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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PAR PR-REITORIA DE PESQUISA E PS-GRADUAO DEPARTAMENTO DE PESQUISA PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAO CIENTFICA PIBIC CNPq

q e PIBIC UFPA RELATRIO TCNICO CIENTFICO Perodo: de 07/2012 a 02/2013 (X) PARCIAL ( ) FINAL IDENTIFICAO DO PROJETO Ttulo do Projeto de Pesquisa: Contribuio qumica e atividade antimicrobiana de fungos endofticos isolados de Bauhinia guianensis. Nome do Orientador: Patrcia Santana Barbosa Marinho Titulao do Orientador: Doutor Departamento: Faculdade de Qumica Unidade: ICEN Laboratrio: Qumica Pesquisa Ttulo do Plano de Trabalho: Atividade antimicrobiana e estudo qumico do fungo endoftico pestalotiopsis sp. Ejc07 isolado de bauhinia guianensis.

Nome do Bolsista: Ellon Lobo da Silva Tipo de Bolsa: ( ) PIBIC/CNPq (X) PIBIC/UFPa

1.

Introduo De acordo com ESPOSITO e AZEVEDO (2004) fungos endofticos so micro-

organismos que, durante certo perodo de suas vidas colonizam os tecidos internos de plantas de forma simbitica, sem causar qualquer efeito negativo imediato sob circunstncias normais. estimado que cerca de 80% das plantas so hospedeiras de fungos. Por crescerem neste nicho biolgico especfico, onde organismo e seu bitipo esto sujeitos a constantes e singulares interaes. A associao com fungos endofticos pode ser benfica planta, pois a estreita relao entre endofticos e planta hospedeira pode produzir metablitos secundrios que podem ser benficas auxiliando o sistema imunolgico da planta no combate a insetos, com produo de toxinas e contra outros fungos patognicos, com produo de fitoalexinas. (STROBEL, 2002; STROBEL e DAISY, 2003). Os fungos endofticos por estarem presentes em plantas medicinais sugerem-se, que as suas propriedades teraputicas poderiam estar no endfito e no na planta, ou provavelmente na sua interao. Atualmente, os fungos endofticos de plantas medicinais so estudados na busca de novos metablitos secundrios potencialmente teis. (STROBEL,2003). Neste aspecto, segundo SCHULTES (1990) e AMOROZO et al (1988) o gnero Bauhinia, pertencentes famlia Leguminosae, as quais so encontradas principalmente nas reas tropicais do planeta, compreendendo

aproximadamente 300 espcies. Muitas espcies deste gnero so amplamente utilizadas no Brasil e em outros pases em forma de chs e outras preparaes fitoterpicas como antifngicos, antibacterianos, analgsicos, antiinflamatrios e no tratamento da diabete, pode-se inferir que estudo de fungos presente na espcie pode se resultar num estabelecimento de opes de substncias de importncia para a humanidade. Em estudos feitos por Carvalho e colaboradores (1999) onde eles demonstraram que alguns extratos obtidos da casca do caule de B. guianensis exercem atividade antiinflamatria no modelo de edema de pata de rato, induzido pela carragenina, dextrana e histamina, alm de efeito analgsico no modelo de contores abdominais induzidas pelo cido actico em camundongos. H relato tambm da atividade antimicrobiana de extratos orgnicos de espcies de Bauhinia frente Salmonella sp., Streptococcus sp. e Staphylococcus aureus (SILVA, 2002). O estudo das interaes entre plantas e micro-organismos, alm de contribuir para o entendimento de muitos processos qumicos na natureza e na ecologia pode resultar

num estabelecimento de fontes alternativas de substncias de interesse para a humanidade. Muitos dos metablitos isolados de fungos endofticos possuem potencial a ser usado na medicina, agricultura, indstria e novos antibiticos. (STROBEL e DAISY, 2003). Um exemplo o cido colettrico, um metablico do fungo endoftico Colletotrichum gloeosporioides, isolado da Artemisia monglica, apresenta atividade antimicrobiana contra Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Sarcina lutea e contra o fungo patognico Helminthosporium sativum (ZOU et al., 2000). So crescentes os relatos de propriedades farmacolgicas nos fungos do gnero Pestalotiopsis mostrandose importantes na produo de metablitos secundrios sendo relatados com aplicabilidades medicinais e biotecnolgicas. Por exemplo, o endoftico P. microspora isolado de Taxus wallichiana, apresentou um enorme potencial na produo de taxol composto com atividade antitumoral. LI e colaboradores (2005) isolaram fungos endofticos de plantas medicinais utilizadas na China, destacando-se entre eles espcies do gnero Pestalotiopsis com atividade antitumoral e atividade antimicrobiana. Esse trabalho vem contribuir para o conhecimento da diversidade qumica dos micro-organismos da Amaznia, a partir de Estudo Qumico e Avaliao Antimicrobiana do Fungo Endoftico Pestalotiopsis sp. EJC07 isolado de Bauhinia guianensis. O isolamento, caracterizao, biodiversidade e conservao da microbiota endoftica pode levar a descoberta de novos metablitos secundrios bioativos de fungos que possam servir de base para o desenvolvimento de novos frmacos.

2.

Justificativa A qumica de micro-organismos tem sido pouco estudada se considerarmos a vasta

biodiversidade fngica e a especificidade nas colonizaes das plantas hospedeiras por fungos. O estudo destas interaes entre plantas e micro-organismos, alm de contribuir grandemente para o entendimento de muitos processos qumicos na natureza e na ecologia pode resultar num estabelecimento de fontes alternativas de substncias de interesse para a humanidade. Muitos dos metablitos isolados de fungos endofticos possuem um grande potencial a ser usado na medicina, agricultura e indstria, alm disso, novos antibiticos, fungicidas, imunossupressores e compostos anticncer so esperados como metablitos produzidos por endofticos. (Santos, 2001; Selosse, 2004). Infeco bacteriana um problema que atinge milhares de pessoas todos os dias, causando desde infeces limitadas (garganta, ouvido, olhos, etc.) comprometendo atividades dirias, at mesmo infeces mais severas, tais como hospitalares, onde so comuns as infeces ps-cirrgicas causadas por bactrias, levando alguns pacientes a bito. O uso constante de antibiticos tem provocado uma srie de problemas dentre os quais se destacam o desequilbrio da ecologia humana e a resistncia microbiana, fazendo com que se busquem novos antibiticos que sejam eficazes, abrindo caminho para a evoluo das pesquisas, pois o desenvolvimento de qualquer novo antimicrobiano vem acompanhado pela resistncia dos micro-organismos. A emergncia de patgenos resistentes uma ameaa a esses avanos. Esta vertente na pesquisa de novos compostos com ao antimicrobiana tem levado a comunidade cientfica a investigar a corrida medicamento versus micro-organismo, pois desde o incio dos anos 80 o nmero de antimicrobianos em fase de desenvolvimento diminuiu consideravelmente enquanto que a resistncia dos micro-organismos aos mesmos tem crescido de forma imensurvel, porque eles esto cada vez mais desenvolvendo uma srie de mecanismos de resistncia. Dentro deste contexto pode-se citar o estudo qumico e biolgico de espcies de Bauhinia por vrios pesquisadores, destacam-se dois trabalhos, onde trinta espcies de plantas tradicionalmente usadas na Bolvia contra os males da malria tiveram seus extratos testados frente atividade antimalrica. Dentre estas espcies destacou-se a B. guianensis, a qual apresentou bons resultados, atuando principalmente para amenizar os sintomas associados a esta patologia (Munoz, 2000) e outro trabalho de Carvalho e colaboradores (1999) onde eles demonstraram que alguns extratos obtidos da casca do

caule de B. guianensis exercem atividade antiinflamatria no modelo de edema de pata de rato, induzido pela carragenina, dextrana e histamina, alm de efeito analgsico no modelo de contores abdominais induzidas pelo cido actico em camundongos. H relato tambm da atividade antimicrobiana de extratos orgnicos de espcies de Bauhinia frente Salmonella sp., Streptococcus sp. e Staphylococcus aureus (Silva, 2002). Fungos do gnero Pestalotiopsis so fontes de metablitos secundrios bioativos. Alguns exibem interessantes atividades biolgicas, tais como atividade antimicrobiana frente a diversos patgenos (Buatong, et. al. 2011; Ding et. al. 2009), anti-HIV (Ding, et. al. 2008b), antifngica (Ding, et. al. 2008a). A diversidade estrutural dos metablitos secundrios produzidos pelos fungos do gnero Pestalotiopsis grande, as classes de metablitos secundrios mais largamente citados esto os policetdeos e os terpenides (Rukachaisirikul et. al. 2012), h tambm relato de isolamento de cromonas (Xu et. al. 2009a), cumarinas e citosporonas (Xu et. al. 2009b). H um nico relato do isolamento de lactonas de 14 membros e -pironas isoladas de Pestalotiopsis (Rukachaisirikul et. al. 2012) e o relato de duas substncias (pestalospiranas A e B) que apresentam um novo esqueleto, raro entre os produtos naturais (Kesting et. al. 20011). Estes trabalhos com fungos do gnero Pestalotiopsis ratificam a importncia do estudo qumico e biolgico do fungo endoftico Pestalotiopsis sp. EJC07 isolado de B. guianensis objetivando o isolamento de substncias bioativas. O equipamento de ressonncia magntica nuclear no encontrava se disponvel durante o desenvolvimento deste relatrio, portanto no foi possvel realizar as analises necessrias para a caracterizao dos metabolitos secundrios. A ufpa esta em busca do recurso necessrio para o concerto do mesmo.

3.

Objetivos

3.2 Geral Realizar o estudo qumico e fazer avaliao da atividade antimicrobiana do fungo endoftico Pestalotiopsis sp. EJC07 isolado de Bauhinia guianensis. 3.2 Especifico Realizar atualizao bibliogrfica. (Parcialmente concludo) Cultivar o fungo Pestalotiopsis sp. EJC07 isolado de Bauhinia guianensis em meio slido (arroz) para crescimento das colnias. (Concludo) Obter os extratos fngicos do meio de cultura. (Concludo) Avaliar a atividade antimicrobiana dos extratos fngicos obtidos de Pestalotiopsis sp. EJC07. (Concludo) Isolar os constituintes qumicos dos extratos fngicos do endfito Pestalotiopsis sp. EJC07 isolado de B. guianensis atravs de tcnicas cromatogrficas. (Parcialmente concludo) Identificar e/ou determinar a estrutura dos constituintes qumicos isolados atravs de mtodos espectroscpicos de RMN, IV, UV e EM. (Em andamento) Avaliar a atividade antimicrobiana das substncias isoladas de Pestalotiopsis sp. EJC07.(Em andamento) Apresentar relatrios parcial e final. (Parcialmente concludo)

4.

Materiais e Mtodos

4.1 Equipamento Capela de luxo laminar (PANCHANE PA320), para o manuseio dos microorganismos; Autoclave vertical modelo (PHOENIX); Estufa de incubao do tipo B.O.D. (Biochemical Oxigen Demand) (QUIMIS), para crescimento dos micro-organismos; Estufa de secagem e esterilizao FAMO mod. Fic 0.3 srie 0196 Balanas analticas modelo TECNAL e modelo BOITTON; Evaporadores rotativos HEIDOLPH e LABOROTA 4000, para a concentrao dos extratos;

Cmara de anlise e fluorescncia por luz ultravioleta (Prodicil), para anlise das placas cromatogrficas.

a)

Solventes Metanol, acetato de etila, hexano, diclorometano, todos de grau PA, NUCLEAR, para a extrao e nos procedimentos cromatogrficos, Solvente deuterado (CDCl3), para anlise do RMN; Ce(SO4)2 , para a revelao das placas cromatogrficas. Tcnicas cromatogrficas Cromatografia em camada delgada: placas cromatogrficas em folhas de alumnio medindo 4 x 5 cm, 250 m Layer, Whatman;

b)

Cromatografia em coluna: Slica gel Silia Flash G60, 70-230 mesh, coluna de vidro.

c)

Meios de cultura B.D.A (batata, dextrose, gar).

d)

Reagentes H2SO4.

4.2 Mtodos 4.2.1 Reativao do fungo O fungo endoftico Pestalotiopsis sp. EJC07 isolado de Bauhinia guianenis que se encontrava conservado em gua destilada na micoteca do LabQuiM (Laboratrio de qumica e bioensaio da UFPA) e foi reativado utilizando-se a tcnica de semeadura de superfcie como mostra a Figura 1.

(a)

(b)

Figura 1: Fotografia do isolamento do fungo endoftico pestalotiopsis sp. Ejc07 em meio bda, aps 7 dias de crescimento a 28c. (a) Frente, (b) Verso

4.2.2 Cultivo em larga escala O cultivo do fungo endoftico Pestalotiopsis sp. EJC07 foi feito em arroz Tio Joo (meio slido). Foram utilizados 20 frascos Erlenmeyers (1000 mL) e 4 kg de arroz. Em cada frasco Erlenmeyer foi adicionado 200 g de arroz e 150 mL de gua destilada. Autoclavou-se o material por 45 minutos temperatura de 121C. Na capela de fluxo laminar inoculou-se cubculos do meio contendo o fungo em 18 frascos Erlenmeyers, 2 frascos Erlenmeyers foram utilizados como branco. Os frascos Erlenmeyers foram fechados com rolhas de algodo estril e deixados em modo esttico por 25 dias. Obteve-se o crescimento sadio em 18 frascos Erlenmeyers e no houve crescimento de nenhuma colnia de fungo nas amostras em branco. As amostras em branco foram descartadas como mostra a Figura 2.

Figura 2: Fotografia do isolamento do fungo endoftico pestalotiopsis sp. ejc07 em meio slido, aps 25 dias de crescimento a 28c.

4.2.3. Obteno dos extratos Aps o crescimento do fungo no meio slido foi acrescentado metanol nos frascos Erlenmeyer, permanecendo o solvente em contato com o material durante trs dias, de modo a eliminar os esporos do fungo e obter o primeiro extrato fngico bruto. Terminado o tempo de percolao do solvente com o material foi feita a filtrao simples. O filtrado foi reservado para posterior concentrao em evaporador rotativo e o retido (biomassa) foi submetido nova percolao, utilizando-se hexano, acetato de etila e metanol, em ordem crescente de polaridade, deixando o solvente em contato com a biomassa durante trs dias e fazendo a percolao duas vezes com cada solvente. As solues orgnicas foram concentradas em evaporador rotativo para a obteno dos extratos. No extrato hexnico houve formao de duas fases sendo uma oleosa e outra solida. Estas foram separadas na fase slida (11,18 g) e oleosa (14,14 g). Parte do extrato de acetato de etila foi concentrado e verificou-se inicialmente a formao de slido branco(0,53g) que foi separado, a parte liquida aps a concentrao foi verificado a formao de um slido e leo, apresentado-se em duas fases. Estas foram separadas apresentando na fase slida (12,65 g) e fase oleosa (15,58 g).. As massas dos extratos orgnicos obtidos aps a concentrao em evaporador rotativo foram MeOH1 (78,0214g), hexnico total (25,22g), Acetato de etila total (28,76g) e MeOH 2 (32,11 g) obteno dos extratos como mostra o fluxograma 1.

Fluxograma 1: Extratos orgnicos do Fungo Endoftico Pestalotiopsis sp. EJC07 isolado de Bauhinia guianensis.

4.2.4 Fracionamento cromatogrfico do extrato hexnico. Fracionamento cromatogrfico do extrato hexnico fase slida. Utilizando-se cromatografia em coluna CC (ver fluxograma 2) com slica gel como fase estacionria e hexano, AcOEt e metanol, em grau crescente de polaridade, como eluentes, resultando em oito fraes de 1000 mL cada, as quais foram concentradas em evaporador rotativo e posteriormente analisadas por cromatografia em camada delgada analtica (CCDA).

Fluxograma 2: Fracionamento da fase solida do extrato hexanico.

5. Resultados e Discusso

A comparao CCDA da substncia 1 (S1) frao 3 (Hex/AcOEt 30%) entre os esteroides comuns em fungos, ergosterol e perxido de ergosterol, mostrou-se apresentar mesmo RF do ergosterol. Esta substncia foi analisada por RMN 1H onde se pode observar sinais em H 0,62 (s), H 0,82 (d, J= 6,3 Hz), H 0,83 (d, J= 6,9 Hz), H 0,91 (d, J= 6,9 Hz), H 0,94 (s) e H 1,03 (d, J= 6,6 Hz) referentes s metilas, o sinal na regio de hidrognios oximetnicos em H 3,63 (m) e os sinais na regio dos hidrognios ligados a carbonos sp em H 5,23 (dd, J= 14,4 e 6,0 Hz) e H 5,16 (dd, J= 15,0 e 6,9 Hz) referente a ligao dupla da cadeia lateral e H 5,38 (m) e H 5,57 (dd, J= 5,6 e 2,2 Hz) referente aos hidrognios H-7 e H-6, respectivamente. O padro apresentado pelo RMN H tpico de substncias da classe dos esteroides. Para a confirmao estrutural do composto, foi realizado um espectro de RMN 13C. No espectro de RMN C de S-1 pode-se observar 28 sinais de carbonos dando nfase aos sinais do carbono oximetnico em C 70,4 e os sinais referentes aos carbonos olefnicos em C 116,3; 119,6; 132,0; 135,5; 139,8 e 141,3. Alm dos sinais referentes aos seis grupos metila (C 12,0; 16,3; 19,6; 17,6; 21,1 e 33,1). Esses dados foram confrontados com os dados de RMN
13

C obtidos da literatura para o

ergosterol, o qual mostrou total similaridade (Tabela 1).

Figura: Ergosterol (S-1). O ergosterol um esteroide muito importante na produo de antimicticos, principalmente os azis, (Resoluo RDC n 2 da ANVISA, de 7 de janeiro de 2002) e funciona tambm como um agente antimutagnico e antineovascularizao (LUCAS, 2008). responsvel por inmeras caractersticas fsicas das membranas, tais como estrutura, permeabilidade e modulao da fluidez (CAMIZOTTI, 2003). Sua ausncia causa alteraes na permeabilidade das membranas plasmticas e inibio do crescimento. Drogas utilizadas no tratamento de infeces fngicas (como a Candidase) so fungiststicas e agem na inibio da sntese do ergosterol, resultando em parada da sntese da membrana celular do fungo (PHILLIPS, 2005).

Tabela 1: Dados de RMN 1H e 13C de S-1 juntamente com a comparao dos dados de ergosterol descrito na literatura. S-1 [MARINHO, 2005b] H (, multiplicidade, J) S-1 [MARINHO, 2005b] C 38,6 32,6 69,7 41,1 140,7 119,4 116,7 140,6 46,5 37,2 21,2 28,3 43 54,6 23,1 39,4 56,0 11,8 16,0 40,5 19,4 132,2 136,0 43,0 19,7 33,2 21,0 17,4

H ( ,multiplicidade,J) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28

C 38,3 31,9 70,4 40,7 141,3 119,6 116,3 139,8 46,2 38,3 21,1 28,3 42,8 54,5 23,0 39,0 55,7 12,0 16,3 40,4 19,6 132,0 136,0 42,8 19,6 33,1 21,1 17,6

3,63 (m)

3,63 (m)

5,57 (dd; 5,4 e 2,4) 5,38 (m)

5,56 (m) 5,38 (m)

0,94 (s) 0,63 (s) 1,04 (d, 6,7) 5,19 (tl) 5,21 (tl)

0,95 (s) 0,63 (s) 1,04 (d, 6,7) 5,20 (m) 5,20 (m)

0,83 (d, 6,8) 0,84 (d, 6,8) 0,92 (d, 6,8)

0,82 (d, 6,8) 0,84 (d, 6,8) 0,92 (d, 6,8)

5.1 Avaliao da atividade antimicrobiana dos extratos MeOH 1, Hexnico, Acetato de etila, MEOH2 Quadro 1: Ensaio dos Extratos orgnicos frente as bactrias P. aeruginosa, B. subtillis, E. coli
P. Aeruginosa []g/mL 2500 1250 625 312,5 156,25 78,12 39,06 HEX + + + + + + + AcoET + + + + + + + MEOH1 + + + + + + MEOH2 + + + + + + + HEX + + + + + + B. Subtilis AcoET + + + + + + MEOH1 + + + + + + + MEOH2 + + + + + + HEX + + + AcoET + + + + + + + E. Coli MEOH1 + + + + + + + MEOH2 + + + + + + +

Legenda: + Sem ao; - Bacteriosttico; = Bactericida.

Os extratos orgnicos foram avaliados frente s bactrias Bacillus subtilis (ATCC 6633), Escherichia coli (ATCC 95922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27835) nas concentraes de 2500 g/mL; 1250 g/mL; 625 g/mL; 312,5 g/mL; 156,25 g/mL; 78,12 g/mL e 39,06 g/mL. O extrato que mais apresentou atividade antimicrobiana foi o extrato hexnico o qual apresentou uma tima atividade bacteriosttica frente bactria Escherichia coli (ATCC 95922) at a concentrao de 312,25 g/mL. O extrato MEOH1 teve ao bacteriosttica na maior concentrao testada para a bactria Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27835), os demais extratos no apresentaram atividade frente a esta bactria. O extrato hexnico e MEOH2 tiveram ao bacteriosttica frente a bactria Bacillus subtilis (ATCC 6633) na maior concentrao testada, os demais extratos no tiveram ao frente a esta bactria.

6. Concluso

O estudo qumico e avaliao antimicrobiana do fungo endoftico Pestalotiopsis sp. isolado de Bauhinia guianensis est sendo conduzido de acordo com o cronograma previsto, sendo que at o momento, foi isolado o esteroide comum em fungos,

ergosterol e outras substancias j isoladas esto aguardando o concerto do aparelho de ressonncia magntica nuclear (RMN). O estudo qumico com Pestalotiopsis sp. EJC07, como se pde observar nos estudos bibliogrficos poder apresentar excelentes resultados no que diz respeito a substncias com importantes atividades biolgicas.

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