Unidad 2

Cintica de Fermentaciones

2.1.- DETERMINACION DE LA CONCENTRACION CELULAR OBJETIVO Cuantificacin de clulas a travs del tiempo Cintica de crecimiento

De qu clulas hablamos ?

! ! ! !

Bacterias Levaduras Hongos filamentosos (mohos) Microalgas

OPTIMIZACION

Economa celular Funcionamiento anormal

Bacterias
Actinomycetes

Microorganismo de menor tamao (12 m) Variada morfologa Fisin binaria No tienen edad 4 8 m Morfologa ovalada, esfrica Yemacin La distribucin de edades ir cambiando Respuesta del cultivo es funcin del tiempo 5 20 m Crecimiento filamentoso (hifas) Estructura miceliar Crecimiento apical Clulas viejas quedan Lenta respuesta fisiolgica Tambin reproduccin mediante esporas

Levaduras

Hongos filamentosos

Microalgas eucarioticas

Tamaos de celulas, virus, y otras cosas pequeas La biologia es un area muy rica visualmente. Sin embargo muchas de las estructuras y eventos biologicos ms interesantes son ms pequeos de lo que el ojo humano puede ver sin ayuda. En realidad el ojo humano tiene una resolusion de cerca de 100 m. En el cuadro de abajo note que de todas las estructuras listadas, solamente la celula vegetal est escasamente dentro de nuestra resolusion

El Microscopio opticoEl microscopio optico tiene un limite resolucon de cerca de 200 nm (0.2 m ). Este limite se debe a la longitud de onda de la luz (0.4-0.7 m ). Las celulas observadas bajo el microscopio optico pueden estar vivas o fijadas y teidas. El Microscopio Electronico de Transmisin(MET) El microscopio electronico de transmisin (MET) tiene un limite de resolusin de cerca de 2 nm. Esto es debido a limitaciones del lente usado para enfocar electrones hacia la muestra. Un MET mira a replicas de celulas muertas , despues de haber sido fijadas y teidas con iones de metales pesados. Los electrones son dispersados cuando pasan a traves de una fina seccin del especimen, y luego detectados y proyectados hacia una imagen sobre una pantalla fluorescente El Microscopio Electronico de Barrido (MEB)El microscopio elctronico de barrido (MEB) tambien tiene un limite de 2nm. Al igual que el MET, el MEB permite mirar a celulas muertas, despues de haber sido fijadas y teidas con iones de metales pesados. Con esta tecnica los electrones son reflectados sobre la superficie del especimen.

Generalmente las bacterias se reproducen por biparticin, como se ve en el siguiente esquema:

Tras la duplicacin del ADN, que esta dirigida por la ADNpolimerasa que se encuentra en los mesosomas, la pared bacteriana crece hasta formar un tabique transversal separador de las dos nuevas bacterias. Pero adems de este tipo de reproduccin asexual, las bacterias poseen unos mecanismos de reproduccin sexual o parasexual, mediante los cuales se intercambian fragmentos de ADN . Puede realizarse por : Transformacin Conjugacin Transduccin

TRANSFORMACION: Consiste en el intercambio gentico producido cuando una bacteria es capaz de captar fragmentos de ADN, de otra bacteria que se encuentran dispersos en el medio donde vive.

CONJUGACIN: En este proceso, una bacteria donadora F+ transmite a travs de un puente o pili, un fragmento de ADN, a otra bacteria receptora F-. La bacteria que se llama F+ posee un plsmido, adems del cromosoma bacteriano.

TRANSDUCCIN: En este caso la transferencia de ADN de una bacteria a otra , se realiza a travs de un virus bacterifago, que se comporta como un vector intermediario entre las dos bacterias.

Yemacin
Modalidad de reproduccin asexual propia de las levaduras. Sobre la superficie de la levadura, comienza a formarse un brote o yema. El ncleo se duplica, y uno de los ncleos se introduce en el brote que est en formacin. Despus de un tiempo, la yema se separa de la clula progenitora y se independiza, constituyendo un nuevo individuo. Tambin, el brote puede quedar unido a la clula madre y formar colonias. Se forman dos clulas de distinto tamao, el citoplasma se reparte en forma desigual. La clula madre permanece.

Levadura X 1500 Yemacin de levaduras X 1500

Cmo se cuantifica ???

NUMERO celdas de recuento (mtodo directo) recuento total en placas (UFC) nefelometra NMP mtodos instrumentales Contador Coulter peso seco turbidimetra MASA volumen compactado dispersin de luz estimaciones fsicas () estimaciones qumicas cambios en el medio de cultivo cambios en la clula balances de materia
BIO MASA + CO2 + H2O + METAB OLITOS

N UTRIENTES + O2

Mtodos Recuento en celda Recuento en placa

Fundamento Conteo directo del N de clulas Conteo del N de colonias

Observaciones Requiere clulas individuales y medio limpio Requiere clulas individuales, influencia de las condiciones de incubacin Requiere cultivo homogneo y traslcido Requiere clulas individuales y medio limpio No admite slidos en el medio. Trabajoso Requiere clulas individuales y medio limpio Poco preciso Cambios en viscosidad, pH. Anlisis de componentes celulares Gran cantidad de datos analticos

Nefelometra N.M.P. Peso seco Turbidimetra Volumen empacado Fsicos y qumicos Balances de masa

Dispersin de la luz Estadstico Medicin directa Transmisin de la luz Centrifugacin Variados, indirectos Conservacin de la masa

Mtodos para la cuantificacin del crecimiento de poblaciones microbianas

2.2.- CURVAS DE CRECIMIENTO EN CULTIVOS POR LOTES

Modalidades de cultivo

por lotes (cargas, tandas, batch) contnuo por lotes alimentados SISTEMA BATCH

ES UN SISTEMA CERRADO CURVA DE CRECIMIENTO

Fase de latencia (fase lag)

[a]

Fase de crecimiento exponencial [b] (fase logartmica) * Fase estacionaria (mantencin) [c] Fase de declinacin o muerte [d] Fase de crecimiento crptico [e]
* Ecuaciones caractersticas

dX dt

= X

X = X 0 e t

X : Concentracin celular en masa [gr clula seca/lt] t : Tiempo [hr] : Velocidad de crecimiento [hr-1]

Observaciones
Es posible distinguir tambin cortas fases de aceleracin y desaceleracin del crecimiento La fase estacionaria puede presentar una leve pendiente positiva si el nutriente limitante es, por ejemplo, la fuente de nitrgeno Si se utiliza nmero de clulas en lugar de biomasa, aparecen algunas diferencias en la curva:
Fase de latencia: no hay aumento de clulas viables Fase estacionaria: no se apreciar aumento en caso de limitacin por nitrgeno

A qu velocidad crece este cultivo ? Hasta cundo crece un M.O. ?

Crecimiento diuxico

Cultivo discontinuo aerbico de la levadura Kluyveromyces lactis en lactosuero desproteinizado. Condiciones: matraces Erlenmeyer con 1/5 de su volumen de medio de cultivo bajo agitacin orbital a 150 rpm y a 30 C.

En la situacin representada en el grfico, en primer lugar la levadura metaboliza la lactosa, fermentando una parte de ella hasta etanol. Este alcohol es consumido oxidativamente en una segunda etapa. Se produce cuando el microorganismo dispone de dos fuentes de carbono en el medio y no comienza a consumir la segunda hasta que no ha agotado la primera.
SE OBSERVAN DOS FASES DE CRECIMIENTO BIEN DIFERENCIADAS

Otro ejemplo comunmente citado es el crecimiento de microorganismos en un medio conteniendo glucosa y lactosa. La glucosa es rpidamente metabolizada, mientras la utilizacin de lactosa queda paralizada por represin catablica.

Modelamiento de la Teora

dX dt

= X

pendiente de la recta

1 dX X dt

d ln X dt

Integrando en fase exponencial

X ln X0

= t

X = X 0 e t

Tiempo de duplicacin
Lapso entre dos duplicaciones sucesivas
Tipo de clula td (h) 0.3 2.0 1.0 4.0 2.0 7.0 18 35 20 40

td

ln 2

Bacterias Levaduras Hongos filamentosos Microalgas Clulas animales in vitro

ECUACIONES VLIDAS PARA LA FISIN BINARIA !!! Bacterias Levaduras Organismos filamentosos

Tiempos de duplicacin caractersticos

2.3.- INFLUENCIA DE LOS FACTORES AMBIENTALES

= f ( MO, factores ambientales )

Microorganismo Medio de cultivo Temperatura pH Fuerza inica Presencia de inhibidores Presencia de tensoactivos Actividad de agua Potencial redox (eH) Composicin del Medio de cultivo Efecto cualitativo Efecto cuantitativo

= M

S KS + S
MONOD, 1949

CASO SIN INHIBICION !!!

Si S >>> KS

= M

Sustrato Glucosa Glucosa Glucosa Glucosa Lactosa Metanol Fosfato Magnesio Arginina Triptfano

Organismo

KS (mg/lt) 0.07 2.0 5.0 25.0 4.5 20.0 0.7 1.6 0.56 0.50 5.0x10-4 1.0x10-3

Escherichia Aspergillus Saccharomyces Candida Escherichia Pseudomonas Escherichia Klebsiella Aspergillus Escherichia

Valores de Constante de Saturacin

= M

S (K S + S ) 1 + S KI

Concentraciones altas de sustrato

CRECIMIENTO INHIBIDO
Concentraciones altas de productos

= M

S (K S + S ) 1 + P KP

Temperatura de cultivo
Cada rama de la curva puede ser modelada por una ecuacin del tipo Arrhenius

=
MO psicrfilos (0-15 C) MO mesfilos (20-40 C) MO termfilos (45 C y superiores) Existe valor ptimo

Ae

Ea R T

Ea [ 8 26 kcal/mol ]

pH
Curva variada

Bacterias ( 6 7.5 ) Levaduras ( 3.5 5.5 ) Mohos ( 3 7 ) No se ha formulado un modelo matemtico simple y general para representarla

Potencial redox

Su valor determina la posibilidad de ocurrencia de reacciones de oxidacin de sustrato Valor relevante para organismos quimioauttrofos

Actividad de Agua

Los MO requieren un nivel mnimo de aw para posibilitar su desarrollo

aw > 0.85

2.3.- DISEO DE MEDIOS DE CULTIVO OBJETIVO Desarrollo de una fermentacin con mnimo costo por unidad de producto materia informacin energa

clulas metabolitos

q Cd H eO f N g + r CO2 + t H 2O + u Ch H i O j N k 1 Ca H bOc + m NH 3 + n O2 MO
% en peso, base seca

Elemento Carbono Hidrgeno Oxgeno Nitrgeno Magnesio Fsforo Azufre Calcio Potasio Hierro Otros
Compuesto Protenas Carbohidratos Lpidos Ac. Nucleicos Cenizas

bacterias 46 52 8 12 18 24 10 14 0.1 0.5 2.0 3.0 0.1 1.0 0.01 1.0 1.0 4.5 0.02 0.2 <0.01

levaduras 46 52 8 12 18 24 59 0.1 0.5 0.8 0.25 0.01 0.25 0.1 0.3 1.0 4.0 0.01 0.5 <0.01

mohos 45 - 55 8 12 18 24 37 0.1 0.3 0.4 4.5 0.1 0.5 0.1 1.4 0.2 2.5 0.1 0.2 <0.01

50 60 6 15 5 10 15 25 4 - 10

35 - 45 30 45 5 10 5 15 4 - 10

25 40 40 55 5 10 2 10 4 - 10

Composicin qumica de clulas microbianas

Fuente de elementos mayores

C, H, O, N

Fuente de elementos menores

P, Ca, S, Mg

Fuente de elementos trazas

K, Mn, Fe, Co, Cu, Zn, B, Na, Al, Si, Cl, Cr, V Ni, As, Se, Mo, Sn, I, Be, F, Sc, Ti, Ga, Ge, Br, W

Nutrientes esenciales
factores de crecimiento Elementos Definidos Medio Mnimo (simple) Medios de cultivo melaza Licor de maceracin de maz Suero de leche Complejos Permeado de suero Extractos Licor de sulfito Harinas y concentrados proteicos Harina de soya Hidrolizados Aceites vegetales Almidn de maz Glucosa (de maz) Amonio urea sales minerales vitaminas Suplementos aminocidos

Formulacin de Medios de Cultivo

Conocer composicin del MO
REQUERIMIENTOS

Definir las fuentes de nutrientes a utilizar

C P Mg N S K C6H12O6 K2HPO4 MgCl2, MgSO4 NH4Cl, (NH4)2SO4 MgSO4x7H2O, K2SO4, FeSO4x7H2O, CuSO4x5H2O, Na2SO4 KCl

Estimar las cantidades necesarias de cada fuente

yx/s Glucosa (NH4)2SO4 KH2PO4 MgSO4x7H2O 0.45 0.50 2.0 3.0 10 15 20 - 25 Cmo estimarlo? Experimentalmente Estimacin terica % del elemento en Fuente f % del elemento en Clula

Cuntas clulas vamos a hacer Cunto sustrato vamos a agregar

RENDIMIENTO yx =
s

X S

Carbono

f=1

yx =
s

= Carbono Aerobio f = 0.6 Anaerobio f = 0.1

Determinar el nutriente limitante Determinar la incorporacin de otros nutrientes y trazas Clculo de tampones
[ KH2PO4 + Na2HPO4 ] ~ 10 g/lt