido catalizada por la -glucosidasa de almendras. Establecer condiciones adecuadas de ensayo. 3. Parte experimental. 3.1 Materiales espectrofotmetro / celdas 1 cronmetro 1 trpode / rejilla/ mechero 1 termmetro 1 bao termostatizado 1 vaso precipitado de 500 ml 1 vaso precipitado de 250 ml 2 gradillas 20 tubos de ensayo 1 pizeta 1 pipeta graduada de 1 ml 1 pipeta graduada de 2 ml 1 pipeta graduada de 5 ml plato poroso.

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3.2

Reactivos p-nitrofenolato 0,2 mM. tampn acetato 50 mM, pH 4,0; 5,0 y 6,0. tampn fosfato 50 mM, pH 7,0. p-nitrofenil--D-glucopiransido 2 mM / tampn. -glucosidasa de almendras (bao agua / hielo). Na2CO3 1.0 M.

4. Procedimiento. Obtencin del coeficiente de extincin milimolar del p-nitrofenolato (pNF). De acuerdo a la tabla 5.1: Prepare una batera de tubos rotulados. Agregue el volumen indicado de la solucin de p-nitrofenol (0,2 mM) a los tubos 2S 7S. Complete el volumen a 1,0 ml a cada tubo (1B, 2S 7S) agregando tampn acetato pH 5,0. Agregue a cada tubo 2,0 ml de Na2CO3 1,0 M. Homogenice la solucin. Mida la absorbancia de los tubos 2S 7S ocupando el blanco (1B) para calibrar el equipo y antela en la tabla. Calcule y anote en la tabla la concentracin del pNF en el volumen final de 3,0 ml.
TABLA 5.1

TUBO 1B 2S 3S 4S 5S 6S 7S

pNF (ml) -----0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6

Tampn (ml) 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4

Na2CO3 (ml) 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0

[pNF] (mM)

A405nm

De acuerdo a los datos. Construya el grfico absorbancia versus [pNF]. Determine la ecuacin de la recta por regresin lineal y el coeficiente de regresin. Calcule el coeficiente de extincin milimolar.

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Obtencin de la velocidad de la reaccin catalizada por la -glucosidasa (Mtodo discontinuo). Preincube 0,9 ml del sustrato (pNPG) 2,0 mM al pH dado durante 3 minutos a la temperatura indicada. Inicie la reaccin mediante la adicin de 0,1 ml de la enzima, inmediatamente, homogenice la solucin y colquela en el bao de agua termostatizado a la temperatura correspondiente. Al mismo momento inicie el cronmetro. Detenga la reaccin a los 5,0 minutos con 2,0 ml de Na2CO3 1,0 M. Cuantifique el p-nitrofenolato, producto de la reaccin, por absorbancia a 405 nm. Calcule la velocidad de la reaccin de acuerdo a la ecuacin 5.1. Blanco. Prepare el blanco (control tiempo 0 o tubo tiempo 0, t0) con todos los componentes del ensayo mezclados en tal forma que no haya reaccin. o Preincube 0,9 ml del sustrato al pH dado durante 3 minutos a la temperatura indicada. o Inmediatamente, detenga la posible reaccin no enzimtica agregando 2,0 ml de Na2CO3 o Agregue 0,1 ml de la enzima. Control. Prepare el control incubando a la temperatura definida todos los componentes del ensayo, menos la enzima, de modo que no haya reaccin enzimtica. o Incube 0,9 ml de pNPG durante 8 minutos (3,0 min de preincubacin y 5,0 min de ensayo), o Inmediatamente, detenga la posible reaccin no enzimtica agregando 2,0 ml de Na2CO3, o Agregue 0,1 ml de la enzima. Ocupe el blanco para calibrar el espectrofotmetro y el control para detectar una reaccin no enzimtica, reste esta lectura a la del ensayo enzimtico correspondiente (Ecuacin 5.1).

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4.1 Efecto de la temperatura en la velocidad de la reaccin enzimtica. Para estudiar el efecto de la temperatura en la actividad de la -glucosidasa, se trabajar a cuatro temperaturas, a un pH dado (pH 5,0), a concentraciones de sustrato y de enzima constantes. De acuerdo a la tabla 5.2: Prepare una batera de tubos rotulados (1R t 4R t) para los ensayos enzimticos. Agregue 0,9 ml de pNPG 2,0 mM Preincube los tubos a una temperatura indicada por 3,0 minutos. Inicie la reaccin agregando 0,1 ml de la enzima, inmediatamente homogenice y coloque en bao termorregulado a la temperatura correspondiente por 5,0 minutos exactos. Detenga la reaccin sacando los tubos del bao, colocndolos en un bao fro (agua / hielo) y agregando 2,0 ml de Na2CO3 1,0 M, que adems disocia el p-nitrofenol a p-nitrofenolato. Homogenice la solucin. Repita la operacin a las restantes temperaturas.
TABLA 5.2

Tubo Sustrato 2,0 mM (ml) Enzima (ml) Temperatura (C) Tiempo incubacin (min) Na2CO3 1,0 M (ml)

1R t 0,9 0,1 25 5,0 2,0

2R t 0,9 0,1 40 5,0 2,0

3R t 0,9 0,1 60 5,0 2,0

4R t 0,9 0,1 100 5,0 2,0

Prepare los blancos a cada temperatura (1B t 4B t). Prepare los controles a cada temperatura (1C t 4C t). Lea a 405 nm la absorbancia de los ensayos enzimticos y de sus respectivos controles ocupando el blanco para calibrar el espectrofotmetro. Calcule la velocidad de la reaccin de acuerdo a la absorbancia obtenida utilizando la ecuacin 5.1.

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4.2 Efecto del pH en la velocidad de la reaccin enzimtica. Para estudiar el efecto del pH en la actividad de la -glucosidasa, se trabajar a cuatro valores de pH, a temperatura (40C), concentracin de sustrato y de enzima constantes. De acuerdo a la tabla 5.3: Prepare una batera de tubos rotulados (1R pH 4R pH) para los ensayos enzimticos. Agregue 0,9 ml de pNPG 2,0 mM a un pH indicado. Preincube los tubos a la 40C por 3,0 minutos. Inicie la reaccin agregando 0,1 ml de la enzima, inmediatamente homogenice y coloque en un bao termorregulado a 40C por 5,0 minutos exactos. Detenga la reaccin sacando los tubos del bao y colocndolos en un bao fro (agua / hielo) y transforme el p-nitrofenol en p-nitrofenolato con 2,0 ml de Na2CO3 1,0 M. Homogenice la solucin.
TABLA 5.3

Tubo Sustrato 2,0 mM (ml) pH 4,0 Sustrato 2,0 mM (ml) pH 5,0 Sustrato 2,0 mM (ml) pH 6,0 Sustrato 2,0 mM (ml) pH 7,0 Enzima (ml) Tiempo incubacin (min) Na2CO3 1,0 M (ml)

1RpH 0,9 ------0,1 5,0 2,0

2RpH --0,9 ----0,1 5,0 2,0

3RpH ----0,9 --0,1 5,0 2,0

4RpH ------0,9 0,1 5,0 2,0

5.

Repita la operacin a los restantes pH. Prepare el blanco correspondiente a cada valor de pH (1B pH 4B pH). Prepare los controles a cada valor de pH (1C pH 4C pH). Lea a 405 nm la absorbancia de los ensayos enzimticos y de sus respectivos controles ocupando el blanco para calibrar el espectrofotmetro. Calcule la velocidad de las reacciones de acuerdo a los resultados y a la ecuacin 5.1. BIBLIOGRAFA Jrgen Bergmeyer and Marienne Gral, 1984. Methods of Enzymatic Analysis, Third Edition, Verlag Chemie. Apuntes de ctedra.

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