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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS Faculdade de Engenharia de Alimentos TA610 Transformaes Bioqumicas

Estudo do modo de ao e aplicaes das enzimas amilolticas

Campinas, 16 de outubro de 2012.

1. Introduo

2. Objetivos Os objetivos da aula prtica consistiram na identificao do tipo de amido recebido atravs da observao dos grnulos em microscpico e determinao da temperatura de gelificao do amido (batata, milho ou mandioca); no teste da liquefao do amido usando -amilase bacteriana; na verificao da solubilidade da amostra de maltodextrina comercial n1 ou n2 e determinao do valor de DE (Dextrose Equivalente = g de acares redutores em 100 g de slidos) da amostra de amido liquefeito preparada no teste II e da amostra de maltodextrina comercial; na anlise dos acares redutores revelados no papel de cromatografia das amostras de amido hidrolisado com enzimas amilolticas e na observao de produtos derivados de amido de alguns alimentos. 3. Materiais e Mtodos 3.1. Materiais Amido de mandioca, batata ou milho; -amilase bacteriana Termamyl 120 L; Soluo de iodo-KI diluda (uma alquota de 2 mL de soluo de iodo-KI estoque e 20 g KI foi transferido para um balo de 500 mL e o volume completado com gua destilada); Grupos nmero mpar: tubo de ensaio contendo 1 g de maltodextrina n1 (Maltodextrina Globe 1905); Grupo nmero par: tubo de ensaio contendo 1 g de maltodextrina n2 (Maltodextrina MosRex 1920); Amostras de alimento contendo derivados de amido (maltodextrina, xarope de glicose, glicose, sorbitol, frutose, maltose e maltitol). 3.2. Mtodos I Exame da forma dos grnulos de amido em microscpio e determinar a temperatura de gelificao de suspenso de amido

Pesou-se 30 g de amido (cada grupo utilizou um tipo de amido) em uma panela pequena e adicionou-se 200 mL de gua destilada. A aparncia microscpica dos grnulos de amido foi verificada, colocando-se uma gota de amido + 1 gota de soluo de iodo-KI diluda em uma lmina de vidro limpa e uma lamnula de vidro sobre a amostra e utilizando-se objetiva com aumento de 40x. Aqueceu-se a suspenso de amido em fogo, de modo que o aquecimento foi lento. A temperatura em que ocorreu a gelatinazao do amido e o aspecto do amido foram anotados. Verificou-se a aparncia microscpica dos grnulos de amido aps gelatinazao, colocando-se 1 gota de soluo de Iodo-KI diluda + uma pequena quantidade de amido gelatinizado em uma lmina de vidro limpa e uma lamnula de vidro sobre a amostra.

II Liquefao do amido com -amilase bacteriana Pesou-se em um bquer de 250 mL uma amostra de 15 g de amido e adicionou-se 100 mL de tampo fosfato 0,05 M pH 6,0. Adicionou-se 1 mL de soluo 20 mg/mL de comercial). A suspenso de amido foi ento aquecida em banho-maria a 90-98C at a obteno de colorao marrom ou amarela com soluo de diluda. O teste de colorao do amido com iodo foi realizado adicionando-se 0,1 mL da suspenso de amido + -amilase em tubos contendo 2 mL de soluo de diluda. e 1 mL de -amilase bacteriana (Termamyl 120 L

Aps a verificao de que o amido foi liquefeito, comparou-se o aspecto da amostra em relao viscosidade e turvao com a amostra de amido gelatinizada no item I. Mediu-se o volume da amostra em proveta de 100 mL. Diluio 1:100 foi preparada em um balo volumtrico de 100 mL e a partir desta diluio preparou-se outras diluies (1:2, 1:5, 1:10) e determinou-

se o teor de acares redutores nas amostras de amido liquefeito diludas (1:200, 1:500, 1:1000). Calculou-se o valor de DE (dextrose equivalente).

III Verificao da solubilidade da amostra de maltodextrina comercial n2 10 mL de gua destilada foi adicionada ao tubo de ensaio contendo 1 g de maltodextrina comercial n2. Incubou-se o tubo em banho-maria a 60C por 5 a 10 minutos e misturou-se a soluo com basto de vidro at homogeneizar. Anotou-se se a maltodextrina era insolvel ou solvel e o aspecto da soluo (translcida ou turva). A amostra de soluo de maltodextrina n2 (1:50) foi diluda em balo volumtrico e a partir dessa soluo 1:50, diluiu-se (1:2) e determinou-se a concentrao de acares redutores nas amostras na diluio final de 1:50 e 1:100.

IV Determinao de acares redutores pelo mtodo de SomogyiNelson Pipetou-se 0,5 mL de amostra e 1 mL de reagente SNI em tubo de ensaio. Agitou-se os tubos e colocou-se em banho-maria em ebulio por 6 minutos. Retirou-se os tubos e colocou-se em banho de gelo at esfriar os tubos a temperatura ambiente. Os tubos foram retirados do banho de gelo e adicionou-se 1 mL do reagente SNII. Agitou-se os tubos e eles foram deixados em repouso por 5 minutos. Adicionou-se 10 mL de gua destilada e misturouse por imerso. Mediu-se a absorbncia a 540 nm contra o tubo branco. O tubo branco foi feito, pipetando-se 0,5 mL de gua destilda ao invs de amostra. Os passos seguintes foram os mesmos.

VI Anlise dos acares redutores revelados na cromatografia em papel A amostra de amido de farinha de trigo hidrolisado com -amilase fngica, a amostra de amido de mandioca hidrolisado com -amilase bacteriana (produo de maltodextrina) e a amostra de amido liquefeito e sacarificado com glicoamilase (produo de xarope de glicose) foram preparadas pelos tcnicos, bem como a cromatografia em papel, segundo metodologia descrita no roteiro.

VII Anotao dos ingredientes obtidos a partir de amido de certos produtos alimentcios Foram observados e anotados os ingredientes obtidos a partir de amido (maltodextrina, xarope de glicose, frutose, xarope de dextrina e maltose, sorbitol) presentes nos alimentos. Descreveu-se as aplicaes e como podem ser obtidos.

4. Resultados

I) Examinar a forma dos grnulos de amido em microscpio e determinar a temperatura de gelificao de suspenso de amido Com a observao dos grnulos de amido ao microscpio antes da gelificao pode-se verificar que o amido que seria estudado pelo grupo era de batata, uma vez que possua formatos esfricos, sendo em sua maioria grandes e contendo alguns pequenos. Aquecendo-se a suspenso de amido em gua obteve-se uma temperatura de gelificao de 58C, o que comprova que o amido estudado de batata, pois os dados da literatura apresentam temperatura de gelificao para esse amido na faixa de 56-60C (FENNEMA, 1996). Aps a gelificao foi coletada uma amostra do gel formado para se observar novamente os grnulos no microscpio, e ento verificamos que os

formatos ficaram um pouco diferente devido formao do gel. Durante tal processo a amilose, de menos peso molecular, passa para a soluo chegando um momento em que no h mais gua livre, uma vez que toda ela est ligada as cadeias de amilose e amilopectina, aumentando a viscosidade da soluo e formando um gel (BOBBIO & BOBBIO, 1995).

II) Liquefao do amido com -amilase bacteriana

Aps

aquecimento

soluo

se

tornou

lmpida

no

marrom/amarelada como se esperava, e ao fazer o teste de colorao de amido com iodo tambm no houve nenhuma alterao na cor. Isso mostrou que no havia mais amido presente na soluo pois toda a cadeia de amilose e amilopectina foi reduzida a aucares de cadeia menor pela -amilase. Ao comparar o amido liquefeito aqui obtido com o amido gelatinizado do item anterior vimos que este ficou lquido e turvo enquanto o amido anterior ficou com aspecto viscoso (formou um gel) e brilhante. Ao medir o volume obtemos 105 mL. Foi feita ento uma anlise de Somogyi-Nelson para determinar a concentrao de acares redutores presentes na amostra. O

espectrofotmetro usado pelo grupo para medir a absorbncia foi o 1, gerando o seguinte grfico para a curva padro:

1900ral 1900ral 1900ral Abs (540nm) 1900ral 1900ral 1900ral 1900ral 1900ral 1900ral 1900ral 1900ral 1900ral 1900ral 1900ral 1900ral 1900ral Curva padro Linear (Curva padro) y = 1900ralx R = 1900ral

Concentrao de glicose (mg/mL)

A partir dele possvel calcular a concentrao de glicose equivalente para cada absorbncia, levando em considerao a diluio realizada, e depois vamos calcular a dextrose equivalente. Para isso tem se as seguintes equaes:

Calculando para cada absorbncia medida chegou-se aos resultados expressos na tabela abaixo. Diluio 1:200 1:500 1:1000 Abs 540 nm 0,218 0,143 0,056 mg/mL 20,67 33,91 26,56 DE 14,88 24,41 19,12

Com base na literatura sabe-se que para valores de DE muito maiores que 20, o produto constitudo por oligmeros curtos que so, livremente, solveis em gua, o que dificulta a formao do gel. Assim quanto maior o valor de DE, menor ser a capacidade de formar gel (LORET et al. 2004). Sendo assim o resultado obtido pelo grupo mostra que ainda possvel formar gel nesse amido aps o tratamento trmico pois os valores de dextrose equivalente encontrados no foram muito altos, sendo apenas um acima de 20.

III)Verificar a solubilidade da amostra de maltodextrina comercial n2

Nessa etapa do experimento pode-se observar que a maltodextrina no solvel em gua fria, porm ao aquecer a soluo por 5 a 10 minutos ela se tornou solvel e formou uma soluo translcida.

Aps realizar a reao de Somogyi-Nelson o grupo mediu a absorbncia novamente no espectrofotmetro 1, obtendo o grfico mostrado no item anterior. E como os clculos para encontrar a concentrao e a dextrose equivalente so os mesmos, vamos obter os seguintes resultados:

Diluio 1:50 1:100

Abs 540 nm 0,547 0,292

mg/mL 12,97 13,85

DE 9,34 9,97

Da literatura v-se que a maltodextrina um produto da hidrlise do amido que possui valor de dextrose equivalente (DE) menor do que 20 (LORET et al. 2004). O que foi confirmado pelos resultados encontrados nesse experimento.

IV)

Anlise dos acares redutores revelados na cromatografia em

papel das amostras de amido de farinha de trigo hidrolisado ou liquefeito

Atravs do resultado obtido na cromatografia em papel pode-se observar que o amido hidrolisado com -amilase fngica (nmero 3) resultou em uma maior quantidade de glicose e maltose (manchas maiores nas mesmas posies desses compostos no padro), e quantidades menores (manchas menores) de maltotriose, maltoteraose e maltopentaose (oligossacardeos). Esse fato deve-se pela enzima fngica possuir atuao na amilose resultando em grande quantidade de glicose e maltose. J o amido tratado com -amilase bacteriana (nmero 4) resultou em grandes quantidades de glicose e maltose e quantidades considerveis de maltotriose, maltotretaose, maltopentaose e oligossacardeos contendo ligaes -1,6. Tal resultado j era o esperado devido a capacidade da enzima bacteriana em produzir glicose, maltose e oligossacardeos contendo ligaes -1,6.

A corrida do amido liquefeito com glicoamilase (nmero 5) mostrou somente duas manchas, uma maior correspondente a glicose e uma menor de isomaltose. Tal resultado devido ao da enzima glicoamilase que agiu sobre o amido parcialmente degradado e produziu glicose a partir da extremidade no redutora, essa enzima tambm produz a isomaltose, que so duas unidades de glicose unidas p ligaes do tipo -1,6.

V)

Anotar os ingredientes obtidos a partir de amido presentes nos alimentos

N 1

Produtos Sopa de Mandioquinha (Ajinomoto)

Ingrediente obtido a partir do amido Maltodextrina

Mtodos de obteno -amilase bacteriana -amilase bacteriana -amilase bacteriana

2 3 4

Sopa de Peito de frango com queijo (Ajinomoto) Sopa de milho com frango (Ajinomoto) Sopa de batata, cenoura e alho-por (Knor)

Maltodextrina Maltodextrina

5 6 7 8

Achocolatado Nescau (Nestl) Gel morango com banana (Nutrisport) Suco Tang laranja e mamo Refresco Manga Light (Ajinomoto)

Maltodextrina

-amilase bacteriana

Maltodextrina

-amilase bacteriana -amilase bacteriana -amilase bacteriana -amilase bacteriana -amilase bacteriana, Glicoamilase Glicoamilase

Gelatina Diet de morango (Dr. Oetker)

Maltodextrina

10 Refresco Per (Kraft) 11 Pastilha Tic Tac 12 Barra de cereais 30 vitaminas e minerais (United Mills) 13 Barra de cereais Neston

Maltodextrina Maltodextrina Maltodextrina, Frutose, Sorbitol Xarope de glicose,

morango (Nestl) 14 Barra de cereais Trio Light torta de ma (United Mills) 15 Bala dura Halls (Cadbury Adams Brasil) 16 Goma de Mascar Trident Splash (Cadbury Adams Mxico) 17 Barra de chocolata ao leite Diet (Gold Nutrition) 18 Barra de chocolate ao leite diet (Nestl) 19 Barra de cereais Light (Nutrimental)

Sorbitol Maltodextrina, Glicose, Sorbitol Xarope de glicose -amilase bacteriana, Glicoamilase -amilase bacteriana, Glicoamilase Sorbitol, Maltitol Glicoamilase, -amilase

Maltodextrina, Maltitol, Polidextrose

-amilase bacteriana, Glicoamilase

Maltodextrina, Xarope de glicose

-amilase bacteriana

Na tabela acima possvel perceber que os produtos obtidos a partir do amido so muito utilizados na indstria de alimentos para diferentes produtos. Alm desses podemos citar ainda outros como bebidas alcolicas e produtos de panificao. Nas bebidas alcolicas antes de ocorrer a fermentao necessria a realizao da etapa de sacarificao do amido, que a hidrlise deste gerando acares fermentveis, para que estes possam ser utilizados pelas leveduras alcolicas. Alguns processos como a obteno da cerveja, se utilizam do malte, que consiste em enzimas de origem vegetal, principalmente amilases (KOBLITZ, 2008). Para a panificao usa-se as enzimas amilolticas que hidrolisam o amido em acares fermentveis na medida certa para as leveduras possam fermentar tais acares e produzir CO2 (necessrio para que o po cresa) melhorando com isso sua textura, viscosidade e qualidade. Outro ponto interessante que a produo de dextrina na massa possui o efeito de retardar o endurecimento do po, prolongando assim a vida de prateleira do mesmo (KOBLITZ, 2008).

5. Discusso

As -amilases bacterianas so as mais amplamente utilizadas na indstria de alimentos uma vez que possuem uma temperatura de atuao de 60-85C. A utilizao de tal enzima promove a obteno de glicose, maltose e outros oligossacardeos (KOBLITZ, 2008). Ela pode ser usada, por exemplo, para hidrlise do amido de cana (RODRIGUES et al, 2008). A -amilase uma enzima utilizada no setor de alimentos, constituda por -amilase fngica obtida de cepas selecionadas de Aspergillus Orizae, disponvel em quatro nveis de atividade. Uma de suas utilizaes na suplementao da atividade diasttica em farinhas de trigo deficientes neste requisito. As glicoamilases ou amiloglicolosidases so exoenzimas que removem unidades de glicose a partir da extremidade no redutora das cadeias de amilose e amilopectina, sendo capazes de romper as ligaes -1,4, -1,6 e 1,3, o que indica que teoricamente tais enzimas seriam capazes de converter totalmente amido em glicose. Na prtica, porm no isto que ocorre, uma vez que na falta de -amilases no meio ocorre sntese de isomaltose, converso esta que em escala industrial poderia representar grandes perdas no rendimento (KOBLITZ, 2008). 1 - A amilose um polmero linear, enquanto que a amilopectina um polmero ramificado. Quais as caractersticas das enzimas que atuam sobre cada um desses polmeros? PANDEY et al (2005) definem a -amilase (1,4--glucan-4-

glucanohydrolase, EC 3.2.1.1.) como sendo uma enzima que quebra as ligaes (1,4) dos polissacardeos que possuem trs ou mais unidades de Dglucose em unio -1,4. O ataque ocorre na forma no seletiva (tipo endoenzima) sobre vrios pontos da cadeia simultaneamente, sendo que os primeiros produtos da hidrlise so sempre oligossacardeos de 5 a 7 unidades de glicose.

As ligaes -1,6 da amilopectina no so hidrolisadas pela amilase, sendo o produto final do ataque da amilopectina pela amilase molculas de isomaltose. A seguir mostrada uma representao esquemtica da ao da -amilase sobre a amilose e amilopectina. Para melhor visualizao das cadeias de ambas as molculas, so apresentadas na figura a seguir as molculas na forma linear ao invs da forma espiral.

A -amilase, cujo nome sistemtico -1,4-glucan maltohidrolase, tambm chamada sacargena, encontrada, sobretudo nos vegetais superiores. A -amilase hidrolisa as ligaes glicosdicas -1,4 de polissacardeos a partir da extremidade no-redutora sobre a penltima ligao xido, separando duas unidades de glicose na forma de -maltose, por uma inverso (HARGER, 1982)

2 - Quais as principais aplicaes industriais das enzimas amilolticas? Qual a vantagem do uso dessas enzimas no processo industrial? Grande parte das enzimas utilizadas nas indstrias so enzimas extracelulares de origem microbiana. As principais aplicaes das enzimas extracelulares que degradam o amido consistem na converso do amido em

monossacardeos como a glucose, em dissacardeos como a maltose e em oligossacardeos como as dextrinas. As enzimas que degradam o amido tambm so empregadas na obteno de acares fermentescveis utilizados nas indstrias cervejeiras, na produo de bebidas alcolicas e na modificao de farinhas empregadas em panificao (WARD, 1989). FELLOWS (1994) relata que a atividade enzimtica tima das enzimas microbianas ocorre nas mesmas condies em que se produz o crescimento mximo dos microrganismos. As enzimas microbianas podem ser

extracelulares (enzimas eliminadas ao meio) ou intracelulares (enzimas retidas no interior das clulas microbianas). A produo de enzimas extracelulares obtida na fase logartmica de crescimento ou na fase estacionria, enquanto as enzimas intracelulares so produzidas durante o crescimento na fase estacionria e somente so liberadas ao meio pela lise celular que ocorre na fase estacionria ou na fase de declnio.

6. Referncias Bibliogrficas

BOBBIO, P. A.; BOBBIO, F. O.; Qumica do processamento de alimentos. 2 ed. So Paulo: Editora Varela, 1995, p.64. FENNEMA, O. R.; Food Chemistry. 3 ed. New York: M. Dekker, 1996, p.1012. KOBLITZ, M. G.; Carboidrases. In: KOBLITZ, M. G. B. Bioqumica de alimentos Teoria e aplicaes prticas. Rio de Janeiro: Editora LAB, 2008, p. 20-74. LORET, C.; MEUNIER, V.; FRITH, W. J.; FRYER, P. J. Rheological

characterization of the gelation behaviour of maltodextrin aqueous solution. Carbohydrate Polymers. v.57, n.2, p. 153-163. 2004.

RODRIGUES, A. C. G.; SATO, H. H.; FIGUEIRA, J. A. Caracterizao e quantificao do amido de cana de acar e estudo de metodologia para determinao de -amilase residual em acar bruto. Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos. Campinas, 2008. WARD, O. Biotecnologia de La Fermentacin: Princpios, Procesos e Productos. Zaragoza: Editorial Acribia S.A., 1989. p. 64-67 e 233-247. FELLOWS, P. Tecnologa del Procesado de Los Alimentos: Principios e Prticas. Zaragoza: Editorial Acribia, 1994. p. 172-177. PANDEY, A.; WEBB, C.; SOCCOL, C.R.; LARROCHE, C. Technology. 1 ed. New Delhi: Asiatech Publishers, Inc, 2005. 760 p. HARGER, C. ; SPRADA, D. ; HIRATSUKA, E. Amilase Fngica. In: Bioqumica das Fermentaes, 1982. 56 p. Enzyme