Manual

UNIVERSIDAD DE COLIMA
FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS
QUIMICO FARMACEUTICO BIOLOGO

1. EDICION
MANUAL DE PRACTICAS DE MICROBIOLOGIA I
MARIO ALBERTO GAITAN HINOJOSA
Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA
Miguel Angel Aguayo Lpez FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS Rector
QUIMICO FARMACEUTICO BIOLOGO Ramn A. Cedillo Nakay

Secretario General Francisco I. Lepe Aguayo Director General de Educacin Superior Jos Gerardo Cerrato Oseguera Delegado Regional No. 4
MICROBIOLOGIA I
Carlos Eduardo Monroy Galindo Director General de Planeacin y Desarrollo Institucional LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA Daniel Jaramillo Cano Director del 2009 1. EDICION Plantel Mario Alberto Gaitn Hinojosa Coordinador del PE de QFB Joel Vzquez Galindo Coordinador Acadmico del PE de IQA Valentn Ibarra Galvn Coordinador Acadmico del PE de IQM Ana Lilia Peraza Campos Coordinadora Acadmico del Programa de Posgrado ESTUDIA -LUCHA-TRABAJA Patricia Campos Pulido Asesora Pedaggica Ma. Rosario Moreno Vjar Secretaria Administrativa MARIO ALBERTO GAITAN HINOJOSA
MANUAL DE PRACTICAS
SEPTIMO SEMESTRE
Qumico Farmacutico Bilogo
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Miguel ngel Aguayo Lpez Rector Ramn A. Cedillo Nakay Secretario General Juan Calos Ynez Velazco Coordinador General de Docencia Carlos Eduardo Monroy Galindo Director General de Educacin Superior Jos Gerardo Cerrato Oseguera Delegado Regional No. 4 Martha Alicia Magaa Echeverra Director General de Planeacin y Desarrollo Institucional Daniel Jaramillo Cano Director del Plantel Mario Alberto Gaitn Hinojosa Coordinador del PE de QFB Patricia Campos Pulido Asesora Pedaggica Juan Carlos Morales Ramrez Secretario Administrativo Mario Alberto Gaitn Hinojosa Profesor de la Materia
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INDICE
CLAVE No. DE PRACTICA NOMBRE DE LA PRACTICA PRESENTACIN Observaciones Generales en el Laboratorio Precauciones Generales en el Laboratorio de Microbiologa Medidas de Bioseguridad Elementos propuestos para que integran una prctica de laboratorio Introduccin al Laboratorio de Bacteriologa Manejo del Microscopio Preparacin del Material de Laboratorio. Citologa Microbiana Preparacin de Frotis y Fijado. Tincin de Bacterias. Coloracin Simple. Tincin Negativa de Microorganismos. La Tincin de Gram. Tincin de Ziehl-Neelsen. Estudio de la Motilidad de Microorganismos. Movilidad de las Bacterias. Demostracin de Vacuolas Grasas. Demostracin de los Grnulos Metacromticos (Volutina) Demostracin de las Endosporas de las Bacterias. Demostracin de las Cpsulas Bacterianas. Tincin para Flagelos. Demostracin del Ncleo y de la Morfologa General de las Levaduras. Tamao y Forma de Algunas Bacterias. Morfologa Colonial y Desarrollo de Diferentes Medios. Caracterizacin Citolgica de Una Bacteria de Identidad Desconocida. Nutricin Bacteriana Nutricin de los Microorganismos. Diferencias Metablicas de las Bacterias. Destruccin e Inhibicin Bacteriana DB-1 DB-2 DB-3 DB-4 DB-5 DB-6 EB-1 EB-2 EB-3 EB-4 EB-5 EB-6 EB-7 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 Efectos de los Agentes Enzimticos sobre las Bacterias. Efectos del Calor y pH en la Supervivencia de las Bacterias. Efectos Qumicos Sobre las Bacterias. Sensibilidad a los Antibiticos. Los Efectos de la Presin Osmtica en los Microorganismos Agentes Bactericidas y Bacteriostticos Exoenzimas y Endoenzimas Bacterianas Produccin de Sulfuro de Hidrgeno por los Microorganismos. Demostracin de la Produccin de Indol. Ensayo de Rojo de Metilo-Vogues Proskauer Deteccin de la Catalasa en las Bacterias. Produccin de Hemolisinas. Reduccin del Azul de Metileno. Reacciones Enzimticas Microbianas 109 112 118 123 128 131 134 137 140 143 146 149 152 PAGINA 7 9 10 12 14 16 22 28 35 40 45 53 57 61 64 68 72 77 80 84 88 93 99 101 106
IL-1 IL-2 CM-1 CM-2 CM-3 CM-4 CM-5 CM-6 CM-7 CM-8 CM-9 CM-10 CM-11 CM-12 CM-13 CM-14 CM-15 CM-16 NB-1 NB-2
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
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CLAVE CM-1 CM-2 MA-1 MA-2 No. DE PRACTICA 34 35 36 37 NOMBRE DE LA PRACTICA Ecologa de los Microorganismos Mtodos de Cuantificacin de Microorganismos La Curva de Crecimiento Bacteriano. Algunas Tcnicas de Microbiologa Aplicada Cultivo de Microorganismos Anaerobios Mtodos Para Obtener Cultivos Puros BIBLIOGRAFIA ANEXO I. Reactivos Empleados en el Manual ANEXO II. Tinciones Empleados en el Manual Anexo III. Medios de Cultivo Empleados en el Manual PAGINA 161 166 173 176 181 182 185 188
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NOMBRE DEL ALUMNO(s) Y NUMERO DE CUENTA
FACULTAD AO GRUPO SEMESTRE PRACTICAS APROBADAS PROMEDIO MAESTRO
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PRESENTACION La Microbiologa es una disciplina extraordinariamente amplia, que abarca especialidades tan diversas como la bioqumica, la biologa celular, la gentica, la taxonoma, la bacteriologa de patgenos, la microbiologa industrial y de alimentos y la ecologa. Los estudiantes ajenos al tema necesitan una introduccin al conjunto antes de concentrarse en aquellas partes que ms les interesen. Este manual aporta una introduccin a las reas ms importantes de la microbiologa, adecuado a estudiantes de diversa procedencia. Gracias a esta adecuacin, el manual readapta a asignaturas con una orientacin que puede variar desde la microbiologa bsica hasta la microbiologa mdica. No solo ser til para estudiantes de Qumico Farmacutico Bilogo sino tambin para otras ciencias de la salud. No se exagera al destacar la importancia de la microbiologa. La sociedad humana se beneficia de los microorganismos de muchas formas. Son necesarios para la elaboracin de pan, queso, cerveza, antibiticos, vacunas, vitaminas, enzimas y otros productos importantes. De hecho la biotecnologa moderna se fundamenta en principios microbiolgicos. Los microorganismos son componentes indispensables de nuestro ecosistema; gracias a ellos, se desarrollan los ciclos del carbono, oxgeno, nitrgeno y azufre, que tienen lugar en los sistemas terrestres y acuticos. La primera persona que observ y describi con rigor cientfico los microorganismos fue el microscopista aficionado Anthony van Leeuwenhoek de Delft, Holanda en 1670. Sin embargo, Louis Pasteur logr el mayor reconocimiento de la relacin entre microorganismos y enfermedades. El objetivo general del manual de microbiologa es que los alumnos se familiaricen con el conocimiento biolgico de los microorganismos, su forma, estructura antignica, reproduccin, fisiologa, metabolismo e identificacin, como estn distribuidos en la naturaleza, sus relaciones con otros seres, los efectos benficos y perjudiciales que ejercen sobre el humano y las alteraciones fsicas y qumicas que provocan en su medio. Asimismo es importante que el estudiante adquiera habilidades y destreza en el manejo de microorganismos en el laboratorio. En virtud de que este manual esta dirigido a estudiantes de las ciencias de la salud y manejarn microorganismos en la realizacin de las prcticas experimentales, es de vital importancia incluir al principio recomendaciones generales relacionadas con los lineamientos generales del laboratorio y los principales procedimientos que deber de aprender, as como las medidas de bioseguridad indispensables para que sean capaces de manipular los microorganismos en forma adecuada sin comprometer su seguridad ni la de sus compaeros.
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El manual de prcticas est compuesto de 37 experimentos, de los cuales 10 estn diseados para que se familiarice con los procedimientos de cultivo y aislamiento de bacterias y levaduras. Estas 10 prcticas estn priorizadas para realizarse de acuerdo al programa terico de la materia de Microbiologa que se lleva a cabo en el sptimo semestre de la carrera de Qumico Farmacutico Bilogo en la Facultad de Ciencias Qumicas dependiente de la Universidad de Colima. Cada parte experimental contempla los objetivos generales y particulares, una introduccin para una mejor comprensin del tema a tratar, material y reactivos a utilizarse as como el procedimiento para la realizacin de la prctica, complementndose con figuras, cuadros, cuestionario y bibliografa recomendada. Como parte complementaria del manual de Microbiologa se presentan en forma de anexos, la preparacin de soluciones, tinciones (anexo I) y medios de cultivo (anexo II) indispensables para la elaboracin de cada una de la prcticas. Finalmente, considero que el manual ser una herramienta indispensable tanto para maestros del rea como alumnos para complementar el contenido terico de la materia, ya que fue elaborado de acuerdo al material y reactivos de laboratorio que se disponen en un almacn comn del rea de la salud, la infraestructura del laboratorio de Microbiologa y a la programacin semestral del curso con 3 horas prcticas por semana. M. en C. Mario Alberto Gaitn Hinojosa Coordinador del PE de QFB.
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OBSERVACIONES GENERALES 1. Hay que seguir cuidadosamente las reglas establecidas para el trabajo correcto del laboratorio. 2. Todos los alumnos deben usar permanentemente una bata de laboratorio limpia y abotonada durante el tiempo que est en el interior del laboratorio. 3. Est absolutamente prohibido: fumar, ingerir lquidos (agua, refresco, etc.) o comer dentro del laboratorio as como ponerse cosmticos ni tocarse la cara con las manos o algn otro objeto. 4. No deber sacar del laboratorio equipo, cepas o medios de cultivo contaminados. 5. No poner ropa o libros sobre la mesa de trabajo, ni guardar material de laboratorio (cultivos) en las bolsas de las batas. 6. Los membretes o etiquetas deben ser humedecidos con agua y no con la lengua. El asa y porta-asa deben ser esterilizados en la flama antes y despus de su utilizacin. Calentar el asa verticalmente (no horizontalmente). Si esta cubierta con algn material, squese al lado de la flama antes de esterilizarla para evitar el chisporroteo del material y su diseminacin. 7. Al inicio y al final de la prctica limpiar y descontaminar las mesas de trabajo y el equipo que vaya a estar o haya estado en contacto con el material infectado. Colocar todo el equipo en su sitio. 8. Lavarse de manera meticulosa las manos con jabn germicida y abundante agua una vez terminada la prctica, incluso si sale antes de la terminacin de la misma por breves momentos. 9. No se permite la visita personal de personas ajenas a la prctica ya que puede ocasionar distraccin del estudiante poniendo en riesgo la seguridad en el trabajo que se realiza. PROCEDIMIENTOS DEL LABORATORIO 1. Comprobar que las llaves del gas y del agua estn cerradas antes de salir del laboratorio. 2. En caso de cualquier accidente personal (herida personal o incendio) o del material de trabajo, notifquese inmediatamente al maestro o al instructor. En caso de derrame de caldos o medios de cultivo debe primero conservar la calma y colocar servilletas o toallas de papel sobre el material derramado para evitar su dispersin y verter abundante solucin desinfectante sobre las toallas como cloro, yodo, fenol o benzal en cualquier sitio o implemento que accidentalmente se haya contaminado. Dejarlo actuar por lo menos 30 minutos,
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Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA retirar las toallas y tirarlas en el contenedor destinado a la eliminacin de material contaminado. 3. No se debe pipetear con la boca. Usar siempre pipetas automticas o micropipetas. 4. Todos los procedimientos se deben efectuar con cuidado para no formar aerosoles o contaminar reas limpias. De preferencia hay que trabajar en una campana de flujo laminar. 5. Todo el personal debe lavarse las manos profusamente con un desinfectante despus de trabajar con muestras clnicas, material contaminado y animales infectados. 6. Todo el material sucio debe ser manejado con guantes. 7. Hay que separar las pipetas, portaobjetos y cubreobjetos contaminados del resto de material sucio y colocarlos en un contenedor punzocortante. 8. A todo el material contaminado de desecho se le deben quitar etiquetas y cintas adhesivas; se colocan en bolsas rojas para que no derramen los caldos o el agar fundido y se colocan en un carro para su transporte al rea de esterilizacin. 9. Las pipetas contaminadas se sumergen en una solucin de hipoclorito de sodio durante 30 minutos. PRECAUCIONES GENERALES EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA La sangre y los lquidos corporales de los pacientes o estudiantes deben considerarse infecciosos. 1. Todas las muestras de sangre y lquidos corporales deben guardarse en un recipiente adecuado con tapn para evitar su derrame durante el transporte. Hay que tener precaucin cuando se recoja cada muestra para evitar la contaminacin del exterior del recipiente y de la etiqueta que acompaa la muestra. 2. Todas las personas que analicen sangre y muestras de lquidos corporales deben llevar guantes. Ante la posibilidad de un posible contacto de la mucosa con sangre o lquidos corporales del paciente, es necesario el uso de mascarilla y gafas protectoras. Hay que cambiarse de guantes y lavarse las manos despus de tomar la muestra. 3. En anlisis rutinarios, como estudios histolgicos y anatomopatolgicos o cultivos microbiolgicos, no es necesario utilizar una cabina de seguridad. Sin embargo, estas cabinas deben emplearse cuando realicen anlisis de muestras con una posibilidad importante de generar aerosoles, por ejemplo en una agitacin intensa. 4. Hay que utilizar pipetas automticas para manipular todos los lquidos en el laboratorio. No se debe pipetear con la boca.
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Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA 5. Hay que limitar el uso de las jeringas y agujas a situaciones en las que no haya otra alternativa, y siempre hay que seguir las recomendaciones generales para evitar lesiones con agujas. 6. Hay que descontaminar todas las superficies de trabajo con un germicida qumico apropiado despus de un derrame de sangre y otros lquidos corporales y cuando se haya finalizado el trabajo. 7. Los materiales contaminados empleados en las pruebas de laboratorio deben limpiarse y descontaminarse antes de ser reprocesados, o bien, guardarlos en bolsas y eliminarlos de acuerdo con la norma para residuos infecciosos. 8. El equipo de laboratorio que se haya contaminado con sangre u otros lquidos corporales deben descontaminarse y limpiarse. 9. Todas las personas deben lavarse las manos despus de finalizar las actividades de laboratorio y quitarse la bata antes de dejar el laboratorio. 10.No se debe comer, beber ni fumar en el rea de trabajo.
Fuente: Morbidity and mortality weekly report, 36 5S-10S, 1987, Center for Disease Control and prevention Guidelines.
Material indispensable que deber traer el estudiante por sesin. 1. Bata blanca de laboratorio. 2. La prctica a realizarse.
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MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD Las medidas de bioseguridad que deben seguirse en un laboratorio de Microbiologa y que deben considerarse las ms importantes se describen a continuacin: 1. Hay que seguir cuidadosamente las reglas establecidas mencionadas anteriormente como observaciones generales en la hoja anterior, reglas establecidas para el trabajo correcto del laboratorio. 2. Se debe verificar diariamente la temperatura de la incubadora y de la estufa bacteriolgica y del estado de los aparatos que se utilizan en el laboratorio. 3. Hay que usar permanentemente la bata de laboratorio. Debe estar expresamente prohibido el consumo de alimentos y bebidas, as como fumar y aplicarse cosmticos. 4. Antes y despus de la jornada de trabajo, limpie y descontamine las mesas y el equipo que vaya a estar o haya estado en contacto con el material infectado. 5. No se debe utilizar el TELEFONO CELULAR dentro de las prcticas de laboratorio. 6. No guardar alimentos en el refrigerador de sustancias contaminantes o qumicos. 7. No se debe pipetear con la boca. Use siempre pipetas automticas o propipetas. 8. Todos los procedimientos se deben realizar con cuidado para no formar aerosoles o contaminar reas limpias. De preferencia hay que trabajar en una campana de flujo laminar. 9. Emplee mascarillas y cubrebocas durante procedimientos que puedan generar salpicaduras aerosoles- de sangre u otros lquidos corporales. 10. Evite deambular con los elementos de proteccin personal por fuera de su sitio de trabajo. 11. Utilice un par de guantes. 12. Abstngase de tocar con las manos enguantadas alguna parte del cuerpo y de manipular objetos diferentes a los requeridos durante el procedimiento. 13. Evite accidentes y avise de inmediato si esto ocurre. Debe limpiarse con soluciones de yodo, cloro, fenol o benzal cualquier sitio o implemento que accidentalmente se haya contaminado. En caso de derrame de sangre u otros lquidos corporales sobre superficies de trabajo, cubra con papel u otro material absorbente; luego vierta hipoclorito de sodio al 6% (o cualquier otro desinfectante indicado) sobre el mismo y sobre la superficie circundante, dejando actuar durante 30 minutos; despus limpie nuevamente la superficie con desinfectante a la misma concentracin y realice limpieza con agua y jabn. El personal encargado de realizar dicho procedimiento debe utilizar guantes, cubreboca y bata. 14. En caso de ruptura de material de vidrio contaminado con sangre u otro lquido corporal, los vidrios deben recogerse con escoba y recogedor, nunca con las manos. 15. Todo el personal debe lavarse las manos profusamente son jabn germicida o desinfectante despus de trabajar con muestras clnicas, material contaminado y animales infectados. 16. Todo el material sucio debe manejarse con guantes.
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Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA 17. Hay que separar las pipetas, cajas de petri y tubos de rosca contaminados del resto de material sucio. 18. Colocarlas cubreobjetos y portaobjetos en el contenedor de punzocortantes. 19. Abstngase de doblar o partir manualmente cualquier material punzocortante. 20. A todo el material contaminado de desecho se le debe quitar etiquetas, cintas adhesivas o despintarlos; se colocan en cubetas con solucin desinfectante (cloro diluido), despus de ser esterilizado para su posterior lavado. El material contaminado como agar se colocan en las bolsas rojas que lo identifique con el smbolo de RPBI y se depositan en el congelador del rea temporal para RPBI. 21. Las pipetas contaminadas se sumergen una solucin de hipoclorito de sodio durante 30 minutos. 22. En caso de accidente con material punzocortante reportar inmediatamente al maestro.
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Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA ELEMENTOS PROPUESTOS PARA QUE INTEGREN A UNA PRCTICA 1. Portada de presentacin 2. Nmero de la prctica 3. Titulo 4. Objetivo de la prctica 5. Materiales (equipos, sustancias, aparatos, implementos, etc.) 6. Introduccin terica 7. Procedimiento o desarrollo 8. Cuestionario 9. Observaciones 10. Resultados 11. Discusiones 12. Conclusiones 13. Bibliografa 14. Vo. Bo. 15. Lugar y fecha Explicacin detallada sobre cada uno de los posibles elementos: Portada de presentacin con los siguientes datos: Nombre de la institucin: Universidad de Colima Nombre de la facultad: Facultad de Ciencias Qumicas Nombre de la carrera: Qumico Farmacutico Bilogo Nombre y nmero de la prctica Nombre del alumno Manual de prcticas de (Nombre de la Materia) Semestre Catedrtico Fecha de elaboracin. Nmero: Es l numero consecutivo que le corresponde a cada una de las prcticas Titulo: Se refiere al nombre que se le asignar a la prctica y que tiene la funcin de indicarnos de forma sinttica en que consistir el trabajo prctico que se va a realizar. Objetivo: En ste elemento se van a especificar claramente las acciones, habilidades, actitudes y destrezas que se pretende que adquiera o desarrollen los alumnos con la realizacin de la prctica, y que sin duda sern factor importante en su formacin profesional. Materiales: Es un listado de todos los elementos materiales necesarios que se van a utilizar en la realizacin de la prctica, como son: sustancias qumicas, implementos y consumibles as como, equipos especficos y aparatos especiales con sus respectivas caractersticas. Introduccin terica: Comprende una breve descripcin terica sobre el tema en particular del que se va a realizar la prctica correspondiente, as como su relacin con algunos otros temas de la forma ms concisa posible. Tratando de mostrar un panorama o marco referencial que le da sustento sobre la actividad a realizar. Qumico Farmacutico Bilogo Pgina 14
Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA Procedimiento o desarrollo: Debe contener una serie de indicaciones o pasos secuenciados para poder realizar la prctica de la mejor manera posible sin descuidar todas las observaciones, sugerencias, esquemas, comentarios o notas pertinentes sobre los pasos o partes del procedimiento a realizar de ser necesarios. Cuestionario: Se integre con una serie de preguntas relacionadas con la introduccin terica, adems preguntas sobre las observaciones y los resultados obtenidos de la realizacin de la prctica. Se integran dos tipos de preguntas: preguntas de complementacin y por ltimo, preguntas de opcin mltiple, en las cuales se tenga que reflexionar; para contestar sta ltima, cada pregunta puede incluir una o varias opciones como respuestas. Deben responder el cuestionario ya que es parte de la evaluacin de la prctica. Observaciones: En este elemento se incluyen todos los dibujos, comentarios a situaciones importantes que resultaron decisivas durante la realizacin de la prctica. Resultados: Es el producto final que se obtiene de realizar adecuadamente el trabajo de una prctica, y pueden ser todos los clculos, tablas, grficas o esquemas, programas, comentarios, dibujos etc., que deben servir como evidencias de la realizacin del trabajo prctico y de las competencias adquiridas o desarrolladas. Discusiones: En este apartado, el cual es uno de los ms importantes para la evaluacin de la prctica, el estudiante tendr que investigar las observaciones realizadas en el experimento para justificarlas cientficamente. Conclusiones: Se refiere al punto de vista personal del alumno en el cual refleja mediante una o varias afirmaciones, la importancia de la realizacin de la prctica en la materia correspondiente y en su propia formacin como futuro profesionista. Bibliografa: Aqu se incluyen todas las referencias bibliogrficas, documentales y direcciones electrnicas de sitios en la pgina web que se consultaron para poder contestar las preguntas del cuestionario, o para ampliar y reforzar los resultados obtenidos. Evaluacin: Dentro del proceso enseanza aprendizaje la evaluacin ocupa un lugar muy importante por lo que es necesario que en el aprendizaje prctico se realice para saber si s esta logrando el objetivo particular de la prctica y el objetivo respectivo de la materia. En cuanto a los instrumentos utilizados para la evaluacin del trabajo prctico, se tomarn en cuenta el reporte mismo de la prctica donde debe tener el cuestionario con todas las respuestas correctamente contestadas, las observaciones, los resultados, las discusiones y las conclusiones especficas de cada prctica realizada. VO.BO. Visto bueno del profesor de la Materia. Lugar y Fecha: Es el lugar y la fecha de la realizacin de la prctica respectiva.
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Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA Prctica No. 1 MANEJO DEL MICROSCOPIO OBJETIVO GENERAL: Reafirmar los conocimientos bsicos adquiridos con anterioridad sobre el manejo del microscopio. OBJETIVOS INMEDIATOS: El estudiante debe ser capaz de: 1. Enumerar sobre un diagrama las partes constituyentes del microscopio, diferencindolas segn el sistema al que pertenezca. 2. Enfocar el microscopio para apreciar los detalles de los microorganismos a observar. 3. Mantener el microscopio limpio y en condiciones ptimas de trabajo. FUNDAMENTO: Para comprender el funcionamiento del microscopio es necesario conocer como amplifica y que factores pueden alterar la amplificacin. La amplificacin se logra con dos sistemas de lentes, los objetivos y los oculares. Los lentes objetivos enfocan los rayos de luz procedentes de la muestra, formando una imagen real dentro del tubo del microscopio, la imagen real se amplifica despus con los lentes oculares permitiendo que el ojo enfoque una imagen virtual de la muestra. La amplificacin total es igual a la amplificacin lograda por el objetivo multiplicada por la amplificacin del ocular. Adems de la amplificacin que se puede lograr, es necesario que el microscopio produzca una imagen visible de definicin adecuada y posea una capacidad de resolucin elevada. El poder de resolucin es la capacidad de producir imgenes independientes de pequeas partes cercanas de un objeto, que se encuentra a poca distancia. Esta capacidad de resolucin se mide por una cifra conocida como abertura numrica. La resolucin tambin depende de la longitud de onda de la luz empleada para la iluminacin. El poder de resolucin del microscopio es una expresin matemtica que denota la capacidad de los lentes para distinguir claridad de detalle. Puede decirse que un sistema de lentes pierde la resolucin de un objeto dado cuando ya no puede separar dos puntos muy cercanos entre s, es decir cuando los dos puntos estn tan cerca que aparecen como uno solo. Por lo tanto, si un microscopio no resuelve un objeto, de nada sirve aumentar la amplificacin puesto que solo se obtendra el efecto de aumentar el tamao de la mancha borrosa sin aadir definicin. Para propsitos prcticos, el lmite de resolucin de su microscopio es de aproximadamente 0,2 . IL-1
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Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA PRECAUCIONES ESPECIALES: 1. Mantener el microscopio libre de polvo siempre. 2. Al manipular el microscopio, ste deber manipularse por el brazo y la base del mismo, nunca por el tubo, los objetivos o cualquier otra parte. 3. El microscopio no se deber sacudir, inclinar o volcar. 4. No se deber usar alcohol en las partes laqueadas ya que este acta como solvente. 5. No se deber manipular descuidadamente el tornillo micromtrico ya que esto ocasiona un contacto violento del objetivo con el portaobjetos, pudindose ocasionar quebrantamientos en ambos. 6. Se deber limpiar los objetivos con el papel adecuado y adems el lente objetivo de inmersin con xilol. 7. No deber dejarse el portaobjetos en la platina cuando el microscopio no est en uso. MANEJO DEL MICROSCOPIO: 1. 2. 3. 4. 5. Colocar el portaobjetos en la platina. Regular el voltaje. (no mayor de 5,5 volts) Ajustar la fuente de iluminacin. Regular la intensidad de la luz. Aproximar el portaobjetos al lente objetivo, primero debe utilizarse el primer aumento. 6. Cuando se encuentra una distancia de 0,6 cm, aproximadamente.; fijar el prefoco con la palanca. 7. Enfocar la muestra con los tornillos. (primero con el macro y despus con el micromtrico.) 8. Si desea cambiar el lente objetivo, girar el revolver hasta or un clic. Esto debe hacerse una vez enfocado un campo definido. 9. Volver a repetir los pasos 4, 5, 6, y 7. 10. Si desea usar el lente de inmersin, utilizar la menor cantidad de aceite posible, colocando una gota en el rea de inters del portaobjetos. 11. Sumergir el lente en el aceite y repetir los pasos 4, 5, 6 y 7. Evitar el choque violento del lente con el portaobjetos. 12. Limpiar el objetivo de inmersin con papel especial para lentes una vez finalizado el uso. No se utilice xilol o ningn otro solvente en la limpieza de este lente. MATERIAL: Microscopio ptico binocular. Aceite de inmersin. Papel para limpiar lentes. Un cabello. Un pedazo de papel con un borde rasgado. Solucin concentrada de cloruro de sodio. Fibras de algodn.
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Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA PROCEDIMIENTO: Examine todos los objetos en la lista de materiales a travs del objetivo de bajo poder. Es ms fcil mantener el cabello y las fibras de algodn en posicin fija para su observacin si se colocan en medio de una gota de agua sobre el portaobjetos. As, se previene que el aire las mueva fuera del campo durante la observacin. La solucin concentrada de cloruro de sodio debe dejarse secar sobre el portaobjetos antes de observarse. Eso causa la formacin de cristales de sal relativamente grandes. Repita sus observaciones usando ahora el objetivo de alto poder en seco. Al observar con este objetivo, coloque un cubreobjetos sobre cada una de sus preparaciones acuosas para proteger el lente del agua. Esto se conoce como un montaje hmedo. Dibuje bosquejos de cada objeto como se observan con el objetivo de bajo poder y con el de alto poder en seco. Asegrese de hacer sus dibujos precisos como bosquejos y con caracteres delineados. Es de gran importancia poner atencin a los detalles, de hecho debe dibujarse cada objeto discernible en el campo visual. Nunca se limite a dibujar puntos y rayas improvisadas o de memoria. CUESTIONARIO: 1. Dibuje las partes tpicas de trabajo del microscopio ptico.
2. De acuerdo con el nmero de lentes como se clasifican los microscopios?
3. Defina el trmino resolucin, apertura numrica y poder de resolucin.
4. Cul es la resolucin total combinado que se logra con el objetivo de 10X, 45X y 100X?
5. Cul es la funcin del diafragma del microscopio?
6. Cmo contribuy el trabajo de Leeuwenhoek en las contribuciones de Pasteur y Koch?
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7. Cuntas aplicaciones se obtienen, por lo comn, con el microscopio de luz?
8. Cul es la funcin del aceite cuando se usa con el objetivo de inmersin?
9. Si se observa una muestra con el objetivo de 43X en un microscopio con un ocular de 15X, Qu aumento tendr la imagen?
10. Cmo se producen las imgenes reales y virtuales en un microscopio ptico? Cul es la que realmente se ve?
Bibliografa Consultada.
DIBUJOS:
1. cabello humano 2. montaje hmedo 3. 10X
1. cabello humano 2. montaje hmedo 3. 45X
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1. fibras de algodn 2. montaje hmedo 3. 10X
1. fibras de algodn 2. montaje hmedo 3. 45X
1. papel con borde rasgado 2. montaje hmedo 3. 10X
1. papel con borde rasgado 2. montaje hmedo 3. 45X
1. cristales de cloruro de sodio 2. preparacin en seco 3. 10X
1. cristales de cloruro de sodio 2. preparacin en seco 3. 45X
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COMENTARIOS Y CONCLUSIONES:______________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________
BIBLIOGRAFIA: Bradshaw L. J. 2000. Microbiologa del Laboratorio. Editorial El Manual Moderno. Mxico, D.F. Pelczar M. J.; Reid Roger; Chan ECS. Microbiologa. (1997). McGraw Hill. 4. Edicin en espaol. Mxico, D.F. Joklik Wolfang, Willet Hilda, Amos Bernard. (1996). Microbiologa de Zinsser. 20. Edicin. Editorial Mdica Panamericana. Buenos Aires, Argentina. Prescott L. M., Harley J.P., Klein D.A. (2004). Microbiologa. 5. Edicin. Editorial Mc. Graw Hill-Interamericana. Espaa. Dulbecco R., Davis B., Eisen H., Ginsberg H., Wood B., McCarty Maclyn. (2000) Tratado de Microbiologa. 4a. Edicin. Editorial Salvat Editores S.A. Barcelona, Espaa.
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Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA Practica No. 2 PREPARACIN DEL MATERIAL DE LABORATORIO OBJETIVO: Que el alumno sea capaz de preparar el material de laboratorio que se utiliza con ms frecuencia en el trabajo rutinario, tomando como ejemplo el ms sencillo (cajas de petri, tubos de ensaye, matraces y pipetas). Que el alumno conozca los principios generales de las tcnicas de esterilizacin de materiales de vidrio y medios de cultivo de uso comn en Microbiologa. Observar el efecto de las condiciones de asepsia en el control de la contaminacin microbiana en el laboratorio. FUNDAMENTO: La preparacin del material de laboratorio se inicia desde el momento de que se colectan los recipientes o utensilios conteniendo sustancias de un estudio ya realizado, estos debern esterilizarse y lavarse, posteriormente se secan, se tapan y se envuelven adecuadamente para ser esterilizados al horno o autoclave. La aplicacin de calor es el mtodo mas simple para esterilizar material, a condicin de que el material por si mismo no sufra deformacin por el calor. Una temperatura de 100 C mata a todas las formas bacterianas en 2 o 3 minutos. Generalmente se usa el vapor, tanto por que las bacterias se mueren mas rpidamente cuando se encuentran hmedas como por que el vapor proporciona un medio de distribuir el calor uniformemente en todas las partes del recipiente de esterilizacin. Para esterilizar material que debe permanecer seco se dispone de hornos elctricos por los que circula aire caliente, en vista de que la distribucin del calor es menos efectiva en estos aparatos se acostumbra aplicar una temperatura de 160C durante dos horas asegurando en esta forma que todas las partes del interior del recipiente alcance cuando menos 120 C por quince minutos. MATERIAL: Caja de Petri 100 X 15 mm. Tubos de ensaye de 13 x 100 mm. Matraces Erlenmeyer de diferente capacidad. Pipetas graduadas de 2, 5 y 10 ml. Pipetas Pasteur. Mechero Fischer. Tapones con algodn y gasa. Papel Manila o de estraza para envolver. Gasa cortada en cuadros pequeos. Agar Nutritivo. Agar Papa Dextrosa. Medio Mnimo de Sales. Soluciones Amortiguadoras pH 4 y 7. Tripi. Algodn. Autoclave Potencimetro Horno de calor seco Incubadora a 37C IL-2
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METODO: El profesor explicar los principios generales de trabajo en el Laboratorio de Microbiologa, enfatizando en la desinfeccin de reas as como en la preparacin y esterilizacin de los medios de cultivo y materiales necesarios para el trabajo cotidiano con microorganismos. Tambin har las demostraciones necesarias para que el estudiante aprenda a envolver los materiales, as como su manejo en condiciones aspticas. Preparacin del material de vidrio y medios de cultivo 1. Lavar perfectamente las cajas de petri y pipetas con escobilln y detergente. Enjuagar con abundante agua corriente. 2. Escurrir el exceso de agua y enjuagar el material con agua destilada con una pizeta por las paredes interiores. Dejar escurrir el material sobre una toalla o papel de envoltura. No debe secar el material por ningn otro medio. 3. Una vez seco el material, se proceder a envolver las cajas de petri y pipetas con papel estraza. Para los tubos y matraces se elaborarn tapones de algodn y gasa, procurando que ajusten con holgura, sobre los que finalmente se les colocar un capuchn de papel. 4. Preparar 20 ml de Caldo Nutritivo (CN) en un matraz Erlenmeyer de 100 ml y ajustar el pH con el potencimetro de acuerdo a las instrucciones del frasco del medio agregando con una pipeta Pasteur poco a poco solucin de HCl 0,1M o de NaOH 0,1M, en caso de que el pH sea ms alcalino o cido respectivamente. Vaciar 5 ml en cuatro tubos de cultivo con tapn de baquelita que debern cerrar sin llegar al tope. 5. Preparar 120 ml de Agar Nutritivo (AN), calentar la mezcla en un tripi agitando constantemente hasta ebullicin, durante 1 minuto (cuidar que no se proyecte) y vaciar enseguida 5 ml de medio en tres tubos con tapn de rosca. Enjuagar inmediatamente la pipeta para evitar que se solidifique el agar. El resto se esteriliza en autoclave. 6. Preparar 120 ml de medio de cultivo Agar Papa Dextrosa (APD) en un matraz Erlenmeyer de 250 ml, ajustar el pH del medio de acuerdo a las instrucciones del frasco con el potencimetro con agitacin constante y calentar a ebullicin durante 1 minuto, cuidando de que no se proyecte o derrame. Posteriormente vaciar 7 ml del medio en tres tubos que se taparn con tapn de algodn y gasa. El resto se esteriliza en autoclave. 7. Preparar 120 ml de medio de cultivo Mnimo de sales (MM) en un matraz Erlenmeyer de 250 ml. Esterilizacin del material de laboratorio y medios de cultivo 1. Las cajas de petri y pipetas envueltas se colocarn en horno a 160C durante 2 horas. Despus de sacarlas, dejarlas enfriar y abrir los paquetes nicamente en rea asptica. 2. Los medios de cultivo se esterilizarn en autoclave de calor hmedo de acuerdo a las siguientes instrucciones: a) Revisar que el nivel del agua coincida con la marca en el tubo indicador. En caso necesario aadir agua destilada. Qumico Farmacutico Bilogo Pgina 23
Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA b) Conectar la autoclave y poner la perilla de control en calentamiento alto. Acomodar los medios y los materiales en la canasta del autoclave y colocarla dentro. c) Cerrar la tapa, apretar las manijas de dos en dos en posicin encontrada y esperar a que salga el vapor de agua por el orificio de purgado. Despus cerrar este orificio con la vlvula de seguridad. d) Dejar que el equipo se caliente hasta alcanzar los 121C o 15 libras de presin revisando cuidadosamente la escala del manmetro. Una vez alcanzada esta temperatura deber bajarse el nivel de calentamiento moviendo la perilla de control al nivel medio o bajo. e) Mantener el equipo en estas condiciones durante 15 minutos. f) Apagar la autoclave y dejar que baje la presin al valor de 0. Abrir la vlvula de seguridad y con la ayuda de guantes de asbesto o una jerga hmeda abrir cuidadosamente la tapa, de adelante hacia atrs para evitar quemaduras por la salida del vapor. Preparacin de las cajas de petri y tubos con medio de cultivo 1) Los tubos con medios de cultivo con agar, se debern colocar en una superficie inclinada de tal forma que el medio se solidifique a una distancia aproximada de 1-2 cm de la boca del tubo. 2) Dejar que los medios de cultivo en matraces que se han sacado del autoclave se enfren a una temperatura aproximada de 40-50C, que coincida con la posibilidad de sostener el matraz en la palma de la mano sin sentir un calor excesivo. 3) Cerca del mechero, etiquetar 3 cajas con AN, 3 cajas con APD y 3 con MM. Los medios de cultivo se vacan en las cajas de petri (aproximadamente 25 ml) en zona asptica cerca del mechero o en campana de flujo laminar. 4) Dejar que solidifiquen los medios (por lo menos 15 minutos) y posteriormente envolver las cajas cuidadosamente con papel estraza o acomodarlas en forma invertida en bolsas de plstico limpias. 5) Guardarlas en refrigeracin hasta 24 horas antes de utilizarlas. Prueba de esterilidad de materiales 1) Colocar los tubos con agar inclinado y las cajas de petri en forma invertida enana estufa de incubacin ajustada a 30C durante24-48 horas. 2) Revisar los tubos y cajas de petri para detectar la presencia de contaminantes, por la aparicin de turbidez, nata superficial y/o depsito de material en el fondo de los tubos con medio lquido; as como la formacin de colonias microbianas en la superficie de medios slidos. 3) Si no hay contaminacin de los medios, se abrir una de las cajas de petri de cada medio durante 1 minuto en el laboratorio o zonas accesorias al mismo y se etiquetar como al aire. 4) La otra caja de cada medio de cultivo se abre durante 30 segundos cerca del mechero y se etiquetar en rea asptica. 5) La tercera caja se conservar sin abrir y se etiqueta como control.
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DATOS: A. Hacer la descripcin morfolgica de las colonias obtenidas en las cajas con diferentes medios de cultivo (AN, APD y MM) y con los distintos tratamientos en relacin a la caja control. B. Reportar el crecimiento en forma cualitativa, (-) no hay crecimiento; (+) poco crecimiento; (++) crecimiento regular y (+++) crecimiento abundante. C. Discuta los resultados y determine si la esterilizacin en el autoclave y horno fue adecuada, as como el manejo de los materiales.
Descripcin morfolgica de microorganismos en cajas de petri con diferentes medios de cultivo. Medio de cultivo Abierto al aire Abierta en rea asptica Control
AGAR NUTRITIVO
MINIMO DE SALES
AGAR PAPA DEXTROSA
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CUESTIONARIO: 1. Cules son los mtodos de esterilizacin ms utilizados en Microbiologa?
2. Explique cuales son las diferencias entre los procesos de esterilizacin, desinfeccin y asepsia. Cmo se relacionan estos procedimientos con la pasteurizacin?
3. Mencione diferencias entre la esterilizacin con calor hmedo y el seco.
4. En qu consiste la esterilizacin con vapor a presin?
5. Cmo funciona la cinta testigo cuando se introduce al autoclave?
6. Por qu a los medios de cultivo previo esterilizacin se deben ajustar el pH y calentar?
7. Cmo ajustara el pH a un medio con agar?
8. Cul es ms eficaz como agente esterilizante, el calor seco o el calor hmedo? Por qu?
9. De una lista de materiales que deben esterilizar preferentemente en un horno de aire caliente en vez de autoclave. Indicar en el caso de cada material, porqu el aire caliente es el mtodo elegible para esterilizar? Qumico Farmacutico Bilogo Pgina 26
10. Dibuje el material esterilizado.
11. Comparar las clulas vegetativas de las bacterias con las esporas bacterianas en relacin con su resistencia al calor.
12. Distinga entre las expresiones punto trmico letal, tiempo trmico letal y tiempo de reduccin decimal.
13. Qu es un autoclave?
14. Qu significado tiene la presin per se en la efectividad del proceso de esterilizacin con el autoclave para lograr esta operacin?
Bibliografa Consultada. BIBLIOGRAFIA: Bradshaw L. J. (2000). Microbiologa del Laboratorio. Editorial El Manual Moderno. Mxico, D.F. Pelczar M. J.; Reid Roger; Chan ECS. (1997). Microbiologa. McGraw Hill. 4. Edicin en espaol. Mxico, D.F. Joklik Wolfang, Willet Hilda, Amos Bernard. (1996). Microbiologa de Zinsser. 20. Edicin. Editorial Mdica Panamericana. Buenos Aires, Argentina. Koneman E., Allen S., Dowell V. R., Sommers H. (1996). Atlas de Diagnstico Microbiolgico. Editorial Interamericana. Mxico.
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Prctica No. 3 PREPARACIN DE FROTIS Y FIJADO
CM-1
OBJETIVO: Que el alumno aprenda las tcnicas de preparacin de frotis, de fijacin y coloracin ms utilizadas en el estudio microscpico de cultivos bacterianos obtenidos de medios slidos. Que identifique las principales formas bacterianas y la importancia de las tinciones simples en la caracterizacin morfolgica de estos microorganismos. INTRODUCCIN: La palabra Citologa significa el estudio de las clulas. La citologa es similar a la anatoma, pero a nivel microscopio. La citologa estudia la clula y sus partes; sin embargo las estructuras con que trata la citologa son muy diferentes de las que trata la anatoma, ya que aquellas son microscpicas y sus lmites morfolgicos no estn bien definidos. A travs del desarrollo de la citologa, los cientficos han tenido que ocurrir a un gran nmero de trucos qumicos para tornar visibles las estructuras que componen la clula. Hasta hace poco, la falta de conocimientos sobre la naturaleza qumica de las estructuras subcelulares haba sido un gran obstculo para la citologa. Sin embargo, las recientes investigaciones en bioqumica y biologa molecular han esclarecido muchos problemas. Una de las herramientas principales en el estudio de las clulas es la tincin diferencial. Una tincin es diferencial cuando dos o mas reactivos se aplican para impartir color a la clula o sus partes especificas, mientras que una tincin simple implica la adicin de un solo reactivo. Como usted probablemente ya sabe, cuando se desea detectar la presencia de almidn en algunas estructuras, por ejemplo, una papa, se trata sta con una solucin de yodo. Una coloracin azul intensa o negra es indicacin de la presencia de almidn. Esta prueba se considera especfica para el almidn. Por lo tanto, como introduccin al estudio de las tcnicas de tincin el estudiante puede tratar una muestra de clulas con solucin de yodo para detectar partculas de almidn en el interior de las clulas. Normalmente, al tratar las clulas con la solucin de yodo, estas se colorean de un tono parduzco caracterstico del yodo y los grnulos de almidn resaltan al teirse de un azul intenso o negro, dependiendo de la concentracin de la solucin de yodo empleado. Al tratar ciertas substancias qumicas con otras substancias se producen reacciones coloreadas especficamente para las substancias as tratadas, como en el caso del yodo y el almidn. Se conocen gran cantidad de pruebas especficas que tienen selectivamente ciertos compuestos o grupos de compuestos. El valor de estos ensayos en citologa es incalculable. La acumulacin gradual de gran nmero de estas pruebas citoqumicas han hecho posible la identificacin de los constituyentes qumicos de la clula, tales como lpidos, cidos nucleicos, protenas, etc. Tambin se sabe que desde hace tiempo los aminocidos y protenas celulares reaccionan como cidos y bases dbiles con una gran variedad de materiales. En otras palabras, las protenas son sustancias anfotricas, se pueden ionizar ya sea como cidos o como bases. Esto significa que las protenas son sustancias de alta reactividad.
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Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA Como las protenas constituyen la mayor parte de los slidos en la clula, ellas participan en la mayor parte de las reacciones de teido. Para poder reaccionar exitosamente con una protena, una tincin biolgica debe ser capaz de ionizarse como cido o base, adems de producir coloracin. Generalmente, estas sustancias se llaman colorantes bsicos cuando presentan fuerte afinidad por las porciones cidas de la clula y colorantes cidos cuando muestran fuerte afinidad por las partes bsicas (alcalinas) de la clula. Muchas veces resulta conveniente usar una mezcla de dos colorantes, uno cido y uno bsico, que tian de distintos colores. Al tratar una clula con esta mezcla, los componentes cidos aparecern de color distinto a las partes alcalinas de la clula. Un ejemplo de esto es la hematoxilina-eosina, tincin sumamente conocida en histologa animal. La hematoxilina es un colorante bsico que tie de azul parte cidas de la clula; la eosina es un colorante cido que tie de rojo o rosa las partes alcalinas de la clula. Puesto que el ncleo de las clulas es cido (principalmente DNA) y el citoplasma es ms alcalino, la aplicacin de la hematoxilinaeosina a una clula animal, generalmente resulta un ncleo azul y un citoplasma rosado, aunque a veces hay excepciones. Al aplicar estas tcnicas al estudio de los microorganismos, el estudiante se enfrenta con problemas especiales. Uno de los problemas principales se debe al tamao de los microorganismos. Los microorganismos son considerablemente ms pequeos que las clulas vegetales o animales y la diferenciacin o resolucin de las estructuras en el interior de las clulas tan pequeas presentan gran dificultad dentro de los lmites de resolucin del microscopio ptico ordinario. Otro problema se origina del hecho de que el interior de las clulas de los microorganismos no esta tan bien diferenciado como en las formas superiores, lo cual dificulta la observacin de las estructuras como entidades discretas. Sin embargo, grandes avances se han logrado que permiten hacer visibles las estructuras subcelulares de los microorganismos por medio de la combinacin de diversas tcnicas ingeniosas. El problema alcanzado con la introduccin del microscopio electrnico ha sido por dems espectacular, pero la mayor parte de los laboratorios estudiantiles no puede darse el lujo de ofrecer este tipo de facilidades. Existen otras tcnicas y procedimientos comunes para todos los estudios citolgicos. Una de estas tcnicas se trata de la preparacin de clulas para ser observadas. Al hacer una preparacin para el microscopio, debe depositarse en el portaobjetos una capa de clulas lo suficientemente delgada para permitir el paso de luz a travs d ella. En el caso de los tejidos vegetales y animales, el procedimiento habitual consiste en preparar cortes finos con el microtomo, es decir, se rebana el tejido en cortes muy delgados, que luego se tien y se observan al microscopio. Estos cortes tienen generalmente un grosor de 5 a 10 . En el caso de los microorganismos el problema es ms sencillo. Generalmente basta con preparar un frotis de clulas microbiales para luego teirlas. Puesto que las clulas son tan pequeas, el objetivo se logra simplemente preparando una suspensin de clulas en agua u otro lquido; una gota de esta suspensin se extiende en un rea del portaobjetos y se deja secar. Se obtiene as una delgada capa de clulas sin necesidad de usar aparatos especializados. Es posible seguir este mismo procedimiento para las clulas vegetales y animales, siempre y cuando se cuente con un medio para disociar los tejidos en suspensin de clulas individuales.
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Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA Cuando se desea hacer un frotis de un caldo de cultivo de microorganismos, el caldo se aplica directamente al portaobjetos sin dilucin previa. Con el asa conviene hacer dos o tres aplicaciones en un rea reducida del portaobjetos, teniendo cuidado de no extender demasiado la suspensin. Al preparar un frotis de un medio slido el problema a evitar es la presencia de demasiadas clulas. Para esto, se toma del medio slido una minscula cantidad de material bacteriano (no mayor que la cabeza de un alfiler) el cual se emulsifica en una gota de agua de la llave sobre la superficie relativamente grande del portaobjetos. Una vez seco, el frotis debe aparecer ligeramente blanquecino, como el residuo que se obtiene al evaporar una gota de leche diluida. Una vez hecho el frotis, hay que fijarlo, para asegurarse que las clulas no se desprendan durante los repetidos lavados a que se somete el portaobjetos para teir la preparacin. Durante la tcnica de fijado se intenta detener toda actividad enzimtica en la clula antes de observarla al microscopio. Muchas, si no todas las clulas, poseen protenas enzimticas capaces de destruir gran parte de las estructuras intracelulares despus de la muerte de la clula. Por lo tanto, si la clula no ha sido fijada adecuadamente antes de teirse, la accin destructora de estas enzimas impedir la aparicin de todo detalle. El calor, adems de inactivar las enzimas ayuda a adherir las clulas al portaobjetos minimizando as la prdida de clulas durante el proceso de tincin. En Microbiologa, esta destruccin de estructuras celulares se evita por medio de la fijacin por calor, mientras que los tejidos vegetales y animales, se fijan tratndolos con distintas sustancias qumicas. Muchos de estos fijadores qumicos son agentes bien conocidos; por ejemplo, el alcohol, formol y substancias de este tipo. Quizs ahora sea propicio realizar algunos experimentos sencillos para ilustrar lo expuesto. MATERIAL: Alcohol etlico (96%). Alcohol metlico. Cultivo bacteriano en agar inclinado. Hisopo de algodn. Azul de metileno de Loeffler. Palillo ordinario. Portaobjetos 100 X 15 mm. Mechero bunsen. PROCEDIMIENTO: El profesor proporcionar a los alumnos cultivos slidos de Escherichia coli, Staphylococcus spp., Klebsiella spp., y Pseudomonas aeruginosa. El estudiante preparar frotis de cada cepa obtenida de cultivo slido, las cuales fijar y teir con azul de metileno. 1) Lave tres portaobjetos meticulosamente con agua y jabn, luego enjuguelos con varias gotas de alcohol, pngalos a secar. Flamee por unos segundos, al mechero bunsen, el lado de arriba de cada portaobjetos. A no ser que se diga de otra manera este mtodo de lavar los portaobjetos habr de usarse en todos Qumico Farmacutico Bilogo Pgina 30
Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA los experimentos futuros. Un portaobjetos sucio puede ocasionar prdida del material y adems dificulta la localizacin del espcimen bajo el microscopio. Sobre el portaobjetos nmero uno, coloque con el asa, una gota de agua de la llave. En esta gota, emulsifique una pequea cantidad del crecimiento bacteriano con que se le ha provedo, djalo secar al aire. Repite el procedimiento en el portaobjetos nmero dos, excepto que esta vez emulsifique material bacteriano raspado de sus propios dientes con el aplicador. A continuacin, con un palillo raspe suavemente la superficie interna de sus mejillas y deposite el material en el portaobjetos nmero tres. En cada caso, extienda el material hasta que forme una pelcula delgada sin cuajos densos. Despus de haber secado los tres frotis, fije los dos primeros con calor. Esto se hace simplemente tomando el portaobjetos con las pinzas y pasndolo lentamente a travs de la flama del mechero una y otra vez aproximadamente tres veces. No debe permitirse que el vidrio se sobrecaliente tanto que resulte doloroso al tacto. Deposite unas dos gotitas de alcohol metlico sobre el frotis nmero tres y, despus de esperar un minuto, squelo al aire. Ahora, aplique un par de gotas de azul de metileno Loeffler a cada uno de los tres frotis y djelos reaccionar por cinco minutos. Luego, elimine el exceso de tincin lavando suavemente los portaobjetos con agua de la llave, recuerde lavar los frotis de canto. Ponga las preparaciones a secar y una vez logrado esto, examnelas al microscopio, primero con el objetivo de bajo poder, y finalmente con aceite de inmersin. Observe las diferencias de tamaos entre las distintas clases de clulas con cada objetivo. Haga algunos dibujos de sus observaciones con el objetivo de aceite de inmersin. Observe la diferencia de tamao y estructuras de los distintos tipos de clulas.
2) 3) 4) 5)
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7) 8)
Como quizs ya se haya dado cuenta usted, los microorganismos son extremadamente pequeos y es muy difcil observar, con mas razn dibujar, los detalles internos. En este experimento como en todos los venideros se requiere que el dibujar los microorganismos observados los amplifique un poco a fin de que su instructor se de cuenta se de cuenta si usted ha observado correctamente todas las estructuras. Sus dibujos han de ser claros y bien definidos ejectelos a los colores observados en las preparaciones teidas. De los organismos observados limtese a dibujar varios ejemplos tpicos poniendo atencin a las variaciones de forma y tamao, especialmente a las maneras de agruparse caractersticas de los organismos en su preparacin.
NOTA: El procedimiento para lavar los frotis ya usados es el siguiente: sostenga el portaobjetos sobre el fregadero y ponga varias gotas de xilol sobre el frotis y enjuguelo con agua y jabn. Repita la operacin por lo menos otra vez para eliminar todo microorganismo. Luego lave el portaobjetos como de ordinario y gurdelo para ser usado en otros ejercicios.
CUESTIONARIO: 1. Investigue cules son las estructuras celulares o molculas responsables de la tincin simple realizada. D ejemplos de otros colorantes que podran utilizarse.
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Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA 2. Porqu se recomienda fijar los frotis de cultivos lquidos con alcohol y no con calor?
3. Cules son las desventajas o limitaciones de la tincin simple?
4. Cules son las fuentes de error ms frecuentes en la preparacin del frotis?
5. Defina los enunciados siguientes: colorante aninico, colorante catinico, preparacin hmeda y tincin simple.
6. Distinguir entre mtodos de tincin simple y tincin diferencial.
7. Seale una situacin en la cual sea preferible utilizar la tincin simple que la diferencial.
8. Explique el fenmeno de fijacin de los frotis. A que se debe que las bacterias se peguen en el portaobjetos.
9. Describa los dos tipos generales de fijacin. Cul de ellos empleara normalmente con bacterias? Con protozoos?
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Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA DATOS: A. Reportar las observaciones de forma, agrupacin y tamao relativo de cada uno de los microorganismos. B. Comparar sus observaciones con las reportadas en la bibliografa.
1. Cultivo microbitico 2. Azul de metileno de Loeffler 3. Aceite de inmersin.
1. Material desprendido entre los dientes 2. Azul de metileno de Loeffler fijado con Calor. 3. Aceite de inmersin.
1. Raspado de la superficie interna de la mejilla. 2. Azul de metileno de Loeffler (fijado con alcohol). 3. Aceite de inmersin.
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BIBLIOGRAFIA: Bradshaw L. J. (2000). Microbiologa del Laboratorio. Editorial El Manual Moderno. Mxico, D.F. Wistreich, G.A. y M.D. Lechtman. (1983). Prcticas de Laboratorio en Microbiologa. Editorial Limusa. Mxico. Joklik Wolfang, Willet Hilda, Amos Bernard. (1996). Microbiologa de Zinsser. 20. Edicin. Editorial Mdica Panamericana. Buenos Aires, Argentina. Koneman Elmer, Allen Stephen, Dowell V. R., Sommers Herbert. (1996). Atlas de Diagnstico Microbiolgico. Editorial Interamericana. Mxico. Prescott L. M., Harley J. P., Klein D. A. (2004). Microbiologa. 5. Edicin. Editorial Mc. Graw Hill-Interamericana. Espaa. Jhonson T.R. and C.L. Case. (1992). Laboratory Experiments in Microbiology. 3a. Edicin. Cummings Publishing Company, Inc. USA. Practical Handbook of Microbiology. (1989). William M OLeary. Cornell Medical College, New York, USA. CRC Press.
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Prctica No. 4 TINCION DE BACTERIAS POR COLORACION SIMPLE
CM-2
OBJETIVO: 1. Que el alumno aprenda la forma de cmo deben de realizarse las tinciones de bacterias por los mtodos simples debido a que dichas clulas bacterianas son en su estado natural y forma, virtualmente incoloras. 2. La finalidad de un tinte sencillo es distinguir bacterias de material inerte, y revelar sus formas y tamaos. FUNDAMENTO: Preparacin de frotis.- Un frotis de bacterias se preparan tomando una porcin de cultivo lquido contenido en un tubo con un asa de platino esterilizada, y extendindola sobre unos tres centmetros cuadrados de superficie de un portaobjetos. Si se emplea un cultivo slido, se emulsiona primero una pequea cantidad de sta en una gota de agua destilada que previamente se habr colocado en el centro del portaobjetos, y se extiende luego. Se seca el frotis calentando cuidadosamente el porta sobre una pequea llama de gas, para evitar que despida humos o vapores; una vez seco, se fija pasando rpidamente el porta 5 o 6 veces por la porcin superior de la llama de bunsen. Esto impide que se arrastre la extensin por el lavado durante el proceso de coloracin. El frotis seco y fijado se cubre entonces de solucin de colorante y se deja reposar por espacio determinado de tiempo, que variar segn la solucin empleada. Finalmente se lava el porta con agua, se seca con papel secante y se examina al microscopio. Viabilidad de microorganismos fijados y teidos.- se afirma generalmente que las bacterias, en frotis secos, fijados y teidos, no pueden vivir mucho tiempo, y no hay peligro de infeccin de microorganismos patgenos asi tratados. Thurh (1914) informa que cultivos de Staphylococcus aureus, Salmonella typhi, Escherichia coli, Bacillus anthracis, Vibrio cholerae, Corynebacterium diphtheriae y Saccharomyces cerevisiae, fijados a la llama, pero no teidos, contena aun grmenes viables. 18 preparaciones de microorganismos patgenos y no patgenos mostraron que ninguno era capaz de vivir despus de teidos segn la tcnica de Gram; en cambio, el Bacillus anthracis despus de ser teido sobrevivi un minuto, y tres minutos el Bacillus mesentericus, al tratamiento con fucsina fenicada, y ambos bacilos resistieron 5 minutos a la accin del azul de metileno. Morton (1939) demostr que ciertos organismos pueden resistir al tratamiento con fucsina bsica, violeta cristal de Hucker, safranina acuosa y azul de metileno. TINCION SIMPLE Para poner en prctica este mtodo basta aplicar una o dos gotas de solucin de azul de metileno sobre la extensin ya seca. Al cabo de 30 o 60 segundos se lava el frotis cuidadosamente con un chorro de agua suave o se agita en el interior de un recipiente que contenga agua limpia, despus se seca la superficie inferior del portaobjetos con un pao, y el superficie con papel filtro adsorbente. Se coloca luego una gota de aceite sobre el frotis seco y teido, y se examina con el objetivo de inmersin. Puede usarse tambin otros colorantes en la misma forma, por ejemplo fucsina fenicada, safranina y violeta de genciana diluidas. Qumico Farmacutico Bilogo Pgina 35
COLORANTES SIMPLES. En los diversos mtodos bacteriolgicos se emplean muchas diferentes soluciones para teir; algunas son de uso general, y otras se destinan a fines especficos. Una solucin colorante simple es aquella que contiene un colorante disuelto en el disolvente; se aplica en una sola operacin a las bacterias, que toman el color caracterstico de la solucin colorante. Las soluciones simples que probablemente se emplean mas para tinciones usuales son las diluidas de fucsina fenicada, violeta cristal y azul de metileno. FUCSINA FENICADA. Este colorante se prepara disolviendo 0,3% de fucsina bsica en una solucin de fenol al 5%. Para usarlo como colorante simple, se recomienda generalmente diluir la solucin unas diez veces con agua destilada. CRISTAL VIOLETA El violeta cristal es tambin un miembro del grupo del triaminotrifenilmetano. Qumicamente es hexametil-p-rosanilina. Se conoce tambin por los nombres de violeta de metilo 10B, violeta de genciana, violeta hexametilo y violeta C, G o 7B. Produce el matiz ms intenso de las pararosanilinas, y entre todos los compuestos violeta, esta considerado como el colorante simple ms satisfactorio para usos generales. AZUL DE METILENO. El azul de metileno es cloruro de tetrametiltionina es un colorante bsico, es acaso el colorante mas usado en trabajos biolgicos. Por su condicin fuertemente bsica, tie con mucha intensidad ncleos y grnulos de cidos nucleicos. Es muy til para apreciar con rapidez la poblacin bacteriana de la leche. Para el diagnstico de la difteria, se prefiere teir los frotis con este colorante. En combinacin con eosina, se emplea como colorante en extensiones de sangre. Incorporado con eosina a una base de agar lactosa, sirve para distinguir Escherichia coli tpica de Enterobacter aerogenes tpico. Estas son tan solo una pocas de las numerosas aplicaciones del azul de metileno en bacteriologa. Los colorantes de anilina, como el violeta de genciana, son bacteriostticos para la mayor parte de los microorganismos Grampositivos pero su accin es casi nula contra los Gramnegativos y cidos-resistentes. Por su accin selectiva, solo son tiles cuando se conocen el tipo de microorganismos que deben inhibirse. COLORANTES DIFERENCIALES. Los colorantes diferenciales se componen de ms de una sustancia. En algunas tcnicas de coloracin, los colorantes se aplican por separado, y junto con otras, formando parte de una sola solucin. Las dos coloraciones diferenciales ms importantes que se emplean son las de Gram y las de grmenes cido-resistentes.
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MATERIAL: Cultivo de 24hr de Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli y Staphylococcus aureus. Hisopos estriles. Portaobjetos de 25 X 75 mm. Cubreobjetos de 22 x 22 mm. Mechero Fischer. Cristal violeta al 0,5% en una solucin acuosa. Asa de inoculacin. Safranina de Gram. METODO: 1. Colocar una asada de un cultivo en una gota de agua colocada sobre un portaobjetos. Agregar una gota de cristal violeta y observar a inmersin. 2. Hacer frotis de cada unos de los cultivos. Dejar secar a temperatura ambiente, fijar al calor, agregar cristal violeta durante un minuto, lavar con agua y secar. Observar a inmersin. 3. Repetir el paso 2 pero en lugar de cristal violeta usar safranina. 4. Con un hisopo tomar un exudado de su boca, de preferencia por el borde gingival. Hacer un frotis y teir como en el paso 2. observar a inmersin y tratar de identificar cocos, bacilos, etc. 5. Hacer esquemas. CUESTIONARIO: 1. Dibuje la estructura qumica orgnica del azul de metileno y cristal violeta.
2. Cmo actan los colorantes catinicos y aninicos?
3. Cmo se lleva a cabo el intercambio de iones entre el colorante y la clula bacteriana?
4. Cuando es necesario aplicar una tincin simple?
5. Defina los trminos cromforo y auxocromo.
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6. Por qu hay que esperar que los colorantes bsicos sean ms eficaces en condiciones alcalinas?
DIBUJOS:
1. S. cerevisiae teido con cristal violeta. 2. preparacin en seco. 3. Aceite de inmersin.
1. E. coli teido con Cristal violeta. 2. Preparacin en seco. 3. Aceite de inmersin.
1. S. aureus teido con Cristal violeta 2. Preparacin en seco. 3. Aceite de inmersin.
1. Exudado gingival con C. violeta 2. Preparacin en seco. 3. Aceite de inmersin.
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Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA COMENTARIOS Y CONCLUSIONES:______________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ BIBLIOGRAFIA: Bradshaw L. J. (2000). Microbiologa del Laboratorio. Editorial El Manual Moderno. Mxico, D.F. Pelczar M. J.; Reid Roger; Chan ECS. (1997). Microbiologa. McGraw Hill. 4. Edicin en espaol. Mxico, D.F. Joklik Wolfang, Willet Hilda, Amos Bernard. (1996). Microbiologa de Zinsser. 20. Edicin. Editorial Mdica Panamericana. Buenos Aires, Argentina. Koneman Elmer, Allen Stephen, Dowell V.R., Sommers Herbert. (1996). Atlas de Diagnstico Microbiolgico. Editorial Interamericana. Mxico. Prescott L. M., Harley J.P., Klein D.A. (2004). Microbiologa. 5. Edicin. Editorial Mc. Graw Hill-Interamericana. Espaa. Dulbecco R., Davis B., Eisen H., Ginsberg H., Wood B., McCarty Maclyn. (2000) Tratado de Microbiologa. 4a. Edicin. Editorial Salvat Editores S.A. Barcelona, Espaa. Jawetz E., Melnick Joseph (1990). Manual de Microbiologa Mdica. Editorial El Manual Moderno. Mxico, D.F.
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Prctica No. 5 TINCION NEGATIVA DE MICROORGANISMOS OBJETIVO:
CM-3
Que el alumno aprenda a llevar a acabo la tincin negativa de microorganismos. Que el alumno observe estructuras bacterias especiales como la cpsula con tinciones selectivas. Que comprenda la importancia que tienen estas tinciones para la caracterizacin e identificacin de las bacterias.
INTRODUCCION: En los estudios citolgicos a veces es importante tener una imagen ms exacta del tramo real de la clula. Esto se puede lograr de varias maneras. Un mtodo de uso frecuente en microbiologa es la tincin negativa. En este caso no son los microorganismos los que se tien, si no la superficie del vidrio sobre la que estos se encuentran. Asi, se pueden observar claramente la forma o contorno del organismo como una ventana contra el fondo oscuro. Esta tcnica, mejor que ninguna otra, permite evaluar el tamao real del organismo observado por que aqu no se emplean el fijado a la flama que de ordinario encoge a los organismos. Sin embargo este mtodo no permite discriminar detalles estructurales puesto que las clulas son de ordinario incoloras al microscopio. MATERIAL: Caldo de suspensin mixta de microorganismos. Cocos y bacilos. Nigrosina Dorner o tinta china nueva. Azul de metileno de loeffler. Xilol. Rojo Congo, solucin al 25%. Acido clorhdrico (HCl), solucin al 1%. Portaobjetos de 25 X 75 mm. Asa de inoculacin. Mechero bunsen.
PROCEDIMIENTO: El profesor proporcionar a los alumnos cultivos lquidos y slidos de Klebsiella spp. y Streptococcus spp. 1. Con tcnica asptica colocar una gota de tinta china en el extremo de un portaobjetos, colocar junto una gota de cultivo lquido de Klebsiella spp, si se trata de un cultivo slido hay que hacer una suspensin con una gota de agua destilada y mezclar cuidadosamente con la tinta china. 2. Distribuir la mezcla a lo ancho del portaobjetos, colocando otro portaobjetos perpendicular en ngulo de 45 sobre la muestra de tal manera que se extienda el material hasta formar una pelcula delgada. Qumico Farmacutico Bilogo Pgina 40
Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA 3. Desplazar poco a poco el segundo portaobjetos a lo largo del primero para hacer una capa fina de la mezcla. Quizs sea necesario extender la pelcula hasta cubrir toda el rea del portaobjetos. Si la dilucin es correcta el frotis debe aparecer gris, no negro. Si la mezcla es demasiado densa se vern grandes grietas en la nigrosina bajo el microscopio. 4. Permita que la mezcla se seque al aire; no fije a la flama. 5. Repetir el procedimiento pero ahora utilice la cepa de Streptococcus spp. 6. Examine sus preparaciones con el lente de aceite de inmersin y haga un dibujo de un campo representativo*. 7. Prepare adems, con la misma suspensin bacteriana original, un frotis simple fijado a la flama y teido con azul de metileno. Trate de detectar diferencias del tamao en los mismos organismos comparando la tincin negativa con la positiva. Sobre que se basan las diferencias?
*Otro mtodo til emplea el rojo congo para teir. Coloque una gota de rojo congo en un extremo de un portaobjetos limpio. Adale un asa llena de caldo con suspensin bacteriana y mezcle con el asa. Ahora coloque una segunda laminilla a 45 del primero, hasta que la gota se difunda hacia los bordes del vidrio, luego empuje lentamente la laminilla inclinada manteniendo el mismo ngulo, hasta el otro extremo del portaobjetos. Squelo al aire, no fije a la flama. Una vez seco, vierta sobre l, HCl al 1% e inmediatamente sacdalo para eliminar el cido clorhdrico pero no lave. Seque al aire y examnelo con el lente de aceite de inmersin. Dibuje un campo representativo.
RESULTADOS: A. Reportar las observaciones de forma, agrupacin, color y tamao relativo tal como se indica en las figuras. B. Hacer los dibujos de la morfologa de cada uno de los microorganismos y colorearlos. C. Comparar las observaciones realizadas con las reportadas en la literatura.
CUESTIONARIO: 1. Explique el fundamento de la tincin negativa realizada en la prctica. Qu tipo de informacin se obtiene? 2.
3. Investigue otra tcnica de tincin selectiva que permita observar esta estructura bacteriana.
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4. Mencione la aplicabilidad de la tincin negativa.
5. Cules son las diferencias sobre el efecto que ejercen en la bacteria una tincin negativa sobre una tincin diferencial?
6. Cules son las ventajas del procedimiento de la tincin negativa para el estudio de la morfologa bacteriana?
7. En que tipo de microorganismos se podra aplicar la tincin negativa? Mencione ejemplos.
DIBUJOS:
1. Suspensin de Klebsiella spp. 2. Nigrosina de Dorner 3. Aceite de inmersin.
1. Suspensin de Klebsiella spp. 2. Rojo Congo sin fijar 3. Aceite de inmersin.
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1. Suspensin de Streptococcus spp. 2. Nigrosina de Dorner 3. Aceite de inmersin.
1. Suspensin de Streptococcus spp. 2. Rojo Congo sin fijar 3. Aceite de inmersin.
1. Suspensin de Klebsiella spp 2. Azul de metileno (fijado con calor) 3. Aceite de inmersin.
1. Suspensin de Streptococcus spp 2. Azul de metileno (fijado con calor) 3. Aceite de inmersin.
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BIBLIOGRAFIA: Bradshaw L. J. (2000). Microbiologa del Laboratorio. Editorial El Manual Moderno. Mxico, D.F. Joklik Wolfang, Willet Hilda, Amos Bernard. (1996). Microbiologa de Zinsser. 20. Edicin. Editorial Mdica Panamericana. Buenos Aires, Argentina. Koneman Elmer, Allen Stephen, Dowell V. R., Sommers Herbert. (1996). Atlas de Diagnstico Microbiolgico. Editorial Interamericana. Mxico. Clark G. L. (1993). Staining procedures. 5. Edition. Williams and Wilkins, Baltimore (USA). Prescott L. M., Harley J. P., Klein D. A. (2004). Microbiologa. 5. Edicin. Editorial Mc. Graw Hill-Interamericana. Espaa. Jhonson T.R. and C.L. Case. (1992). Laboratory Experiments in Microbiology. 3a. Edicin. Cummings Publishing Company, Inc. USA. Practical Handbook of Microbiology. (1989). William M OLeary. Cornell Medical College, New York, USA. CRC Press. Holt, J.G., N.R. Krieg, P.H.A. Sneath, J.T. Staley and J.T. Williams. (1994). Bergeys Manual of Determinative Bacteriology. 9th. Edition. The Williams and Wilkins Co., Baltimore, USA.
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Prctica No. 6 TINCION DE GRAM OBJETIVO:
CM-4
El alumno conocer y llevar a cabo la tincin diferencial de Gram. Que el estudiante clasifique algunas especies bacterianas en Grampositivas o Gramnegativas de acuerdo a la tincin de Gram. Que comprenda la importancia que tienen estas tinciones diferenciales para la caracterizacin e identificacin de las bacterias. FUNDAMENTO: La tincin bacteriolgica mas usada es la de Gram, de carcter diferencial, llamadas en honor de su inventor. La tincin de Gram es una herramienta de gran valor taxonmico. Al aplicar la tincin de Gram automticamente se divide todo el reino de microorganismos en dos categoras. Adems observando la forma de la clula en cuestin, es posible establecer dos subdivisiones o ms. La tincin de Gram se compone de 4 reactivos diferentes, y se requiere de algo de entrenamiento para que la tincin funcione correctamente. Estos componentes son los siguientes: cristal violeta (colorante primario), solucin diluida de yodo o yodo Lugol (mordente), una mezcla de alcohol 95% y acetona en proporciones de 70 y 30% respectivamente y por ltimo un colorante rojo llamado safranina (contratincin). A los organismos que retienen el cristal violeta con gran tenacidad a pesar del colorante se les conoce como Grampositivos, y a los organismos que se destieron con el colorante primario se han tornado incoloros, como estaban originalmente, por eso es que, para tornar visibles estos organismos se emplea una contratincin de diferente color que el colorante primario, a estos organismos se les llama Gram negativos. MATERIAL: Cultivo de 24hr. de Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis, y cultivo de 48hr. de Saccharomyces cerevisiae (levadura). Colorante violeta cristal de Gram. solucin de yodo de Gram. solucin decolorante, acetona-alcohol o alcohol (96%). Safranina de Gram. Palillo aplicador. Portaobjetos de 25 X 75 mm. Mechero Fischer.
PROCEDIMIENTO: El profesor proporcionar a los alumnos cultivos lquidos y slidos de Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis y Saccharmomyces cerevisiae. El estudiante preparar frotis de cultivo lquido y de cultivo slido de los microorganismos y aplicar la tincin de Gram. Qumico Farmacutico Bilogo Pgina 45
1. Limpie 4 portaobjetos y prepare 4 frotis idnticos en cada porta, de la siguiente manera: cerca de uno de los extremos del porta (dejando suficiente rea para los dedos, al sostener el porta) prepare un pequeo frotis de E. coli ms o menos del tamao de una moneda de 5 centavos. Junto a este primer frotis, prepare otro ms o menos del mismo tamao pero con Staphylococcus epidermidis. Junto a este segundo frotis prepare un tercero con una gota de suspensin de la levadura Saccharomyces cerevisiae. Finalmente, en el otro extremo del porta, prepare un cuarto frotis usando algo de material raspado de su enca, con un aplicador y previamente emulsificado en una gota de agua. 2. Ejecute esta serie de cuatro frotis en cada uno de los 4 portaobjetos. Numere los porta del 1 al 4 con un crayn de cera. Ponga los 4 frotis a secar al aire y fjelos a la flama como de costumbre. 3. Cubra el portaobjetos nmero uno con cristal violeta de Gram (violeta de genciana), teniendo cuidado que el lquido bae los cuatro frotis, djelo reaccionar por 1minuto. Descarte el exceso de colorante y lave en la llave brevemente. Aplique yodo de Gram y djelo reaccionar por 1minuto. Lave en la llave. Ahora con cuidado agregue solucin decolorante, gota a gota a cada uno de los frotis con el porta inclinado sobre el fregadero. Tan pronto como las gotas de solucin ya no arrastren color lave en la llave para detener la accin de colorante. Finalmente, cubra el porta con la solucin de safranina de Gram. y djela reaccionar de 10 a 20 segundos. 4. Lave el exceso de colorante y seque a aire. 5. Repita el mismo procedimiento con el portaobjetos nmero 2 pero sin teir con safranina. En otras palabras detenga el procedimiento despus de decolorar; seque al aire. 6. Repita el procedimiento con el portaobjetos nmero 3 pero ahora detngase antes de decolorar, en otras palabras no decolore esta preparacin, seque al aire. 7. Ejecute nicamente el primer paso de la serie con el porta 4. Lave a la llave y seque al aire. 8. Observe las preparaciones con el objetivo de aceite de inmersin y haga un dibujo que muestre unos cuantos organismos de cada uno de los 16 frotis que usted prepar, indique claramente los colores de los organismos. El procedimiento que emple en el portaobjetos nmero 1 es el procedimiento completo de la tincin de Gram. Cuando vuelva ejecutar esta tcnica ignore los procedimientos parciales en los portas 2, 3 y 4. Estos fueron hechos como ejercicios, para que usted se diera cuenta de cmo se ven las clulas en cada paso del proceso. Cuando se le pida una tincin de Gram en el futuro, usted deber seguir el procedimiento que se us para el portaobjetos nmero 1. CUESTIONARIO: 1. Cules son las diferencias principales entre bacterias grampositivas y gramnegativas?
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2. Por qu la coloracin de Gram es una de las tinciones ms importantes y uno de los mtodos de tincin cuyo uso es ms amplio en bacteriologa?
3. Cmo es la reaccin de Gram en las levaduras? Estos resultados tendrn la misma importancia que para las bacterias? Por qu?
4. Cul es el fundamento de la tincin de Gram?
5. Explique en forma completa la teora que explica la tincin de Gram. Investigue otros dos ejemplos de tincin diferencial.
6. Cules son las fuentes de error ms comunes en la tincin de Gram?
7. Por qu se utiliza la tcnica de Gram como un parmetro entre otros para la clasificacin taxonmica de las bacterias?
8. Cmo influye la pared celular en la retencin del color azul o rojo?
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9. Qu generalizaciones pueden hacerse con respecto a morfologa y reaccin de Gram?
10. Qu etapa de la tincin de Gram puede eliminarse sin perder su capacidad para distinguir entre bacterias Gram positivas y Gram negativas? Por qu?
RESULTADOS: A. Reportar las observaciones de forma, agrupacin, color y tamao relativo tal como se indica en el cuadro siguiente. B. Hacer los dibujos de la morfologa de cada uno de los microorganismos y colorearlos. C. Comparar las observaciones realizadas con las reportadas en la literatura. TINCION DE GRAM Aumento total Forma: cocos, bacilos, etc. Agrupamiento de las clulas Tamao: Reaccin de Gram Descripcin del cultivo: lquido o slido, edad del cultivo, etc. Escherichia coli S. epidermidis S. cerevisiae
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DIBUJOS: Portaobjetos 1
1. Frotis del material de las encas. 2. Tincin de Gram completa. 3. Aceite de inmersin.
1. Staphylococcus epidermidis 2. Tincin de Gram completa. 3. Aceite de inmersin.
1. Saccharomyces cerevisiae. 2. Tincin de Gram completa. 3. Aceite de inmersin.
1. Escherichia coli. 2. Tincin de Gram completa. 3. Aceite de inmersin. Portaobjetos 2
1. Frotis del material de las encas. 2. Tincin de Gram sin safranina. 3. Aceite de inmersin. Qumico Farmacutico Bilogo
1. Staphylococcus epidermidis. 2. Tincin de Gram sin safranina. 3. Aceite de inmersin. Pgina 49
1. Saccharomyces cerevisiae. 2. Tincin de Gram sin safranina. 3. Aceite de inmersin.
1. Escherichia coli 2. Tincin de Gram sin safranina. 3. Aceite de inmersin.
Portaobjetos 3
1. Frotis de material de las encas. 2. Solucin de lugol y C. violeta 3. Aceite de inmersin.
1.Staphylococccus epidermidis 2. Solucin de lugol y C. violeta. 3. Aceite de inmersin.
1. Saccharomyces cerevisiae. 2. Solucin de lugol y C. violeta 3. Aceite de inmersin. Qumico Farmacutico Bilogo
1. Escherichia coli. 2. Solucin de lugol y C. violeta. 3. Aceite de inmersin. Pgina 50
Portaobjetos 4
1. Frotis de material de las encas. 2. Cristal violeta nicamente 3. Aceite de inmersin.
1. Staphylococcus epidermidis. 2. Cristal violeta nicamente. 3. Aceite de inmersin.
1. Saccharomyces cerevisiae. 2. Cristal violeta nicamente. 3. Aceite de inmersin.
1. Escherichia coli 2. Cristal violeta nicamente. 3. Aceite de inmersin.
COMENTARIOS Y CONCLUSIONES:______________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ BIBLIOGRAFIA: Bradshaw L. J. (2000). Microbiologa del Laboratorio. Editorial El Manual Moderno. Mxico, D.F. Pelczar M. J.; Reid Roger; Chan ECS. (1997). Microbiologa. McGraw Hill. 4. Edicin en espaol. Mxico, D.F. Pgina 51
Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA Joklik Wolfang, Willet Hilda, Amos Bernard. (1996). Microbiologa de Zinsser. 20. Edicin. Editorial Mdica Panamericana. Buenos Aires, Argentina. Koneman Elmer, Allen Stephen, Dowell V. R., Sommers Herbert. (1996). Atlas de Diagnstico Microbiolgico. Editorial Iinteramericana. Mxico. Prescott L. M., Harley J. P., Klein D. A. (2004). Microbiologa. 5. Edicin. Editorial Mc. Graw Hill-Interamericana. Espaa. Jhonson T.R. and C.L. Case. (1992). Laboratory Experiments in Microbiology. 3a. Edicin. Cummings Publishing Company, Inc. USA. Practical Handbook of Microbiology. (1989). William M OLeary. Cornell Medical College, New York, USA. CRC Press. Holt, J.G., N.R. Krieg, P.H.A. Sneath, J.T. Staley and J.T. Williams. (1994). Bergeys Manual of Determinative Bacteriology. 9th. Edition. The Williams and Wilkins Co., Baltimore, USA.
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Prctica No. 7 TINCION DE ZIEHL NEELSEN
CM-5
OBJETIVO: El estudiante ser capaz mediante el empleo de la tincin diferencial de Ziehl Neelsen de identificar los tipos morfolgicos ms corrientes, ya que por medio de l se hacen accesibles a la vista. FUNDAMENTO: La tincin acidorresistente se llama as debido a la naturaleza cida del agente decolorante empleado- una solucin de HCl al 3% en alcohol al 95%. Este decolorante es mucho ms fuerte que la mezcla de acetona-alcohol usada en el Gram, nunca debe usarse el cido para decolorar en el procedimiento de Gram. Los organismos acidorresistentes son capaces de retener el colorante primario debido a que este colorante es ms soluble en las sustancias lipoides presentes en estos organismos, que en la solucin decolorante. Por lo tanto, el proceso de decoloracin en la tincin acidorresistente no es un proceso tan delicado como en la tincin de Gram. Sin embargo los organismos acidorresistentes crecidos en cultivo artificial durante algn tiempo tienden a volverse menos acidorresistentes que aquellos recientemente aislados de su habitad natural. Otras caractersticas de la tincin acidorresistentes es el empleo de calor como agente intensificador del colorante primario. De hecho el colorante primario es forzado a penetrar en la clula hasta que el colorante empiece a vaporizarse Este procedimiento es necesario debido a que los miembros del gnero Mycobacterium poseen una concentracin elevada de material graso en el citoplasma. Por lo tanto, para que el colorante penetre a las clulas, se requiere el calor o algn agente surfactante (detergentes, por ejemplo). La tincin acidorresistente encuentra gran aplicacin en medicina, porque algunos organismos del gnero Mycobacterium se asocian con infecciones y existen muy pocas otras bacterias que dan reaccin positiva a la tincin acidorresistente. Mycobacterium tuberculosis es el agente causal de la tuberculosis. En general, son raras las clulas que son acidorresistentes. MATERIAL: 1. Fucsina bsica saturada. Sol. Stock. Fucsina bsica 31,5 gr. Etanol 95% 1000,0 ml Mezclar en un matraz de 1Litro y dejar permanecer durante toda la noche. Filtrar antes de usar. 2. Fenol al 5% Fenol Agua 5,0 gr. 100,0 ml. 10,0 ml. 90,0ml Pgina 53
3. Carbolfucsina (solucin de trabajo) Fucsina bsica saturada. Sol. Stock Fenol al 5% Mezclar y filtrar antes de usar. Qumico Farmacutico Bilogo
4. Alcohol cido. Acido clorhdrico concentrado Alcohol 96%
3,0 ml. 97,0 ml.
5. Azul de metileno. Sol. Stock Azul de metileno 1,0 ml. Etanol de 96% 100,0 ml. Mezclar y esperar 24 horas. Filtrar antes de usar. MATERIALES: Un cultivo de 72 horas de Mycobacterium tuberculosis (una cepa avirulenta). Si es posible tambin se les facilitar un esputo de tuberculoso procesado en la autoclave. Un cultivo de 24 horas de Staphylococcus epidermis. Tincin carbolfucsina de Ziehl-Neelsen. Azul de metileno de Loeffler. Alcohol acidulado. Solucin de albmina de huevo (1,0%) en salina. Portaobjetos 25 X 75 mm. Mechero bunsen. PROCEDIMIENTO.Prepare un frotis mixto de Mycobacterium tuberculosis y Staphylococcus epidermidis despus de haber emulsificado las clulas en una solucin de albmina al 1%. La solucin de albmina ayuda a mantener la clula de M. tuberculosis adheridas al portaobjetos. Ya que de ordinario tiende a despegarse fcilmente, sin duda debido a su gran contenido graso. Si el esputo esterilizado del tuberculoso se puede conseguir, prepare tambin un segundo frotis de este material. Despus de secar al aire fije a la flama. Con las pinzas, mantenga el portaobjetos suspendido sobre el fregadero y belos con carbolfucsina de Ziehl Neelsen. Tome el mechero bunsen por la base y flame al colorante por abajo del porta hasta que se empiece a desprender el vapor. No hierva el colorante, mantngalo al punto de vaporizacin por unos 5minutos. Si los bordes del frotis se empiezan a secar aada ms colorante. Lave preparaciones en la llave y lave luego con alcohol acidulado, aadindole gota a gota sobre el frotis hasta que ya no arrastre colorante. Lave en la llave y contra tia con azul de metileno durante 1minuto. Lave en la llave y seque al aire. Examine la preparacin con el objetivo de inmersin y haga, por cada preparacin, un dibujo de un campo tpico. CUESTIONARIO: 1. Qu utilidad tiene la tincin diferencial de Ziehl-Neelsen?
2. Cul es el fundamento de la tincin de BAAR? Qumico Farmacutico Bilogo Pgina 54
3. Para qu se calienta el frotis con el colorante primario de la tincin de BAAR?
4. Mencione diferencias entre este tipo de tincin con la de Gram.
5. En infecciones por tuberculosis pulmonar como se realiza el diagnstico final?
6. En infecciones extrapulmonares por Mycobacterium tuberculosis como se realiza el diagnstico final?
7. Componente estructural de la bacteria responsable de la propiedad de cido alcohol resistencia en M. tuberculosis.
DIBUJOS:
1. M. tuberculosis y S. epidermidis. 2. Tincin acidorresistente. Qumico Farmacutico Bilogo
1. Esputo de tuberculoso. 2. Tincin acidorresistente. Pgina 55
Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA 3. Aceite de inmersin. COMENTARIOS Y CONCLUSIONES: 3. Aceite de inmersin
BIBLIOGRAFIA: Bradshaw L. J. (2000). Microbiologa del Laboratorio. Editorial El Manual Moderno. Mxico, D.F. Pelczar M. J.; Reid Roger; Chan ECS. (1997). Microbiologa. McGraw Hill. 4. Edicin en espaol. Mxico, D.F. Joklik Wolfang, Willet Hilda, Amos Bernard. (1996). Microbiologa de Zinsser. 20. Edicin. Editorial Mdica Panamericana. Buenos Aires, Argentina. Koneman Elmer, Allen Stephen, Dowell V. R., Sommers Herbert. (1996). Atlas de Diagnstico Microbiolgico. Editorial Interamericana. Mxico. Prescott L. M., Harley J. P., Klein D. A. (2004). Microbiologa. 5. Edicin. Editorial Mc. Graw Hill-Interamericana. Espaa. Dulbecco R., Davis B., Eisen H., Ginsberg H., Wood B., McCarty Maclyn. (2000) Tratado de Microbiologa. 4a. Edicin. Editorial Salvat Editores S.A. Barcelona, Espaa. Jawetz E., Melnick Joseph (1990). Manual de Microbiologa Mdica. Editorial El Manual Moderno. Mxico, D.F.
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Prctica No. 8 ESTUDIO DE LA MOTILIDAD DE MICROORGANISMOS
CM-6
OBJETIVO: El alumno ser capaz de observar el movimiento browniano que presentan las bacterias. INTRODUCCIN: La tcnica de la gota colgante se utiliza con frecuencia cuando se desea determinar la capacidad de los microorganismos para desplazarse con locomocin propia. Aqu se observa al organismo en su estado natural, vivo, y se puede ver fcilmente si presenta algn tipo de locomocin propia. De ordinario, las bacterias son tan minsculas que cuando se les suspende en un medio lquido estn sujetas a movimientos que no son propios. Como ya se ha estudiado en qumica, todas las molculas estn en movimiento constante. Las bacterias son tan pequeas que debido a los choques con las molculas en movimiento del agua circundante, y otras molculas en solucin, la clula bacteriana rebota ligeramente, en funcin de la suma de los impactos recibidos. Puesto que hay miles de millones de molculas que chocan simultneamente con la clula bacteriana, esta parece vibrar al azar. La bacteria no da impresin de llevar direccin definida, simplemente parece bailar dentro de un territorio dado. Por esto, se dice que las bacterias presentan movimiento browniano, aunque hay que hacer notar que los organismos presentan movimientos propios adems del movimiento browniano. Muchos organismos cuentan con rganos de locomocin que los capacita para moverse con direccin y sentido en un medio lquido. Es posible observar como estos organismos giran y se tuercen y a menudo se desplazan por distancias relativamente grandes en el campo microscpico. Este tipo de desplazamiento es la motilidad real. MATERIAL: Caldo de cultivo de Proteus morganii y Bacillus subtilis. Infusin de paja (una infusin de paja adecuada se prepara en un recipiente con agua algo de paja, yerba, hojas, tierra, etc. y dejndolo reposar a temperatura ambiente de 3-4dias. Durante este periodo es necesario burbujear aire a travs de la infusin, para evitar que se desarrolle una capa de Bacillus ssp. la cual terminara por sofocar los llamados organismos en la infusin). Portaobjetos cncavo. Vaselina. Azul de metileno (1:10 000) o cristal violeta acuoso (1: 2 000). Asa de nicromo.
PROCEDIMIENTO: Este procedimiento se demuestra mas fcilmente en forma objetiva que en forma verbal, por eso, su instructor le dar una demostracin preliminar de la tcnica a seguir. Brevemente los pasos son los siguientes: Qumico Farmacutico Bilogo Pgina 57
1. se deposita una delgada capa de vaselina alrededor del borde de la depresin en el portaobjetos cncavo. 2. en el centro del cubreobjetos se coloca, con el asa, una gotita de la suspensin de microorganismos. 3. se toma el portaobjetos cncavo invertido y se presiona firmemente contra el cubreobjetos de tal manera que ste cubra por completo la depresin. 4. con gran rapidez se vuelve a voltear toda la preparacin. 5. Se revisa los bordes del cubreobjetos para cerciorarse que la vaselina ha sellado efectivamente. Si se sigue este procedimiento, la gota de suspensin microbiana estar ahora colgando del reverso del cubreobjetos en el interior de la cmara formada en la concavidad del portaobjetos. Coloque esta preparacin bajo el microscopio en posicin tal que, a bajo poder, los bordes de la suspensin queden en el centro del campo. Reduzca la intensidad de la luz cerrando el diafragma (o descendiendo el condensador) hasta que el campo empiece a aparecer algo oscuro. Luego, cambie el objetivo de seco fuerte sin cambiar nada ms. La suspensin deber quedar ms o menos en foco. Trate de detectar algn microorganismo en movimiento. Recuerde que estos son muy pequeos y que bajo las condiciones operantes, probablemente aparecern como fantasmas debido a que carecen de color propio y son translcidos. Determine si los organismos observados presentan motilidad propia o no. Repita ahora el procedimiento pero con una gota de infusin de paja la cual contendr gran variedad de protistas. Ahora ejecute una variacin de la tcnica mencionada, simplemente coloreando la gota de suspensin con una asa llena de azul de metileno (diluido 1:10,000) o de violeta cristal (1:2,000). La tincin a esta dilucin teir ligeramente los organismos sin afectar su viabilidad. Si con el primer procedimiento tuvo alguna dificultad para observar bacterias, sta nueva variacin facilitar las cosas. Esta es la nueva tcnica que utilizar de ahora en adelante cuando desee observar la motilidad de microorganismos por medio de la tcnica de la gota colgante o preparaciones en vivo simples. CUESTIONARIO: 1. Compare la qumica y la funcin de los flagelos.
2. Describir dos procedimientos diferentes para determinar si una bacteria es mvil.
3. Dibuje las 3 partes estructurales del flagelo y en que parte estructural se fijan cada una de ellas.
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4. Defina el trmino movimiento browniano.
5. De donde deriva la energa que requiere el flagelo para producir el desplazamiento de la bacteria?
6. Porque algunos tipos bacterianos giran su flagelo en sentido de las manecillas del reloj y otras las hacen en sentido antihorario?
Datos: Preparaciones de cada uno de los siguientes organismos con la tcnica de la gota colgante: Portaobjetos 1. Proteus morganii. Portaobjetos 2. Bacillus subtilis. Portaobjetos 3. Infusin de paja.
COMENTARIOS Y CONCLUSIONES:
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BIBLIOGRAFIA: Bradshaw L. J. (2000). Microbiologa del Laboratorio. Editorial El Manual Moderno. Mxico, D.F. Pelczar M. J.; Reid Roger; Chan ECS. (1997). Microbiologa. McGraw Hill. 4. Edicin en espaol. Mxico, D.F. Joklik Wolfang, Willet Hilda, Amos Bernard. (1996). Microbiologa de Zinsser. 20. Edicin. Editorial Mdica Panamericana. Buenos Aires, Argentina.
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Prctica No. 9 MOVILIDAD DE LAS BACTERIAS EN MEDIOS SOLIDOS
CM-7
OBJETIVO: El estudiante ser capaz de observar la movilidad bacteriana en medios de cultivo slidos o semislidos. FUNDAMENTO: El movimiento de las bacterias se atribuye a la presencia de unos rganos de locomocin llamados flagelos, que por primera vez observ Cohn (1975) en especies teidas. La presencia de los flagelos no indica que los microorganismos sean siempre capaces de locomocin, pero denota una aptitud de movimiento. La movilidad autnoma bacteriana implica una velocidad de traslacin, que no debe confundirse con el movimiento oscilatorio observado en partculas pequeas en lquidos. Esta ltima clase de movimiento se clasifica en browniano, por haberlo descubierto Robert Brown; proviene de las molculas del lquido suspensor contra las partculas suspendidas. Movimiento de colonias. Se ha descrito varios microorganismos que producen colonias en movimiento. Turner film a intervalos regulares diferentes colonias de bacterias en placas de agar y logr medir sus velocidades, inform que el movimiento lineal medio de colonias de 0,2-0,5 mm. de dimetro eran de unos 14 mm por hora. El movimiento de las colonias no era solo lineal, sino tambin giratorio lento. El sentido de la rotacin de 200 a 300 colonias observadas eran anti horario, salvo dos de ellas que giraban a la inversa. Turner y Eales comunicaron que la rotacin de un aerobio se produca muy al principio del crecimiento, las clulas se segregaban en pequeos grupos se alineaban concntricamente en torno a un centro comn, para formar placas discordes de unas o pocas clulas de espesor, luego, las colonias iniciaban su migracin, dejando un rastro curioso en la superficie del agar. Unas pocas clulas quedaban rezagadas; la mayora en los bordes del rastro que formaban las dos lneas separadas por la anchura de la colonias en movimiento. Especialmente las pequeas y activas seguan trayectos curvos o espirales a veces muy complicados y de longitud grande, hasta de 2-3 cm. El sentido de rotacin era horario o inverso. Despus de correr una distancia variables, una colonia se aproximaba al centro de su camino espiral, disminuyendo rpidamente su radio, cesaba de emigrar, comenzaba a girar alrededor de su centro, perda se forma alargada y alcanzaba un tamao de varias veces la anchura del rastro cuyo trmino se constitua. MATERIAL: Cultivo de 24hr de Escherichia coli y Proteus mirabilis en gelosa nutritiva. 2 tubos con medio de cultivo semislidos (caldo nutritivo con agar al 0.5%, medio SIM MIO). Agar Sangre. Pgina 61
METODO: Mtodo para observar la movilidad del cultivo. 1. Sembrar por picadura en un medio semislido, para movilidad con E. coli y otro con P. mirabilis. Medio para movilidad: Gelatina 80,0 g. Peptona 10,0 g. Extracto de carne 3,0 g. Cloruro de sodio 5,0 g. Agar 4,0 g. Agua destilada 1000 ml Agregar la gelatina al agua caliente hasta disolverse, posteriormente agregar los dems ingredientes, uno a uno y poco a poco. Calentar a ebullicin hasta incorporacin de todos los ingredientes, principalmente el agar. Envasar en tubos de 13X100 mm con 4,0ml. Esterilizar en autoclave a 10 1b-115C durante 20min. 2. Sembrar tambin los microorganismos en dos placas de agar sangre. 3. Incubar a 37C. 4. Observar a las 24hr el tipo de crecimiento y si hay produccin de swarming. 5. Dibujar el crecimiento en los tubos y placas. CUESTIONARIO: 1. De un ejemplo de un medio semislido comercial que se utiliza para detectar la movilidad de las bacterias.
2. Cmo se detecta la movilidad de las bacterias en los medios semislidos?
3. Mencione la tcnica utilizada para inocular un medio semislido de movilidad.
4. Qu concentracin de agar se requiere para la preparacin de los medios semislidos de movilidad?
5. Explique el trmino swarming que produce el proteus en los medios slidos y como se interpreta?
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6. Qu generalizaciones pueden hacerse con respecto a morfologa y motilidad?
7. Describir dos procedimientos diferentes para determinar si una bacteria es mvil.
BIBLIOGRAFIA: Bradshaw L. J. (2000). Microbiologa del Laboratorio. Editorial El Manual Moderno. Mxico, D.F. Joklik Wolfang, Willet Hilda, Amos Bernard. (1996). Microbiologa de Zinsser. 20. Edicin. Editorial Mdica Panamericana. Buenos Aires, Argentina. Prescott L. M., Harley J. P., Klein D. A. (2004). Microbiologa. 5. Edicin. Editorial Mc. Graw Hill-Interamericana. Espaa. Dulbecco R., Davis B., Eisen H., Ginsberg H., Wood B., McCarty Maclyn. (2000) Tratado de Microbiologa. 4a. Edicin. Editorial Salvat Editores S.A. Barcelona, Espaa. Jawetz E., Melnick Joseph (1990). Manual de Microbiologa Mdica. Editorial El Manual Moderno. Mxico, D.F.
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Prctica No. 10
CM-8
DEMOSTRACION DE VACUOLAS GRASAS OBJETIVO: El alumno observar las vacuolas grasas como parte de las estructuras internas de los microorganismos por medio de tinciones simples y diferenciales. INTRODUCCION: Muchos microorganismos contienen pequeos grnulos y vacuolas compuestos de distintos materiales. Estos grnulos son probablemente almacenes de metabolitos anlogos a las grasas y almidones de las formas superiores. Para poder hacer visibles estas estructuras deben utilizarse reactivos que, adems de reaccionar especficamente con las estructuras deseadas les confieran un color que pueda ser detectada. Por ejemplo, es hecho conocido, que algunos microorganismos producen y almacenan sustancias grasas. Por lo tanto, si uno simplemente selecciona un colorante que tia nicamente materias grasa, se tiene ya un procedimiento adecuado para tornar visibles los grnulos de grasa almacenados dentro de la clula microbiana. En el siguiente experimento se emplear tal sustancia (negro sudn B). Para hacer que los glbulos grasos resalten con mayor relieve, se aplica un colorante rojo soluble en agua, (safranina), el cual colorea toda la clula menos los glbulos grasos. MATERIAL: Un cultivo de Bacillus subtilis en agar inclinado, incubado de 24 a 48 hrs. El agar nutriente del matraz habr sido suplementado con 5% de glicerol (agarglicerol). Un cultivo de Saccharomyces cerevisiae preincubado de 24 a 48 horas en probeta con agar con un medio de agar extracto de malta (o de levadura). Saccharomyces cerevisiae no es una bacteria sino un organismo de la clase de los mohos. Generalmente tiene forma de huevo algo mayor que una bacteria ordinaria y es bien conocida debido a que produce alcohol etlico y dixido de carbono entre los productos de su metabolismo. Colorante negro Sudn B. Safranina acuosa (0,5%). Xilol. Solucin de yodo Lugol o yodo de Gram. Papel secante. Portaobjetos 25X75mm. Mechero bunsen. Asa de inoculacin.
PROCEDIMIENTO: Prepare un frotis de Bacillus subtilis en un portaobjetos limpio. Squelo al aire y fjelo a la flama. Cubra el portaobjetos con negro sudn B y djelo reaccionar por no menos de 10 minutos. No permita que el colorante se seque durante estos 10 minutos. Elimine el exceso de colorante y seque la preparacin colocando una tira
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Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA de papel secante directamente sobre el frotis hasta que todo el colorante se absorba. Evite mover o restregar el papel durante el secado. Cundo el secado sea completo levante el papel con cuidado. Este colorante es selectivo para partculas solubles en grasa as, esta primera etapa del procedimiento tie exclusivamente las vacuolas grasas. Lave el frotis con unas gotas de xilol para eliminar el exceso de colorante y luego vuelva a secar con secante. Para colorear el resto de la clula contratia ahora con solucin acuosa de safranina. Aplique unas cuantas gotas al frotis y djelo reaccionar por 10 a 15 segundos. Lave inmediatamente con agua de la llave y djelo secar al aire. Con el objetivo de aceite de inmersin examine cuidadosamente su preparacin para detectar glbulos de grasa que aparezcan azul-negro en contraste con el color rojo del citoplasma circundante. Pequeas gotitas de negro sudn pueden haberse adherido al vidrio sin que este indique la presencia de grasas. Dibuje lo que observe. Usando otro organismo es posible demostrar otra manera de detectar la misma sustancia. Sobre un portaobjetos limpio mezcle un asa llena de negro Sudn B, con un asa de cultivo de Saccharomyces cerevisiae y otra asa llena de agua de la llave. Con cuidado, coloque un cubreobjetos sobre la preparacin y examnela con el objetivo de alto poder y tambin con el de aceite de inmersin. A veces es necesario esperar unos minutos para que el colorante reaccione con las vacuolas grasas, por eso, contine observando unos 10 minutos. Dibuje lo que observe. Este tipo de preparacin se conoce como un montaje hmedo y es muy usada en estudios citolgicos. A veces es posible observar tambin los depsitos de glucgeno en las clulas de levaduras. Con este fin, prepare un montaje hmedo de S. cerevisiae usando el yodo de Gram o la solucin lugol, y trate de detectar depsitos de apariencia rojizocaf ms oscuro que el caf con el que el yodo tie de ordinario. Si detecta algo, dibjelo. CUESTIONARIO: 1. Donde se encuentran localizados en la clula bacteriana los grnulos de almidn y vacuolas grasas?
2. Para qu utiliza la clula bacteriana los depsitos de glucgeno?
3. Cmo sintetiza la bacteria el glucgeno?
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4. Mencione los principales componentes grasos que estn contenidas en las vacuolas.
5. Mencione mtodos de tincin tanto para almidn como para las vacuolas de grasa.
DATOS:
1. Bacillus subtilis. 2. Negro Sudn B y safranina. 3. Aceite de inmersin.
1. Saccharomyces cerevisiae. 2. Negro Sudn B (montaje hmedo). 3. Aceite de inmersin.
1. Saccharomyces cerevisiae. 2. Solucin de yodo-lugol (montaje hmedo). Qumico Farmacutico Bilogo Pgina 66
Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA 3. Aceite de inmersin.
BIBLIOGRAFIA: Bradshaw L. J. (2000). Microbiologa del Laboratorio. Editorial El Manual Moderno. Mxico, D.F. Pelczar M. J.; Reid Roger; Chan ECS. (1997). Microbiologa. McGraw Hill. 4. Edicin en espaol. Mxico, D.F. Joklik Wolfang, Willet Hilda, Amos Bernard. (1996). Microbiologa de Zinsser. 20. Edicin. Editorial Mdica Panamericana. Buenos Aires, Argentina.
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Prctica No. 11
CM-9
DEMOSTRACION DE LOS GRANULOS METACROMATICOS (VOLUTINA) OBJETIVO: El alumno demostrar la presencia de los grnulos de volutina en las bacterias.
FUNDAMENTO: Los grnulos de volutina se conocen por varios nombres dados por los investigadores en el pasado. Se les llama grnulos metacromticos debido al hecho de que algunos colorantes cambian color en su presencia. Tambin se les ha llamado grnulos de volutina y otros nombres. Estos grnulos estn compuestos de fosfatos inorgnicos polimerizados y representan una manera de almacenar este compuesto que se requiere para varios de los procesos metablicos celulares. El nmero de grnulos disminuye notablemente cuando se someten las bacterias a un periodo de inanicin. Los grnulos metacromticos tienen gran afinidad por los colorantes bsicos, cuando se tratan las clulas bacterianas con un colorante bsico se observan que los grnulos se tien ms intensamente que el resto de la clula. MATERIAL: Cultivo fresco (18-24horas) de Corynebacterium pseudodiphtheriticum (es un bacilo delgado, no patgeno, que se encuentra en la flora normal de la nariz y garganta de los humanos. Tambin se le conoce como bacilos de Hofmann) en agar inclinado. Tincin de Albert para difteria. Solucin de yodo lugol. Azul de metileno Loeffler. Infusin de paja. Portaobjetos de 15X75 mm. Mechero bunsen.
PROCEDIMIENTO: Asegrese que sus portas estn bien limpios para este experimento. 1. Prepare un frotis de C. pseudodiphtheriticum de la manera habitual. 2. Fijar con calor muy suave. 3. Cubra el frotis con solucin de Albert (colorante) y djelo reaccionar unos 5 minutos. A veces es conveniente calentar ligeramente la tincin misma. Para esto invierta el mechero prendido sobre el porta para que la flama apenas toque el colorante sobre el porta. Haga esto muy brevemente. Nunca permita que el colorante hierva o vaporice. 4. Despus de los 5 minutos, elimine el exceso de colorante, pero no lave a la llave. 5. Aplique la solucin de yodo lugol al lado hmedo y djelo reaccionar por 1 minuto. Qumico Farmacutico Bilogo Pgina 68
Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA 6. Lave con agua de la llave y seque al aire. 7. Examine la preparacin con el objetivo de aceite de inmersin y trate de detectar en el citoplasma los grnulos de volutina. Estos debern aparecer como puntos redondos de un azul intenso sobre el fondo verde plido del resto del citoplasma. Recuerde que solo aquellos grnulos que aparecen dentro del citoplasma son significativos. Otro mtodo para demostrar los grnulos de volutina, consiste en hacer un frotis como al principio de este experimento pero esta vez tiendo con azul de metileno por 5 minutos. Lave la preparacin con agua de la llave y squela al aire, examnela bajo el objetivo de aceite de inmersin. Al igual que la tcnica anterior, los grnulos se tien de color azul intenso, mientras el citoplasma aparecer azul plido. Haga los dibujos apropiados para cada una de las tcnicas realizadas. Usando la tincin de Albert, prepare un frotis con una gota de la infusin de paja y yerba que se le ha facilitado. Muchas veces este tipo de infusin contiene unos bastoncillos largos helicoidales (espiroquetas) que son muy abundantes en grnulos metacromticos. Observe bajo aceite de inmersin y haga los dibujos apropiados. CUESTIONARIO: 1. Que son los grnulos de volutina tambin conocidos como grnulos metacromticos?
2. Cules son los principales componentes de los grnulos metacromticos?
3. Cite varios cuerpos o sustancias de inclusin citoplsmicos. A que funcin est vinculado cada uno de stos?
4. Cmo se observan y localizan los grnulos metacromticos teidos en la clula?
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DATOS:
1. Corynebacterium pseudodiphthericum.. 1. C. pseudodiphthericum. 2. Tincin de Albert para difteria. 2.Azul de metileno de Loeffler. 3. Aceite de inmersin. 3. Aceite de inmersin.
1. Infusin de paja. 2. Tincin de Albert. 3. Aceite de inmersin.
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BIBLIOGRAFIA: Bradshaw L. J. (2000). Microbiologa del Laboratorio. Editorial El Manual Moderno. Mxico, D.F. Pelczar M. J.; Reid Roger; Chan ECS. (1997). Microbiologa. McGraw Hill. 4. Edicin en espaol. Mxico, D.F. Joklik Wolfang, Willet Hilda, Amos Bernard. (1996). Microbiologa de Zinsser. 20. Edicin. Editorial Mdica Panamericana. Buenos Aires, Argentina. Prescott L. M., Harley J. P., Klein D. A. (2004). Microbiologa. 5. Edicin. Editorial Mc. Graw Hill-Interamericana. Espaa. Dulbecco R., Davis B., Eisen H., Ginsberg H., Wood B., McCarty Maclyn. (2000) Tratado de Microbiologa. 4a. Edicin. Editorial Salvat Editores S.A. Barcelona, Espaa.
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Prctica No. 12 DEMOSTRACION DE LAS ENDOESPORAS EN LAS BACTERIAS OBJETIVO:
CM-10
Que el alumno observe estructuras bacterianas especiales como las endoesporas con tinciones selectivas. Que comprenda la importancia que tienen estas tinciones para la caracterizacin e identificacin de las bacterias.
FUNDAMENTO: Ahora ya que ha adquirido algo de experiencia en el uso de las tinciones diferenciales con propsitos taxonmicos, se proceder a estudiar estructuras celulares especficas por medio de la tincin diferencial. Para tornar visibles una o ms de las estructuras bacterianas es necesario aprovecharse de las caractersticas peculiares de la estructura en cuestin. Por ejemplo en las bacterias, una vez formada la endoespora, sta es extremadamente resistente a los mtodos ordinarios de tincin, caracterstica sta que inmediatamente sugiere un posible mtodo de tornar visible la endoespora. La aplicacin de una tincin simple a una clula bacteriana que contenga una endoespora colorear toda la clula excepto la espora (clula vegetativa); mientras que la espora permanecer sin colorear y por lo tanto, resaltar a la vista. Otros mtodos de tincin se valen de medidas enrgicas para forzar la penetracin del colorante a la endoespora. Una vez que el colorante ha penetrado a la endoespora, se necesitan medidas decolorantes igualmente enrgicas para extraerlo, lo cual permite someter a la clula a medidas decolorantes que decoloren fcilmente el resto de la clula dejando la espora bien teida. Para aumentar ms el contraste entre la espora y la porcin vegetativa de la clula, generalmente se aplica una contratincin como de ordinario, y el resultado final muestra la endoespora teida con el colorante primario y el citoplasma teido con el segundo colorante. Se cuenta as con un mtodo bastante simple para diferenciar la endospora de la parte vegetativa de la clula. MATERIAL: 1. Un cultivo de 48 a 72 horas de Bacillus spp. en agar inclinado y cultivo lquido de 24 horas de Streptococcus spp. 2. Azul de metileno de Loeffler. 3. Verde malaquita (solucin acuosa al 5%). 4. Safranina (solucin acuosa al 0,5%). 5. Portaobjetos 25 X 75 mm. 6. Mechero Fischer. METODO: El profesor proporcionar a los alumnos cultivos lquidos y slidos de Bacillus spp y Streptococcus spp. Realizar la tincin selectiva de endosporas en un frotis fijado al calor. Qumico Farmacutico Bilogo Pgina 72
Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA 1. Prepare dos frotis de Bacillus spp. y dos de Streptococcus spp de la misma forma habitual y squelos a la flama. 2. Bae el primer frotis con azul de metileno y djelo reaccionar de 3 a 5 minutos. Lvelo y squelo al aire. 3. Examnelo con el objetivo de inmersin y dibuje un campo que muestre claramente las endosporas. 4. otro mtodo muy til de demostrar las endoesporas es la tcnica de SchaefferFulton. Esta tcnica consiste en lo siguiente: a) Tome el segundo frotis y coloque un pequeo trozo de papel filtro sobre el frotis de Bacillus spp y Streptococcus spp. de tal manera que cubran la preparacin. b) Agregar verde malaquita sobre el papel filtro de tal manera que cubra la preparacin. c) Colocar el portaobjetos sobre un vaso de precipitados de 100 ml con agua en ebullicin. d) djelo que reaccione por 5 minutos evitando que se seque el colorante (agregar un poco ms si es necesario). e) Lave el frotis con agua de la llave durante medio minuto. f) Contratia con solucin de safranina al 0,5% (no use la safranina de Gram) y djela reaccionar por medio minuto. g) Lave en la llave y seque al aire. Examine su preparacin con el objetivo de inmersin y haga dibujos de las esporas y de las clulas vegetativas. Las esporas son verdes y las clulas vegetativas rojas. CUESTIONARIO: 1. Explique el fundamento de la tincin de endosporas. Por qu se debe calentar la preparacin?
2. Qu dificultades se tendra si no se adiciona la safranina al final de la tincin?
3. Es la formacin de endosporas en las bacterias un modo de reproduccin o de multiplicacin? Explicar.
4. Qu funcin tienen las esporas?
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Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA 5. A que se debe la alta resistencia de la bacteria esporulada a la desecacin, falta de nutrientes, polvo, temperatura?
6. Cmo se inicia el proceso de esporulacin a nivel de microscopio electrnico?
7. Contribuye la posicin y el tamao de la endospora en una clula vegetativa a identificar una bacteria? Complemente la respuesta con ejemplos concretos.
8. Mencione las diferentes capas que se generan durante la elaboracin de la espora.
9. Qu generalizacin puede hacerse con respecto a la morfologa y formacin de esporas?
10. Describa brevemente la formacin y la germinacin de la endospora. Cul es la importancia de la endospora?
11. Cmo podra demostrarse que las bacterias forman verdaderas endosporas?
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Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA RESULTADOS: A. Reportar las observaciones de forma, agrupacin, color y tamao relativo tal como se indica en el cuadro siguiente. B. Hacer los dibujos de la morfologa de cada uno de los microorganismos y colorearlos. C. Comparar las observaciones realizadas con las reportadas en la literatura. Descripcin Microscpica de Cultivos Bacterianos TINCION DE ENDOSPORAS Aumento total Forma: cocos, bacilos, etc. Agrupamiento de las clulas Tamao: Descripcin del cultivo: lquido o slido, edad del cultivo, etc. DATOS: Bacillus spp. Streptococcus spp.
1. Especie Bacillus . 2. Azul de metileno de Loeffler. 3. Aceite de inmersin.
1. Especie Bacillus. 2. Mtodo de Schaeffer-Fulton. 3. Aceite de inmersin
1. Especie Streptococcus. 2. Azul de metileno de Loeffler. 3. Aceite de inmersin. Qumico Farmacutico Bilogo
1. Especie Streptococcus. 2. Mtodo de Schaeffer-Fulton. 3. Aceite de inmersin Pgina 75
BIBLIOGRAFIA: Bradshaw L. J. (2000). Microbiologa del Laboratorio. Editorial El Manual Moderno. Mxico, D.F. Pelczar M. J.; Reid Roger; Chan ECS. (1997). Microbiologa. McGraw Hill. 4. Edicin en espaol. Mxico, D.F. Joklik Wolfang, Willet Hilda, Amos Bernard. (1996). Microbiologa de Zinsser. 20. Edicin. Editorial Mdica Panamericana. Buenos Aires, Argentina. Koneman Elmer, Allen Stephen, Dowell V.R., Sommers Herbert. (1996). Atlas de Diagnstico Microbiolgico. Editorial Interamericana. Mxico. Jhonson T. R. and C. L. Case. (1992). Laboratory Experiments in Microbiology. 3th. Edition. Cummings Publishing Company, Inc. USA. Practical Handbook of Microbiology. (1989). William M OLeary. Cornell Medical College, New York, USA. CRC Press. Holt, J.G., N.R. Krieg, P.H.A. Sneath, J.T. Staley and J.T. Williams. (1994). Bergeys Manual of Determinative Bacteriology. 9th. Edition. The Williams and Wilkins Co., Baltimore, USA.
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Prctica No. 13 DEMOSTRACION DE LAS CAPSULAS DE LAS BACTERIAS OBJETIVO:
CM-11
El estudiante ser capaz de observar la cpsula de una cepa de Streptococcus pneumoniae por ser muy variables los polisacridos especficos existentes en sus cpsulas.
FUNDAMENTO: Las clulas bacterianas estn circundadas por una capa de sustancias viscosas, que cuando tienen grosor suficiente para verse con facilidad se denomina cpsula. Dicha sustancia radica fuera de la pared celular, y se considera como producto de excrecin desprovisto de vida. Muchas cpsulas contienen polisacridos, y en muchas ocasiones la composicin qumica de la cpsula es especfica para un organismo determinado, hasta el punto de poder identificarse y distinguirse por las mismas de otras formas bacterianas afines. Algunas bacterias producen cpsula de material nitrogenado de tipo proteico. En ocasiones, la cpsula parece estar constituida de sustancias alimenticias, y de hecho, quiz no sea ms que una reserva nutritiva. En otras bacterias, por el contrario, la capa externa que nos ocupa parece estar compuesta de productos de desecho. En ambos casos probablemente ejerce tambin funcin protectora. MATERIAL: 1. 2. 3. 4. 5. 6. cepa de Streptococcus pneumoniae. Portaobjetos 25 X 75 mm. Asa de inoculacin. Mechero fischer. Cristal violeta al 1%. Solucin de sulfato de cobre al 20%.
METODO: 1. Hacer un frotis del cultivo procurando que sea uniforme, secar al aire. No fijar al calor. 2. agregar solucin acuosa de cristal violeta al 1% por 2 minutos. 3. lavar con una solucin al 20% de sulfato de cobre. 4. secar al aire en posicin vertical y examinar con inmersin. La cpsula no est teida, contrastando con el campo prpura y las clulas son dbilmente teidas.
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CUESTIONARIO: 1. Mencione de que est formada y cmo se produce la cpsula?
2. Qu funcin tiene la cpsula?
3. Todas las bacterias producen cpsula? Complemente su respuesta con ejemplos concretos.
4. Como se relaciona la presencia de cpsula con la virulencia o patogenicidad de la bacteria?
5. Mencione los diferentes tipos de neumococos productores de cpsula.
6. Describa brevemente: cpsula, capa mucosa, glicoclix y capa S. Cules son las funciones?
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Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA DATOS:
1. Streptococcus pneumoniae . 2. Cristal Violeta al 1% . 3. Aceite de inmersin. BIBLIOGRAFIA: Bradshaw L. J. (2000). Microbiologa del Laboratorio. Editorial El Manual Moderno. Mxico, D.F. Pelczar M. J.; Reid Roger; Chan ECS. (1997). Microbiologa. McGraw Hill. 4. Edicin en espaol. Mxico, D.F. Koneman Elmer, Allen Stephen, Dowell V.R., Sommers Herbert. (1996). Atlas de Diagnstico Microbiolgico. Editorial Interamericana. Mxico. Prescott L. M., Harley J. P., Klein D. A. (2004). Microbiologa. 5. Edicin. Editorial Mc. Graw Hill-Interamericana. Espaa. Jawetz E., Melnick Joseph (1990). Manual de Microbiologa Mdica. Editorial El Manual Moderno. Mxico, D.F. Schaechter, Medoff, Eisenstein, Guerra (1992). Microbiologa: Mecanismos de las Enfermedades Infecciosas. Editorial Interamericana.
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Prctica No. 14 TINCION PARA FLAGELOS. OBJETIVO:
CM-12
El estudiante ser capaz de realizar una tincin de flagelos, por medio de un mordiente para que stos tomen la coloracin con intensidad.
FUNDAMENTO: Para teir los flagelos por medio de est mtodo se requiere de mucha experiencia de laboratorio y es algo difcil de llevar a cabo en el laboratorio estudiantil. La teora de procedimiento es bastante sencilla. El colorante se aplica junto con el cido tnico como mordente, el cual se adhiere a la clula y a los flagelos en capas sucesivas hasta que las bacterias y los flagelos aumenten sus dimensiones. Esto es necesario debido a que los flagelos son demasiado delgados para ser percibidos con el microscopio ptico. Las clulas y los flagelos recubiertos por capas de mordente nos dan una imagen algo aumentada y distorsionada. La ejecucin de la tincin de flagelos presenta muchos inconvenientes. Una de las cosas que hay que evitar es la presencia de materia orgnica, ajenas a las clulas a teir, en el porta. El mordente tiene una tremenda afinidad por cualquier tipo de materia orgnica y, por eso, teir intensamente cualquier rastro de materia orgnica presente en el porta. Por lo tanto, antes de empezar debe asegurarse de que el portaobjetos este extremadamente limpio. De preferencia, los porta deben de ser nuevos y nunca haber sido tocados con las manos excepto por los bordes. Otro problema con esta tincin es que los flagelos son tan delgados y frgiles que tienden a romperse con facilidad. Debido a esto, en cualquier preparacin donde se hayan teido flagelos se observar gran cantidad de flagelos libres, despegados de las clulas y desparramados por todo el frotis. Sin embargo, su paciencia y atencin a los detalles los recompensarn con una preparacin excelente. MATERIAL: Cepa de Proteus mirabilis y Escherichia coli. Portaobjetos 25 X 75 mm. Asa de inoculacin. Mechero fischer. Mordente: Alumbre de potasio (solucin) Acido tnico al 20% en solucin acuosa Solucin acuosa saturada de cloruro mercrico
5 ml. 2 ml. 2 ml.
Mezclar y aadir 0,4 ml de una solucin alcohlica saturada de fucsina bsica, preparar el mordente fresco para cada da. Carbn fucsina de Ziehl-Neelsen. Qumico Farmacutico Bilogo Pgina 80
Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA PROCEDIMIENTO: 1. 2. 3. 4. 5. Hacer un frotis y secar al aire. No calentar. Aadir el mordente y dejarlo actuar 10 minutos. Lavar abundantemente con agua destilada. Aadir carbol fucsina por 5 o 10 minutos. Lavar con agua de la llave. Secar al aire y observar a inmersin.
CUESTIONARIO: 1. Compare la qumica y la funcin de los flagelos y de las fimbrias bacterianas.
2. Mencione las 3 partes estructurales del flagelo.
3. En qu parte estructural de la clula se une el flagelo, gancho y cuerpo basal?
4. Cmo se clasifican las bacterias mviles de acuerdo a la posicin de los flagelos?
5. Qu significa el trmino swarming que produce el proteus?
6. Mencione 3 mtodos para determinar la movilidad de las bacterias.
7. De dnde se origina la energa necesaria para la rotacin flagelar?
8. Porqu las clulas multiflagelares giran en sentido anti-horario?
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9. Que son los anillos y el cilindro que conforman el cuerpo basal y gancho de la clula y que significa las letras de los mismos?
10.Discuta los temas siguientes: modelos de distribucin flagelar; estructura y sntesis de flagelos; mecanismo por el que los flagelos hacen mover a las bacterias.
DATOS:
1. Proteus mirabilis. 2. Mordente y carbolfucsina. 3. Aceite de inmersin. BIBLIOGRAFIA:
1. Escherichia coli. 2. Mordente y C. fucsina. 3. Aceite de inmersin
Bradshaw L. J. (2000). Microbiologa del Laboratorio. Editorial El Manual Moderno. Mxico, D.F. Pelczar M. J.; Reid Roger; Chan ECS. (1997). Microbiologa. McGraw Hill. 4. Edicin en espaol. Mxico, D.F. Joklik Wolfang, Willet Hilda, Amos Bernard. (1996). Microbiologa de Zinsser. 20. Edicin. Editorial Mdica Panamericana. Prescott L. M., Harley J. P., Klein D. A. (2004). Microbiologa. 5. Edicin. Editorial Mc. Graw Hill-Interamericana. Espaa. Pgina 82
Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA Dulbecco R., Davis B., Eisen H., Ginsberg H., Wood B., McCarty Maclyn. (2000) Tratado de Microbiologa. 4a. Edicin. Editorial Salvat Editores S.A. Jawetz E., Melnick Joseph (1990). Manual de Microbiologa Mdica. Editorial El Manual Moderno. Mxico, D.F. Schaechter, Medoff, Eisenstein, Guerra (1992). Microbiologa: Mecanismos de las Enfermedades Infecciosas. Editorial Interamericana.
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Prctica No. 15
CM-13
DEMOSTRACION DEL NUCLEO Y DE LA MORFOLOGIA GENERAL DE LAS LEVADURAS OBJETIVO: El alumno demostrar la presencia del ncleo y observar la morfologa general de las levaduras.
FUNDAMENTO: Aunque la tcnica para tornar visible el ncleo bacteriano es algo imprctica en los laboratorios estudiantiles, es ms factible hacer una tincin que demuestre el ncleo en las clulas de levaduras ordinarias. Aunque las dificultades encontradas son las mismas, es ms fcil resolverlas con las levaduras que con las bacterias. Ciertos factores citoplasmticos (que normalmente interfieren con el teido del ncleo) deben hidrolizarse antes de emplear la tincin nuclear (azul de toluidina). En el siguiente experimento tendr la oportunidad de estudiar la morfologa general de la levadura tpica. MATERIAL: Cultivo fresco (6 12 horas) de Saccharomyces cerevisiae en agar Sabouraud inclinado. Solucin de etanol (40%). Solucin de hidrxido de potasio (0,1M). Solucin de toluidina 0,1% en etanol 10%. Solucin de etanol (10%). Solucin de yodo de gram. Portaobjetos de 15 X 75 mm. Mechero bunsen.
PROCEDIMIENTO: 1. Prepare un frotis de regular densidad con las clulas de levadura en suspensin en agua de la llave. 2. Seque al aire. 3. Fije a la flama muy suavemente. 4. Bae el porta durante 1minuto con solucin de etanol al 40%, lave en la llave. 5. Bae el frotis con solucin de KOH y djelo reaccionar 1 hora; si se empieza a deshidratar agregue ms KOH. 6. Lave bien a la llave y luego aplique el azul de toluidina por 2 minutos. 7. Lave con etanol al 10%, sacuda el exceso de alcohol y seque al aire. 8. Prepare un segundo portaobjetos como el anterior pero proceda nicamente hasta el segundo paso, es decir, hasta el bao con etanol inclusive al 40%. Omita el tratamiento con KOH. Aplique azul de toluidina por 2 minutos y contine como en el primer frotis. Compare ambas preparaciones. La segunda Qumico Farmacutico Bilogo Pgina 84
Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA demuestra que la hidrolizacin previa del citoplasma (tratamiento con KOH) es necesaria antes de aplicar el colorante. Examine las preparaciones con el objetivo de aceite de inmersin y dibjelas. Los ncleos se tien de azul oscuro o rosa y el citoplasma de un rosa mucho ms claro. Para continuar el estudio de las levaduras, prepare un montaje hmedo usando yodo de Gram en vez de agua. Trate de detectar las gmulas y las estructuras internas, tales como grandes vacuolas. Dibuje algunas clulas representativas, como se aprecia con el objetivo de alto poder en seco y con el de aceite de inmersin. CUESTIONARIO: 1. De qu est conformado el cuerpo nuclear de las bacterias?
2. Qu funcin realiza el mesosoma con el DNA bacteriano?
3. Qu son los poliribosomas y como estn conformados?
4. Qu son las protenas similhistonas y las poliaminas y que funcin realizan en asociacin con el DNA?
5. Es correcto decir que la clula bacteriana contiene un ncleo tpico?
6. Que estructura de la bacteria contiene comnmente cantidades apreciables de DNA?
7. Describa la estructura del ncleo. Qu son la eucromatina y heterocromatina? Cul es el papel de los poros en la envoltura nuclear?
la
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8. Discuta brevemente la estructura y funcin del nucleolo. Qu es el organizador nucleolar?
DATOS:
1. Saccharomyces cerevisiae. . 2. Azul de toluidina 0,1% (con KOH). 3. Aceite de inmersin.
1. Saccharomyces cerevisiae. 2. Azul de toluidina 0,1% sin Hidrxido de potasio. 3. Aceite de inmersin
1. Saccharomyces cerevisiae. . 2. Yodo de Gram (montaje hmedo). 3. Aceite de inmersin.
1. Saccharomyces cerevisiae. 2. Yodo de Gram (montaje Hmedo). 3. Aceite de inmersin
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BIBLIOGRAFIA: Bradshaw L. J. (2000). Microbiologa del Laboratorio. Editorial El Manual Moderno. Mxico, D.F. Pelczar M. J.; Reid Roger; Chan ECS. (1997). Microbiologa. McGraw Hill. 4. Edicin en espaol. Mxico, D.F. Joklik Wolfang, Willet Hilda, Amos Bernard. (1996). Microbiologa de Zinsser. 20. Edicin. Editorial Mdica Panamericana. Buenos Aires, Argentina. Koneman Elmer, Allen Stephen, Dowell V. R., Sommers Herbert. (1996). Atlas de Diagnstico Microbiolgico. Editorial Interamericana. Mxico. Prescott L. M., Harley J. P., Klein D. A. (2004). Microbiologa. 5. Edicin. Editorial Mc. Graw Hill-Interamericana. Espaa. Schaechter, Medoff, Eisenstein, Guerra (1992). Microbiologa: Mecanismos de las Enfermedades Infecciosas. Editorial Interamericana.
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Prctica No. 16 TAMAO Y FORMA DE ALGUNAS BACTERIAS OBJETIVO:
CM-14
Determinar la forma y tamao de Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus y Escherichia coli por medio del procedimiento en el cual se utiliza un ocular micromtrico y un objetivo micromtrico. FUNDAMENTO: Las bacterias pertenecen a la gran clase de microorganismos conocido por equizomicetos, nombre que se aplica a estos seres por su reproduccin tpica mediante divisin transversal o binaria. Configuracin de las bacterias. Las clulas bacterianas presentan tres formas fundamentales: esfricas, bacilar y espiral o curvada. Todas las bacterias, en condiciones normales o anormales, exhiben pleomorfismo en mayor o menor grado; pero una especie bacteriana suele asociarse siempre a una forma celular definida, cuando se desarrolla en un medio regular, y en condiciones controladas. Las bacterias esfricas (cocos) se dividen en uno, o tres planos, y originan pares o cadenas, agregados o paquetes de clulas. Algunos parecen esferas perfectas; otras son algo alargadas o elipsoidales. Lo estreptococos se dividen solo en un plano, y crecen normalmente formando pares o cadenas. Segn las especies, los extremos distales de cada par pueden tener forma de lanceta, o aplanada por los lados contiguos, a modo de grano de caf. Las sarcinas se dividen en tres planos, y producen paquetes regulares que son masas cbicas formada por capa de bacteria superpuestas. Los bastoncitos o bacilos tambin ofrecen variaciones considerables. Se considera generalmente un bacilo como un cilindro con los extremos ms o menos redondeados; algunos, son francamente elipsoidales. Los extremos del cuerpo cilndrico pueden mostrar tambin notables diferencias, pues en algunas especies son marcadamente redondeados, y en otros tienen caras redondeadas planas perpendiculares a los lados. Los bacilos presentan asimismo gran variedad de relaciones entre longitud y anchura. Algunos son desproporcionadamente largos, y otros cortos, que pueden confundirse con los cocos. Tamao de la bacteria. El tamao vara mucho segn la especie; algunos son tan diminutos, que incluso con el microscopio ms potente resulta difcil distinguirla, y tan grandes otras, que casi se perciben a simple vista, aunque nunca con claridad. Sin embargo, las dimensiones de la mayora son intermedias entre estos dos extremos. Una bacteria esfrica o coco se mide por la magnitud de su dimetro; una forma bacilar o espiral, por su longitud o anchura. Calculando por este mtodo la longitud de una bacteria espiral, se obtiene la aparente; la real se determina midiendo la longitud de cada espiral.
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El mtodo que se emplea para fijar y teir bacterias pueden ser tambin causa de diferencia de tamao. Las clulas des las bacterias se contraen considerablemente mientras se secan y se fijan, y tal contraccin vara segn el medio de cultivo. Por trmino medio, supone un tercio de la longitud de la clula comparada con una preparacin sin teir en gota pendiente. Clulas jvenes de Bacilus megaterium pueden sufrir una contraccin de 15 a 24 por 100 al pasar de un caldo nutritivo a otro medio semejante que contenga cloruro sdico en concentracin 2M. Las mediciones ofrecern algunas discrepancias, que dependen de la solucin colorante y del modo de aplicacin. En frotis secos y fijados, la pared celular y la capa mucosa no se tien con colorantes dbiles, como azul de metileno, pero si lo hacen con los enrgicos, como p-rosanilina, neofucsina, violeta cristal y violeta de metilo. La gran mayora de las bacterias estudiadas y clasificadas se han medido en preparaciones fijadas y teidas. Algunas veces se emplearon frotis secos con coloracin negativa. Por eso, al indicar el tamao de las bacterias debe especificarse el mtodo seguido para su determinacin; de lo contrario, tales datos sern de escasa utilidad. La unidad de medida para bacterias es la micra, equivale a 0,001 mm o 0,00001 cm. Una milimicra es 0,001 de micra o 0,000001 mm, algunas bacterias miden hasta 80 micras, y otras no pasan de 0,2 micras. Sin embargo, la mayora de los microorganismos corrientes, incluidas las bacterias patgenas, miden aproximadamente, 0,5 micras de dimetro los cocos, y 0,5 por 2 a 3 micras las formas bacilares. Los grmenes esporgenos son mayores, por regla general, que los incapaces de reproducirse por esporulacin. Algunas de las bacterias corrientes dan en preparaciones desecadas y teidas las siguientes dimensiones: Escherichia coli, 0,5 por 1 a 3 micras; Salmonella typhi, 0,6 a 0,7 por 2 a 3 micras; Staphylococcus aureus, 0,8 a 1 micra de dimetro; Lactobacillus acidophilus 0,6 a 0,9 por 1,5 a 6 micras; Bacillus subtilis, 0,7 a 0,8 por 2 a 3 micras, con esporas de 0,6 a 0,9 por 1 a 1,5 micras; B. megaterium, 0,9 a 1,3 por 3 a 10 micras, con esporas de 0,8 a 1 por 1,3 a1,5 micras. El mtodo que ms comnmente se sigue para medir bacterias se vale de un Micrmetro Ocular. Tambin se puede utilizar una cmara clara con oculares de dibujos, o proyectar sobre una pantalla la imagen real y tomar las medidas. Los mismos agentes que hacen variar la forma de las bacterias alteran tambin su tamao. Con una o dos excepciones, las clulas jvenes son mayores que la vieja o madura. Clulas de B. subtilis de un cultivo de 4 horas son de 5 a 7 veces ms larga que las de un cultivo de 24 horas: las diferencias de anchura son mucho menos manifiesta. Una notable excepcin a esta regla de contraccin por efecto de la edad es el Corinebacterium diphtheriae. La disminucin de la longitud y anchura de las clulas parece provenir de diversos factores. Las transformaciones del ambiente, con acumulacin de residuo txico en el medio, se consideran como causa principal. Un incremento de la presin osmtica del medio motivar una disminucin del tamao, y tal vez sea este factor ms importante. Las bacterias son mucho ms pequeas que la mayora de las clulas animales y vegetales. Se utiliza para medirla una cantidad microscpica llamada micra, que representa 1/1000 de mm, aproximadamente 1/25000 de pulgada. La mayora de los cocos tienen poco menos de 1 micra de dimetro mientras que los bacilos tienen de 1 a 3 micras de longitud y 1/2 a 1 de dimetro. A veces se encuentran bacterias hasta de 50 micras de longitud. Qumico Farmacutico Bilogo Pgina 89
Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA Los tipos bacterianos de mayor volumen pueden descubrirse con el microscopio ordinario de luz de poco aumento, pero en la mayor parte de los casos, es necesario emplear lentes de gran potencia que brinden grandes aumentos. De cualquier forma, el observador ve las bacterias muy pequeas, incluso empleando los mayores aumentos de los microscopios usuales de laboratorio. MATERIAL: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
Cultivos de 24 horas en gelosa nutritiva de Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus y Escherichia coli. Suspensin de glbulos rojos lavados en solucin salina fisiolgica. Asa de inoculacin. Pipeta pasteur. Portaobjetos de 25 X 75 mm. Alcohol metlico. Colorante de Wright.
PROCEDIMIENTO: a) Colocar una gota de la suspensin de glbulos rojos en un extremo. Poner una asada de cultivo bacteriano y extender la suspensin sobre la lmina con ayuda de otro portaobjetos. b) Dejar secar al aire, fijar con alcohol metlico de 1 a 3 minutos. c) Colorear con Wright o Giemsa y observar a inmersin. d) Hacer esquemas y anotar el tamao aproximado, suponiendo que un glbulo rojo tiene un dimetro aproximado de 7 micras. CUESTIONARIO: 1. Mencione las distintas formas caractersticas que pueden adquirir las bacterias dando un ejemplo de cada una de ellas (gnero y especie).
2. Haga un esquema con los distintos tipos de morfologa colonial que se pueden observar en los medios de cultivo.
3. Dibuje las distintas formas de crecimiento que se observan por el mtodo de estra en agar, picadura en gelatina y caldo de nutrientes (superficie de crecimiento).
4. Qu funcin ejerce la pared celular de las bacterias en su forma?
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5. Describa el mtodo ms utilizado para medir las bacterias.
6. Si se hace un exmen microscpico de una preparacin teida correctamente de Staphylococccus aureus, cabra esperar que todas las bacterias estn agrupadas en racimos? Explicar.
7. Explicar porqu algunas especies de cocos se disponen en cadena, y otras en cubos.
8. Cules son los tipos morfolgicos habituales de las bacterias clasificadas en el orden Eubacteriales?
DATOS:
1. Especie Bacillussubtilis 2. Tincin de Wright . 3. Aceite de inmersin.
1. Especie S. aureus 2. Mtodo de Wright. 3. Aceite de inmersin
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1. Escherichia coli. 2. Tincin de Wright. 3. Aceite de inmersin. BIBLIOGRAFIA:
Bradshaw L. J. (2000). Microbiologa del Laboratorio. Editorial El Manual Moderno. Mxico, D.F. Joklik Wolfang, Willet Hilda, Amos Bernard. (1996). Microbiologa de Zinsser. 20. Edicin. Editorial Mdica Panamericana. Buenos Aires, Argentina. Koneman Elmer, Allen Stephen, Dowell V. R., Sommers Herbert. (1996). Atlas de Diagnstico Microbiolgico. Editorial Interamericana. Mxico. Prescott L. M., Harley J. P., Klein D. A. (2004). Microbiologa. 5. Edicin. Editorial Mc. Graw Hill-Interamericana. Espaa. Jawetz E., Melnick Joseph (1990). Manual de Microbiologa Mdica. Editorial El Manual Moderno. Schaechter, Medoff, Eisenstein, Guerra (1992). Microbiologa: Mecanismos de las Enfermedades Infecciosas. Editorial Interamericana.
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Prctica No. 17
CM-15
MORFOLOGIA COLONIAL Y DESARROLLO EN DIFERENTES MEDIOS DE CULTIVO OBJETIVO: Determinar la forma en que deben sembrarse los distintos medios de cultivo como son, los medios slidos, lquido y semislido (medios selectivos y diferenciales, caldo, gelatina y Agar Nutritivo inclinado). Que el estudiante prepare medios de cultivo para uso general, diferenciales y selectivos para el cultivo de diferentes especies bacterianas. Identificar un germen desconocido inoculado en distintos medios tanto por medio de su morfologa como su fisiologa y compararlo con su patrn bioqumico. FUNDAMENTO: Los zologos y botnicos clasifican la mayor parte de microorganismos por observacin de sus caractersticas estructurales, aunque en realidad las bacterias no pueden clasificarse completamente por tales medios. As vemos que dos tipos de bacterias imposibles de distinguir por examen microscpico pueden pertenecer a dos especies completamente distintas. Por ejemplo, la observacin al microscopio no permite establecer diferencia entre Escherichia coli y el productor de la fiebre tifoidea, Salmonella typhi. Sin embargo son muy diferentes desde el punto de vista fisiolgico, ya que E. coli fermenta muchos azcares con formacin de gas; S. typhi, por el contrario, forma cidos con muy pocos azcares y con ningn gas. Adems, y de manera decidida ambos difieren tambin en patogenicidad. En consecuencia, es indispensable para diferenciarlo, considerar sus caractersticas fisiolgicas y morfolgicas. En trminos generales, toda especie bacteriana desarrollada en un medio slido patrn forma un tipo caracterstico de agrupacin o colonia. Las colonias se diferencian por su tamao, forma, borde, altura o elevacin, estructura interna, etc.; cuando el bacterilogo trata de clasificar un germen desconocido debe estudiar, tanto su morfologa como su fisiologa. Examina al microscopio en gota pendiente para determinar su movilidad, en frotis con tincin simple para percatarse de su morfologa celular y forma de agruparse, y por el mtodo de Gram para decidir sobre su reaccin al mismo. Estudia adems sus caractersticas de desarrollo en tubo de cultivo y el aspecto de su colonia. Debe asimismo inocular el cultivo puro en tubos de fermentacin con medio hidrocarbonado, para comprobar que azcares fermentan, hacer una siembra por transfixin en gelatina para observar si lica, cultivo en leche para cerciorarse de su capacidad para digerir la casena, etc. Suele calificarse a esta serie de pruebas como estudio sistemtico de un cultivo puro. Puede tambin el bacterilogo incluir inoculaciones en animales para determinar patogenicidad, y pruebas serolgicas para descubrir la reaccin de las bacterias a sustancias inmunes en sueros de animales.
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Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA MATERIAL: 1. Dos tubos con B.H.I. (caldo Infusin Cerebro Corazn). 2. Dos tubos con Gelatina. 3. Nueve tubos de Agar Base Sangre en posicin inclinada. 4. Microscopio estereoscpico. 5. Asa de inoculacin. 6. Mechero Fischer. 7. Tres Cajas de petri com Agar Nutritivo. 8. Dos Cajas de petri com Agar Eosina Azul de Metileno (EMB). 9. Dos Cajas de petri com Agar Sal y Manitol (MSA). 10. Dos Cajas de petri com Medio Mnimo de Sales (MM). PROCEDIMIENTO. El profesor proporcionar Cultivos puros de 24 horas en Agar Base Sangre de Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa; Bacillus subtilis y Streptococcus spp. Tambin proporcionar una muestra problema por equipo (con 2 microorganismos diferentes) en la que practicarn la tcnica de aislamiento por estra cruzada. Tcnica de Estra Cruzada a) En la parte posterior y exterior de la caja de Agar Nutritivo, dividirla en cuatro cuadrantes. Tomar una muestra con el asa previamente flameada y fra, inocular la muestra haciendo 4-5 estras simples, muy juntas de lado a lado sobre el primer cuadrante de la caja, cerrar la caja. b) Flamear el asa de inoculacin y hacer girar la caja de petri un cuarto de vuelta. Abrir nuevamente la caja y enfriar el asa de siembra tocando la superficie del medio lejos de la zona de estras recin hechas. c) Rozar con el asa una vez la superficie del conjunto original de estras y hacer un segundo grupo de estras en el segundo cuadrante como en el caso anterior. d) Repetir el procedimiento b y c en el tercer cuadrante y al efectuar la siembra en el ltimo cuadrante no se deber flamear el asa de inoculacin y se har una estra muy abierta (simple). e) Incubar a 35C por 24 horas. Observar en el microscopio estereoscpico los diferentes tipos de colonias que desarrollaron en las cajas de gelosa nutritiva. Cualquier variacin en forma, consistencia, superficie, y probablemente tamao, indican una especie bacteriana distinta. Hacer esquemas. Siembra en Tubos con Caldo a) Sembrar un cultivo puro diferente en cada uno de los 2 tubos de caldo B.H.I. b) Incubar a 35 C por 24 horas. Terminando el periodo de incubacin, observar el tipo de desarrollo (velo, sedimento, turbidez, etc.). c) Sembrar con el asa extendida los mismos cultivos puros en otros dos tubos con gelatina en forma recta. d) Incubar a 37 C por 48 horas. e) Sembrar un cultivo puro diferente en cada uno de los dos tubos con gelosa nutritiva inclinada, en estra. f) Incubar a 37 C por 48 horas. Dibujar los tipos de cultivo desarrollados. Qumico Farmacutico Bilogo Pgina 94
Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA Siembra de Cajas de Petri con Medios Diferenciales y Selectivos a) Dividir en tres partes una caja de petri con Agar EMB, otra con MSA y una de Agar MM. Sembrar en cada parte un cultivo puro diferente por estra simple. b) En otra serie de 3 cajas con cada uno de los medios antes descritos, sembrar por estra cruzada la muestra problema. c) Incubar las placas en forma invertida a 35C durante 24 horas. d) De las cajas inoculadas por estra cruzada, seleccionar la colonia ms aislada (generalmente del cuarto cuadrante). Transferir una pequea muestra (una colonia) a tubos inclinados con Agar Base Sangre en pico de flauta. e) Incubar los tubos a 35C de 24-48 horas. Observar la aparicin de colonias y reportar la forma en que se distribuyen a lo largo del tubo. Morfologa Colonial de Cultivos Bacterianos Escherichia coli Aislamiento por Estra Cruzada Forma: Color: Tamao (mm): Borde: Superficie: Aspecto: Elevacin: Luz transmitida: Luz reflejada: Consistencia: Medio EMB 11 Siembra1en medios de Cultivo 222 Selectivos 33 y 3 Diferenciales Microorganismo 1: Forma: Color: Tamao (mm): Elevacin: Luz Transmitida: Luz Reflejada: Consistencia: Medio MSA Medio MM Streptococcus spp. Muestra problema
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Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA La descripcin colonial puede hacer tomando en cuenta los siguientes criterios: Cultivos de agar en estra: En rosario, filiforme, equinulado, diseminado, arborescente. Cultivos en gelatina por transfixin: estratiforme, crateriforme, infundibuliforme, saculiforme y forma de nabo. Cultivos en agar (mtodo de vibracin): facultativo, aerobio, anaerobio y microaerfilo. Borde: entero, ondulado, gastado, filamentoso, arborescente y ensortijado. Elevacin: esparcida, plana, elevada, convexa, en cazoleta y umbilicada. Estructura interna: homognea, granulosa, lisa, rizada, rugosa y anular. Superficie: lisa, rugosa y anular. Forma de crecimiento de las bacterias: puntiforme, grnulos, rizoide, irregular filamentosa y circular. Aspecto de la colonia: Hmeda, seca, butirosa. Consistencia: Dura, blanda, mucoide. Luz Transmitida: Translcida, opaca. Luz Reflejada: Brillante, mate. Descripcin Morfolgica de Cultivos Puros en Tubos de Cultivo. Escherichia coli Tubos inclinados de Agar Nutritivo Crecimiento: arborescente, filiforme, rizoide, disperso, punitiforme. Color: Cultivos en tubos de Caldo BHI Crecimiento: superficie, con pelcula, con sedimento, turbidez en todo el tubo. Color: Tubos rectos de Gelatina Crecimiento: en forma de pelcula superficial, a lo largo de la picadura, solo en el fondo. Color: RESULTADOS: A. Recopilar la informacin de la caracterizacin colonial de cada cepa en los cuadros. Qumico Farmacutico Bilogo Pgina 96 Streptococcus spp. Muestra Problerma
Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA B. De acuerdo a sus observaciones identifique las especies presentes en la muestra problema. CUESTIONARIO: 1. Qu es el agar y de donde se obtiene? Cules son los nutrientes que proporcionan a los microorganismos?
2. Qu necesidades nutricionales en trminos de sustancias qumicas, son necesarias para el buen desarrollo y funcionamiento de las bacterias?
3. Cules son los ingredientes del caldo BHI? Que tipo de nutriente puede proveer cada uno de estos ingredientes?
4. Cules son las ventajas inherentes al uso de medios de cultivo sintticos? Cules son las desventajas?
5. Cul es la composicin qumica de los medios EMB, MSA y MM? Cules son los componentes o propiedades responsables de su funcin como medios selectivos o diferenciales?
6. Por qu el agar nutritivo es un medio de uso general para el cultivo de bacterias?
7. Proponga algunas sustancias que se le agregaran para hacerlo selectivo para bacterias Gramnegativas.
8. Cul es la informacin que se obtiene de la siembra de cultivos bacterianos en tubos con agar inclinados y en tubos de gelatina?
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9. Qu pasos se deben de seguir en la preparacin de un medio de cultivo bacteriolgico?
10.Por qu se necesitan diferentes medios de cultivo? Clasifique los medios de cultivo de acuerdo con su funcin.
11.Desde el punto de vista qumico, Cul es la diferencia entre caldo nutritivo y un medio sinttico?
12.Cmo se clasifican las bacterias con base en su temperatura ptima de desarrollo?
BIBLIOGRAFIA: Bradshaw L. J. (2000). Microbiologa del Laboratorio. Editorial El Manual Moderno. Mxico, D.F. Joklik Wolfang, Willet Hilda, Amos Bernard. (1996). Microbiologa de Zinsser. 20. Edicin. Editorial Mdica Panamericana. Buenos Aires, Argentina. Prescott L. M., Harley J. P., Klein D. A. (2004). Microbiologa. 5. Edicin. Editorial Mc. Graw Hill-Interamericana. Espaa. Holt, J.G., N.R. Krieg, P.H.A. Sneath, J.T. Staley and J.T. Williams. (1994). Bergeys Manual of Determinative Bacteriology. 9th. Edition. The Williams and Wilkins Co., Baltimore, USA. Practical Handbook of Microbiology. (1989). William M OLeary. Cornell Medical College, New York, USA. CRC Press. Wistreich, G.A. y M.D. Lechtman. (1983). Prcticas de Laboratorio en Microbiologa. Editorial Limusa. Mxico.
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Prctica No. 18
CM-16
CARACTERIZACION CITOLOGICA DE UNA BACTERIA DE IDENTIDAD DESCONOCIDA OBJETIVO: El alumno identificar un organismo desconocido. FUNDAMENTO: Si a usted se le presenta un organismo desconocido, una de las maneras de identificarlo es por medio de un anlisis citolgico. Este es precisamente el objeto del siguiente experimento. A usted se le dar un organismo cuya identidad desconoce y usted deber caracterizarlo en funcin de su citologa. En primer lugar le dar oportunidad de repetir los procedimientos hasta ahora aprendidos para asegurarse de que ha dominado la tcnica para hacer este tipo de estudio. Cada vez que termine un ensayo, se le dar a conocer si su resultados fueron o no atinados. Adems, la repeticin de estas tinciones recalcar su aplicacin universal en microbiologa. En este experimento usted se enfrenta con una tarea especfica, la cual le permite probar su aptitud para desarrollar este tipo de tcnica. Cabe hacer algunas aclaraciones con respecto al estudio citolgico de organismos cuya identidad se desconoce, una de las cosas ms difciles de asimilar para el estudiante, es el hecho de que una misma especie dada de bacterias no presenta necesariamente la misma apariencia de una ocasin a otra, o de un mtodo de tincin a otro. Indudablemente, por ejemplo, que uno de los problemas mas difciles es determinar si el organismo en cuestin es un coco o un bacilo, cuando la bacteria aparece como un bastn corto y grueso. A esta forma se le llama cocobacilo por su tendencia a parecerse a un coco aunque de hecho sea un bacilo, en general, al tratar con un cocobacilo en cultivo puro, siempre habr uno que otro bastn bien definido en cada campo observado. Cuando usted observe formas casi esfricas que parecen diferir de los cocos tpicos y en la misma preparacin se observa uno que otro bacilo bien definido, puede usted asumir que se trata de un cocobacilo (siempre que se trate de un cultivo puro), requiere prctica y concentracin en el campo visual aprender a identificar correctamente. Observe los organismos individuales, no la totalidad del campo. MATERIAL: 1. Organismo de identidad desconocida, asignado por nmeros. PROCEDIMIENTO: a) En este experimento se le ha asignado un cultivo de 24 horas, presumiblemente puro. La nica marca que identifica al cultivo es un nmero. Anote ese nmero en su cuaderno, tan pronto como reciba el cultivo, trabajando con este cultivo de identidad desconocida, realice las siguientes tcnicas de tincin (o aquella tinciones que le indique su instructor): vacuolas grasas grnulos metacromticos tincin de Gram tincin acidorresistente tincin de espora Qumico Farmacutico Bilogo Pgina 99
Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA tincin de flagelos demostracin de la cpsula motilidad (ya sea montaje con cubreobjetos, medio semislido o bien empleando la tcnica de la gota colgante). b) Una vez terminado su estudio, entregue un registro de sus observaciones. Se le informar entonces de lo acertado de sus resultados. Haga dibujos de sus resultados. CUESTIONARIO: 1. Nombre 10 gneros de bacterias que tengan caractersticas morfolgicas que las distingan. Describa las caractersticas morfolgicas de cada gnero.
2. Podra hacer una clasificacin de gnero bacteriano en base a las caractersticas citolgicas de las clulas bacterianas asignadas en este experimento? Explique ampliamente.
BIBLIOGRAFIA: Bradshaw L. J. (2000). Microbiologa del Laboratorio. Editorial El Manual Moderno. Mxico, D.F. Joklik Wolfang, Willet Hilda, Amos Bernard. (1996). Microbiologa de Zinsser. 20. Edicin. Editorial Mdica Panamericana. Buenos Aires, Argentina. Koneman Elmer, Allen Stephen, Dowell V.R., Sommers Herbert. (1996). Atlas de Diagnstico Microbiolgico. Editorial Interamericana. Mxico. Prescott L. M., Harley J. P., Klein D. A. (2004). Microbiologa. 5. Edicin. Editorial Mc. Graw Hill-Interamericana. Espaa. Dulbecco R., Davis B., Eisen H., Ginsberg H., Wood B., McCarty Maclyn. (2000) Tratado de Microbiologa. 4a. Edicin. Editorial Salvat Editores S.A. Schaechter, Medoff, Eisenstein, Guerra (1992). Microbiologa: Mecanismos de las Enfermedades Infecciosas. Editorial Interamericana.
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Prctica No. 19 NUTRICION DE LOS MICROORGANISMOS
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OBJETIVO: El alumno ser capaz de determinar los requerimientos mnimos necesarios para el crecimiento de los microorganismos en diferentes medios de cultivos. FUNDAMENTO: Una de las facetas ms importantes de cualquier estudio de los seres vivos es la ciencia de la nutricin. Por regla general, se piensa en la nutricin en funcin de uno mismo y nuestros requerimientos de tipos de alimentos especficos, sin pensar mucho sobre el hecho de que todos los seres vivos tienen requerimientos alimentarios tambin. En ltimo anlisis la ciencia de la nutricin trata sobre las clases de alimentos que un organismo debe incluir en su dieta para sobrevivir. La dieta de todos los seres vivos requiere de alguna sustancia que contenga nitrgeno en forma que ellos puedan utilizar. Muchos microorganismos son capaces de utilizar las protenas y los aminocidos como fuentes de nitrgeno, pero muchos otros no requieren formas tan complejas de este elemento. Los compuestos de nitrgeno inorgnico, como nitrato de potasio y fosfato de amonio, de hecho constituyen la nica fuente de nitrgeno para cierto tipo de microorganismos. Estos son capaces de fabricar aminocidos y protenas a partir del nitrgeno inorgnico. Otra sustancia nutritiva familiar son los carbohidratos (azcares, almidn, etc.). Generalmente los carbohidratos proporcionan energa rpida o el combustible del que la vida depende. La fuente de energa vara entre los microorganismos, algunos pueden utilizar la mayora de los carbohidratos, mientras que otros nicamente algunos o ninguno. Idealmente todos los distintos medios (dietas) que se emplean en Microbiologa deberan ser del tipo llamado sinttico. De acuerdo a la nutricin las bacterias se clasifican en: Bacteria autotrfica estricta. Estos grmenes no pueden utilizar materia orgnica, y hasta los perjudica su presencia. Son capaces de sintetizar los productos complejos que integran su protoplasma, a partir de simples sales inorgnicas; obtienen su carbono, y su energa de la oxidacin de ciertos compuestos o incluso elementos inorgnicos, con lo que resultan independientes de la vida animal o vegetal. Bacterias heterotrficas estrictas. Estas bacterias no pueden sintetizar su complicado citoplasma a partir de simples sales inorgnicas, sino que necesitan para su desarrollo productos orgnicos tales como protenas, peptonas, aminocidos y vitaminas. Los medios nutritivos empleados para cultivar bacterias puede dividirse en dos grupos, segn el carcter de las sustancias que entra en su composicin: sintticos y no sintticos. Medios de cultivo sintticos: estos medios de cultivo se componen de productos de estructura qumica conocida como sales orgnicas, aminocidos, carbohidratos, cidos grasos ligeros, hidroxicidos y alcoholes. Medios de cultivo no sintticos: los medios no sintticos se componen de ingredientes de composicin qumica ignorada; por ejemplo, extracto de carne de
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Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA vaca, extracto de levadura, diversas peptonas, infusin de carne sangre, suero e hidrolizado de casena. MATERIAL: 1. Cuatro cajas de petri con: a) nicamente agar (lavado y purificado antes de disolverlo). b) Agar + minerales (lavado y purificado antes de disolverlo). c) Agar + minerales + fuentes de carbono orgnico (glucosa). d) Agar + minerales + azcar + fuentes de nitrgeno (peptona) 2. Cajas de petri estriles (4). 3. Cultivos de Escherichia coli, Staphylococcus aureus Saccharomyces cerevicae. 4. Asa de inoculacin. 5. Mechero fischer.
PROCEDIMIENTO: a) Derrita una cantidad fija de cada uno de los diferentes tipos de medios y deje que se enfre a 45C, vierta cada medida enfriada en una caja de petri estril separada, djela endurecer y etiqutela. b) Con un lpiz de cera, trace sobre el fondo de vidrio de cada caja petri para dividirla en cuatro sectores y numere cada sector. c) Inocule los sectores correspondientes de cada caja con uno de los tres organismos; deje el cuarto sector de cada caja sin inocular. d) Invierta las cajas, incbelos a 37 C durante 48 horas y observe el crecimiento en cada uno de los sectores inoculados. La caja rotulada Agar solo no contiene nada ms que agua destilada y agar. Los minerales de los otros tres medios incluye fosfato de amonio (NH4H2PO4), cloruro de potasio (KCl) y sulfato de magnesio (MgSO4). La fuente de carbono orgnico empleada en los ltimos dos medios es la azcar glucosa, y la fuente de nitrgeno orgnico empleada es una peptona bacteriolgica. e) Haga las observaciones y dibuje los resultados. CUESTIONARIO: 1. Qu interpretaciones puede hacer respecto a las habilidades de los distintos organismos para proliferar en los distintos medios usados?
2. Qu necesidades nutricionales en trminos de sustancias qumicas son necesarias para el desarrollo y buen funcionamiento de cualquier forma de vida?
3. Defina a los dos tipos de bacterias de acuerdo a su nutricin: fototrofos y quimiotrofos.
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4. Mencione necesidades vitamnicas de algunas bacterias.
5. Mencione necesidades heterotrficas.
nutricionales
mnimas
de
algunas
bacterias
6. Mencione caractersticas y valor nutritivo de varios materiales que se usan como ingredientes en los medios de cultivo: extracto de carne, peptona, agar y extracto de levadura.
7. Cul es la diferencia entre las bacterias fototrficas y las quimiotrficas? Y entre las autotrficas y las heterotrficas?
8. Exponga los fundamentos para clasificar los microorganismos en funcin de sus necesidades de energa, hidrgeno y electrones.
9. Comprese el espectro de necesidades nutricionales de las bacterias con las necesidades nutricionales de las plantas verdes y animales.
10. Cules son las ventajas inherentes en el uso de medios de cultivo sintticos? Cules son las desventajas?
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Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA DATOS: Placa 1. Slo Agar. Sector 1: Escherichia coli Sector 2: Sector 3: Sector 4. Staphylococcus aureus Saccharomyces cerevisiae Testigo.
Placa 2. Agar + minerales. Sector 1: Escherichia coli Sector 2: Sector 3: Sector 4. Staphylococcus aureus Saccharomyces cerevisiae Testigo.
Placa 3. Agar + minerales + fuentes de carbono orgnico. Sector 1: Escherichia coli Sector 2: Sector 3: Sector 4. Staphylococcus aureus Saccharomyces cerevisiae Testigo.
Placa 4. Agar + minerales + fuente de carbono orgnico + fuente de nitrgeno orgnico. Sector 1: Escherichia coli Sector 2: Sector 3: Sector 4. Staphylococcus aureus Saccharomyces cerevisiae Testigo.
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Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA COMENTARIOS Y CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFIA: Bradshaw L. J. (2000). Microbiologa del Laboratorio. Editorial El Manual Moderno. Mxico, D.F. Pelczar M. J.; Reid Roger; Chan ECS. (1997). Microbiologa. McGraw Hill. 4. Edicin en espaol. Mxico, D.F. Prescott L. M., Harley J. P., Klein D. A. (2004). Microbiologa. 5. Edicin. Editorial Mc. Graw Hill-Interamericana. Espaa. Dulbecco R., Davis B., Eisen H., Ginsberg H., Wood B., McCarty Maclyn. (2000) Tratado de Microbiologa. 4a. Edicin. Editorial Salvat Editores S.A. Barcelona, Espaa. Jawetz E., Melnick Joseph (1990). Manual de Microbiologa Mdica. Editorial El Manual Moderno. Schaechter, Medoff, Eisenstein, Guerra (1992). Microbiologa: Mecanismos de las Enfermedades Infecciosas. Editorial Interamericana.
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Prctica No. 20 DIFERENCIAS METABOLICAS EN LAS BACTERIAS
NB-2
OBJETIVO: Identificar y clasificar bacterias (gnero y especie) por medio de una serie de pruebas bioqumicas o diferencias metablicas. FUNDAMENTO: Es corriente aadir a medios de cultivo carbohidratos y compuestos de naturaleza anloga, con dos fines importantes: servir de fuentes de energa directamente disponibles, y ayudar en la identificacin y clasificacin de bacterias. Los carbohidratos se pueden aprovechar ms fcilmente que las protenas como fuentes de energa. Esto significa que el ritmo de multiplicacin de un microorganismo suele aumentar en presencia de un carbohidrato fermentable. Es muy variable la capacidad de los microbios para fermentar diversos carbohidratos. Algunas bacterias pueden atacar muchos carbohidratos; otras no pueden fermentar ninguno. Entre estos grados existen todos los intermedios. Hay grmenes que fermentan carbohidratos y producen cidos y gases, otros solo dan cido. Estos datos son muy valiosos para identificar microorganismos. La capacidad de un microorganismo para fermentar un determinado carbohidrato se puede determinar incorporando la sustancia con un indicador adecuado a un medio lquido o slido. Se reconoce la reproduccin de gas colocando una ampolleta invertida en el medio, para recoger el que se desprenda. MATERIAL: 1. Tubos de fermentacin (campana de Durham) con 5 ml de cada uno de los siguientes medios: - Glucosa-rojo de fenol. - Sacarosa-rojo de fenol. - Lactosa-rojo de fenol. - Arabinosa-rojo de fenol. - Salicina-rojo de fenol. - Maltosa-rojo de fenol. - Manitol-rojo de fenol. 2. Asa de inoculacin. 3. Mechero Fischer. 4. Cultivo de 24 horas de Escherichia coli y Staphylococcus aureus. PROCEDIMIENTO: a) Tomar con el asa una parte de cada uno de los cultivos mencionados y depositarlos en todos los tubos. b) Incubar por 24 horas a 37 C y leer. c) Hacer observaciones a las 24 y 48 horas de incubacin. Determinar si hay crecimiento, cambios en el color del indicador y produccin de gas en la campana de Dirham. d) Anotar los resultados y haga los dibujos de los tubos.
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CUESTIONARIO: 1. Cules son las rutas bioqumicas de obtencin de energa de las bacterias respiradoras aerobias, las de respiracin anaerobia, las fermentadoras y las anaerobias estrictas? Cul de stas es ms eficiente? Por qu?
2. Explique porqu los tubos de fermentacin de azcares deben evaluarse a las 24 y 48 horas? Qu resultados se observaran en los tubos en el caso de que un microorganismo metabolizara oxidativamente la glucosa?
3. Como se detecta la utilizacin de un carbohidrato en los tubos de fermentacin?
4. Qu finalidad tiene utilizar un indicador de pH y la probeta invertida en los tubos de fermentacin?
5. Por lo general se utiliza rojo de fenol como indicador. Cul es el pH al que este indicador cambia de viraje hacia el color cido?
6. Cmo se observan los tubos de fermentacin con rojo de fenol como indicador en caso de que la prueba sea positiva y gas?
7. Qu es una fermentacin y una oxidacin? Diferencias entre ambas?
8. Describa de forma general como se emplean pruebas bioqumicas en el API20E para identificar bacterias.
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BIBLIOGRAFIA: Bradshaw L. J. (2000). Microbiologa del Laboratorio. Editorial El Manual Moderno. Mxico, D.F. Mac Faddin J. F. (2000). Pruebas Bioqumicas para la Identificacin de Bacterias de Importancia Clnica. 3. Edicin. Editorial Mdica Panamericana. Mxico, D.F. Practical Handbook of Microbiology. William OLeary. Cornell Medical College. New York, USA. CRC Press. 1989. Bergeys Manual of Determinative Bacteriology. 9th. Edition. The Williams and Wilkins Co.,Baltimore, USA. Joklik Wolfang, Willet Hilda, Amos Bernard. (1996). Microbiologa de Zinsser. 20. Edicin. Editorial Mdica Panamericana. Buenos Aires, Argentina. Koneman Elmer, Allen Stephen, Dowell V. R., Sommers Herbert. (1996). Atlas de Diagnstico Microbiolgico. Editorial Interamericana. Mxico. Prescott L. M., Harley J. P., Klein D. A. (2004). Microbiologa. 5. Edicin. Editorial Mc. Graw Hill-Interamericana. Espaa. Hernndez Mndez, J.T; Cano Ramos E; Giono Cerezo S; Aparicio Ozores G. (2003). Bacteriologa Mdica Diagnstica. Ediciones Cuellar. 2. Edicin.IPN. Mxico. Escobar Gutirrez A., Giono Cerezo S. (1995). Manual de Tcnicas de laboratorio. Volumen I. INDRE, Secretara de Salud. Mxico, D.F.
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Prctica No. 21
DB-1
EFECTOS DE LOS AGENTES ENZIMATICOS SOBRE LAS BACTERIAS OBJETIVO: El estudiante ser capaz de observar el efecto de la lisozima sobre las bacterias (Escherichia coli y Bacillus subtilis). FUNDAMENTO: La lisozima es una enzima presente en la mucosa nasal, capaz de disolver bacterias. Existe en la clara de huevo, de la cual puede aislarse y cristalizarse sin dificultad. Se cree que constituye uno de los mecanismos de defensa. Welshimer y Robinow (1949) sometieron primeramente una cepa de Bacilus megaterium sensible a la lisozima a la accin de formol al 2%. Las clulas muertas, expuestas a los lisozimas durante 5 minutos, fijadas luego en lquido de Bouin y teidas con azul Victoria 4R, mostraron un evidente aumento de intensidad de coloracin en el citoplasma. Tras una exposicin de 60 minutos a la lisozima, las clulas tomaron una dbil tonalidad, y solo pudieron observarse con ayuda de un filtro de contraste adecuado. El nmero de bacilos apreciable fue sumamente reducido, y el aspecto de las clulas era de fragilidad. Grula y Hartsell (1954) trataron con lisozima clulas de Micrococcus lysodeikticus, e informaron que la lisis se deba a destruccin enzimtica de la pared celular. Los resultados finales dependan del poder inico del medio suspensivo. Despus de actuar la lisozima, el protoplasto revent inmediatamente en agua destilada, mientras solamente se observaron mas bien opacidades en un medio cuya presin osmtica era igual o similar a la de una solucin de cloruro sdico (sal comn) al 0,85%. Grnulos intracelulares densos y muy opacos no fueron destruidos por la lisozima, aunque las clulas dejaron en libertad acido desoxirribonucleico, que hizo an ms intensa la viscosidad de la suspensin disuelta. MATERIAL: 1. 2 tubos con suspensiones de Escherichia coli. 2. 2 tubos con suspensiones de B. subtilis ( Micrococcus lysodeickticus). 3. Matraz con albmina de huevo al 10% en solucin salina. PROCEDIMIENTO: a) Tomar los dos tubos con suspensiones de E. coli y marcar uno como problema y otro como testigo. Aadir 4 o 5 gotas de albmina de huevo al tubo marcado como problema y al tubo testigo agregar la misma cantidad de solucin salina e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. b) Tomar lo mismo con los tubos con suspensiones de B. subtilis ( Micrococcus lysodeickticus). c) Hacer frotis, teir con Gram y observar al microscopio.
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CUESTIONARIO: 1. Explique porqu es muy improbable que un solo agente qumico sea el mejor para todas las situaciones en que se necesita control de la poblacin microbiana.
2. Seale las principales condiciones que influyen sobre la actividad de los agentes qumicos.
3. Mencione ejemplos concretos de mecanismos por medio de los cuales los agentes qumicos inhiben o matan microbios.
4. Defina la expresin accin oligodinmica. Cmo se puede demostrar en el laboratorio?
5. Compare la capacidad germicidad del fenol, los preparados a base de yodo, de cloro.
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BIBLIOGRAFIA: Bradshaw L. J. (2000). Microbiologa del Laboratorio. Editorial El Manual Moderno. Mxico, D.F. Pelczar M. J.; Reid Roger; Chan ECS. (1997). Microbiologa. McGraw Hill. 4. Edicin en espaol. Mxico, D.F. Joklik Wolfang, Willet Hilda, Amos Bernard. (1996). Microbiologa de Zinsser. 20. Edicin. Editorial Mdica Panamericana. Buenos Aires, Argentina. Koneman Elmer, Allen Stephen, Dowell V.R., Sommers Herbert. (1996). Atlas de Diagnstico Microbiolgico. Editorial Interamericana. Mxico.
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Prctica No. 22
DB-2
EFECTOS DEL CALOR Y pH EN LA SUPERVIVENCIA DE LAS BACTERIAS OBJETIVO: El alumno observar la destruccin de las clulas por el calor. FUNDAMENTO: Cada microorganismo tiene una temperatura mxima, otra mnima y otra ptima para su desenvolvimiento. Estas temperaturas varan al cambiar las condiciones del ambiente, de modo que los valores tienen validez solo si se especifican las condiciones experimentales. Temperatura mxima de desarrollo.- Esta temperatura mxima se puede definir como la ms alta compatible con el crecimiento y la reproduccin, si los dems factores del medio se mantienen constantes. Temperatura ptima de desarrollo.- Es la ms favorable para la actividad vegetativa. Para los organismos psicrfilos no llegan a vivir a 20 grados centgrados; estos microorganismos se encuentran en aguas fras de lagos y manantiales, y en aguas salinas conservadas a bajas temperaturas. Temperatura mnima de desarrollo.- La temperatura mnima es la ms baja compatible con el crecimiento y la multiplicacin, y tambin vara cuando se altera uno o ms factores ambientales. Zonas de temperaturas de desarrollo.- Esta zona es la de los grados comprendidos entre las temperaturas mnima y mxima de desarrollo; para unos grmenes es muy estrecha, y muy amplia para otros. Zona trmica letal.- El punto trmico letal puede definirse como la temperatura que, aplicada a un microorganismo durante 10 minutos, bajo ciertas condiciones reguladas, causa su muerte. Como los microorganismos sujetos a condiciones desfavorables no mueren en este lapso, parece ms apropiado hablar de zona trmica letal. Humedad del medio.- La muerte de bacterias por calor se atribuye a coagulacin de protenas del protoplasma. Dentro de ciertos lmites, a una mayor proporcin de agua en un medio corresponde una temperatura bactericida ms baja; el calor hmedo es ms eficaz que el seco para esterilizar. Concentracin de hidrogeniones del medio.- El pH del medio ambiente tiene un importante influjo sobre el nmero de supervivientes. La mayora de los microorganismos que se destruyen con ms facilidad en soluciones cidas o alcalinas corresponde una zona trmica letal ms baja. Los grmenes acidorresistentes constituyen la excepcin, pues sobreviven al calor durante lapsos que bastaran para matar las clulas calentadas en un medio alcalino. Composicin del medio.- La composicin del medio o sustrato influye mucho en los resultados obtenidos respecto a la zona trmica letal. Los medios que contienen protenas o albuminoides muy concentrados suelen elevar la temperatura necesaria para destruir bacterias, pues estas sustancias forman una pelcula en torno a los grmenes y la protegen contra influencias desfavorables. El nmero de clulas tratadas capaces de desarrollo dependa en alto grado de la composicin del medio empleado para subcultivo.
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Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA Edad de las clulas.- Tambin influye en la zona trmica letal la edad de las clulas. Las viejas son ms resistentes a los factores adversos del medio que las muy jvenes. Para los ensayos deben utilizarse cultivos de 24 horas. Presencia o ausencia de esporas.- Las bacterias no esporgenas y las formas vegetativas de las esporgenas son generalmente destruidas por el calor hmedo a temperaturas de 60 a 70 C; las esporas resisten hasta 100 C o ms. Las esporas o clulas vegetativas de distintas especies, o de distinta cepa de la misma especie, muestran sealadas diferencias en su resistencia trmica. MATERIAL: 1. 1 tubo de caldo nutritivo con suspensin de Staphylococcus aureus. 2. 1 tubo de caldo nutritivo con una suspensin de Bacilus subtilis. 3. Pipetas pasteur de 1 ml. estriles. 4. 10 tubos de hemlisis estriles de 13 X 100 mm. 5. 2 cajas de Petri con gelosa nutritiva. 6. Termmetro. PROCEDIMIENTO: a) Coloque 1 ml. (30 gotas) de la suspensin de Bacilus subtilis, en un tubo procurando que no toque la pared. Marque los tubos perfectamente y calintelos en bao mara (el nivel de agua debe estar un poco por encima del nivel del caldo en el tubo) de la siguiente forma: Tubo 1 50C por 5 minutos Tubo 2 61C por 10 minutos. Tubo 3 61C por 30 minutos. Tubo 4 100C por 10 minutos. Tubo 5 121C por 15 minutos Tubo 6 Control (NO CALENTAR) Para determinar si los contenidos de los tubos estn a la temperatura deseada, introduzca al bao de agua otro tubo con un volumen de agua de la llave igual al del caldo de los tubos que han sido inoculados. Inserte el termmetro en este tubo con agua de la llave. Cuando el termmetro indique que la temperatura del tubo es la misma que la del bao, todo est listo para iniciar el experimento. Divida una caja de gelosa nutritiva en 6 partes siembre una asada de cada uno de los tubos. Incube por 24 horas a 37 C. b) Haga lo mismo que en el ejercicio anterior pero utilizando la cepa de S. aureus. Reprtelo en cuadro sinptico el cual contenga el crecimiento despus de los calentamientos siguientes mencionados en el enciso a) junto con el control del organismo B. subtilis y S. aureus. EFECTO DE LA CONCENTRACION DE IONES HIDROGENO EN LAS BACTERIAS FINALIDAD Observar el efecto del pH en los microorganismos de Escherichia coli y Saccharomyces cerevisiae.
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FUNDAMENTO: La concentracin de hidrogeniones del cultivo es de primordial importancia para el desarrollo adecuado de bacterias. Algunos microorganismos crecen mejor en medio cido; otros lo requieren alcalino, y algunos tienen predileccin por sustratos neutros. Para cada organismo existe una concentracin ptima de iones hidrgeno, con la que se produce y vegeta en las condiciones ms ventajosas; las concentraciones de iones hidrogeniones por debajo o encima de las cuales cesa el desarrollo de un germen se conoce por valores pH mximo y mnimo respectivamente. Estos valores o ndices son significativos solo cuando los dems factores del medio se mantienen constantes. Si vara la composicin del sustrato, la temperatura de incubacin o la presin osmtica del medio, aunque sea poco, se alteran tambin los valores mnimo, ptimo y mximo del pH para un microorganismo. La amplitud para el valor mnimo y mximo se conoce como margen de pH de un germen determinado, y es grande o pequeo segn las especies. MATERIAL: 1. Cultivos de 24 horas de Escherichia coli y Saccharomyces cerevisiae. 2. Tubos con caldo nutritivo estril ajustadas con HCl 1N y NaOH 1N a valores de pH de 3, 5, 7, 9 y 11(uno de cada uno). 3. Tubos con caldo de extracto de malta ajustados a los mismos valores de pH. PROCEDIMIENTO: a) Inocule cada uno de los tubos de caldo de distintos valores de pH con E. coli. b) Repita el procedimiento pero ahora con los tubos de extracto de malta estril inoclelas todas con S. cerevisiae. c) Incube todos los tubos en su cajn y anote sus observaciones, en trminos de la cantidad de crecimiento, al primero, segundo y quinto da. Emplee la siguiente escala: 4+ para mximo crecimiento, y 0 para nada de crecimiento; clasifique los crecimientos intermedios como 3+, 2+ 1+. CUESTIONARIO: 1. Qu efecto ejerce la variacin en la concentracin de hidrogeniones sobre las bacterias?
2. Cul sera el pH ptimo tanto para Escherichia coli como para Saccharomyces cerevisiae?
3. Comparar la eficacia de los calores seco y hmedo como medios de esterilizacin. Qumico Farmacutico Bilogo Pgina 114
4. Por qu son preferibles las esporas a las clulas vegetativas en los experimentos para determinar el patrn (cintica) de muerte de las bacterias?
5. En qu difiere el trmino muerte usado en microbiologa del aplicado a los organismos superiores?
6. Explique el mecanismo por el cual se produce la muerte de las bacterias con la temperatura.
7. Por qu se establece la esterilizacin a 121C con calor hmedo?
8. Comparar las clulas vegetativas de las bacterias con las esporas bacterianas en relacin con su resistencia al calor.
9. Distinga entre las expresiones punto trmico letal, tiempo trmico letal y tiempo de reduccin decimal.
10. Qu es un autoclave?
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11. Qu significado tiene la presin per se en la efectividad del proceso de esterilizacin con el autoclave para lograr esta operacin?
DATOS: A) EFECTO DEL CALOR EN LA SOBREVIVENCIA DE LAS BACTERIAS Placa de Agar nutritivo inoculada con Staphylococcus aureus 5 minutos 50C 61C 100C 121C Placa de Agar nutritivo inoculada con Bacillus subtilis 5 minutos 50C 61C 100C 121C 10 minutos 15 minutos 30 minutos Testigo 10 minutos 15 minutos 30 minutos Testigo
EFECTO DEL PH EN LOS MICROORGANISMOS Escherichia coli en caldo nutritivo Da 1 2 3 pH 3,0 pH 5,0 pH 7,0 pH 9,0 pH 11,0
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Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA Saccharomyces cerevisiae en caldo de extracto de malta Da 1 2 3 pH 3,0 pH 5,0 pH 7,0 pH 9,0 pH 11,0
COMENTARIOS Y DISCUSIONES
BIBLIOGRAFIA: Bradshaw L. J. (2000). Microbiologa del Laboratorio. Editorial El Manual Moderno. Mxico, D.F. Pelczar M. J.; Reid Roger; Chan ECS. (1997). Microbiologa. McGraw Hill. 4. Edicin en espaol. Mxico, D.F. Joklik Wolfang, Willet Hilda, Amos Bernard. (1996). Microbiologa de Zinsser. 20. Edicin. Editorial Mdica Panamericana. Buenos Aires, Argentina. Koneman Elmer, Allen Stephen, Dowell V. R., Sommers Herbert. (1996). Atlas de Diagnstico Microbiolgico. Editorial Interamericana. Mxico.
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Prctica No. 23 EFECTOS QUIMICOS SOBRE LAS BACTERIAS
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OBJETIVO: a) El estudiante ser capaz de observar el efecto de la materia orgnica sobre los agentes bactericidas. b) Observar el crecimiento de los cultivos y la manera de cmo son afectados por los desinfectantes qumicos. FUNDAMENTO: El fenol (cido fnico) es uno de los ms antiguos desinfectantes qumicos, y se usa en las pruebas estndar de determinacin de la actividad bactericida de otros compuestos. Se obtuvo junto con otras muchas sustancias aromticas (de estructura en anillo) del coaltar (carbn de brea), por lo que el fenol y otros desinfectantes qumicamente afines se incluyeron en un grupo llamado del coaltar. Los desinfectantes de este grupo destruyen las clulas bacterianas vegetativas, incluso en presencia de materia orgnica, pero son menos eficaces contra esporas, hongos y virus. Tambin tienen una accin irritante sobre la piel. Las alteraciones qumicas de la molcula del fenol, por ejemplo, la sustitucin de hidrgenos por grupos metilos sobre el anillo fenlico para formar cresoles, o la sustitucin por cloro para formar clorofenoles, tienden a aumentar su accin desinfectante. El cloruro mercrico se ha utilizado durante muchos aos. A partir de su antigua popularidad tiene muchos inconvenientes, por lo que ha sido sustituido por otros productos. Se trata de un veneno muy potente que es inhibido por la presencia de albmina y corroe los metales. Su accin antibacteriana es neutralizada por compuestos que contengan grupos SH, residentes habituales en los tejidos. Sin embargo los compuestos de mercurio son bacteriostticos en altas diluciones, y debido a su insolubilidad los compuestos inorgnicos, se liberan lentamente cuando se combinan en pomadas o ungentos y, en consecuencia, ejerce su efecto durante tiempo prolongado. MATERIAL: 1. 3 tubos de agua destilada (tubo No.1). 2. 3 tubos con fenol al 1% en agua destilada (tubo No.2). 3. 3 tubos con fenol al 1% en sangre al 10% (tubo No.3). 4. 3 tubos de cloruro mercrico al 0,01% en agua destilada (tubo No.4). 5. 3 tubos de cloruro mercrico al 0,01% en sangre al 10% (tubo No.5) 6. 7 cajas de gelosa nutritiva. 7. Asa de inoculacin. Trabajar en pares y usar cada uno de los cultivos siguientes: Escherichia coli, Bacillus subtilis y Staphylococcus aureus; tomando una asada de estos y colocndola en cada uno de los tubos. Debe asegurarse que el inculo no toque las paredes del tubo, pero suspenda perfectamente en el medio, agite fuertemente y mantenga a la temperatura ambiente durante 10 minutos. PROCEDIMIENTO: a) Con el marcador divida en dos una caja de gelosa nutritiva. En un lado coloque una asada de E. coli del tubo no. 2 y en la otra una asada del tubo no. 3, distribuyndolo perfectamente. Qumico Farmacutico Bilogo Pgina 118
Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA b) Haga lo mismo que en el inciso anterior pero utilice los tubos 4 y 5. c) En otra caja, divdala en 3 partes con su marcador, y siembre una asada de cada uno de los tubos no.1. d) Repita el procedimiento pero ahora con B. subtilis y S. aureus. e) Incube las placas durante 48 horas a 37 C y estime cualitativamente el crecimiento. Haga sus observaciones y dibuje. CUESTIONARIO: 1. Seale las principales condiciones que influyen sobre la actividad de los agentes qumicos.
2. Compare la capacidad germicida del fenol con los otros agentes del tipo fenlico.
3. Cun efectivos son como agentes antimicrobianos los preparados a base de yodo?
4. De ejemplos de la accin inhibidora selectiva de los colorantes sobre los microorganismos.
5. Describa el uso de los colorantes en los medios de cultivo.
6. Explique la expresin detergente catinico.
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Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA 7. Si se determina que un desinfectante tiene un coeficiente fenlico de 3,0. Qu significa esto?
8. Cmo es demostrable la capacidad antimicrobiana de un ungento antisptico?
DATOS:
Escherichia coli 2. 3.
Escherichia coli 4. 5.
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Bacillus subtilis 2. 3.
Bacillus subtilis 4. 5.
Sataphylococcus aureus. 2. 3.
Staphylococcus aureus 4. 5.
1.Escherichia coli. 2.Bacillus subtilis 3.Staphylococcus aureus .
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Prctica No. 24 SENSIBILIDAD A LOS ANTIBIOTICOS
DB-4
OBJETIVO: a) Evaluar, por parte de los estudiantes, la sensibilidad de varios agentes quimioteraputicos antibiticos sobre Staphylococcus aureus. b) Observar y cuantificar la sensibilidad a los antibiticos a travs del halo de inhibicin que se produce alrededor del disco. FUNDAMENTO: Muchas veces al tratar una infeccin, el mdico desea saber no solamente de que organismo se trata, sino tambin que antibitico la combatir eficazmente. Muchos antibiticos pierden su efectividad contra ciertas clases de bacterias (debido a la mutacin bacteriana) y por lo tanto, resulta necesario hacer un anlisis en cada infeccin especfica, usando organismos tomados del rea infectada, contra los cuales se prueba una serie de antibiticos potencialmente efectivos. Incluso cuando se conoce la identidad del organismo infeccioso, es preciso hacer pruebas de susceptibilidad al antibitico debido a que existen muchas cepas resistentes. Los agentes quimioteraputicos, aunque pueden aplicarse tpicamente a las heridas, se administran tambin por va bucal o parenteral para tratamiento especfico de las enfermedades infecciosas. Los frmacos eficaces contra las bacterias se dividen generalmente en dos grupos: los producidos en el laboratorio por alteracin qumica de sustancias orgnicas conocidas, como colorantes y vitaminas, y los obtenidos directamente como productos naturales de bacterias y hongos superiores. Los primeros se denominan quimioteraputicos sintticos, y los segundos antibiticos. Antibiticos.- Aunque es difcil precisar el modo de accin de los antibiticos, si disponemos de algunos datos tiles al respecto. La penicilina obstaculiza la formacin de la pared celular; la estreptomicina afecta ciertas reacciones implicadas con el metabolismo energtico de la clula; el cloramfenicol y las tetraciclinas, como la aureomicina, inhiben la formacin de protenas, aunque tambin afectan otras reacciones bioqumicas. El mtodo del disco es el ms frecuentemente usado. Se emplean bacterias aisladas del paciente o muestras patolgicas, como sangre o pus. Cada disco consta de un pequeo crculo de papel filtro saturado de un antibitico a concentracin previamente elegida, secndolo despus. Los discos pueden adquirirse en las casas productoras de medicamentos. Se presentan en diversos colores indicadores de diferentes antibiticos. (Los discos de penicilina son verdes, y los de aureomicina, amarillos, por ejemplo.). Tienen adems una marca especial que indica la concentracin del antibitico, que puede ser baja, media o alta. Se procede al examen de las placas despus de incubacin adecuada. Se juzga respecto a la accin bacteriosttica por las dimensiones de las zonas alrededor de cada disco en que no se ha producido crecimiento del microorganismo. Si un germen es sensible a un antibitico dado, se producirn halos bien definidos alrededor del disco en bajas concentraciones, mientras que si es resistente, aun en concentraciones elevadas, no se observar la aparicin del halo.
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EJERCICIO A.- SENSIBILIDAD EN PLACA MATERIAL: 1. Cultivo en caldo BHI y Mueller Hinton de Staphylococcus aureus y Escherichia coli respectivamente, en una escala de McFarland de 0,5. 2. 1 caja de Petri con agar Mueller Hinton. 3. Hisopos de algodn estriles. 4. Mechero Fischer. 5. Sensidiscos o discos de papel impregnados con penicilina, ampicilina, tetraciclina y gentamicina. 6. Pinzas. 7. Mechero fischer. PROCEDIMIENTO: a) Prepare dos cajas de petri de agar Mueller Hinton, enfre e inocule cada una con un organismo diferente con un hisopo de algodn estril. b) Rotule las tapas de las cajas segn el organismo inoculado y, con el lpiz de cera, divida los fondos de la caja de petri de plstico en cuatro sectores, uno para cada antibitico. c) Con tcnica asptica, deposite cada uno de los cuatro discos impregnados de antibitico en el sector correspondiente de cada caja de petri. d) Incube las dos cajas durante 24 horas. e) Observar los resultados y haga los dibujos necesarios; escriba sus conclusiones respecto a la efectividad de cada antibitico para combatir cada organismo ensayado. EJERCICIO B.- SENSIBILIDAD EN TUBO MATERIAL: 1. Tubos con 20,000 U/ ml de penicilina. 2. Matraz con caldo tripticasa soya estril. 3. 18 tubos de ensaye estriles de 12 X 75 ml. 4. Pipetas graduadas estriles de 5 ml. y de 1 ml. 5. Agua destilada estril. 6. Mechero fischer. PROCEDIMIENTO: a) Marcar los tubos del 1 al 18. b) Aadir 0,2 ml del antibitico al tubo 1 dando una concentracin final de 1000 mg/ml. c) Colocar 3,5 ml de caldo tripticasa soya estril al tubo 1, en el resto de los tubos colocar 2 ml. d) Mezclar el tubo 1 y transferir 2 ml del tubo 1 al tubo 2 y hacer lo mismo hasta el tubo 17. El tubo 18 sirve como testigo y no recibe antibitico. Descartar 2 ml del tubo 17. e) Comenzando del tubo 1 aadir 0,1 ml de una dilucin 1:1000 de un cultivo de 24 horas de S. aureus a cada uno de los tubos. Agitar fuertemente e incubar a 37 C por 24 horas. f) Observar la ms alta dilucin que no muestra crecimiento. Este es el efecto final bacteriosttico.
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CUESTIONARIO: 1. Defina el trmino antibitico. Son todos los antibiticos tiles como agentes quimioteraputicos? Explquelo.
2. Qu es un antibitico de amplio espectro? Cite tres.
3. Qu importancia tiene el ncleo de la penicilina en la efectividad del antibitico? Describa dos formas en las que difieren las diversas penicilinas. Qu es una penicilina semisinttica?
4. Explique porqu la penicilina es activa solamente en bacterias en desarrollo activo.
5. Defina el trmino concentracin mnima inhibitoria (CMI).
6. Por qu es importante determinar la susceptibilidad de un organismo patgeno a los antibiticos? Cmo se hace?
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Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA 7. Con referencia su modo de accin, explique porqu algunos agentes antimicrobianos son bactericidas y otros bacteriostticos.
8. Cite tres cualidades esenciales de un buen agente antimicrobiano.
DATOS:
Sataphylococcus aureus 1. Penicilina. 2. Ampicilina. 3. Tetraciclina. 4. Gentamicina.
Escherichia coli 1. Penicilina. 2. Ampicilina. 3. Tetraciclina. 4. Gentamicina.
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Prctica No. 25
DB-5
LOS EFECTOS DE LA PRESION OSMOTICA EN LOS MICROORGANISMOS OBJETIVO: El alumno observar los efectos de la presin osmtica en los microorganismos. FUNDAMENTO: El cambio en la presin osmtica es uno de los factores que de continuo amenazan la existencia de los microorganismos en su microambiente. Los microorganismos, en sus mltiples ambientes naturales, constantemente se enfrentan con cambios drsticos en el contenido del agua que constituye su medio. Cuando la concentracin de los solutos alrededor del organismo se vuelve muy elevada en relacin a los solutos dentro del organismo, se produce una condicin adversa de alta presin osmtica, es decir, una solucin de hipertonicidad. Cuando la concentracin del agua es la misma dentro y fuera de la membrana, se establece un estado de equilibrio y se dice que el sistema es isotnico. Un sistema que ocasione el enjuntamiento del citoplasma como resultado de la prdida de agua hacia el ambiente, es hipertnico. Por otro lado, si la concentracin de agua en el interior de la clula es menor que la concentracin de agua en le exterior, el agua tender a fluir hacia el interior. En esta situacin, las clulas se hinchan. Un sistema de este tipo se llama hipotnico. MATERIAL: 1. Un cultivo de 24 horas de Escherichia coli y una suspensin de Saccharomyces cerevisiae. 2. Tubos con caldo nutritivo ajustados a las siguientes concentraciones de glucosa: 0,0%, 5,0%, 10,0% y 25,0% (1 de cada una). 3. Tubos con caldo de extracto de malta ajustada a las siguientes concentraciones de glucosa: 0,0%, 15,0%, 30,0% y 40,0% (1 de cada una). 4. Asa de inoculacin. 5. Mechero fischer. PROCEDIMIENTO: a) Inocule todos sus tubos de caldo nutritivo con E. coli, y los tubos de extracto de malta con S. cerevisiae. b) Incube ambos juegos de probetas en su cajn y observe el crecimiento durante el periodo de una semana. c) Anote sus resultados empleando cualquiera de dos escalas de evaluacin ya descritas. La glucosa es el ingrediente clave de ambos medios empleados, puesto que su concentracin es la nica variable de un tubo a otro. La presin osmtica en cada tubo est en funcin de la concentracin de glucosa en el medio. CUESTIONARIO: 1. En que consiste el trmino presin osmtica?
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2. Supngase que algunas clulas bacterianas estn suspendidas en una solucin que contenga 20% de cloruro de sodio. Qu suceder con las bacterias? Cmo se llama este fenmeno?
3. Supngase que algunas clulas bacterianas estn suspendidas en una solucin que contenga menos del 1%, digamos 0,01% de cloruro de sodio. Qu suceder con las bacterias? Cmo se llama este fenmeno?
4. Defina a las bacterias haloflicas.
5. Trate de explicar la base fisiolgica de la facultad haloflica que poseen algunos microorganismos.
DATOS: Escherichia coli en caldo de nutrientes con glucosa. Da 0% (normal) 5% 10% 25%
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Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA Saccharomyces cerevisiae en caldo de extracto de malta con glucosa Da 0% (normal) 15% 30% 40%
BIBLIOGRAFIA: Prescott L. M., Harley J. P., Klein D. A. (2004). Microbiologa. 5. Edicin. Editorial Mc. Graw Hill-Interamericana. Espaa. Bradshaw L. J. (2000). Microbiologa del Laboratorio. Editorial El Manual Moderno. Mxico, D.F. Pelczar M. J.; Reid Roger; Chan ECS. (1997). Microbiologa. McGraw Hill. 4. Edicin en espaol. Mxico, D.F. Joklik Wolfang, Willet Hilda, Amos Bernard. (1996). Microbiologa de Zinsser. 20. Edicin. Editorial Mdica Panamericana. Buenos Aires, Argentina.
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Prctica No. 26 AGENTES BACTERICIDAS Y BACTERIOSTATICOS
DB-6
OBJETIVO: Determinar la accin de agentes bacteriostticos y bactericidas sobre cultivos de Staphylococcus epidermidis y Bacillus subtillis. FUNDAMENTO: Un Agente Bacteriosttico denota la actividad que, sin destruir forzosamente las bacterias, impide su reproduccin. Churman (1912) observ que los colorantes a ciertas concentraciones no matan a los grmenes sino que mantienen en suspenso sus funciones vitales, de suerte que al aumentar la dilucin de la mezcla de las bacterias y de los colorantes se reanudan el desarrollo de los grmenes. Se di a los colorantes el nombre de agentes bacteriostticos y el de bacteriostasis al fenmeno. Otros agentes germicidas no colorantes, como los compuestos de mercurio y de plata, muestran igual propiedad y se denominan agentes bacteriostticos. Agente bactericida, se dice de cualquier agente que destruya bacterias patgenas o no, pero no siempre sus esporas. En la prctica bactericida es sinnimo de germicida. MATERIAL: 1. 10 cajas de petri estriles. 2. Cultivos de 24 horas, de Bacillus subtilis y Staphylococcus epidermidis. 3. Dos tubos con gelosa nutritiva y cristal violeta, 2 mg por 100 ml. 4. Dos tubos con gelosa nutritiva y cristal violeta 1 mg por 100 ml. 5. Dos tubos con gelosa nutritiva y cristal violeta 0,5 mg por 100 ml. 6. Dos tubos con gelosa nutritiva y azida de sodio 20 mg por 100 ml. 7. Dos tubos con gelosa nutritiva y azida de sodio 10 mg por 100 ml. 8. 10 tubos con gelosa nutritiva y verde de bromocresol 1 mg por 100 ml.
PROCEDIMIENTO: a) Tome por pares un tubo con gelosa nutritiva ms verde de bromocresol y otro con gelosa nutritiva ms el agente a probar. b) Vacelos simultneamente a la placa. Los dos medios debern encontrarse a la mitad de la placa, deje solidificar y mrquelos con una lnea en el lmite de los dos medios. c) Haga lo mismo con los otros cuatro pares de tubos. Cada mitad de la caja divdala y siembre las cepas en cada una de las porciones de manera que quede a la misma distancia del testigo y el problema. d) Incube por 48 horas a 37C. e) Anote resultados. CUESTIONARIO: 1. Establezca diferencias entre los pares de trminos y expresiones siguientes: esterilizacin y desinfeccin; saneamiento y desinfeccin; accin germicida y accin bactericida; sustancias bacteriostticas y sustancias bactericidas. Qumico Farmacutico Bilogo Pgina 131
2. Cules son los dos tipos de compuestos colorantes que tienen especial inters como agentes antimicrobianos?
3. De ejemplos de la accin inhibidora selectiva de los colorantes sobre los microorganismos. Describa el uso de los colorantes en los medios de cultivo. 4. Defina la expresin accin oligodinmica. Cmo se puede demostrar en el laboratorio?
5. Trate de explicar el mecanismo de accin inhibidora de los trifenilmetano sobre los microorganismos.
colorantes del
6. Dentro de la agrupacin de los principales agentes qumicos antimicrobianos, en que categora cae el compuesto azida de sodio ampliamente usado en microbiologa?.
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BIBLIOGRAFIA: Prescott L. M., Harley J. P., Klein D. A. (2004). Microbiologa. 5. Edicin. Editorial Mc. Graw Hill-Interamericana. Espaa. Pelczar M. J.; Reid Roger; Chan ECS. (1997). Microbiologa. McGraw Hill. 4. Edicin en espaol. Mxico, D.F. Joklik Wolfang, Willet Hilda, Amos Bernard. (1996). Microbiologa de Zinsser. 20. Edicin. Editorial Mdica Panamericana. Buenos Aires, Argentina. Dulbecco Renato, Davis Bernard, Eisen Herman, Ginsberg Harold, Wood Barry, McCarty Maclyn. (2000). Tratado de Microbiologa. 4a. Edicin. Editorial Salvat Editores S.A. Barcelona, Espaa. Jawetz E., Melnick Joseph (1990). Manual de Microbiologa Mdica. Editorial El Manual Moderno. Mxico, D.F.
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Prctica No. 27 PRODUCCION DE SULFURO DE HIDROGENO POR LOS MICROORGANISMOS OBJETIVO: El alumno observar la produccin de cido sulfhdrico de un organismo.
EB-1
FUNDAMENTO: La mayor parte de las protenas contienen aminocidos sulfurados. Algunos de los organismos tienen una enzima que desprende el tomo de azufre de stos aminocidos, el cual es luego reducido con hidrgeno (de los sustratos) para formar cido sulfhdrico. Por lo tanto, el azufre funciona como aceptor de hidrgeno en tales casos. Si se desea detectar la capacidad de un organismo para producir cido sulfhdrico es preciso incubarlo en un medio de aminocidos que contenga azufre. El aminocido cistena es el que suele utilizarse en estos casos. El medio que se emplea en el siguiente experimento contiene grandes cantidades de cistena. Puesto que el cido sulfhdrico es un gas, para detectarlo se ha incorporado al medio una prueba qumica especfica para esta sustancia. As, el medio contiene un aditivo, ya sea una sal de plomo o de fierro, que reacciona rpidamente con el cido sulfhdrico para formar el sulfuro insoluble correspondiente (ambos sulfuros son negros), como lo indican las ecuaciones: H2S + FeSO4 H2S + PbSO4 FeS + H2SO4 (negro) PbS + H2SO4 (negro)
MATERIAL: 1. Cultivos de 24 horas de Proteus mirabilis y Escherichia coli. 2. Tubos con peptona-hierro-agar o bin de azcar triple-hierro-agar (TSI). 3. Asa de inoculacin. 4. Mechero Fischer. PROCEDIMIENTO: a) Inocule un tubo de peptona-hierro-agar o de TSI, con Proteus mirabilis y un segundo tubo con E. coli. b) Incube ambos tubos a 37 C por 48 horas y observe cualquier obscurecimiento o ennegrecimiento a lo largo de la lnea de picadura; este ennegrecimiento es evidencia de la presencia de cido sulfhdrico, algunos organismos son ms lentos que otros, extienda sus observaciones por cuatro das antes de concluir que sus resultados son negativos. c) Haga cuadros tubulares de sus observaciones diarias. CUESTIONARIO: 1. Explique brevemente como se lleva a cabo la produccin de sulfuro de hidrgeno en el medio de TSI.
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2. Qu sal de fierro contiene el medio de TSI para formar el sulfuro insoluble correspondiente?
3. Mencione algunos mtodos para detectar la produccin de sulfuro de hidrgeno.
4. Consideras que esta reaccin tiene valor taxonmico?
DATOS: Tubo 1. TSI inoculado con Escherichia coli. Da Observaciones
Tubo 2. TSI inoculado con Proteus mirabilis. Da Observaciones
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BIBLIOGRAFIA: Mac Faddin J. F. (2000). Pruebas Bioqumicas para la Identificacin de Bacterias de Importancia Clnica. Editorial Mdica Panamericana. Mxico, D.F. Bradshaw L. J. (2000). Microbiologa del Laboratorio. Editorial El Manual Moderno. Mxico, D.F. Pelczar M. J.; Reid Roger; Chan ECS. (1997). Microbiologa. McGraw Hill. 4. Edicin en espaol. Mxico, D.F. Koneman Elmer, Allen Stephen, Dowell V. R., Sommers Herbert. (1996). Atlas de Diagnstico Microbiolgico. Editorial Interamericana. Mxico. Hernndez Mndez Jos, Cano Ramos Elsa, Giono Cerezo Silvia, Aparicio Ozores Gerardo. (2003). Bacteriologa Mdica Diagnstica. Ediciones Cullar. IPN. Mxico, D.F.
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Prctica No. 28 DEMOSTRACION DE LA PRODUCCION DE INDOL
EB-2
OBJETIVO: El alumno ser capaz de observar y demostrar la produccin de indol por algunos microorganismos. FUNDAMENTO: Para demostrar que la fermentacin se puede llevar a cabo con otros productos adems de los carbohidratos, se incluye el siguiente experimento. Algunos organismos pueden degradar el aminocido triptfano, formando un producto llamado indol. En el experimento que se ha diseado para detectar este cambio se emplea un medio muy rico en triptfano. Este medio (caldo de triptona) se inocula y luego se le somete a un ensayo qumico para determinar si el indol se ha acumulado en el medio. No todos los organismos pueden convertir la triptona en indol, por lo cual esta reaccin es tambin de valor taxonmico. MATERIAL: 1. Cultivos de Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae. 2. Tubos con caldo de indol o MIO (movilidad-indol-ornitina) estril. 3. Solucin de Kovac. 4. Pipetas pasteur estriles. 5. Asa de inoculacin. 6. Mechero Fischer. PROCEDIMIENTO: a) Inocule un tubo de caldo indol o MIO con E. coli y el otro con K. pneumoniae, incbelos a 37 C por 3 das. b) Una vez completada la incubacin, con gran cuidado, aada, gota a gota suficiente solucin (5 gotas) de reactivo de Kovac hasta formar sobre el medio una capa de 1 cm de grueso, muy suavemente agite el tubo con movimientos rotatorios y djelo en posicin vertical por varios minutos. No agite o sacuda el tubo con fuerza tal que disperse la carga de encima, es preciso mantenerla intacta o por encima del medio. Si el indol esta presente en el medio, la capa de reactivo de Kovac tomara un color rojo cereza. c) Repita el mismo procedimiento con el segundo organismo, escriba sus resultados. CUESTIONARIO: 1. Escriba la reaccin que se lleva a cabo en el caldo indol al degradar el triptfano formando un producto de hidrlisis.
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Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA 2. Por qu se considera a esta reaccin de valor taxonmica?
3. Mencione la preparacin del reactivo de kovac.
4. Cmo reacciona el reactivo de kovac con los productos para dar una reaccin colorida?
DATOS: Tubo 1. Caldo de indol inoculado con Escherichia coli. Tubo 2. Caldo de indol inoculado con K. pneumoniae.
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BIBLIOGRAFIA: Mac Faddin J. F. (2000). Pruebas Bioqumicas para la Identificacin de Bacterias de Importancia Clnica. Editorial Mdica Panamericana. Mxico, D.F. Bradshaw L. J. (2000). Microbiologa del Laboratorio. Editorial El Manual Moderno. Mxico, D.F. Pelczar M. J.; Reid Roger; Chan ECS. (1997). Microbiologa. McGraw Hill. 4. Edicin en espaol. Mxico, D.F. Koneman Elmer, Allen Stephen, Dowell V. R., Sommers Herbert. (1996). Atlas de Diagnstico Microbiolgico. Editorial Interamericana. Mxico. Hernndez Mndez Jos, Cano Ramos Elsa, Giono Cerezo Silvia, Aparicio Ozores Gerardo. (2003). Bacteriologa Mdica Diagnstica. Ediciones Cullar. IPN. Mxico, D.F. Dulbecco Renato, Davis Bernard, Eisen Herman, Ginsberg Harold, Wood Barry, McCarty Maclyn. (2000). Tratado de Microbiologa. 4a. Edicin. Editorial Salvat Editores S.A. Barcelona, Espaa.
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Prctica No. 29 EL PROCEDIMIENTO ROJO DE METILO-VOGUES PROSKAUER
EB-3
OBJETIVO: El alumno ser capaz de conocer el fundamento de la prueba de Rojo de Metilo y Vogues Proskauer. Utilizar la prueba diferencial de RM-VP para distinguir entre gneros de Enterobacterias. FUNDAMENTO: Uno de los experimentos ms interesantes en el campo de la respiracin bacteriana ha originado un ensayo diferencial conocido como el ensayo RM-VP. Las siglas iniciales son por rojo de metilo y vogues proskauer, dos ensayos diferenciales que se usan con el mismo propsito: distinguir entre Escherichia coli y Klebsiella-Enterobacter. En la prueba de rojo de metilo se inoculan ambos organismos pero separadamente, en un medio que contiene una pequea cantidad de carbohidrato capaz de ser fermentado por ambos microorganismos. Debido a que las cepas tpicas de Escherichia coli, fermentan los carbohidratos produciendo una variedad de cidos, se obtiene un pH lo suficientemente bajo para virar el rojo de metilo a su color cido. Las cepas tpicas de Klebsiella-Enterobacter, fermentando los mismos carbohidratos no pueden causar un descenso similar en el pH. Algunos de los productos formados por ejemplo de Enterobacter aerogenes no son cidos, como alcohol etlico y acetilmetil-carbinol. As a partir de las mismas sustancias, E. coli produce una serie de productos predominantemente cidos, mientras que Enterobacter aerogenes termina con una variedad de productos de los cuales solo unos pocos son cidos. Por lo tanto, el cultivo de E. coli vira el rojo de fenol al rojo mientras que Enterobacter aerogenes lo mantiene amarillo alcalino. La segunda parte, la prueba de vogues proskauer, confirma esta diferencia al mostrar que E. coli no forma acetil-metil-carbinol, mientras que las cepas tpicas de Enterobacter aerogenes s lo hacen. Este es un ensayo simple qumico para detectar el acetil-metil-carbinol en el medio. La combinacin de estas dos pruebas confirman la identificacin. Los usos prcticos del conocimiento de la respiracin microbiana se hace patente en la aplicacin de estos ensayos. Una vez que se conocen los productos de la respiracin de dos organismos siempre es posible disear un ensayo diferencial. Cuando el pH es menor de 4,4 el rojo de metilo es rojo; cuando el pH es superior a 6,0 se obtiene el amarillo. MATERIAL: 1. Cultivos de Escherichia coli y Enterobacter aerogenes. 2. Tubos con caldo de RM-VP (4). 3. Indicador Rojo de Metilo. Qumico Farmacutico Bilogo Pgina 140
Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA 4. Solucin de -naftol. 5. Solucin de Hidrxido de Potasio al 40%. 6. Pipetas estriles (2). PROCEDIMIENTO: a. Inocule dos tubos de caldo de RM-VP con E. coli y dos tubos con E. aerogenes. b. Incbelas todas a 37C por 2 das. c. Despus de incubar realice la prueba de rojo de metilo en un tubo de cada organismo, aadiendo 5 gotas de rojo de metilo a cada tubo y anote el color obtenido para E. coli y E. aerogenes. d. Con los otros dos tubos, una de cada organismo, lleve a cabo la prueba de Vogues-Proskauer aadiendo 0,6 ml de solucin de -naftol a cada tubo. Luego adales 0,2 ml de la solucin de hidrxido de potasio. e. Agite y djelas en posicin vertical por 30 minutos. f. Observe si ha aparecido una coloracin rosa o roja, que es prueba positiva de la presencia de acetil-metil-carbinol. CUESTIONARIO: 1. Cul es el fundamento de la prueba de Rojo de metilo y Vogues Proskauer? 2. Para qu se utiliza esta prueba?
3. Explique las bases bioqumicas de la prueba de rojo de metilo que se lleva a cabo por las bacterias al fermentar los carbohidratos.
4. Por qu no debe intentarse interpretar un resultado con el rojo de metilo con menos de 48 horas de incubacin?
5. Cmo se produce acetilmetilcarbinol a partir de la fermentacin de la glucosa en las bacterias que dan prueba positiva para Vogues-Proskauer?
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Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA 6. Cul es el principal producto terminal de la utilizacin del piruvato por los grupos Klebsiella-Enterobacter?
DATOS: Microorganismo Escherichia coli Enterobacter aerogenes

Ensayo del Rojo de Metilo Prueba del Vogues-Proskauer
COMENTARIOS Y DISCUSIONES:
BIBLIOGRAFIA: Mac Faddin J. F. (2000). Pruebas Bioqumicas para la Identificacin de Bacterias de Importancia Clnica. Editorial Mdica Panamericana. Mxico, D.F. Bradshaw L. J. (2000). Microbiologa del Laboratorio. Editorial El Manual Moderno. Mxico, D.F. Joklik Wolfang, Willet Hilda, Amos Bernard. (1996). Microbiologa de Zinsser. 20. Edicin. Editorial Mdica Panamericana. Buenos Aires, Argentina. Koneman Elmer, Allen Stephen, Dowell V. R., Sommers Herbert. (1996). Atlas de Diagnstico Microbiolgico. Editorial Interamericana. Mxico. Prescott L. M., Harley J. P., Klein D. A. (2004). Microbiologa. 5. Edicin. Editorial Mc. Graw Hill-Interamericana. Espaa.
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Prctica No. 30 DETECCION DE LA CATALASA EN LAS BACTERIAS OBJETIVO: El alumno demostrar la presencia de catalasa en las bacterias.
EB-4
FUNDAMENTO: Una enzima que parece estar muy relacionada con la capacidad de un organismo para utilizar el oxgeno es la catalasa. La catalasa, que cataliza la degradacin del agua oxigenada en agua y oxgeno, no se encuentra en los organismos anaerobios ni en ciertas especies que son microaerfilas. Aparentemente, la falta de catalasa en los organismos anaerobios es la causa de que el oxgeno les sea venenoso. Cuando hay oxgeno estos organismos lo emplean como aceptor de hidrgeno para formar agua oxigenada, pero esta no puede ser degradada en agua y oxgeno debido a la falta de catalasa. Por lo tanto, el agua oxigenada se acumula y envenena a los anaerobios. MATERIAL: 1. Cultivos de 24 horas de Staphylococcus aureus y Enterococos (Enterococcus faecalis). 2. Tubos con triptosa-fosfato-agar. (2) 3. Tubos con caldo BHI (2) 4. Solucin de agua oxigenada (0,3%) 5. Cajas de Petri. 6. Pipetas pasteur. PROCEDIMIENTO: a) Prepare dos cajas de Petri con triptosa-fosfato-agar. Inocule en estras para aislar colonias, una de S. aureus y la otra de enterococo. b) Incube ambas cajas a 37 C por 48 horas. Tome una colonia aislada de ambos microorganismos e inocule en caldo BHI. Incbelo a 37C por 24 horas. Cubra la superficie de las cajas con una capa de agua oxigenada y a los caldos de BHI con 5 gotas y observe cuidadosamente para detectar la presencia de la catalasa en los organismos, la cual se manifiesta por la presencia de rastros de pequeas burbujas que parten de las colonias sumergidas en el agua oxigenada. c) Anote sus resultados. CUESTIONARIO: 1. Cul es el gas que se produce en esta reaccin?
2. Escriba la reaccin que se lleva a cabo al contacto del agua oxigenada.
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3. Por qu las bacterias anaerbicas son incapaces de desdoblar el agua oxigenada?
DATOS: Placa 1. Staphylococcus aureus en agar triptosa fosfato con agua oxigenada aadida despus de incubar.
Placa 2. Enterococcus faecalis en agar triptosa fosfato con agua oxigenada despus de incubar. Tubo 1. Staphylococcus aureus en caldo BHI con agua oxigenada despus de incubar. Tubo 2. Streptococcus faecalis en caldo BHI con agua oxigenada despus de incubar. . COMENTARIOS Y CONCLUSIONES:
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BIBLIOGRAFIA: Mac Faddin J. F. (2000). Pruebas Bioqumicas para la Identificacin de Bacterias de Importancia Clnica. Editorial Mdica Panamericana. Mxico, D.F. Bradshaw L. J. (2000). Microbiologa del Laboratorio. Editorial El Manual Moderno. Mxico, D.F. Pelczar M. J.; Reid Roger; Chan ECS. (1997). Microbiologa. McGraw Hill. 4. Edicin en espaol. Mxico, D.F. Joklik Wolfang, Willet Hilda, Amos Bernard. (1996). Microbiologa de Zinsser. 20. Edicin. Editorial Mdica Panamericana. Buenos Aires, Argentina. Koneman Elmer, Allen Stephen, Dowell V. R., Sommers Herbert. (1996). Atlas de Diagnstico Microbiolgico. Editorial Interamericana. Mxico. Hernndez Mndez Jos, Cano Ramos Elsa, Giono Cerezo Silvia, Aparicio Ozores Gerardo. (2003). Bacteriologa Mdica Diagnstica. Ediciones Cullar. IPN. Mxico, D.F.
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Prctica No. 31 PRODUCCION DE HEMOLISINAS
EB-5
OBJETIVO: El alumno diferenciar los tipos de hemolisinas que producen las bacterias en los medios de cultivo con sangre. FUNDAMENTO: El mtodo empleado en este experimento es base de agar sangre o agar soya tripticasa al cual se le ha aadido sangre entera a una concentracin final de 5%. Este medio tan extremadamente rico, propicia el crecimiento de muchos de aquellos microorganismos que, por sus necesidades alimenticias especiales, resulta difcil de cultivar en el laboratorio. Muchos de estos organismos producen exoenzimas con efectos destructivos sobre los glbulos rojos. Tales enzimas se llaman hemolisinas. Algunos microorganismos fabrican hemolisinas que destruyen y decoloran la hemoglobina de los glbulos rojos. Esto se observa en la caja de agar-sangre como reas clarificadas alrededor de las colonias. Otros microbios producen hemolisinas del tipo alfa, que no decoloran la hemoglobina pero la cambian a un color verdoso. MATERIAL: 1. Cultivos de 24 horas de Staphylococcus aureus ( Bacillus subtillis) y Streptococcus pneumoniae ( Streptococcus grupo viridans). 2. Caja petri con agar-sangre de preferencia de carnero. 3. Asa de inoculacin. 4. Mechero Fischer. PROCEDIMIENTO: a) Con un lpiz de cera divida la caja de agar-sangre en dos mitades e inocule en estras para aislar organismos usando la mitad de la placa. Si se est usando cepas patgenas, Staphyloccocus aureus y Streptococcus pneumonie, sea extremadamente cuidadoso al trabajar con ellos. Si emplea la tcnica estril correctamente, no tendr dificultades, pero si es descuidado tendr problemas, si derrama cualquiera de los cultivos, asegrese de cubrir toda la zona con desinfectantes (yodo o cloro) y dejarlo actuar por 30 minutos, mnimo. b) Incube sus cajas a 37C por 48 horas, y vea si ha habido hemlisis. Es conveniente usar un contador de colonias con iluminacin para observar este fenmeno. Escriba sus resultados. CUESTIONARIO: 1. Defina el trmino hemolisinas.
2. Mencione los dos tipos de hemolisinas.
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3. Mencione diferencias entre las estreptolisinas O y S.
4. Cul (es) son los efectos que producen las hemolisinas alfa y beta sobre los glbulos rojos? Cmo se visualiza en el medio?
5. Existe relacin de hemlisis con virulencia de las bacterias patgenas?
6. Por qu en la preparacin del agar sangre se prefiere que sta sea de carnero y no humana?
DATOS:
1.Caja de petri con agar sangre 2.Staphylococcus aureus Organismo Tipo de hemlisis
1.Caja de petri con agar sangre 2. Streptococcus pneumoniae Streptococcus pneumoniae
Staphylococcus aureus
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BIBLIOGRAFIA: Bradshaw L. J. (2000). Microbiologa del Laboratorio. Editorial El Manual Moderno. Mxico, D.F. Pelczar M. J.; Reid Roger; Chan ECS. (1997). Microbiologa. McGraw Hill. 4. Edicin en espaol. Mxico, D.F. Koneman Elmer, Allen Stephen, Dowell V. R., Sommers Herbert. (1996). Atlas de Diagnstico Microbiolgico. Editorial Interamericana. Mxico. Prescott L. M., Harley J.P., Klein D.A. (2004). Microbiologa. 5. Edicin. Editorial Mc. Graw Hill-Interamericana. Espaa. Dulbecco Renato, Davis Bernard, Eisen Herman, Ginsberg Harold, Wood Barry, McCarty Maclyn. (2000). Tratado de Microbiologa. 4a. Edicin. Editorial Salvat Editores S.A. Barcelona, Espaa. Mac Faddin J. F. (2000). Pruebas Bioqumicas para la Identificacin de Bacterias de Importancia Clnica. Editorial Mdica Panamericana. Mxico, D.F.
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Prctica No. 32 REDUCCION DEL AZUL DE METILENO
EB-6
OBJETIVO: Observar el efecto reductor del azul de metileno producido por algunos microorganismos. FUNDAMENTO: En la gran parte de las oxidaciones anaerobias el substrato cede un Hidrgeno. Considrese que el Hidrgeno nunca se desprende en su forma molecular, sino que debe ser capturado por algn compuesto aceptor. Si no hay aceptores de Hidrgeno disponibles, la fermentacin no puede realizarse, por otro lado, si se mantiene un abasto continuo de aceptores de Hidrgeno, el organismo puede respirar continuamente hasta que las condiciones cambien. Una manera muy sencilla de ilustrar este efecto es empleando uno de los varios compuestos coloreados que se decoloran al reducirse (aceptar Hidrgenos), el tornasol y el azul de metileno son dos substancias de esta clase, cualquiera de los compuestos se colorean en el estado de oxidacin, el tornasol tiene color prpura y el azul de metileno, azul. Si estos compuestos son reducidos al aadir H pierden su color. Obsrvese que despus de incubar organismos con los colorantes, los tubos con cultivo pierden su color, indicando que estos lo usan como aceptores de H. MATERIAL: 2. Un recipiente de 500 ml con 250 ml de cultivo fresco de Escherichia coli. 3. Tubos limpios estriles de 20 X 200 mm. 4. Pipetas graduadas estriles de 5 ml. 5. Azul de metileno (Loeffler). 6. Caldo nutritivo estril (15 ml). 7. Muestra de leche en varios estados de fermentacin (1, 2, 3 y 4 das). 8. Pipetas pasteur estriles. PROCEDIMIENTO: a) Prepare tres tubos limpios y en ellas vierta con la pipeta mezclas de cultivo bacteriano y caldo nutritivo estril de tal forma que la primera contenga 6 ml de cultivo bacteriano ms 3 ml de caldo nutritivo estril; la segunda 4,5 ml de cultivo bacteriano ms 4.5 ml de caldo nutritivo y la tercera 3 ml de cultivo bacteriano mas 6 ml de caldo nutritivo estril. b) Mezcle bien cada tubo y aada dos gotas de azul de metileno a cada uno y vuelva a mezclar. c) Ponga los tubos a 37C y obsrvelos a intervalos de 10 minutos para detectar los cambios. No agite las probetas. d) Tome nota del tiempo que le tome a cada probeta. Como experimento opcional adicional, ensaye esta tcnica con varias muestras de leche obtenidas uno, dos, tres y cuatro das antes del experimento.
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CUESTIONARIO: 1. En que consiste la prueba de la reductasa en la leche?
2. Para qu se utiliza la prueba de la reductasa?
3. El azul de metileno es un indicador del potencial de O/R til para la prueba de la reductasa. Cul es el producto que se forma y el color en la transformacin que ocurre entre la oxidacin y la reduccin de este compuesto?
4. Mencione dos limitantes en la prueba de reduccin.
5. Compare la prueba de reduccin con azul de metileno con la cuenta estndar en placa, como mtodos para contar microorganismos en la leche con base a su seguridad, tiempo y equipos necesarios para realizar ambas pruebas.
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DATOS: Tubo 1. 6,0 ml de caldo de cultivo y 3,0 ml de caldo de nutriente estril Tubo 2. 4,5 ml de caldo de cultivo y 4,5 ml de caldo de nutriente estril Tubo 3. 3,0 ml de caldo de cultivo y 6,0 ml de caldo de nutriente estril
BIBLIOGRAFIA: Mac Faddin J. F. (2000). Pruebas Bioqumicas para la Identificacin de Bacterias de Importancia Clnica. Editorial Mdica Panamericana. Mxico, D.F. Prescott L. M., Harley J.P., Klein D. A. (2004). Microbiologa. 5. Edicin. Editorial Mc. Graw Hill-Interamericana. Espaa. Bradshaw L. J. (2000). Microbiologa del Laboratorio. Editorial El Manual Moderno. Mxico, D.F. Joklik Wolfang, Willet Hilda, Amos Bernard. (1996). Microbiologa de Zinsser. 20. Edicin. Editorial Mdica Panamericana. Buenos Aires, Argentina.
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Prctica No. 33 REACCIONES ENZIMATICAS MICROBIANAS
EB-7
OBJETIVO: El alumno realice algunas pruebas bioqumicas en medios de cultivo con sustratos especficos que permitan demostrar actividades metablicas de bacterias y levaduras. Que el alumno comprenda la importancia de las pruebas bioqumicas para la caracterizacin e identificacin de estos microorganismos. FUNDAMENTO: Los microorganismos pueden modificar en alguna medida el medio que lo rodea. Todas las actividades de las clulas estn catalizadas por las enzimas. Podemos medir los productos qumicos finales de algunas de estas reacciones enzimticas o bien detectar la desaparicin de ciertas sustancias en el medio. Lo anterior nos ayuda a identificar y a diferenciar un microorganismo dado entre otros estrechamente relacionados. La capacidad de hidrolizar el almidn depende de la amilasa. Los productos del almidn en contacto con el Yodo producen un color diferente al azul que es caracterstico del almidn en contacto con el yodo. La degradacin de las protenas constituye una reaccin til en la identificacin de especies microbianas. La protena gelatina se obtiene por hidrlisis parcial del colgeno que es un componente del tejido conectivo y de los tendones de los animales. La gelatina proporciona un sustrato til para ensayar las reacciones de las enzimas proteolticas de los microorganismos. La hidrlisis de grasas conduce a un descenso del pH, debido a la formacin de cidos grasos. El cambio de pH se emplea para medir la capacidad de ciertos microorganismos para descomponer las grasas. MATERIAL: 1. Cajas petri estriles. 2. Tubos de cultivo diferentes (Escherichia coli, Bacillus subtilis, proteus vulgaris, Klebsiella spp., Saccharomyces cerevisiae y Pseudomonas aeruginosa). 3. Gradilla. 4. Pipetas de 1 ml estriles. 5. 1 ml de emulsin de aceite de algodn u otros aceites similares. 6. Tubos con agar-almidn.(2) 7. Tubos con agar nutriente para la hidrlisis de casena.(2) 8. Tubos de gelatina nutritiva.(3) 9. Tubos con agar-rojo-neutro.(4) 10. Tubos con 4,5 ml de medio SIM. 11. Tubos con 4,5 ml de medio TSI solidificados en forma inclinada. 12. Tubos con 4,5 ml de Citrato de Simmons en pico de flauta. 13. Tubos con caldo Urea. 14. Solucin de yodo al 0,1 N (puede ser yodo de gram). 15. Perxido de hidrgeno al 30%. 16. Acido tricloroactico al 5%. 17. Leche descremada estril. Qumico Farmacutico Bilogo Pgina 152
Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA 18. Bao de hielo. 19. Asa de inoculacin. 20. Mechero de Fischer. PROCEDIMIENTO: El profesor proporcionar los cultivos puros de Escherichia coli, Bacillus subtilis, proteus vulgaris, Klebsiella spp., Saccharomyces cerevisiae y Pseudomonas aeruginosa (una de ellas se proporcionar como la muestra problema). 1. Hidrlisis del almidn a) Licuar tres tubos de agar-almidn y dejar enfriar hasta 50C. b) Preparar tres cajas con agar-almidn e inocularlas con cultivos de Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae y Cultivo Problema. c) Las estras deben ser cortas y confinarse al rea central de las placas. Procurar que las estras no lleguen al borde de las placas de tal forma que quede una zona control sin inocular para facilitar el contraste al revelar la placa con yodo. d) Incubar a 37C durante 48 horas. e) Determinar la actividad de amilasas en las cajas de agar almidn por el crecimiento y aparicin de zonas claras alrededor de las colonias. Si no es posible observarlas a simple vista, agregar de la solucin de yodo (lugol) unas gotas a cada una de las placas y observar la reaccin diastsica, notando el color que se produce. (Se colorear de azul como indicativo de prueba (+). En un portaobjetos hacer una suspensin en una gota de agua de las colonias obtenidas en cajas de agar almidn y agregar unas gotas de perxido de hidrgeno al 30%. Observar la formacin de burbujas que significa una prueba de catalasa (+). f) Registrar en una tabla. DATOS:
1. Caja de petri con agar almidn. 2. Saccharomyces cerevisiae. Organismo Hidrlisis de almidn Catalasa
1. Caja de petri con agar almidn. 2. Escherichia coli. Escherichia coli Bacillus subtilis
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2. Hidrlisis de la casena a) Licuar tres tubos de agar nutriente y dejar enfriar hasta 45C b) Pipetear 1 ml de leche fresca descremada esterilizada* o deshidratada a cada uno de los tres tubos. Para evitar que el agar se solidifique prematuramente, antes de aadir la leche a la porcin de agar, sta debe ponerse en un bao mara a 45C junto con la porcin de agar antes de pipetear la leche, as tendrn la misma temperatura. Despus de aadir la leche al agar, tape los tubos y mezcle bien las soluciones rotndolas rpidamente entre las palmas. c) Cuando la mezcla est homognea vierta este agar-leche en cada caja petri. Djela solidificar. d) Inocularlas sembrando, por estra corta, cultivos de Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae y Bacillus subtilis. e) Las estras deben hacerse segn lo indica en el punto 1.c. f) Incubar a 37C durante 96 horas. g) Observar la reaccin. Las colonias de microorganismos que hidrolizan la casena se vern rodeadas de una zona clara. Cuando no hay ataque a la casena la opacidad de la placa permanece. h) Registrar en una tabla. *La leche se esteriliza hirvindola por 20 minutos diarios durante tres das consecutivos. No emplee la
autoclave.
DATOS:
1. Caja de petri con agar - leche. 2. Bacillus subtilis. Organismo Hidrlisis de la casena
1. Caja de petri con agar-leche. 2. Escherichia coli. Escherichia coli Bacillus subtilis
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Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA COMENTARIOS Y CONCLUSIONES:
3. Hidrlisis de la gelatina a) Inocular tres tubos de gelatina nutritiva, uno con Proteus vulgaris, Escherichia coli y otro con Bacillus subtilis, para esto tome los organismos con la aguja de inocular e insrtela exactamente en el centro de la gelatina, hasta el fondo del tubo y squela verticalmente sin ampliar ms la lnea de inoculacin. b) Incubar a 37C durante 48 horas, los tubos y un tubo control que contenga gelatina estril. Se puede incubar a temperatura ambiente porque la gelatina se derrite si se mete a la incubadora, lo cual destruira los patrones de licuefaccin. c) Para examinar la hidrlisis, enfriar solo los tubos que fueron incubados en la incubadora en un bao de hielo; el tubo control y los tubos en los que no hubo hidrlisis se solidificarn. La gelatina hidrolizada permanecer liquida. Adicionar a los tubos de gelatina unas gotas de solucin de TCA (cido tricloroactico) al 5%, observar la aparicin de zonas claras o nubosidad en el medio. d) Registrar en una tabla. DATOS: PRUEBA Hidrlisis gelatina Proteus vulgaris de la Escherichia coli Bacillus subtilis
Tubo 1. Escherichia coli en cultivo por picadura en gelatina nutriente Tubo 2. Bacillus subtilis en cultivo por picadura en gelatina nutriente Tubo 3. Proteus vulgaris en cultivo por picadura en gelatina nutriente
4. Rancidez hidroltica a) Poner 0,25 ml de la emulsin de aceite en cada una de las cuatro cajas petri. b) Licuar cuatro tubos de agar rojo-neutro; dejar que enfren hasta 50C y verter en las cajas petri con la emulsin. c) Mezclar con movimiento de 8 el contenido de las cajas petri.
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Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA d) Inocular sembrando por estra en cada placa con los siguientes microorganismos: E. coli, B. subtilis, P. aeruginosa y otro cualquiera mas. e) Incubar a 37C durante 96 horas. f) La hidrlisis de la grasa se podr observar por la formacin de glbulos rojizos bajo las colonias. Esto se debe al descenso del pH por liberacin hidroltica de los cidos grasos de la grasa. El indicador a pH neutro o alcalino es amarillo y rojo a pH en el rango cido. g) Registrar en una tabla. DATOS:
1. Caja de petri con agar rojo neutro. 2. 0,25 ml de emulsin de aceite. 3. Escherichia coli.
1. Caja de petri con agar rojo neutro. 2. 0,25 ml de emulsin de aceite. 3. Bacillus subtilis.
1. Caja de petri con agar rojo neutro. 2. 0,25 ml de emulsin de aceite. 3. Psudomonas aeruginosa.
1. Caja de petri con agar rojo neutro. 2. 0,25 ml de emulsin de aceite. 3. Otra cepa cualquiera.
6. Pruebas del Citrato, TSI, SIM y Caldo Urea. a. Los tubos (3) de caldo urea se inocularn mezclando una asada de cada uno de los microorganismos. b. Los tubos de agar TSI y Citrato se inocularn por estra simple y por picadura hasta el fondo del tubo. c. Los tubos de SIM se inocularn por picadura (con el asa recta). d. Incubar los tubos a 35C durante 48 horas.
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Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA Resultados: A. Reportar los resultados en el siguiente cuadro de acuerdo al siguiente criterio: no hay crecimiento (-), crece poco (+), moderado crecimiento (++), crecimiento abundante (+++), actividad sobre sustratos (+) o negativa (-). B. Investigar los resultados bibliogrficos de cada una de las cepas y compararlos con los obtenidos en la prctica. C. Investigar las reacciones enzimticas y de color realizadas para la evaluacin de actividades metablicas. D. De acuerdo a sus observaciones proponga el nombre de la especie que corresponde a su microorganismo problema.
Resultados de Pruebas de Diferenciacin Bioqumica MEDIO DE CULTIVO Escherichia coli Saccharomyces cerevisiae. CULTIVO PROBLEMA
Agar Almidn:
Crecimiento: Color del medio con el lugol: Hidrlisis del almidn: Prueba de catalasa: Aparicin de burbujas al agregar H2O2. Gelatina Nutritiva: (dibujos)
Crecimiento: Licuefaccin del medio: Formacin de nubosidad al agregar TCA al 5%. Qumico Farmacutico Bilogo Pgina 157
Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA Leche descremada: (Dibujos)
Acido: Alcali: Sin cambio: Reduccin: Peptonizacin: Coagulacin: Gas: Caldo Urea: (Dibujos)
Crecimiento: Color: Hidrlisis de urea: Medio TSI: (Dibujos)
Crecimiento: Cambio de color: Produccin de H2S: Produccin de gas: Fermentacin del azcar: Medio de Citrato de Simmons: (Dibujos) Crecimiento: Cambio de color: Utilizacin Citrato: del
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Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA COMENTARIOS Y CONCLUSIONES:
CUESTIONARIO: 1. Explique porqu se busca la presencia de precipitados de sulfuros en el fondo del tubo de TSI y no en la superficie?
2. Defina el trmino metabolismo bacteriano.
3. Mencione diferencias entre las exotoxinas y las endotoxinas.
4. En que consiste el trmino exoenzimas hidrolticas.
5. Como se lleva a cabo la hidrlisis del almidn en el experimento y como se interpreta el resultado de la hidrlisis?
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Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA 6. Cmo se lleva a cabo la hidrlisis de la casena por las bacterias en cuestin y porqu disminuye la turbidez del medio?
7. Defina los trminos cristaloide, coloide y suspensoides y d ejemplos de ellos.
8. A que se debe la actividad proteoltica de algunas bacterias para realizar la licuefaccin de la gelatina?
9. Trate de explicar el fundamento de la rancidez hidrlitica que realizan algunas bacterias al producir glbulos de grasa de color rojo en el medio de agar rojo neutro.
BIBLIOGRAFIA: Mac Faddin J. F. (2000). Pruebas Bioqumicas para la Identificacin de Bacterias de Importancia Clnica. 3. Edicin. Editorial Mdica Panamericana. Mxico, D.F. Bradshaw L. J. (2000). Microbiologa del Laboratorio. Editorial El Manual Moderno. Mxico, D.F. Practical Handbook of Microbiology. William OLeary. Cornell Medical College. New York, USA. CRC Press. 1989. Bergeys Manual of Determinative Bacteriology. 9th. Edition. The Williams and Wilkins Co.,Baltimore, USA. Joklik Wolfang, Willet Hilda, Amos Bernard. (1996). Microbiologa de Zinsser. 20. Edicin. Editorial Mdica Panamericana. Koneman Elmer, Allen Stephen, Dowell V. R., Sommers Herbert. (1996). Atlas de Diagnstico Microbiolgico. Editorial Interamericana. Mxico. Pgina 160
Prctica No. 34 METODOS DE CUANTIFICACION DE MICROORGANISMOS
CM-1
OBJETIVOS: Que el alumno conozca algunas de las tcnicas de cuantificacin directa e indirecta de microorganismos ms utilizadas. Que compare las ventajas y desventajas de cada una en funcin de la informacin que se obtiene, del tiempo invertido y de los recursos necesarios. INTRODUCCION: Existen diferentes mtodos para cuantificar el nmero o peso (biomasa) de clulas microbianas en un cultivo; los mtodos pueden ser directos e indirectos. Entre los directos se pueden mencionar a la determinacin de peso seco y el recuento de clulas en cmara de Neubauer. La determinacin de peso seco es un mtodo de cuantificacin muy utilizado en cultivos de gran densidad, sobre todo para hongos y levaduras. Como los cultivos se someten a varios procedimientos (filtracin, lavado, secado) pueden causar prdidas importantes de biomasa y errores en la cuantificacin. El mtodo de cuenta directa en cmara tiene la ventaja de ser muy rpido y econmico, aunque no se pueden distinguir las clulas viables y no viables. Se puede calcular el nmero de microorganismos en una muestra a partir del volumen de la cmara y de las diluciones de la muestra que sean necesarias. Sun embargo, tiene el inconveniente de que la observacin y la cuantificacin se dificultan en clulas muy pequeas (1 5 ) o en poblaciones de baja densidad debido al pequeo volumen de muestra que se utiliza (0,1 0,2 mm3). Entre los mtodos indirectos, uno de los ms utilizados es la medicin de la turbidez de los cultivos en un espectrofotmetro, que es relativamente rpida y que se basa en la capacidad de las clulas microbianas de dispersar la luz que incide sobre stas. Como el tamao de las clulas en una poblacin es casi constante, el grado de dispersin es proporcional a la concentracin de clulas presentes pero no se puede diferenciar la turbidez dada pro clulas viables o no viables. La forma de cuantificar clulas viables ms utilizada en Microbiologa, es la de preparare diluciones y cuenta en placa con medios de cultivo especficos para la poblacin en inters. Esta tcnica se basa en la suposicin de que cada bacteria incluida en un medio de agar o en su superficie se multiplicar y producir una colonia visible, en consecuencia el nmero de colonias que se observarn a simple vista ser igual al nmero de clulas viables o unidades formadoras de colonias (UFC) inoculadas en el agar multiplicadas por la dilucin. Esta tcnica aplicada a muestras complejas, dar una estimacin del nmero aproximado del nmero total de microorganismos, dependiendo del medio de cultivo utilizado, ya que no hay un medio y condiciones de incubacin que favorezcan el crecimiento de todos los microorganismos. Qumico Farmacutico Bilogo Pgina 161
Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA Tambin puede presentarse problemas relacionadas con falta de homogeneidad de las diluciones y en la inoculacin de las muestras, por lo que se pueden obtener valores bajos y valores elevados si la toma de las muestras se hacen del fondo del tubo donde se han concentrado por gravedad los microorganismos. MATERIAL: Cajas de petri con Agar Mtodos Estndar. Pipetas graduadas de 1 y 2 ml estriles. Tubos con 9 ml de diluyente 9 (tubos con 9 ml con peptona de gelatina al 0,1% y cloruro de sodio al 0,85%). Matraz erlenmeyer de 125 ml con 99 ml de diluyente 99 (peptona de gelatina al 0,1% y cloruro de sodio al 0,85%). Vasos de precipitados. Espectrofotmetro. Cmara de Neubauer. Pipetas Pasteur estriles. Fenol al 2%. Varillas de vidrio dobladas en L Microscopio compuesto. Safranina. PROCEDIMIENTO: A) El profesor proporcionar un caldo de cultivo de Saccharomyces cerevisiae y Escherichia coli en una concentracin de 0,5 de McFarland. B) El alumno medir la turbidez de los cultivos en un espectrofotmetro; cuantificarn el nmero de clulas totales, por cuenta directa en cmara en Neubauer y determinar el nmero de unidades formadoras de colonias (UFC) por dilucin y siembra en placa. Tcnica Turbidimtrica 1. Encender el aparato y dejar que el instrumento se caliente por 15 minutos. 2. Ajustar el aparato a la longitud de onda de 520 nm. 3. Calibrar el instrumento a 0% de transmitancia con el botn izquierdo. Para leer en la escala, observar la aguja a nivel de los ojos y tomar el dato donde la aguja coincida sobre su reflejo en el espejo. 4. Colocar una celda con medio de cultivo estril como testigo (sin inocular) y calibrar el instrumento a 100%T. 5. Para medir la turbidez de una muestra, vaciarla en otra celda, limpiar perfectamente con papel kleenex y medir el valor de %T. 6. Calcule la absorbancia de la frmula A = -log (%T/100). 7. En caso de disponer de un aparato digital ajustar las mediciones a absorbancia (D.O.). Tcnica de Cuenta Directa en Cmara de Neubauer. 1) Se coloca 1 ml de la muestra en un tubo de ensaye. Cuando se trata de cuantificar muestras muy concentradas (D.O. >1.5) ser necesario preparar diluciones de la misma con diluyente 9. Agregar 0,5 ml de solucin de fenol al 2% y dos gotas de safranina de Gram. Mezclar y dejar en reposo durante 5-10 minutos. 2) Lavar cuidadosamente la cmara de neubauer sin frotar la zona brillante del centro y el cubrehematmetro. Secar con papel kleenex. Colocar el cubreobjetos Qumico Farmacutico Bilogo Pgina 162
Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA sobre la zona central limitada por dos excavaciones laterales, donde se aprecia una zona cuadriculada a simple vista. Homogeneizar perfectamente la muestra en un vrtex, tomar inmediatamente una muestra con una pipeta pasteur de punta fina, y depositar una gota entre la cmara y el cubreobjetos por el borde de la cmara. Dejar que la muestra se distribuya por capilaridad, evitando el exceso que dificultar la evaluacin precisa de la poblacin microbiana. Dejar reposar durante 5 minutos, colocar la cmara en la platina del microscopio y localizar con el objetivo seco dbil (10X) la zona cuadriculada que se muestra en la figura. Localizar el cuadro central grande (C1) que mide 1,0 mm por lado, que se encuentra dividido en 5x5 cuadros pequeos (C2) limitados por triple lnea que miden 0,2 mm por lado. Estos cuadros pequeos a su vez se encuentran divididos en 16 cuadros ms pequeos (C3) de 0,05 mm de lado. Hacer la cuantificacin de las clulas con el objetivo seco fuerte (40X), contando el nmero de clulas que se localicen en el cuadro C1, los cuadros de menor tamao C2 sirven de gua para el cmputo. Se empieza a contar desde de la parte superior de los cuadros C2 y se continua hasta la base. Si las clulas tocan los lmites de los cuadros C2, debern contarse solamente aquellas que toquen la parte superior y el lado derecho del cuadro. Si las clulas tocan la parte inferior o el lado izquierdo no se cuentan. Este mtodo reduce las posibilidades de contar la misma clula dos veces. Cuente hasta cerca de 200 a 250 clulas antes de determinar el nmero de clulas por ml. En el proceso de contar se pueden presentar tres situaciones diferentes, que a continuacin se explican: Si hay de 200 a 250 clulas por cuadro grande (C1), multiplicar directamente X 104 para reportar el nmero de clulas por ml. Con menos de 200 clulas por cuadro grande (C1), ser necesario contar algunos de los cuadros de las esquinas (miden 1x1 mm de lado y divididos en 4x4). De esta manera se cuantificarn ms de 200 clulas. Despus dividir el nmero total de clulas entre el nmero de cuadros empleados y sacar el valor promedio por cuadro grande. Despus multiplicar este valor por 104 para reportar el nmero de clulas por ml. En el caso de que se observen ms de 200 clulas por cuadro grande (C1), se debern contar las clulas de los cuadros de menor tamao (C2) hasta contar cerca de 200 clulas. Dividir este valor entre el nmero de cuadros usados para la cuenta para sacar el valor promedio por cuadro C2. Multiplicar este valor promedio por 25 para obtener el nmero de clulas aproximado en un cuadro grande C1 y despus multiplicar x10 4 para reportar el nmero de clulas por ml. El factor de 104 por el cual se debe multiplicar el nmero de clulas por cuadro grande (C1) es por que este cuadrado contiene un volumen de 0,1 mm 3 (mide 1 mm por lado y la cmara tiene una profundidad de 0,1 mm).
No. Clulas /cuadro C1 (25 cuadros C2) = No. clulas/0,1 mm3 X 104 = No. clulas/ml.
3)
4) 5)
6)
7)
8)
9) En el caso de que el nmero de clulas sea muy grande, la suspensin debe diluirse y se har la correccin como sigue:
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No. clulas/ml. en la muestra diluda X (factor de dilucin) = No. clulas/ml. en la suspensin original.
Tcnica de Dilucin y Siembra en Placa 1. Hacer diluciones decimales del cultivo de 10-5 hasta 10-9 en condiciones estriles como en la figura. Se colocarn en cajas de petri con Agar Mtodos Estndar por duplicado 0,1 ml de las ltimas tres diluciones. 2. Distribuir cuidadosamente el inculo en toda la caja con ayuda de una varilla de vidrio doblada en L previamente esterilizada y enfriada. 3. Dejar absorber el lquido durante 10 minutos. 4. Incubar las placas en forma invertida a 35C durante 24-48 horas para bacterias y de 5-7 das para hongos filamentosos. 5. Hacer la cuenta de colonias de las placas, seleccionando la dilucin donde el nmero de colonias sea entre 30 y 300 colonias. 6. Si la inoculacin fue por duplicado o triplicado, se calcule el promedio de colonias por dilucin y este nmero se multiplicar por el inverso de la dilucin X 10 (por ajuste de volumen inoculado) para obtener el nmero total de unidades formadoras de colonias (UFC)/ml en la muestra original. Resultados: A. Reportar los resultados de cuantificacin de los cultivos aplicando las tcnicas descritas. Indicar los clculos hechos para cada metodologa. B. Recopilar sus resultados en el cuadro incluyendo los de los otros equipos, indicando la muestra analizada por cada equipo. Indicar en cada caso cules fueron las ventajas y desventajas de las metodologas de cuantificacin. DATOS: Cuantificacin de Microorganismos por Tcnicas Directas e Indirectas. MICROORGANISMO Turbidez (D.O.) Escherichia coli Cuenta en cmara Cuenta viable en de Neubauer (No. placa (UFC/ml) clulas totales/ml)
Saccharomyces Cerevisiae
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Cuestionario: 1) Compare el mtodo de dilucin en placa con el mtodo de cuenta directa en cmara de Neubauer para la cuantificacin de microorganismos. En que casos conviene usar cada uno?
2) Explique cules son las ventajas t desventajas del mtodo turbidimtrico de cuantificacin de clulas.
3) Mencione dos aplicaciones concretas en las que se utilicen cada una de las tcnicas de cuantificacin realizadas.
4) Algunos autores sugieren la medicin de actividad biolgica y la determinacin de constituyentes celulares para la cuantificacin de poblaciones microbianas. Comente sus ventajas y desventajas.
Bibliografa: Jhonson T.R. and C.L. Case. (1992). Laboratory Experiments in Microbiology. 3a. Edicin. Cummings Publishing Company, Inc. USA. Wistreich, G.A. y M.D. Lechtman. (1983). Prcticas de Laboratorio en Microbiologa. Editorial Limusa. Mxico. Madigan M.T., J.M. Martinko, J. Parker. (1998). Biologa de los Microorganismos. 8. Edicin. Prentice Hall. Espaa. Prescott L. M., Harley J. P., Klein D. A. (2004). Microbiologa. 5. Edicin. Editorial Mc. Graw Hill-Interamericana. Espaa.
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Prctica No. 35 LA CURVA DE CRECIMIENTO BACTERIANO
CM-2
OBJETIVO: El alumno elaborar un censo de una poblacin bacteriana dada. Que el alumno conozca las fases de una curva de crecimiento en un cultivo en lote de Escherichia coli. Que el alumno aprenda a calcular parmetros cinticos (, t d) caractersticos de las especies bacterianas. FUNDAMENTO: En el sentido usual de la palabra, crecimiento significa aumento en el tamao de un organismo, pero en el mundo de los seres unicelulares, crecimiento significa, simplemente un aumento en el nmero de organismos. En realidad, el medir el crecimiento bacteriano, se est estudiando la dinmica de poblaciones. El siguiente experimento demuestra el procedimiento para hacer un censo de una poblacin bacteriana dada. Es muy difcil obtener resultados exactos de este procedimiento y los conteos individuales difieren mucho entre s, sin embargo, un tcnico experto es capaz de obtener resultados con reproducibilidad sorprendente. La principal causa de error son las mediciones volumtricas. Cuando se transfiere con la pipeta de 1 ml de un cultivo que contiene 1X108 organismos por ml, incluso una diferencia de media gota (alrededor de 0,025 ml.) se amplificar a travs de las mediciones sucesivas hasta resultar en errores enormes. Otra causa de error se debe a la tendencia de las bacterias a agruparse o adherirse en pequeos racimos. MATERIAL: 1. Matraz erlenmeyer con 100 ml de caldo infusin de cerebro y corazn, la cual ha sido inoculada con E. coli 10-12 horas antes, e incubadas a 37 C. 2. Frascos con 99 ml de solucin salina estril y tubos con 9,9 y 9,0 ml de solucin salina estril. 3. Porciones de agar nutritivo. 4. Pipetas estriles de 1 ml. 5. Pipetas estriles de 10 ml. 6. Cajas de petri estriles. 7. Mechero Fischer. 8. Contador de colonias. 9. Espectrmetro y celdas. 10. Potencimetro. PROCEDIMIENTO: Se ha provisto un cultivo de 12 horas de E. coli en infusin de cerebro y corazn para ser usado por toda la clase, que se utilizar como inculo para los cultivos en frascos o matraces erlenmeyer.
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Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA Los estudiantes cuantificarn el crecimiento peridicamente durante 6 horas de incubacin. Se aplicarn los mtodos turbidimtricos y el de diluciones y siembra por vaciado en placa para cuantificar el crecimiento bacteriano. Inoculacin e Incubacin del cultivo 1. Inocular en condiciones estriles un frasco o matraz erlenmeyer de 250 ml con 100 ml de caldo BHI con 10 ml de un cultivo de Escherichia coli. 2. Homogeneizar cuidadosamente agitando el frasco o matraz e inmediatamente tomar una muestra de 5 ml con una pipeta estril y vaciarla en una celda del espectrofotmetro. Esta muestra corresponde al tiempo cero (t=0). De la misma manera se tomarn muestras a las 0,5, 1, 2, 3 y 4 horas. Para el tiempo de incubacin de 6 horas se tomarn 6 ml. 3. Colocar el cultivo en incubadora con agitacin (150 rpm) a 35C. Tratamiento de las Muestras Determinar la turbidez de las muestras en un espectrofotmetro. Leer el valor de la densidad ptica. Ajuste el control de la longitud de onda a 560 nm y ajuste el cero con muestras del caldo de infusin de cerebro y corazn, sin inocular. Todas las lecturas que se tomen debern utilizar la infusin como cero. Luego se grafica la absorcin en funcin del tiempo. En las muestras de diferentes horas (incluir tiempo cero) adems de evaluar la turbidez, se deber poner 1 ml del cultivo en un frasco o matraz erlenmeyer con 99 ml de solucin salina isotnica. Expele el contenido de la pipeta y luego aspire solucin salina del frasco varias veces para lavar bien la pipeta y transferir todos los organismos. Tape bien el matraz y agtelo bien para desbaratar los racimos de bacterias. Esta suspensin bacteriana es una dilucin 1:100 del cultivo original. Ahora transfiera con la pipeta exactamente 0,1 ml de esta dilucin a un tubo con 9,9 ml de agua estril, repitiendo el lavado de la pipeta como en el caso anterior. Despus de tapar la probeta, agtela bien. Esta nueva suspensin es una dilucin 1: 10,000 del cultivo original. Repita el procedimiento transfiriendo 0,1 ml de esta nueva dilucin a otra probeta con 9,9 ml de agua estril, lavando bien la pipeta y agitando la probeta. Esta ltima probeta constituye una dilucin 1: 1000,000 de cultivo original. Ahora transfiera con la pipeta exactamente 1 ml de cada una de las dos ltimas diluciones a las probetas con 9 ml de solucin salina estril y vaciarlas en alcuotas de 1 ml en el agar nutriente previamente rotuladas 1: 100,000 y 1: 10000,000 o 1: 10 5 y 1: 107 , respectivamente. Espere a que solidifique el agar, invirtalas e incbelas a 37 C durante 24-48 horas. Repita el mismo procedimiento a la segunda hora (o a cualquier intervalo). Asegrese de etiquetar correctamente las cajas de petri en trminos de intervalos de tiempo y la dilucin. Despus de incubar cuente las colonias que hayan crecido tanto dentro del agar como en la superficie. Descarte las cajas cuyo nmero de colonias sean mayores de 30. Calcule la poblacin de bacterias por ml de cultivo original multiplicando el numero de Qumico Farmacutico Bilogo Pgina 167
Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA colonias en una caja por el factor de dilucin, por ejemplo, si en una caja la dilucin es de 105 y crecieron 39 colonias entonces el numero de bacterias por ml de cultivo original es igual a 39 *105, es decir 3900,000 bacterias/ml. Grafique sus datos en papel milimtrico (Log del num. Bacterias visibles contra el tiempo en horas). Determine la tasa de crecimiento promedio (k) de la frmula k= (log N -log No)/log 2 (t), donde No = # de UFC al tiempo 0 y N= # de UFC al final del experimento. a) Calcular la tasa de crecimiento especfica () de la frmula = ln2 (k), con este valor determinar el tiempo de generacin de Escherichia coli con la relacin td= ln2/. Resultados de mediciones del crecimiento de Escherichia coli en un cultivo por lote Tiempo de Muestreo (h) 0 0,5 1 2 3 4 6 CUESTIONARIO: 1. Cmo se define el crecimiento en Microbiologa y cules son los eventos a nivel celular que ocurren en cada una de las etapas de crecimiento? Turbidez (D.O.) UFC/ml
2. Un medio de cultivo fresco se inocula con bacterias. Describa la secuencia de fenmenos que suceden.
3. En un cultivo de bacterias que se estn multiplicando activamente, hay algunas clulas viejas? Explicar la causa. Qumico Farmacutico Bilogo Pgina 168
4. Si un medio es inoculado con cultivo de bacterias que contengan 1,000 clulas por mililitro en el momento cero, cuntas generaciones se han formado despus de 10 horas de desarrollo si el cultivo contiene entonces 1 milln de clulas por mililitro?
5. Cabe esperar que el tiempo de generacin sea una caracterstica constante de las especies bacterianas? Explicar por qu.
6. Dibuje la curva tpica del desarrollo y marque las diversas fases. Explique los factores que determinan el principio y el final de cada fase.
7. En que estadio de la curva de desarrollo bacteriano las clulas incrementan notablemente su tamao? Explique el proceso.
8. Cuando los datos apropiados se representan grficamente para obtener la curva de desarrollo bacteriano por qu se obtiene una lnea curva en lugar de una abrupta recta?
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Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA 9. El desarrollo en dos cultivos diferentes de bacterias se determina por medio de la turbidimetra y se observa que es igual en los dos casos. A partir de este resultado se puede concluir que los dos cultivos contienen el mismo nmero de clulas viables? Explique esto.
10. Cmo se define el tiempo de duplicacin? Cmo se relaciona con la tasa de crecimiento especfica ()?
DATOS:
Grupo Diluido 10-5X Diluido 10-7X Nmero promedio de bacterias/ml de cultivo original Promedio de 0 horas la clase Nmero de
100 80 60 40 20 0 1er trim . 2do trim . 3er trim . 4to trim . E te s O te es N orte
Grupo
colonias
Promedio de 1 hora la clase la bacterianas en
Grupo
caja
Promedio de 2 horas la clase de petri
Log del nmero de bacterias
9 8
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viables 7 6 5 4 3 2 1 1 2 3 4 Tiempo (horas) 5
Absorcin A 600 nm.
Tiempo COMENTARIOS Y CONCLUSIONES:
BIBLIOGRAFIA: Prescott L. M., Harley J. P., Klein D. A. (2004). Microbiologa. 5. Edicin. Editorial Mc. Graw Hill-Interamericana. Espaa.
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Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA Joklik Wolfang, Willet Hilda, Amos Bernard. (1996). Microbiologa de Zinsser. 20. Edicin. Editorial Mdica Panamericana. Buenos Aires, Argentina. Dulbecco Renato, Davis Bernard, Eisen Herman, Ginsberg Harold, Wood Barry, McCarty Maclyn. (2000). Tratado de Microbiologa. 4a. Edicin. Editorial Salvat Editores S.A. Barcelona, Espaa. Jawetz E., Melnick Joseph (1990). Manual de Microbiologa Mdica. Editorial El Manual Moderno. Mxico, D.F.
Prctica No. 36 CULTIVOS DE MICROORGANISMOS ANAEROBIOS Qumico Farmacutico Bilogo
MA-1
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Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA OBJETIVO: a) Que el alumno aprenda y sea capaz de preparar cultivos de microorganismos anaerobios por el mtodo de tioglicolato y otros medios anaerobios especiales, excluyendo o eliminando el oxgeno del cultivo. b) Observar a inmersin. FUNDAMENTO: Los microorganismos que usan oxgeno (o aire disuelto en agua) para este objeto, se denominan aerobios. Por el contrario, se llaman anaerobios a los organismos en que el receptor final de hidrgeno es una sustancia distinta al oxgeno. Basndose su relacin con el oxgeno se divide la bacteria en cuatro grupos: 1.- Aerobias obligadas que solo pueden crecer en presencia de oxgeno libre (es decir no cambiando qumicamente). 2.- Aerobias facultativas o anaerobias, que pueden crecer o desarrollar con oxgeno libe o sin l. 3.- Microaerofilias, que necesitan algn oxgeno pero en menor proporcin del que existe habitualmente en la atmsfera. 4.- Anaerobias obligadas, que solo crecen en ausencia de oxgeno libre. Cultivos anaerobios. Se han ideado muchos mtodos diferentes para excluir o eliminar el oxgeno de cultivo puro, con el fin de que se puedan desarrollar las bacterias anaerobias. Algunos requieren la utilizacin de aparatos relativamente costosos, pero permiten la incubacin de gran nmero de cultivos al mismo tiempo. Como ejemplo de estos aparatos, cabe citar la jarra o recipiente anaerbico de Brewer, en el cual una masa caliente de asbesto platinado cataliza la combinacin de oxgeno contenido en el recipiente con hidrgeno para formar agua. Cuando no se dispone de tales aparatos relativamente costosos se pueden utilizar otros ms sencillos de los cuales enumeraremos a continuacin uno de los ms tiles: Tubo de Buchner y placa de rozamiento, tioglicolato y otros medios anaerobios especiales, cultivo de agar (mtodo vibratorio). MATERIAL: 1. Tierra de establos. 2. Agua estril en frascos con 90 y 99 ml. 3. Pipetas graduadas estriles de 1 y 10 ml. 4. Matraces Erlenmeyer. 5. Tubos con tioglicolato. PROCEDIMIENTO: a) Pesar 10 gr de tierra y colocarlas en 90 ml de agua de manera que quede a una dilucin 1:10. Tomar 1 ml de este matraz y colocarlo a 99 ml de agua. Tomar de este 10 ml y pasarlo a 90 ml de agua. Repetir este ltimo paso. b) De esta ltima dilucin tomar 1 ml y colocarlo en un tubo con tioglicolato, calentar en bao Mara a ebullicin e incubar a 37 C durante 48 horas. Terminado el periodo de incubacin hacer frotis y teir con Gram. c) Observar a inmersin. Hacer esquemas. CUESTIONARIO: 1. Defina a las bacterias anaerobias estrictas.
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2. Cmo se puede obtener un ambiente de anaerobiosis? Seale algunos mtodos.
3. Cmo acta el medio de tioglicolato para disminuir el contenido de oxgeno?
4. Cmo funciona el sistema de anaerobiosis Gaspak?
5. Mencione 5 gneros anaerobios formadores de cocos grampositivos.
6. Mencione 5 gneros anaerobios formadores de cocos gramnegativos.
DATOS:
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Observacin de la tincin de Gram
BIBLIOGRAFIA: Bradshaw L. J. (2000). Microbiologa del Laboratorio. Editorial El Manual Moderno. Mxico, D.F. Pelczar M. J.; Reid Roger; Chan ECS. (1997). Microbiologa. McGraw Hill. 4. Edicin en espaol. Mxico, D.F. Joklik Wolfang, Willet Hilda, Amos Bernard. (1996). Microbiologa de Zinsser. 20. Edicin. Editorial Mdica Panamericana. Buenos Aires, Argentina. Koneman Elmer, Allen Stephen, Dowell V. R., Sommers Herbert. (1996). Atlas de Diagnstico Microbiolgico. Editorial Interamericana. Mxico. Hernndez Mndez Jos, Cano Ramos Elsa, Giono Cerezo Silvia, Aparicio Ozores Gerardo. (2003). Bacteriologa Mdica Diagnstica. Ediciones Cullar. IPN. Mxico, D.F. MA-2 METODO PARA OBTENER CULTIVOS PUROS
Prctica No. 37
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Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA OBJETIVO: Que el alumno aprenda la preparacin y obtencin de cultivos puros por los distintos mtodos existentes, ya que son muy importantes para cuando se requiere un estudio intensivo de un germen, identificacin del mismo y para la mayor parte de trabajos experimentales. FUNDAMENTO: Cultivo puro es aquel que contiene una sola especie de microorganismos. El mtodo mas frecuente usado para obtener un cultivo puro, consiste en transferir un microorganismo de una colonia aislada de una placa de cultivo puro a un tubo que contenga un cultivo estril. Se llama a esta maniobra pesca de una colonia. Un cultivo mixto consiste en la vegetacin conjunta de una o varias especies distintas a microorganismos en un medio nutritivo. Estudio de cultivos puros de bacterias. Esta expresin se entiende aqu limitada al examen de cultivos bacterianos puros con objeto de determinar sus caractersticas e identidad. Comprende mtodos para aislamiento y conservacin de diversas clases de bacterias; examen microscpico de especies puras, teidas o no, determinacin de caracteres morfolgicos, vegetativos y fisiolgicos, incubaciones a animales y estructuras antignicas. Mtodo de la placa estriada. Se funde en agua hirviendo o en un esterilizador (cuando llegue a 15 libras se apaga el esterilizador) dos tubos de agar nutritivo y se deja enfriar hasta unos 50 C. Es importante que se enfre el agar antes de verterlo, a fin de reducir la evaporacin, de otro modo podra humedecerse en la superficie, con peligro de confluencia de las colonias. METODO DE LA ESTRIA MATERIAL: 1. Cultivo de Escherichia coli y Staphylococcus epidermidis. 2. 2 cajas de Petri conteniendo gelosa sangre. 3. 2 cajas de Petri conteniendo Gelosa Chocolate. 4. Asa de inoculacin. 5. Mechero de fischer. PROCEDIMIENTO: a) Descargar una asada del cultivo cerca de la periferia de la placa. b) Con el asa extender el inculo descargando sobre la porcin de la placa. c) Esterilizar el asa y extender nuevamente repitiendo el proceso hasta terminar en la porcin central. METODO DE VACIADO EN PLACA MATERIAL: 1. 10 tubos de ensaye con solucin salina (0,85%); dos con 10 ml, los otros 8 con 9,0 ml. 2. Pipetas graduadas estriles de 1ml. 3. 3 tubos con 15 ml de eosina y azul de metileno (EMB). 4. 3 tubos con 15 ml de Gelosa Nutritiva Agar Mtodo Estndar. 5. 12 cajas de Petri estriles. 6. Cultivos de Escherichia coli y de Staphylococcus epidermidis. 7. Asa de inoculacin. 8. Mechero Fischer. Qumico Farmacutico Bilogo Pgina 176
PROCEDIMIENTO: a) Tomar una asada del cultivo de E. coli y descargarla en el tubo que contiene 10 ml de solucin salina, pasar 1 ml de este tubo a un tubo con 9 ml y de este al siguiente hasta terminar el quinto. b) De las tres ltimas diluciones, tomar 1 ml de cada una de las colonias y colocarlas en las placas estriles rotulndolas con la dilucin correspondiente, enseguida vaciar el tubo con EMB fundidos y enfriados a 45 C, agitando perfectamente. Dejar solidificarse, incubar por 24 horas a 37 C y contar el nmero de colonias desarrolladas. c) Repetir el procedimiento anterior utilizando S. epidermidis pero en lugar de EMB utilizar la gelosa nutritiva. Hacer esquemas. CUESTIONARIO: 1. Diferencia de significado de los trminos cultivo puro, cultivo axnico y cultivo mixto.
2. Compare varias de las diferentes tcnicas para aislar microorganismos en cultivo puro.
3. Supngase que un cultivo puro se aisl con una tcnica aceptable. Qu se tendr que hacer para determinar que lo que se aisl es verdaderamente un cultivo puro?
4. Por qu se han establecido organizaciones para mantener microorganismos en cultivo puro, por ejemplo ATCC?
5. Mencione varias razones de porqu algunas compaas de productos biolgicos industriales conservan grandes colecciones de cultivo.
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6. Qu tcnicas se usan para preservar microorganismos en cultivo puro? Cules son las ventajas de cada mtodo?
7. Qu aspectos distintivos se deben observar para establecer las caractersticas coloniales de una especie?
8. Cul ser el aspecto del desarrollo en un tubo de caldo nutritivo que se sembr con microorganismos: a) aerobios estrictos, b) anaerobios facultativos, c) anaerobios estrictos?
DATOS:
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1. Escherichia coli. 2. Mtodo de Estra. 3. Agar sangre.
1. Escherichia coli. 2.Mtodo de Estra. 3. Agar chocolate.
1. Staphylococcus epidermidis 2. Mtodo de Estra. 3. Agar sangre.
1. Staphylococcus epidermidis. 2.Mtodo de Estra. 3. Agar chocolate.
Dilucin 10-3
10-4 .
10-5
1. Escherichia coli . 2. Mtodo de Vaciado en placa. 3. Agar EMB.
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Dilucin 10-3
10-4 . .
10-5
1. Staphylococcus epidermidis 2. Mtodo de Vaciado en placa. 3. Agar Nutritivo COMENTARIOS Y CONCLUSIONES:
BIBLIOGRAFIA: Bradshaw L. J. (2000). Microbiologa del Laboratorio. Editorial El Manual Moderno. Mxico, D.F. Pelczar M. J.; Reid Roger; Chan ECS. (1997). Microbiologa. McGraw Hill. 4. Edicin en espaol. Mxico, D.F. Joklik Wolfang, Willet Hilda, Amos Bernard. (1996). Microbiologa de Zinsser. 20. Edicin. Editorial Mdica Panamericana. Buenos Aires, Argentina. Koneman Elmer, Allen Stephen, Dowell V. R., Sommers Herbert. (1996). Atlas de Diagnstico Microbiolgico. Editorial Interamericana. Mxico. Hernndez Mndez Jos, Cano Ramos Elsa, Giono Cerezo Silvia, Aparicio Ozores Gerardo. (2003). Bacteriologa Mdica Diagnstica. Ediciones Cullar. IPN. Mxico, D.F. Dulbecco Renato, Davis Bernard, Eisen Herman, Ginsberg Harold, Wood Barry, McCarty Maclyn. (2000). Tratado de Microbiologa. 4a. Edicin. Editorial Salvat Editores S.A. BIBLIOGRAFIA. Bradshaw, L.J. (2000). Microbiologa del Laboratorio. Editorial El Manual Moderno. Mxico, D.F. Pgina 180
Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA Bryan A. H; Bryan Ch. A.; Bryan Ch. G. (1986). Bacteriologa. Principios y Prcticas. Editorial CECSA. 10. Edicin. Mxico. Dulbecco Renato, Davis Bernard, Eisen Herman, Ginsberg Harold, Wood Barry, McCarty Maclyn. (2000). Tratado de Microbiologa. 4a. Edicin. Editorial Salvat Editores S.A. Barcelona, Espaa. Hernndez Mndez, J T; Cano Ramos E; Giono Cerezo S; Aparicio Ozores G. (2003). Bacteriologa Mdica Diagnstica. Ediciones Cuellar. 2. Edicin.IPN. Holt, J.G., N.R. Krieg, P.H.A. Sneath, J.T. Staley and J.T. Williams. (1994). Bergeys Manual of Determinative Bacteriology. 9th. Edition. The Williams and Wilkins Co., Baltimore, USA. Jawetz E., Melnick Joseph (1990). Manual de Microbiologa Mdica. Editorial El Manual Moderno. Joklik Wolfang, Willet Hilda, Amos Bernard. (1996). Microbiologa de Zinsser. 20. Edicin. Editorial Mdica Panamericana. Buenos Aires, Argentina. Jhonson T.R. and C.L. Case. (1992). Laboratory Experiments in Microbiology. 3a. Edicin. Cummings Publishing Company, Inc. USA. Koneman Elmer, Allen Stephen, Dowell V. R., Sommers Herbert. (1996). Atlas de Diagnstico Microbiolgico. Editorial Interamericana. Mxico. Krupp, Jawetz, Tierney (1992). Diagnstico Clnico y de Laboratorio. Editorial El Manual Moderno. Lynch M.J., S.S. Raphael, L. D. Mellor. 1997. Mtodos de Laboratorio. Vol. I y II. Editorial Interamericana. Mxico. Mac Faddin J. F. (2000). Pruebas Bioqumicas para la Identificacin de Bacterias de Importancia Clnica. 3. Edicin. Editorial Mdica Panamericana. Mxico, D.F. Madigan M.T., J.M. Martinko, J. Parker. (1998). Biologa de los Microorganismos. 8. Edicin. Prentice Hall. Espaa. Practical Handbook of Microbiology. (1989). William M OLeary. Cornell Medical College, New York, USA. CRC Press. Pelczar M. J.; Reid Roger; Chan ECS. (1997). Microbiologa. McGraw Hill. 4. Edicin en espaol. Mxico, D.F. Prescott L. M., Harley J. P., Klein D. A. (2004). Microbiologa. 5. Edicin. Editorial Mc. Graw Hill-Interamericana. Espaa. Schaechter, Medoff, Eisenstein, Guerra (1992). Microbiologa: Mecanismos de las Enfermedades Infecciosas.2. Edicin. Editorial Mdica Panamericana. Buenos Aires, Argentina. Snchez Vegas J. T, Tay Zavala J. (2003). Fundamentos de Microbiologa y Parasitologa Mdicas. Mndez Editores. Mxico, D.F. Wistreich, G.A. y M.D. Lechtman. (1983). Prcticas de Laboratorio en Microbiologa. Editorial Limusa. Mxico.
ANEXO I Qumico Farmacutico Bilogo Pgina 181
Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA REACTIVOS EMPLEADOS EN EL MANUAL DE MICROBIOLOGIA 1. ACETONA-ALCOHOL Etanol (96%) 700 ml Acetona 300 ml Mezcle ambos lquidos. 2. ALCOHOL ACIDULADO Acido Clorhdrico (37%) 30 ml Etanol (96%) 970 ml Disuelva el cido clorhdrico en el etanol. 3. SOLUCION DE -NAFTOL -naftol 5g Etanol (96%) 100 ml Disolver el -naftol en el etanol. Agite enrgicamente. 4. ALBUMINA DE HUEVO (1,0%) Disuelva 1 gramo de albmina de huevo liofilizada en 100 ml. De solucin salina fisiolgica. 5. ALBUMINA DE HUEVO (10,0%) Disuelva 10 gramos de albmina de huevo liofilizada en 100 ml. de solucin salina fisiolgica. 6. FENOL AL 1% En un matraz aforado de 100 ml colocar 1 gramo de fenol cristales y disolver con una pequea cantidad de agua poco a poco, despus aforar con agua destilada. 7. FENOL AL 2% En un matraz aforado de 100 ml colocar 2 gramos de fenol cristales y disolver con una pequea cantidad de agua poco a poco, despus aforar con agua destilada. 8. ETANOL 10% Etanol 96% 52 ml Aada suficiente agua destilada para completar un volumen total de 500 ml.
9. ETANOL 40% Etanol 96% 210 ml Agregue suficiente agua destilada para completar un volumen total de 500 ml. Qumico Farmacutico Bilogo Pgina 182
10. ETANOL 70% Etanol 96% 368,4 ml Agregar suficiente agua destilada para completar un volumen final de 500 ml. 11. SOLUCION DE ACIDO CLORHIDRICO ALCOHOL 96% Acido clorhdrico (37%) 83,5 ml Etanol 96% 916,5 ml Disuelva el cido clorhdrico en el etanol. 1,0N
12. ACIDO CLORHIDRICO 0,1N Acido clorhdrico (37%) Q.P. 8,4 ml Disuelva el cido clorhdrico en suficiente agua destilada para hacer el volumen final de 1000 ml. 13. SOLUCION DE KOVAC p-dimetil-aminobenzaldehdo 5g Alcohol amlico butlico 75 ml Acido clorhdrico (37%) Q.P. 25 ml Disuelva el p-dimetil-aminobenzaldehdo en el alcohol. Caliente suavemente la solucin en un bao de agua tibia. Una vez disueltos los ingredientes, agregue el cido clorhdrico con cuidado. 14. SOLUCION AMORTIGUADORA MONOPOTASICO 0,1M Fosfato monopotsico (KH2PO4) 13,6 g Agua destilada 1000 ml Disuelva el fosfato monopotsico en el agua destilada. DE FOSFATO
15. SOLUCION DE HIDROXIDO DE POTASIO PARA EL ENSAYO R.M.-V.P. Hidrxido de potasio 40 g Creatina 0,3 g Agua destilada 100 ml Disuelva el hidrxido de potasio en 75 ml de agua destilada y deje que la solucin se enfre a la temperatura ambiente. Luego aada la creatina, agitando hasta disolver. Agregue el resto del agua destilada. 16. HIDROXIDO DE POTASIO 0,1M Hidrxido de potasio 5,6 g Agua destilada 1000 ml Agregue el hidrxido de potasio en el agua destilada y mezcle bien.
17. SOLUCION SALINA 0,85% Cloruro de sodio 8,5 g Agua destilada 1000 ml Qumico Farmacutico Bilogo Pgina 183
Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA Disuelva la sal en el agua destilada. Esterilice en autoclave a 15 libras de presin por 15 minutos. 18. HIDROXIDO DE SODIO 0,1N Hidrxido de sodio Q.P. 0,4 g Disuelva el hidrxido de sodio en 100 ml de agua destilada. 19. HIDROXIDO DE SODIO 4% 1N Hidrxido de sodio Q.P. 4g Agua destilada 100 ml Disuelva el hidrxido de sodio en el agua destilada. 20. FOSFATO SODICO DIBASICO 0,1M Fosfato sdico dibsico (Na2HPO4) 14,2 g Agregue el fosfato sdico dibsico a un litro de agua destilada. Agite hasta disolver. 21. FOSFATO SODICO MONOBASICO 0,1M Fosfato sdico monobsico (NaH2PO4) 12 g Agregue el fosfato sdico monobsico a un litro de agua destilada. Agite hasta disolver. 22. DILUYENTE 9 y 99 Peptona de Gelatina Cloruro de Sodio Agua Destilada 1 gramo 8.5 gramos. 1000 ml.
En un vaso de precipitados de 2 litros colocar 1000 ml de agua destilada, adicionar la peptona de gelatina y el cloruro de sodio. Ajustar el pH a 7,0. Distribuir en tubos de 16X150 mm con 9 ml para el diluyente 9 y frascos con 99 ml para el diluyente 99. Esterilizar a 121C por 15 minutos.
ANEXO II
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Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA TINCIONES EMPLEADAS EN EL MANUAL 1. TINCION DE ALBERT PARA DIFTERIA Azul de toluidina 0,15 g Verde de metilo 0,20 g Acido actico glacial (99%) Q.P. 1,00 ml Etanol 96% 2,00 ml Agua destilada 100 ml Disuelva el azul de toluidina y el verde de metilo en el agua destilada. Luego aada el cido actico y el etanol. Mezcle bien. 2. CRISTAL VIOLETA 0,5% Cristal violeta 1,25 g Disuelva el cristal violeta en 250 ml de agua destilada. 3. CRISTAL VIOLETA 1,0% Cristal violeta 1,0 g Disuelva el cristal violeta en 100 ml de agua destilada. 4. CRISTAL VIOLETA 1:2,000 Cristal violeta 0,5 g Disuelva el cristal violeta en 1000 ml de agua destilada. 5. NIGROSINA DE DORNER Nigrosina 10,0 g Aada la nigrosina en 100,00 de agua destilada. Hierva durante 30 minutos. Como preservativo, aada 0,5 ml de formaldehido (40%). Filtre, con papel filtro, dos veces y almacnela en condiciones aspticas. 6. CRISTAL VIOLETA DE GRAM Solucin A: Cristal violeta 2,0 g Etanol 96% 20,0 ml Disuelva el cristal violeta en el etanol. Solucin B: Oxalato amnico Q.P. 0,8 g Agua destilada 80,0 ml Disuelva el oxalato amnico en el agua destilada. Despus de preparar las dos soluciones, vierta una en la otra agitando hasta que se mezclen perfectamente. 7. YODO DE GRAM Yodo Q.P. 1,0 g Yoduro de potasio Q.P. 2,0 g Agua destilada 300,00 ml Mezcle en un mortero, el yodo y el yoduro de potasio y mulalos muy finamente. Aada luego una pequea cantidad de agua para lavar el material; agregue el resto del agua. Agite bien.
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Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA 8. SAFRANINA DE GRAM Safranina 0,25 g Etanol 96% 10,00 ml Agua destilada 100,00 ml Disuelva la safranina en el etanol, mezclando bien. Agregue el agua destilada y vuelva a agitar. Filtre la solucin con papel filtro. 9. TINCION LEIFSON PARA FLAGELOS Tincin para flagelos (de venta en el comercio) 1,7 g Etanol 96% 35,0 ml Agua destilada 65,0 ml Disuelva la tincin para flagelos en el etanol. Agregue el agua destilada. Agite la solucin durante 10 minutos para disolver el colorante. Si se mantiene bien tapada, la tincin es estable por dos semanas. 10. AZUL DE METILENO DE LOEFFLER Azul de metileno 0,3 g Etanol 96% 30,0 ml Agua destilada 100,00 ml Disuelva el azul de metileno en el alcohol. Agregue el agua destilada y mezcle bien. Filtre con papel filtro. 11. SOLUCION DE YODO LUGOL Yodo Q.P. 50,0 g Yoduro de potasio Q.P. 100,00 g Agua destilada 1000 ml Agregue el yodo con el yoduro de potasio en un mortero y tritrelo bien finamente. Aada suficiente agua para transferir todo el material a un matraz. Agregue luego el resto del agua destilada y agite hasta mezclar completamente. 12. VERDE DE MALAQUITA AL 5% Verde de malaquita 5,0 g Disuelva el verde de malaquita en 100,00 ml de agua destilada. 13. AZUL DE METILENO 1:10,000 Azul de metileno 0,01 g Disuelva el azul de metileno en 100,00 ml de agua destilada. 14. SOLUCION INDICADORA DE ROJO DE METILO Rojo de metilo 0,1 g Etanol 96% 250,00 ml Agua destilada 250,00 ml Disuelva el rojo de metilo en el etanol. Agregue el agua destilada y mezcle bien. Filtre con papel filtro. 15. SAFRANINA 0,5% Safranina 0,5 g Disuelva la safranina en 100,00 ml de agua destilada.
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Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA 16. NEGRO SUDAN B Negro sudn B 0,3 g Etanol 96% 75,00 ml Disuelva el negro de sudn B en el etanol. Agregue 25,0 ml de agua destilada y mezcle bien. 17. AZUL DE TOLUIDINA 0,1% EN ETANOL 10% Azul de toluidina 0,5 g Prepare una solucin de etanol al 10%, 500 ml en total. Agregue el azul de toluidina y mezcle bien. 18. CARBOLFUCSINA ZIEHL-NEELSEN Fucsina bsica 0,3 g Etanol 96% 10,0 ml Cristales de fenol Q.P. 5,0 g Agua destilada 95,00 ml Disuelva la fucsina bsica en el etanol. En otro recipiente disuelva los cristales de fenol en el agua destilada. Mezcle ambas soluciones y agite bien. 19. AMORTIGUADOR Y TINCION DE WRIGHT Puesto que ambas soluciones son difciles de preparar correctamente, resulta ms conveniente adquirirlas en el comercio. 20. SULFATO DE COBRE AL 20% Sulfato de Cobre 20 g Disuelva el Sulfato de Cobre en 100 ml de agua destilada.
ANEXOS III MEDIOS DE CULTIVO
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AGAR SIMPLE PROCEDIMIENTO: 1. Colocar 15,0 gramos de agar (lavado y purificado) en un matraz erlenmeyer de 2000 ml. 2. Aadir el agar a un litro de agua destilada. 3. Medir el pH inicial. Ajustar el pH a 7,0 4. Calentar el medio con agitacin frecuente y hervir por un minuto hasta disolucin completa. 5. Dejar enfriar hasta los 50C aproximadamente y posteriormente vaciar a frascos de cristal perfectamente limpios de acuerdo al volumen que se necesite. 6. Esterilizar los frascos a una temperatura de 121C por un periodo de 15 minutos. AGAR + MINERALES Ingredientes Agar Fosfato de amonio (NH4H2PO4) Cloruro de potasio (KCl) Sulfato de magnesio (MgSO4) (g/L) 15,0 g. 1,0 g. 1,0 g. 1,0 g.
pH final: 7,0 0,2 PROCEDIMIENTO: 1. 2. 3. 4. Agregar los ingredientes mencionados en un litro de agua destilada. Mezclar perfectamente hasta disolucin de los solutos. Medir el pH inicial. Ajustar el pH a 7,0. Calentar el medio con agitacin frecuente y hervir por un minuto hasta disolucin completa. 5. Dejar enfriar hasta los 50C aproximadamente y posteriormente vaciar a frascos de cristal perfectamente limpios de acuerdo al volumen que se necesite. 6. Esterilizar los frascos a una temperatura de 121C por un periodo de 15 minutos. AGAR + MINERALES + FUENTE DE CARBONO ORGANICO (DEXTROSA) Ingredientes Agar Fosfato de amonio (NH4H2PO4) Cloruro de potasio (KCl) Sulfato de magnesio (MgSO4) Dextrosa (glucosa) (g/L) 15,0 g. 1,0 g. 1,0 g. 1,0 g. 10,0 g.
pH final: 7,0 0,2 PROCEDIMIENTO:
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1. 2. 3. 4. Agregar los ingredientes mencionados en un litro de agua destilada. Mezclar perfectamente hasta disolucin de los solutos. Medir el pH inicial. Ajustar el pH a 7,0. Calentar el medio con agitacin frecuente y hervir por un minuto hasta disolucin completa. 5. Dejar enfriar hasta los 50C aproximadamente y posteriormente vaciar a frascos de cristal perfectamente limpios de acuerdo al volumen que se necesite. 6. Esterilizar los frascos a una temperatura de 121C por un periodo de 15 minutos. 7. AGAR + MINERALES + DEXTROSA + FUENTE DE NITROGENO ORGANICO (PEPTONA) Ingredientes Agar Fosfato de amonio (NH4H2PO4) Cloruro de potasio (KCl) Sulfato de magnesio (MgSO4) Dextrosa (glucosa) Peptona de casena (g/L) 15,0 g. 1,0 g. 1,0 g. 1,0 g. 10,0 g. 10,0 g.
pH final: 7,0 0,2 PROCEDIMIENTO: 8. Agregar los ingredientes mencionados en un litro de agua destilada. 9. Mezclar perfectamente hasta disolucin de los solutos. 10. Medir el pH inicial. Ajustar el pH a 7,0. 11. Calentar el medio con agitacin frecuente y hervir por un minuto hasta disolucin completa. 12. Dejar enfriar hasta los 50C aproximadamente y posteriormente vaciar a frascos de cristal perfectamente limpios de acuerdo al volumen que se necesite. 13. Esterilizar los frascos a una temperatura de 121C por un periodo de 15 minutos. BASE DE AGAR SANGRE
USO: Para el aislamiento, cultivo y actividad hemoltica de grmenes de difcil crecimiento. Ingredientes Agar Cloruro de sodio Infusin de msculo cardiaco Peptona (g/L) 15,0 g. 5,0 g. 10,0 g. 10,0 g.
pH final: 7,3 0,2
PROCEDIMIENTO:
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1. Suspender 40 g. del polvo por cada litro de agua destilada.

2. Mezclar perfectamente hasta disolucin del polvo. 3. Medir el pH inicial. Ajustar el pH al indicado en la libra. 4. Calentar el medio con agitacin frecuente y hervir por un minuto hasta disolucin completa. 5. Dejar enfriar hasta los 50C aproximadamente y posteriormente vaciar a frascos de cristal perfectamente limpios de acuerdo al volumen que se necesite. 6. Esterilizar los frascos a una temperatura de 121C por un periodo de 15 minutos. 7. Dejar enfriar los frascos y posteriormente vaciarlos a cajas petri o tubos de 13 x 100 segn sea requerido. 8. Dejar solidificar las placas, o si se trata de tubos inclinarlos para que solidifiquen y se forme el pico de flauta. A la placa se le rotula las iniciales del medio de cultivo (ABS). Se dejan enfriar hasta solidificacin. 9. Incubar las cajas y/o tubos por 24 hrs. A 37C para realizar la prueba de esterilidad. 10. Sacar las cajas y/o tubos revisar si hubo desarrollo de colonias y si no la hubo, guardarlas en bolsas de plstico a la cual se le pegar una etiqueta y la leyenda PRUEBA DE ESTERILIDAD ACEPTABLE.
AGAR SANGRE USO: Para el aislamiento, cultivo y actividad hemoltica de grmenes de difcil crecimiento. Ingredientes Agar Cloruro de sodio Infusin de msculo cardiaco Peptona (g/L) 15,0 g. 5,0 g. 10,0 g. 10,0 g.
pH final: 7,3 0,2 PROCEDIMIENTO: 1. Suspender 40 g. del polvo por cada litro de agua destilada. 2. Mezclar perfectamente hasta disolucin del polvo. 3. Medir el pH inicial. Ajustar el pH al indicado en la libra. 4. Calentar el medio con agitacin frecuente y hervir por un minuto hasta disolucin completa. 5. Dejar enfriar hasta los 50C aproximadamente y posteriormente vaciar a frascos de cristal perfectamente limpios de acuerdo al volumen que se necesite. 6. Esterilizar los frascos a una temperatura de 121C por un periodo de 15 minutos. 7. Dejar enfriar las frascos aproximadamente a 45C y adicionarle sangre estril (3% si es concentrado eritrocitario o 5% si se trata de sangre total) girando suavemente el frasco para evitar la formacin de burbujas. 8. Vaciar a cajas de petri y eliminar las burbujas que hayan quedado con la ayuda de la flama de un mechero bunsen. A la placa se le rotula las iniciales del medio de cultivo (AS). Se dejan enfriar hasta solidificacin. 9. Incubar las cajas a 37C por 24 hrs. para realizar la prueba de esterilidad. 10. Sacar las cajas, revisar si hubo desarrollo de colonias y si no la hubo, guardarlas en bolsas de plstico a la cual se le pegar una etiqueta y la leyenda PRUEBA DE ESTERILIDAD ACEPTABLE.
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AGAR NUTRITIVO
USO: Es un medio slido complejo de uso general para el cultivo de bacterias exigentes. Ingredientes Peptona de gelatina Extracto de carne de res Cloruro de sodio Agar (g/L) 5,0 g. 3,0 g. 8,0 g. 15,0 g.
1. Suspender 23 g. del polvo por cada litro de agua destilada. 2. Remojar unos 15 minutos y mezclar perfectamente hasta disolucin del polvo.
3. Medir el pH inicial. Ajustar el pH al indicado en la libra. 4. Calentar el medio con agitacin frecuente y hervir por uno a dos minutos hasta disolucin completa. 5. Dejar enfriar hasta los 50C aproximadamente y posteriormente vaciar a frascos de cristal perfectamente limpios de acuerdo al volumen que se necesite. 6. Esterilizar los frascos a una temperatura de 121C por un periodo de 15 minutos. 7. Vaciar a cajas de petri y eliminar las burbujas que hayan quedado con la ayuda de la flama de un mechero bunsen. A la placa se le rotula las iniciales del medio de cultivo (AN). Se dejan enfriar hasta solidificacin. 8. Incubar las cajas a 37C por 24 hrs. para realizar la prueba de esterilidad. 9. Sacar las cajas, revisar si hubo desarrollo de colonias y si no la hubo, guardarlas en bolsas de plstico a la cual se le pegar una etiqueta y la leyenda PRUEBA DE ESTERILIDAD ACEPTABLE. MEDIO MINIMO DE SALES USO: Es un medio qumicamente definido de uso general para el cultivo de bacterias poco exigentes. Ingredientes (g/L)
Glucosa 10,0 g. Sulfato de amonio (NH4)2SO4 5,0 g. Sulfato de magnesio MgSO4.7H2O 2,0 g. Fosfato cido dipotsico K2HPO4 2,0 g. Sulfato frrico FeSO4. 7H2O 0,1 g Agar 15,0 g pH final: 6,8 0,2 PROCEDIMIENTO: 1. Disolver cuidadosamente los ingredientes en el orden indicado, excepto la glucosa.
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2. La glucosa deber disolverse en recipiente separado de las sales. 3. Medir el pH inicial. Ajustar el pH en el medio de sales 4. Agregar el agar y calentar a ebullicin durante 1 minuto. 5. Esterilizar a una temperatura de 121C por un periodo de 15 minutos las dos soluciones. 6. Dejar enfriar a 45C y cerca del mechero mezclar las dos soluciones. 7. Distribuir el medio en volmenes de 25 ml. En cajas de petri en condiciones aspticas. AGAR PAPA DEXTROSA-ROSA DE BENGALA USO: Para el cultivo e identificacin de hongos y levaduras. Ingredientes Glucosa Extracto de papa Rosa de bengala Agar (g/L) 20,0 g. 4,0 g. 0,03 g. 15,0 g.
pH final: 5,6 0,2 PROCEDIMIENTO: 1. 2. 3. 4. Suspender 39 g. del polvo por cada litro de agua destilada. Remojar de 10 a 15 minutos. Medir el pH inicial. Ajustar el pH al indicado en la libra. Calentar el medio con agitacin frecuente y hervir por un minuto hasta disolucin completa. 5. Dejar enfriar hasta los 50C aproximadamente y posteriormente vaciar a frascos de cristal perfectamente limpios de acuerdo al volumen que se necesite. 6. Esterilizar los frascos a una temperatura de 121C por un periodo de 15 minutos. 7. Dejar enfriar los frascos aproximadamente a 45C y adicionarle cido tartrico al 10% en una proporcin de 14 ml por litro de medio preparado. 8. Vaciar a cajas de petri y eliminar las burbujas que hayan quedado con la ayuda de la flama de un mechero bunsen. A la placa se le rotula las iniciales del medio de cultivo (APD). Se dejan enfriar hasta solidificacin. 9. Incubar las cajas a 37C por 24 hrs. para realizar la prueba de esterilidad. 10. Sacar las cajas, revisar si hubo desarrollo de colonias y si no la hubo, guardarlas en bolsas de plstico a la cual se le pegar una etiqueta y la leyenda PRUEBA DE ESTERILIDAD ACEPTABLE.
AGAR EOSINA Y AZUL DE METILENO
USO: Para la identificacin y diferenciacin de enterobacterias patgenas. Ingredientes Peptona de gelatina (g/L) 10,0 g.
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, Lactosa Sacarosa Fosfato dipotsico Agar Eosina Azul de metileno pH 7,2 0,2 PRCEDIMIENTO: 1. Suspender 36 g. del polvo por cada litro de agua destilada. 2. Mezclar perfectamente hasta disolucin del polvo. 3. Medir el pH inicial. Ajustar el pH al indicado en la libra. 4. Calentar el medio con agitacin frecuente y hervir por un minuto hasta disolucin completa. 5. Dejar enfriar hasta los 50C aproximadamente y posteriormente vaciar a frascos de cristal perfectamente limpios con el volumen que se necesite. 6. Esterilizar los frascos a una temperatura de 121C por un periodo de 15 minutos. 7. Dejar enfriar los frascos. 8. Vaciar a cajas de petri y eliminar las burbujas que hayan quedado con la ayuda de la flama de un mechero bunsen. A la placa se le rotula las iniciales del medio de cultivo (EMB). Se dejan enfriar hasta solidificacin. 9. Incubar las cajas a 37C por 24 hrs. para realizar la prueba de esterilidad. 10. Sacar las cajas, revisar si hubo desarrollo de colonias y si no la hubo, guardarlas en bolsas de plstico a la cual se le pegar una etiqueta que contenga el nombre del medio de cultivo y la leyenda PRUEBA DE ESTERILIDAD ACEPTABLE. AGAR DE SAL Y MANITOL 5,0 g. 5,0 g. 2,0 g. 13,5 g. 0,4 g. 0,065 g.
USO: Medio selectivo para aislar estafilococos patgenos de materiales clnicos diversos (orina, genitales, heridas, exudados farngeos, etc.). Tambin se utiliza en la industria alimenticia con los mismos fines. Extracto de carne Peptona de carne Peptona de caseina Cloruro de sodio D-manitol Agar Rojo de fenol 1,0 g. 5,0 g. 5,0 g. 75,0 g. 10,0 g. 15,0 g. 0,025 g.
pH final: 7,4 0,2 PROCEDIMIENTO: 1. Suspender 111 g. del polvo por cada litro de agua destilada a preparar. 2. Mezclar perfectamente hasta disolucin del polvo. 3. Medir el pH inicial. Ajustar el pH al indicado en la libra. 4. Calentar el medio con agitacin frecuente y hervir por un minuto hasta disolucin completa.
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Manual de Prcticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGA 5. Dejar enfriar hasta los 50C aproximadamente y posteriormente vaciar a frascos de
cristal perfectamente limpios con el volumen que se necesite. 6. Esterilizar los frascos a una temperatura de 121C por un periodo de 15 minutos. 7. Dejar enfriar los frascos. 8. Vaciar a cajas de petri y eliminar las burbujas que hayan quedado con la ayuda de la flama de un mechero bunsen. A la placa se le rotula las iniciales del medio de cultivo (ASM). Se dejan enfriar hasta solidificacin. 9. Incubar las cajas a 37C por 24 hrs. para realizar la prueba de esterilidad. 10. Sacar las cajas, revisar si hubo desarrollo de colonias y si no la hubo, guardarlas en bolsas de plstico a la cual se le pegar una etiqueta que contenga el nombre del medio de cultivo y la leyenda PRUEBA DE ESTERILIDAD ACEPTABLE. AGAR MUELLER HINTON USO: Recomendado para el ensayo de sensibilidad, o para ensayos de resistencia de agentes patgenos mdicamente importantes frente a antibiticos y sulfamidas. Ingredientes Extracto de carne Peptona de casena cida Almidn Agar (g/L) 2,0 g. 17,5 g. 1,5 g. 17,0 g.
pH final: 7,4 0,2 PROCEDIMIENTO: 1. Suspender 38 g. del polvo por cada litro de agua destilada. 2. Mezclar perfectamente hasta disolucin del polvo. 3. Medir el pH inicial. Ajustar el pH al indicado en la libra. 4. Calentar el medio con agitacin frecuente y hervir por un minuto hasta disolucin completa. 5. Dejar enfriar hasta los 50C aproximadamente y posteriormente vaciar a frascos de cristal perfectamente limpios con el volumen que se necesite. 6. Esterilizar los frascos a una temperatura de 121C por un periodo de 15 minutos. 7. Dejar enfriar los frascos. 8. Vaciar a cajas de petri y eliminar las burbujas que hayan quedado con la ayuda de la flama de un mechero bunsen. A la placa se le rotula las iniciales del medio de cultivo (AMH). Se dejan enfriar hasta solidificacin. 9. Incubar las cajas a 37C por 24 hrs. para realizar la prueba de esterilidad. 10. Sacar las cajas, revisar si hubo desarrollo de colonias y si no la hubo, guardarlas en bolsas de plstico a la cual se le pegar una etiqueta que contenga el nombre del medio de cultivo y la leyenda PRUEBA DE ESTERILIDAD ACEPTABLE.
BASE DE AGAR GELOSA CHOCOLATE
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USO: Diseado especialmente para aislar Neisserias patgenas, gonococo y meningococo cuando se le agrega hemoglobina, antimicrobianos y factores de crecimiento. Ingredientes Peptona de caseina Peptona de carne Almidn de maz Fosfato dipotsico Fosfato monopotsico Cloruro de sodio Agar (g/L) 7,5 g. 7,5 g. 1,0 g. 4,0 g. 1,0 g. 5,0 g. 10,0 g.
1. Suspender 7,2 g. del polvo por cada 100 ml de agua destilada.

2. Mezclar perfectamente hasta disolucin del polvo. 3. Medir el pH inicial. Ajustar el pH al indicado en la libra. 4. Calentar el medio con agitacin frecuente y hervir por un minuto hasta disolucin completa. 5. Dejar enfriar hasta los 50C aproximadamente y posteriormente vaciar a matraces erlenmeyer de cristal perfectamente limpios y estriles con un volumen de 600 ml cada uno. 6. Esterilizar los matraces a una temperatura de 121C por un periodo de 15 minutos. 7. Sacar los matraces e inmediatamente adicionarle sangre estril para que halla hemlisis (3% si es concentrado eritrocitario o 5% si se trata de sangre total) girando suavemente el matraz para evitar la formacin de burbujas. 8. Enfriar el matraz en un bao de agua fra para posteriormente adicionarle reactivo de polienriquecimiento (1 ml por cada 100 ml). 9. Vaciar a cajas de petri y eliminar las burbujas que hayan quedado con la ayuda de la flama de un mechero bunsen. A la placa se le rotula las iniciales del medio de cultivo (AGCH). Se dejan enfriar hasta solidificacin. 10. Incubar las cajas a 37C por 24 hrs. para realizar la prueba de esterilidad. 11. Sacar las cajas, revisar si hubo desarrollo de colonias y si no la hubo, guardarlas en bolsas de plstico a la cual se le pegar una etiqueta que contenga el nombre del medio de cultivo y la leyenda PRUEBA DE ESTERILIDAD ACEPTABLE. AGAR DEXTROSA SABOURAND AGAR MALTOSA SABOURAUND USO: Recomendado para el aislamiento, identificacin y conservacin de hongos patgenos y saprfitos.
Ingredientes
(g/L)
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Mezcla de peptonas Dextrosa maltosa Agar 10,0 g. 40,0 g. 15,0 g.
pH final: 5,6 0,2 PROCEDIMIENTO: 1. Suspender 65 g. del polvo por cada litro de agua destilada. 2. Remojar de 10 a 15 minutos. 3. Mezclar perfectamente hasta obtencin de una suspensin uniforme. 4. Medir el pH inicial. Ajustar el pH al indicado en la libra. 5. Calentar el medio con agitacin frecuente y hervir por un minuto hasta disolucin completa. 6. Dejar enfriar hasta los 50C aproximadamente y posteriormente vaciar a frascos de cristal perfectamente limpios con el volumen que se necesite. 7. Esterilizar los frascos a una temperatura de 118C (noms de 15 libras de presin) por un periodo de 15 minutos. 8. Dejar enfriar los frascos. 9. Vaciar a cajas de petri y eliminar las burbujas que hayan quedado con la ayuda de la flama de un mechero bunsen. A la placa se le rotula las iniciales del medio de cultivo (ADS AMS). Se dejan enfriar hasta solidificacin. 10. Incubar las cajas a 25C por 24 hrs. para realizar la prueba de esterilidad. 11. Sacar las cajas, revisar si hubo desarrollo de colonias y si no la hubo, guardarlas en bolsas de plstico a la cual se le pegar una etiqueta que contenga el nombre del medio de cultivo y la leyenda PRUEBA DE ESTERILIDAD ACEPTABLE. AGAR METODOS ESTANDAR
USO: Recomendado para el recuento en placa de bacterias en Microbiologa sanitaria. Ingredientes Extracto de levadura Peptona de casena Dextrosa Agar (g/L) 2,5 g. 5,0 g. 1,0 g. 15,0 g.
pH final: 7,0 0,2 PROCEDIMIENTO: 1. 2. 3. 4. Suspender 23,5 g. del medio deshidratado por cada litro de agua destilada. Remojar y Mezclar perfectamente de 5 a 10 minutos hasta disolucin del polvo. Medir el pH inicial. Ajustar el pH al indicado en la libra. Calentar el medio con agitacin frecuente y hervir por un minuto hasta disolucin completa. 5. Dejar enfriar hasta los 50C aproximadamente y posteriormente vaciar a frascos de cristal perfectamente limpios con el volumen que se necesite. 6. Esterilizar los frascos a una temperatura de 121C por un periodo de 15 minutos. 7. Dejar enfriar los frascos y rotular con el nombre del medio (CMA).
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AGAR HIERRO PEPTONA Ingredientes Peptona Proteosa-peptona Citrato frrico amnico Tiosulfato sdico (Na2S2O3.5H2O) Fosfato dipotsico (K2HPO4) Agar (g/L) 15,0 g. 5,0 g. 0,5 g. 0,08 g. 1,0 g. 15,0 g.
pH final: 6,7 0,2 PROCEDIMIENTO: 1. 2. 3. 4. Suspender 36 g. del medio deshidratado por cada litro de agua destilada. Remojar y Mezclar perfectamente de 5 a 10 minutos hasta disolucin del polvo. Medir el pH inicial. Ajustar el pH al indicado en la libra. Calentar el medio con agitacin frecuente y hervir por un minuto hasta disolucin completa. 5. Dejar enfriar hasta los 50C aproximadamente y posteriormente vaciar a frascos de cristal perfectamente limpios con el volumen que se necesite. 6. Esterilizar los frascos a una temperatura de 121C por un periodo de 15 minutos. 7. Dejar enfriar los frascos y rotular con el nombre del medio (AHP). AGAR TRIPTOSA FOSFATO Ingredientes Triptosa Dextrosa Cloruro de sodio Fosfato disdico (Na2HPO4) Agar (g/L) 20,0 g. 2,0 g. 5,0 g. 2,5 g. 15,0 g.
pH final: 7,3 0,2 PROCEDIMIENTO: 8. Suspender 29,5 g. del medio deshidratado por cada litro de agua destilada. 9. Remojar y Mezclar perfectamente de 5 a 10 minutos hasta disolucin del polvo. 10. Medir el pH inicial. Ajustar el pH al indicado en la libra. 11. Calentar el medio con agitacin frecuente y hervir por un minuto hasta disolucin completa. 12. Dejar enfriar hasta los 50C aproximadamente y posteriormente vaciar a frascos de cristal perfectamente limpios con el volumen que se necesite. 13. Esterilizar los frascos a una temperatura de 121C por un periodo de 15 minutos.
14. Dejar enfriar los frascos y rotular con el nombre del medio (ATP).
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AGAR ALMIDON USO: Recomendado para determinar la actividad amiloltica. Ingredientes Agar nutritivo Almidn (soluble) (g/L) 1000 ml. 10,0 g.
pH final: 6,8 0,2 PROCEDIMIENTO: 1. Al preparar el agar nutritivo, aada el almidn a los ingredientes antes de disolverlos en el agua destilada. 2. Mezclar perfectamente hasta disolucin del polvo. 3. Medir el pH inicial. Ajustar el pH al indicado en la libra. 4. Calentar el medio con agitacin frecuente y hervir por un minuto hasta disolucin completa. 5. Dejar enfriar hasta los 50C aproximadamente y posteriormente vaciar en frascos. 6. Esterilizar los frascos a una temperatura de 121C por un periodo de 15 minutos. 7. Dejar enfriar los frascos.
MEDIO DE TRANSPORTE STUART USO: Es un sustrato semislido empleado en el transporte y conservacin de especmenes para cultivos de diversos grmenes como gonococos, estreptococos, enterobacterias, y muchos otros ms. Ingredientes Agar Tioglicolato de sodio Glicerofosfato de sodio Cloruro de sodio Azul de metileno (g/L) 3,0 g. 1,0 g. 10,0 g. 0,01 g. 0,002 g.
1. Suspender 14,1 g. del polvo por cada litro de agua destilada.

2. Mezclar perfectamente hasta disolucin del polvo. 3. Medir el pH inicial. Ajustar el pH al indicado en la libra. 4. Calentar el medio con agitacin frecuente y hervir por un minuto hasta disolucin completa. 5. Dejar enfriar hasta los 50C aproximadamente y posteriormente vaciar a tubos de 13 X 100 mm de cristal con rosca, perfectamente limpios y adicionar un volumen de 3,0 ml cada uno. 6. Agrupar tubos de 10 en 10 y colocar a cada grupo de tubos una etiqueta que contenga el nombre del medio de cultivo.
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7. Esterilizar los tubos a una temperatura de 121C por un periodo de 10 minutos con la tapa floja. 8. Dejar enfriar los tubos. 9. Incubar los tubos a 37C por 24 hrs. para realizar la prueba de esterilidad. 10. Sacar los tubos, revisarlos y guardarlos en bolsas de plstico a la cual se le pegar una etiqueta que contenga el nombre del medio de cultivo y la leyenda PRUEBA DE ESTERILIDAD ACEPTABLE. CALDO MUELLER HINTON USO: Recomendado para el ensayo de sensibilidad, o para ensayos de resistencia de agentes patgenos mdicamente importantes frente a antibiticos y sulfamidas. Extracto de carne Peptona de casena cida Almidn 2,0 g. 17,5 g. 1,5 g.
pH final: 7,4 0,2 PROCEDIMIENTO: 1. 2. 3. 4. 5. 6. Suspender 38 g. del polvo por cada litro de agua destilada. Mezclar perfectamente hasta disolucin del polvo. Medir el pH inicial. Ajustar el pH al indicado en la libra. Envasar en recipientes adecuados con el volumen que se necesite. Esterilizar los recipientes a una temperatura de 121C por un periodo de 15 minutos. A los recipientes se le rotula las iniciales del medio de cultivo (CMH). Se dejan enfriar. CALDO NUTRITIVO
USO: Cultivo lquido complejo de uso en general para el cultivo de bacterias. Ingredientes Peptona de gelatina Extracto de carne de res Cloruro de sdio pH final: 6,9 0,1 PROCEDIMIENTO: 1. 2. 3. 4. 5. Suspender 8 g. del polvo por cada litro de agua destilada. Mezclar perfectamente hasta disolucin del polvo. Medir el pH inicial. Ajustar el pH al indicado en la libra. Envasar en recipientes adecuados con el volumen que se necesite. Esterilizar los recipientes a una temperatura de 121C por un periodo de 15 minutos. 6. A los recipientes se le rotula las iniciales del medio de cultivo (CN). Se dejan enfriar. (g/L) 5,0 g. 3,0 g. 8,0 g.
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CALDO NUTRITIVO CON AGAR AL 0,5%
USO: Cultivo semislido de uso en general para el cultivo de bacterias no exigentes para determinar movilidad. Ingredientes Peptona de gelatina Extracto de carne de res Cloruro de sdio Agar pH final: 6,9 0,1 PROCEDIMIENTO: (g/L) 5,0 g. 3,0 g. 8,0 g. 5,0 g.
1. Suspender 8 g. del polvo de caldo nutritivo por cada litro de agua destilada.
2. Mezclar perfectamente hasta disolucin del polvo. 3. Adicionar el agar en la cantidad sealada. 4. Medir el pH inicial. Ajustar el pH al indicado en la libra. 5. Envasar en recipientes adecuados (tubos de ensayo de 13 x 100 mm con tapn de rosca) con un volumen de 4,0 ml. 6. Esterilizar los recipientes a una temperatura de 121C por un periodo de 15 minutos. 7. A los recipientes se les rotula las iniciales del medio de cultivo (CNA 0,5%)). Se dejan enfriar. CALDO INFUSION DE CEREBRO CORAZON (BHI)
USO: Cultivo lquido de grmenes exigentes. Ingredientes Infusin de cerebro de ternera Infusin de corazn de res Peptona de gelatina Dextrosa Cloruro de sodio Fosfato disdico pH final: 7,4 0,1 PROCEDIMIENTO: 1. 2. 3. 4. 5. 6. Suspender 37 g. del medio deshidratado por cada litro de agua destilada. Mezclar perfectamente hasta disolucin del polvo. Calentar ligeramente si es necesario. Medir el pH inicial. Ajustar el pH al indicado en la libra. Envasar en recipientes adecuados con el volumen que se necesite. Esterilizar los recipientes a una temperatura de 121C por un periodo de 15 minutos. 7. A los recipientes se le rotula las iniciales del medio de cultivo (BHI). Se dejan enfriar. (g/L) 200,0 g. 250,0 g. 10,0 g. 2,0 g. 5,0 g. 2,5 g.
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CALDO SOYA TRIPTICASA USO: Cultivo lquido altamente nutritivo de grmenes exigentes. Ingredientes Peptona de soya Peptona de caseina Cloruro de sdio Fosfato dipotsico Dextrosa pH final: 7,3 0,1 PROCEDIMIENTO: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Suspender 30 g. del medio deshidratado por cada litro de agua destilada. Mezclar perfectamente hasta disolucin del polvo. Calentar ligeramente si es necesario. Medir el pH inicial. Ajustar el pH al indicado en la libra. Envasar en recipientes adecuados con el volumen que se necesite. Esterilizar los recipientes a una temperatura de 121C por un periodo de 15 minutos. A los recipientes se le rotula las iniciales del medio de cultivo (CST). Se dejan enfriar. CALDO EXTRACTO DE MALTA USO: Cultivo lquido altamente nutritivo de grmenes exigentes. Ingredientes Extracta de malta pH final: 7,0 0,1 PROCEDIMIENTO: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Aadir el extracto de malta a un litro de agua destilada. Mezclar perfectamente hasta disolucin del polvo. Calentar ligeramente si es necesario. Medir el pH inicial. Ajustar el pH al indicado en la libra. Envasar en recipientes adecuados con el volumen que se necesite. Esterilizar los recipientes a una temperatura de 121C por un periodo de 15 minutos. A los recipientes se le rotula las iniciales del medio de cultivo (CEM). Se dejan enfriar. CALDO ROJO DE FENOL + CARBOHIDRATOS (g/L) 15,0 g. (g/L) 3,0 g. 17,0 g. 5,0 g. 2,5 g. 2,5 g.
USO: Estudio de fermentacin de carbohidratos por bacterias.
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Ingredientes Peptona de caseina Cloruro de sodio Carbohidratos Rojo de fenol (g/L) 10,0 g. 5,0 g. 5,0 g. 0,018 g.
pH final: 7,4 0,2 PROCEDIMIENTO: 1. Disolver 20 gramos del medio deshidratado en un litro de agua destilada. 2. Mezclar perfectamente hasta disolucin del soluto. 3. Calentar ligeramente si es necesario. 4. Medir el pH inicial. Ajustar el pH al indicado en la libra. 5. Coloque una campana de Durham en cada uno de los tubos con tapn de rosca de 13X100 mm. 6. Vierta el caldo en los tubos en porciones de 5 ml. 7. Esterilizar los recipientes a una temperatura de 116 - 118C (no ms de 12 libras de presin) por un periodo de 15 minutos. No sobrecalentar. 8. Permitir enfriar los tubos a temperatura ambiente. Nota: Los azcares glucosa, lactosa y sacarosa se pueden esterilizar a 116-118C sin que sufran dao. La fructosa y la xilosa deben ser esterilizados por medio de filtros bacteriolgicos. CALDO UREA
USO: Estudio de diferenciacin de enterobacterias a travs de la actividad de la ureasa. Ingredientes Urea Fosfato monopotsico Fosfato disdico Extracto de levadura Rojo de fenol (g/L) 20,0 g. 9,1 g. 9,5 g. 0,1 g. 0,01 g.
1. Disolver 38,7 gramos del medio deshidratado en un litro de agua destilada.

2. 3. 4. 5. 6. Mezclar perfectamente hasta disolucin del soluto. Sin calentar. Medir el pH inicial. Ajustar el pH al indicado en la libra. Cuando el polvo se haya disuelto, pasar a travs de un filtro bacteriolgico estril. Vierta el caldo en los tubos de 13 x 100 estriles en porciones de 2 ml. CALDO INDOL
USO: Cultivo para la identificacin de enterobacterias sobre la base de la produccin de indol a partir de triptfano.
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Ingredientes Peptona de caseina Cloruro de sdio pH final: 7,3 0,1 PROCEDIMIENTO:
(g/L) 20,0 g. 5,0 g.
1. Suspender 25 g. de la mezcla de los ingredientes por cada litro de agua destilada. 2. Mezclar perfectamente hasta disolucin de los solutos.
3. Calentar ligeramente si es necesario. 4. Medir el pH inicial. Ajustar al pH final. 5. Envasar en tubos con tapn de rosca de 13 x 100 mm con el volumen que se necesite (4 ml). 6. Agrupar los tubos en serie de 10 piezas y esterilizarlos a una temperatura de 121C por un periodo de 15 minutos. 7. A los recipientes se le rotula las iniciales del medio de cultivo (Indol). Se dejan enfriar. 8. Para la interpretacin de la prueba adicionar 5 gotas del reactivo de Kovac. CALDO TIOGLICOLATO
USO: Pruebas de esterilidad de productos biolgicos y farmacuticos. Ingredientes Peptona de caseina Extracto de levadura Dextrosa (glucosa) Cloruro de sdio L-cistina Tioglicolato de sdio Agar Rezasurina (certificada) (g/L) 15,0 g. 5,0 g. 5,0 g. 2,5 g. 0,5 g. 0,5 g. 0,75 g. 0,001 g.
1. Suspender 28,5 g. del medio deshidratado por cada litro de agua destilada. 2. Mezclar perfectamente hasta disolucin del medio.
3. Medir el pH inicial. Ajustar al pH final. 4. Calentar agitando frecuentemente. 5. Hervir hasta disolucin. 6. Distribuir en tubos con tapn de rosca de 16 x 175 mm con el volumen que se necesite (10 ml). 7. Agrupar los tubos en serie de 10 piezas y esterilizarlos a una temperatura de 121C por un periodo de 15 minutos. 8. A los recipientes se le rotula las iniciales del medio de cultivo (Tioglicolato). Se dejan enfriar.
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9. Se puede prescindir del agar y de la rezasurina. LECHE DESCREMADA ESTERIL PRECEDIMIENTO:
1. Obtenga la cantidad necesaria de leche fresca descremada (puede ser deshidratada). 2. Vierta 7,5 ml en cada tubo. 3. Hierva diariamente durante 20 minutos, por tres das consecutivos. 4. No esterilice en la autoclave. AGAR DE HIERRO Y TRIPLE AZUCAR
USO: Para identificacin y diferenciacin de enterobacterias. Ingredientes Peptona de casena Peptona de carne Cloruro de sodio Lactosa Sacarosa Dextrosa Sulfato de hierro y amonio Tiosulfato de sodio Rojo de fenol Agar (g/L) 10,0 g. 10,0 g. 5,0 g. 10,0 g. 10,0 g. 1,0 g. 0,2 g. 0,2 g. 0,25 g. 13,0 g.
pH final: 7,3 0,2 PRECEDIMIENTO:

2. Mezclar perfectamente hasta disolucin del polvo. 3. Medir el pH inicial. Ajustar el pH al indicado en la libra. 4. Calentar el medio con agitacin frecuente y hervir por un minuto hasta disolucin completa. 5. Dejar enfriar hasta los 50C aproximadamente y posteriormente vaciar a tubos de 13 x 100 mm de cristal con rosca, perfectamente limpios y adicionar un volumen de 4,0 ml cada uno. 6. Agrupar tubos de 10 en 10 y colocar a cada grupo de tubos una etiqueta que contenga el nombre del medio de cultivo. 7. Esterilizar los tubos a una temperatura de 118C por un periodo de 15 minutos. 8. Sacar los tubos e inclinarlos para que al solidificarse quede la forma de pico de flauta. 9. Incubar los tubos a 37C por 24 hrs. para realizar la prueba de esterilidad. 10. Sacar los tubos, revisarlos y guardarlos en bolsas de plstico a la cual se le pegar una etiqueta que contenga el nombre del medio de cultivo y la leyenda PRUEBA DE ESTERILIDAD ACEPTABLE.
AGAR DE HIERRO Y LISINA
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USO: Agar de ensayo para demostracin simultnea de lisina - descarboxilasa y de la formacin de cido sulfhdrico para la identificacin de Enterobacterias sobre todo de Salmonella y Shigella. Ingredientes Peptona de gelatina Extracto de levadura Dextrosa L-lisina Citrato de hierro y amonio Tiosulfato de sodio Prpura de bromocresol Agar (g/L) 5,0 g. 3,0 g. 1,0 g. 10,0 g. 0,50 g. 0,04 g. 0,02 g. 15,0 g.
pH final: 6,7 0,2 PROCEDIMIENTO: 1. Suspender 33 g. del polvo por cada litro de agua destilada. 2. Mezclar perfectamente hasta disolucin del polvo. 3. Medir el pH inicial. Ajustar el pH al indicado en la libra. 4. Calentar el medio con agitacin frecuente y hervir por un minuto hasta disolucin completa. 5. Dejar enfriar hasta los 50C aproximadamente y posteriormente vaciar a tubos de 13 x 100 mm de cristal con rosca, perfectamente limpios y adicionar un volumen de 4,0 ml cada uno. 6. Agrupar tubos de 10 en 10 y colocar a cada grupo de tubos una etiqueta que contenga el nombre del medio de cultivo. 7. Esterilizar los tubos a una temperatura de 118C por un periodo de 15 minutos. 8. Sacar los tubos e inclinarlos para que al solidificarse quede la forma de pico de flauta. 9. Incubar los tubos a 37C por 24 hrs. para realizar la prueba de esterilidad. 10. Sacar los tubos, revisarlos y guardarlos en bolsas de plstico a la cual se le pegar una etiqueta que contenga el nombre del medio de cultivo y la leyenda PRUEBA DE ESTERILIDAD ACEPTABLE. MEDIO MIO
USO: Para la identificacin de enterobacterias sobre la base de movilidad, la produccin de ornitina descarboxilasa y el indol. Ingredientes Extracto de levadura Peptona de gelatina Peptona de caseina L-Ornitina Dextrosa Agar Prpura de bromocresol (g/L) 3,0 g. 10,1 g. 10,0 g. 5,0 g. 1,0 g. 2,0 g. 0,02 g.
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1. Suspender 31 g. del polvo por cada litro de agua destilada. 2. Mezclar perfectamente hasta disolucin del polvo. 3. Medir el pH inicial. Ajustar el pH al indicado en la libra. 4. Calentar el medio con agitacin frecuente y hervir por un minuto hasta disolucin completa. 5. Dejar enfriar hasta los 50C aproximadamente y posteriormente vaciar a tubos de 13 x 100 mm de cristal con rosca, perfectamente limpios y adicionar un volumen de 4,0 ml cada uno. 6. Agrupar tubos de 10 en 10 y colocar a cada grupo de tubos una etiqueta que contenga el nombre del medio de cultivo. 7. Esterilizar los tubos a una temperatura de 121C por un periodo de 15 minutos. 8. Incubar los tubos a 37C por 24 hrs. para realizar la prueba de esterilidad. 9. Sacar los tubos, revisarlos y guardarlos en bolsas de plstico a la cual se le pegar una etiqueta que contenga el nombre del medio de cultivo y la leyenda PRUEBA DE ESTERILIDAD ACEPTABLE. AGAR CITRATO DE SIMMONS USO: Utilizado para la diferenciacin de Enterobacterias basado en la utilizacin de Citrato. Ingredientes Sulfato de Magnesio Fosfato dihidrgeno de amonio Fosfato dipotsico Citrato de sodio Cloruro de sodio Agar Azul de bromotimol (g/L) 0,2 g. 1,0 g. 1,0 g. 2,0 g. 5,0 g. 15,0 g. 0,08 g.
pH 6,8 0,2 PROCEDIMIENTO:

2. Mezclar perfectamente hasta disolucin del polvo. 3. Medir el pH inicial. Ajustar el pH al indicado en la libra. 4. Calentar el medio con agitacin frecuente y hervir por un minuto hasta disolucin completa. 5. Dejar enfriar hasta los 50C aproximadamente y posteriormente vaciar a tubos de 13 x 100 mm de cristal con rosca, perfectamente limpios y adicionar un volumen de 4,0 ml cada uno. 6. Agrupar tubos de 10 en 10 y colocar a cada grupo de tubos una etiqueta que contenga el nombre del medio de cultivo. 7. Esterilizar los tubos a una temperatura de 118C por un periodo de 15 minutos. 8. Sacar los tubos e inclinarlos para que al solidificarse quede la forma de pico de flauta. 9. Incubar los tubos a 37C por 24 hrs. para realizar la prueba de esterilidad. 10. Sacar los tubos, revisarlos y guardarlos en bolsas de plstico a la cual se le pegar una etiqueta que contenga el nombre del medio de cultivo y la leyenda PRUEBA DE ESTERILIDAD ACEPTABLE.
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MEDIO SIM USO: Utilizado para la diferenciacin e identificacin de Enterobacterias basado en la utilizacin de sulfuros, indol y movilidad. Ingredientes Peptona de casena Peptona de carne Sulfato de hierro y amonio Tiosulfato de sodio Agar (g/L) 20,0 6,1 0,2 0,2 3,5
pH 7,3 0,2 PROCEDIMIENTO: 1. 2. 3. 4. 5. Suspender 30 g. del medio deshidratado por cada litro de agua destilada. Mezclar perfectamente hasta disolucin del polvo. Remojar durante 10 minutos. Medir el pH inicial. Ajustar el pH al indicado en la libra. Calentar el medio con agitacin frecuente y hervir por un minuto hasta disolucin completa. 6. Dejar enfriar hasta los 50C aproximadamente y posteriormente vaciar a tubos de 13 x 100 mm de cristal con rosca, perfectamente limpios y adicionar un volumen de 4,0 ml cada uno. 7. Agrupar tubos de 10 en 10 y colocar a cada grupo de tubos una etiqueta que contenga el nombre del medio de cultivo. 8. Esterilizar los tubos a una temperatura de 121C por un periodo de 15 minutos. 9. Sacar los tubos y enfriar en posicin vertical. 10. Incubar los tubos a 37C por 24 hrs. para realizar la prueba de esterilidad. 11. Sacar los tubos, revisarlos y guardarlos en bolsas de plstico a la cual se le pegar una etiqueta que contenga el nombre del medio de cultivo y la leyenda PRUEBA DE ESTERILIDAD ACEPTABLE. GELATINA NUTRITIVA
USO: Utilizado en la determinacin de grmenes que licuan la gelatina (proteolticos). Ingredientes Peptona de gelatina Extracto de carne de res Gelatina (g/L) 5,0 3,0 120,0
pH 6,8 0,2 PROCEDIMIENTO: 1. Suspender 128 g. del medio deshidratado por cada litro de agua destilada. 2. Remojar durante 10 minutos.
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3. 4. 5. 6. Mezclar perfectamente hasta disolucin del polvo. Calentar ligeramente para disolverlo. Medir el pH inicial. Ajustar el pH al indicado en la libra. Dejar enfriar hasta los 50C aproximadamente y posteriormente vaciar a tubos de 13 x 100 mm de cristal con rosca, perfectamente limpios y adicionar un volumen de 4,0 ml cada uno. 7. Agrupar tubos de 10 en 10 y colocar a cada grupo de tubos una etiqueta que contenga el nombre del medio de cultivo. 8. Esterilizar los tubos a una temperatura de 121C por un periodo de 15 minutos. 9. Sacar los tubos y enfriar. 10. Incubar los tubos a 37C por 24 hrs. para realizar la prueba de esterilidad. 11. Sacar los tubos, revisarlos y guardarlos en bolsas de plstico a la cual se le pegar una etiqueta que contenga el nombre del medio de cultivo (GN) y la leyenda PRUEBA DE ESTERILIDAD ACEPTABLE.
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