Apresentação Proteómica TP1

Departamento de Qumica e Bioqumica, Licenciatura em Bioqumica
Biologia Molecular 2012/2013 Docentes: Margarida Amaral, Anabela Ramalho Discentes: Alexandra Salvado, n40267 Andreia Sousa, n40261
FCUL, Departamento de Qumica e Bioqumica
Tpicos a abordar
Os princpios da genmica e protemica;
Diferentes tipos de tcnicas de protemica e respectivo
equipamento;
Anlise e interpretao de resultados;
Exemplos de aplicao.
Licenciatura em Bioqumica, Biologia Molecular 2012-2013
Genmica
Cincia que estuda o genoma completo de um
organismo.
determinar a sequncia completa do DNA de organismos ou apenas uma sequncia de interesse

Mas estas informaes no so suficientes para saber
quais so as protenas que esto a ser realmente expressas na clula, num dado momento e numa determinada condio
Genmica funcional
Cincia que descreve a funo de genes e protenas
Tenta explicar:
Funo do DNA a nvel dos genes; Transcrio de RNA (transcriptmica) Sntese de protenas (protemica)
Genmica funcional Genmica

A genmica funcional foca-se em aspetos dinmicos tais como: Transcrio de um gene; Traduo e interaes entre protenas
Enquanto a genmica foca-se em aspetos estticos tais como: Sequenciao de DNA; Estudos estruturais
Genmica e Genmica funcional

Genmica DNA (gene)
Transcrio
Transcriptmica Genmica funcional Protemica
RNA
Traduo
Protena
Viso mais abrangente de como uma funo biolgica surge a partir da informao codificada a partir do genoma de um organismo
Um pouco de histria
1970 criao de bases de dados de protenas usando a
tcnica eletroforese bidimensional; 1994 Wilkins e Willians propuseram o tema proteoma como sendo todo o contedo de protenas expressas por um genoma;
Para compreender na totalidade a funo gnica era necessrio o estudo em larga escala das protenas expressas
A anlise das sequncias dos nucletidos nem sempre reflete uma relao direta com os nveis de protenas expressas e consequentemente com a atividade biolgica
Protemica
Cincia que estuda o conjunto de protenas e as suas
isoformas (que so determinadas pelo genoma) contidas numa amostra biolgica

Organismo Tecido Clula Organelo celular
Mtodo direto para identificar, quantificar e estudar as
modificaes ps-traducionais das protenas numa clula;

o equivalente proteico do genoma
Protemica: como surgiu?

Necessidade de se investigar o controle da expresso
gnica e os seus impactos no metabolismo celular; Informaes importantes como:

Quais as protenas que so expressas;
Os nveis de expresso destas protenas; O momento de expresso destas protenas; Modificaes ps-traducionais; Interaes entre protenas;
Respostas expressas pelas clulas em diferentes situaes ou
tratamentos; Diferenas moleculares entre linhagens de clulas.
Protemica vs. Genmica

Estudo da estrutura, funo e controlo dos sistemas biolgicos atravs das propriedades das protenas; Conhecimento acerca da abundncia, atividade e estrutura das protenas expressas por uma clula No esttica: modifica-se de acordo com as condies e estmulos a que um organismo est exposto Estudo apenas da sequncia dos genes (genoma); No elucida muitos dos processos biolgicos; No se obtm dados sobre a expresso dos genes, a quantidade expressa e o funcionamento dos seus produtos; esttica.
Ponte de ligao entre o gentipo e o fentipo de um organismo

10
Fatores que afetam o proteoma duma clula

Genoma
Expresso gnica Interaes entre protenas
Temperatura
Proteoma
Condies ambientais Substncias qumicas
Infeo por organismos patognicos

11
Protemica: Vantagens e Desvantagens

Vantagens estudo da expresso gnica em condies especficas; identificao de protenas que sofrem modificaes pstraducionais (que no so detetadas por anlise do genoma).
Desvantagens Limitaes
S uma parte das protenas sintetizadas pode ser detetada
experimentalmente; Degradao da amostra.
12
Protemica: tcnicas utilizadas

Eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida
Separao (por carga e massa), deteo e quantificao das
protenas
ICAT (isotope-coded affinity tags)

Permite identificar diferenas no contedo proteico de duas amostras
Microarrays de protena
Interaces das protenas e as suas funes
Espectrometria de massa
Fragmentao de protenas; Anlise de pptidos;
Identificao das protenas (bioinformtica).
13
Preparao da amostra
Rutura celular atravs de: Mtodos qumicos (detergentes, solventes orgnicos, entre outros) Mtodos fsicos (homogeneizao com misturador, agitao mecnica, entre outros)
Solubilizao e desnaturao das protenas
Figura 1. Homogeneizador de Potter Elvehjem.
Figura 2. Esquema da preparao da amostra.
14
Eletroforese 2D princpios
Consiste em separar, sob a influncia de um campo
eltrico, molculas carregadas. A velocidade de migrao depende de:

Tamanho
Forma
Carga eltrica
Numa eletroforese 2D, as protenas so submetidas a
duas etapas de separao eletrofortica consecutivas:

Etapa de 1 dimenso
Etapa de 2 dimenso
15
Eletroforese 2D etapa de 1 dimenso

Consiste numa focagem isoeltrica: protenas so
separadas pela sua carga eltrica atravs de um gradiente de pH

As protenas migram no gel at atingirem uma posio estacionria, onde o seu pI igual ao valor de pH (carga nula)
Figura 3. Primeira dimenso: focagem isoeltrica das protenas.
16
Eletroforese 2D etapa de 2 dimenso

As protenas so submetidas a uma eletroforese
desnaturante em gel de poliacrilamida SDS-PAGE;

As protenas (carga global negativa) so separadas de acordo com as suas massas moleculares protenas de maiores dimenses migram menos no gel
Figura 4. Segunda dimenso: SDS-PAGE.
17
Eletroforese 2D - Equipamento
Focagem isoeltrica
Cmara de focagem isoeltrica
Unidade de focagem isoeltrica
Figura 5. Equipamento utilizado numa eletroforese de focagem isoeltrica.
SDS-PAGE
Figura 6. Equipamento utilizado numa eletroforese SDS-PAGE.

18
Eletroforese 2D Resultados I
Os resultados da eletroforese so visveis atravs de
vrios mtodos de deteo:

Colorao de protenas
Corantes (Azul de Coomassie, nitrato de prata, entre outros) Reagentes fluorescentes
Fluorografia ou autoradiografia
Deteo de protenas marcadas radioativamente (incorporao de 3H,
14C, 35S, 32P, 33P
ou 125I s protenas)
Aplicados juntamente com os mtodos anteriores
19
Eletroforese 2D Resultados II
No final da eletroforese 2D obtm-se um gel contendo numerosas
manchas (spots) bem separadas, cada uma correspondente a uma protena ou a uma forma proteica.
Figura 7. Eletroforese bidimensional 2D-PAGE utilizado na anlise de proteomas.

20
Eletroforese 2D vantagens e desvantagens

Vantagens
Boa resoluo para protenas; Deteo de modificaes ps-
Desvantagens
Limitado pelo intervalo de pH; As protenas pouco abundantes
traducionais;
Comparaes quantitativas; Boa avaliao visual para
so de difcil deteo;
Quando a quantidade de
protenas muito elevada a resoluo baixa

Anlise e quantificao so
amostras pouco complexas
difceis.
21
Eletroforese 2D Exemplo
Figura 8. Eletroforese bidimensional dos componentes proticos totais de C. albicans na faixa de pH de 3 a 10 com tratamento com fluconazol na concentrao de 1400 g/mL em gis corados pelo azul de Coomassie.
22
Eletroforese 2D Exemplo
Alteraes verificadas:
Figura 9. Eletroforese bidimensional dos componentes proticos totais de C. albicans com tratamento com fluconazol na concentrao de 1400 g/mL, viso ampliada das protenas alteradas.
23
ICAT
O mtodo utiliza 2 marcaes: Marcador leve Marcador pesado (tomos de H so substitudos por D)
O marcador constitudo por: a) Um grupo qumico que reage com os grupos especficos das protenas (por exemplo: se reagir com o grupo tiol, o marcador liga-se a todas as cistenas na protena) b) Grupo biotina
Figura 10. Estrutura de um reagente ICAT especifico para os grupos tiol das protenas.
24
ICAT Como aplicar?

1. 2.
3. 4. 5.
Aplicar o marcador leve a uma das amostras e o marcador pesado a outra; Clivar as protenas com tripsina (Ateno: os fragmentos com cistena continuam marcados!) Juntar os dois extratos proteicos; Cromatografia de afinidade (liga a biotina da molcula de ICAT e portanto os fragmentos de interesse) Obtm-se uma mistura idntica de pptidos (os pptidos de cada amostra diferem 8 Da)
Sinais aos pares, separados por 8 unidades de massa, com a mesma abundncia
A no ser que a protena esteja a ser expressa em diferentes quantidades nas amostras
6.
25
ICAT Estratgia (I)
Figura 11. Estratgia de atuao do ICAT.
As protenas isoladas de uma clula saudvel so tratadas com o marcador leve (amostra de controlo) enquanto as protenas isoladas de uma clula doente so tratadas com o marcador pesado
Os pptidos marcados com ICAT so separados dos outros pptidos por cromatografia de afinidade
26
ICAT Estratgia (II)

Cromatografia liquida de afinidade Espectrometria de massa
Figura 12. Exemplos de cromatograma e de espectro obtido por cromatografia liquida de afinidade e espectrometria de massa, respetivamente.
Quantificao de protenas
Identificao de protenas
27
ICAT Exemplo (Proteoma de T. Cruzi)

Doena de Chagas (Chaguismo) Tambm conhecida por tripanossomase americana; uma infeco causada pelo protozorio Trypanosoma cruzi
Resultados:
Expresso conservativa entre as formas evolutivas epimastigota, tripomastigota e amastigota.
Figura 13. Exemplo esquemtico de estratgia utilizada para o estudo de proteoma. (Retirado de Kalume et al. 2005)
28
ICAT Exemplo (Proteoma de T. Cruzi)

MAS O nmero de protenas focalizadas no gel e o nmero de
identificaes obtidas representaram uma pequena parte de todo o

proteoma de cada forma evolutiva.
ICAT anlise quantitativa das protenas das formas tripomastigota e amastigota
29 protenas com nveis ~ de expresso 9 protenas predominantes na forma tripomastigota 3 protenas predominantes na forma amastigota
29
Espectrometria de massa I
O espectrmetro um aparelho complexo que: Vaporiza os compostos a analisar; Produz ies (em fase gasosa); Separa ies de acordo com a sua razo massa/carga (m/z).
Obtm-se um grfico da abundncia dos ies a cada razo m/z obtida
constitudo por: Sistema de introduo da amostra (input); Fonte de ies (cmara de ionizao); Analisadores (separao dos ies); Detetor de ies; Sistema de tratamento de dados.
Figura 14. Espectrmetro de massa.
30
Espectrometria de massa II
Fonte inica (ies em fase gasosa) Analisador (Separao dos ies)
Vcuo
Detetor (deteo dos ies)
Sistema de introduo da amostra
Sistema de dados (tratamento de dados)
Espetro de massa
31
Espectrometria de massa III

Campo magntico
Campo eltrico
Cmara de Ionizao
Figura 15. Espectrmetro de massa e todos os seus principais componentes.
32
Espectrometria de massa - Fonte inica (I)

Na anlise de protenas, a fonte de ies mais utilizada : MALDI (matrix-assisted laser desorption/ ionisation)
Porqu?
A amostra misturada com a matriz (composto orgnico conjugado).
As matrizes so projetadas de forma a ter um mximo de absoro ao comprimento de onda do feixe do laser.
O laser causa a excitao e a vaporizao do solvente e a amostra fica na fase gasosa.
33
Espectrometria de massa - Fonte inica (II)

Vantagens
Mtodo de ionizao suave; Como a matriz absorve quase
Desvantagens
Se a concentrao da soluo
toda a radiao, aumenta a probabilidade da amostra ficar ionizada sem fragmentar

Produo de ies de massa
desconhecida, necessrio realizar diluies em srie da amostra
Melhores resultados na gama de concentraes 0,1-10 pmol mm-3
molecular elevada com elevada sensibilidade;
34
Espectrometria de massa analisador (I)

Na anlise de protenas, o analisador mais utilizado : TOF (time of flight)
Porqu?
Os ies entram num tubo de voo em que os ies mais leves migram mais rapidamente, chegando em primeiro lugar ao detetor.
Os ies so separados com base na razo m/z, uma vez que aplicado, ao mesmo tempo inicial, o mesmo potencial
Vantagens: Virtualmente, no existe limite de massa molecular para amostra
35
Espectrometria de massa MALDI-TOF (I)
Figura 16. Esquema do funcionamento da espectrometria de massa MALDI-TOF.

36
Espectrometria de massa MALDI-TOF (II)

Desvantagem: esta tcnica afetada por corantes, sais,
tampes ou detergentes (inicos ou no inicos)

Soluo?
Remover estes compostos por: Lavagem;

Dilise;
Resinas de troca inica; Cromatografia de pipeta (cromatografia de fase reversa em que a amostra se liga ao interior da pipeta enquanto os sais no, a amostra depois removida com solventes orgnicos, exemplo: acetonitrilo 50-75%)
Figura 17. Cromatografia de pipeta.
37
Anlise quantitativa de complexos proteicos

A anlise do proteoma envolve os seguintes passos:
1. 2. 3.
Corrida em gel (eletroforese unidimensional ou bidimensional); Corar a amostra (ex: azul de Coomassie); Encontrar as protenas de interesse
4.
5. 6.
Extrair e clivar as protenas

Anlise da massa dos resultados Procurar correspondncias numa base de dados
Ferramenta Mascot de Matrix Science Protein prospector NCBInr Ferramenta SwissProt do Expasy
38
Espectrometria de massa exemplo
Figura 18. Exemplo de espectro obtido por espectrometria de massa para a parvalbumina de jacar.
39
Aplicaes da Protemica
Mining de Proteomas
Perfil de expresso de protenas

Identificao de interaes protena-protena Mapeamento de modificaes de protenas
40
Mining de Proteomas
Objetivos: Identificar o maior nmero possvel de componentes do proteoma Catalogar todo o proteoma duma clula, num dado momento
Interesse: Estudar as mudanas na composio proteca dos proteomas
Associadas a doenas num organismo
Utilidade como marcadores de diagnstico (biomarcadores)
41
Perfil de Expresso de Protenas - I

Objetivo: Medir a expresso de um conjunto de protenas em duas amostras e depois compar-los
Detetar e identificar as mesmas protenas nas duas amostras
Ferramenta bioinformtica: MelanieTM
MelanieTM interface para visualizar, explorar e analisar as imagens do gel de electroforese 2D identificar os marcadores de protena de interesse atravs de anlise de expresso diferencial
Problemas Este mtodo pode indicar apenas o nvel do produto do gene por si s e no a forma como as protenas so modificadas
42
MelanieTM Output
Anlise:
Presena ou ausncia de spots Volume dos spots: quantificao relativa Posio dos spots: modificaes ps-traducionais
Figura 20. Aspecto de um output do programa MelanieTM.
43
Identificao de interaes protena-protena

Imunoprecipitao Utilizao de anticorpos monoclonais para remover a protena de interesse Phage Display (Exibio de fagos) Atravs da utilizao de fagos (ex. M13) permite o rastreio dos clones obtidos devido ligao do fentipo (o pptido de interesse) com o gentipo (o vetor de clonagem) que o expressou. The Yeast Two Hybrid System (Sistema do duplo hbrido) Permite detectar in vivo interaces protena-protena atravs de um ativador transcricional que leva expresso de um gene
44
Mapeamento das modificaes da protena I

Mapear as MPTs = identificar em que resduo se
encontra a alterao
Essa alterao pode ser (entre outras):

Fosforilao adio de um grupo fosfato (PO4) a um aminocido Acetilao introduo um grupo funcional acetil
Alquilao transferncia de um grupo alquilo

Metilao substituio de H por um grupo metil (CH3).
45
Contribuies da Protemica
Tendo em conta todas as aplicaes da protemica, esta
pode ser aplicada a:
Estudo de agentes infecciosos Desenvolvimento de novos frmacos
Marcadores de diagnstico (biomarcadores)
Cancro Doena de Alzheimer
46
Concluso
A protemica um mtodo direto
amplamente utilizado para identificar, quantificar e estudar as modificaes ps-traducionais das protenas de uma clula;
As tcnicas mais utilizadas so a
eletroforese bidimensional e a espectrometria de massa;

As suas aplicaes so vastas;
Os seus contributos para o
desenvolvimento de novos frmacos e de marcadores de diagnstico so de grande importncia.
Figura 22. Interao entre as protenas da clula de levedura.
47
Bibliografia
Wilson, K., & Walker, J. (2005). Principles and Techniques of Biochemistry and Molecular Biology
(6th edition). Cambridge: Cambridge University Press; Brown, T. A. (2010). Gene Cloning And DNA Analysis An Introduction (6th edition). Wiley-Blackwell; Liebles D.C., & Yates, John R, III (2002). Introduction to Proteomics Tools for the New Biology . Humana Press Inc.; Uto et al. Clinical proteomics for liver disease: a promising approach for discovery of novel biomarkers (2010). Proteome Science; OFarrel, P. H. High Resolution Two-dimensional Electrophoresis of Proteins (1975). J. Biol. Chem. (250, 40074021); Silva, A. M. S., Corra, G. C., & Reis, E. M. Proteomica Uma abordagem funcional do estudo do genoma. Universidade do Grande Rio; Latterich M., Abramovitz M., & Leyland-Jones, B. Proteomics: New technologies and clinical applications (2008). European Journal Of Cancer 44 (2008) 27372741; http://www.conhecer.org.br/enciclop/2010c/proteonica.pdf; http://www.biota.org.br/publi/banco/docs/18502_1203966649.pdf http://www.scielo.br/pdf/cr/v40n3/a479cr1680.pdf; http://www.biotecnologia.com.br/revista/bio07/analise.pdf; http://www.e-escola.pt/ftema.asp?id=116&canal=5 http://www.posgraduacao.fcfar.unesp.br/biociencias/Disertacoes/2008/liliana_scorzoni-completo.pdf http://www.dionex.com/en-us/webdocs/5475-5475_AN520_V16.pdf

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gnica e os seus impactos no metabolismo celular; Informaes importantes como:

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Protemica: Vantagens e Desvantagens

experimentalmente; Degradao da amostra.

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Figura 2. Esquema da preparao da amostra.

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eltrico, molculas carregadas. A velocidade de migrao depende de:

Numa eletroforese 2D, as protenas so submetidas a

duas etapas de separao eletrofortica consecutivas:

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Eletroforese 2D etapa de 1 dimenso

separadas pela sua carga eltrica atravs de um gradiente de pH

Figura 3. Primeira dimenso: focagem isoeltrica das protenas.

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Eletroforese 2D etapa de 2 dimenso

desnaturante em gel de poliacrilamida SDS-PAGE;

Figura 4. Segunda dimenso: SDS-PAGE.

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Unidade de focagem isoeltrica

Figura 5. Equipamento utilizado numa eletroforese de focagem isoeltrica.

Figura 6. Equipamento utilizado numa eletroforese SDS-PAGE.

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vrios mtodos de deteo:

Aplicados juntamente com os mtodos anteriores

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