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Mestrado Integrado em Medicina Dentária - 1º Ciclo

SEBENTA PRÁTICA DE
BIOLOGIA CELULAR E
MOLECULAR II

Ano Lectivo 2008/2009


BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR II
Mestrado Integrado em Medicina Dentária – 1º Ciclo
Professor Regente: Isabel Barahona
Assistente: Susana Bandarra
Ano lectivo 2008/2009

PLANEAMENTO DAS AULAS PRÁTICAS

As aulas práticas são obrigatórias e têm a duração de 3 horas,


ministradas de 15 em 15 dias.

1. Programa das Aulas Práticas

Objectivo: Produção de uma Proteína Recombinante por


Engenharia Genética

1º e 2º Aula
Extracção de DNA cromossomal.

3º e 4º Aula
Amplificação do gene que codifica a proteína Vif por PCR
(polimerase chain reaction).
Análise dos resultados em electroforese em gel de agarose.

5º e 6º Aula
Noção de vectores e de clonagem.
Extracção de DNA plasmídico, com e sem fragmento de DNA
inserido.

7º e 8º Aula
Restrição dos DNAs preparados anteriormente (cromossomal e
plasmídicos).
Análise dos resultados obtidos após a separação dos
fragmentos de DNA por electroforese em gel de agarose.

9º e 10º Aula
Transformação de E.coli com os DNAs dos plasmídeos
preparados anteriormente.

11º e 12º Aula


Preparação de proteínas. Análise de proteínas por electroforese
em gel de poliacrilamida.

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2. Calendário

Dia Turno Trabalho Prático


9-03-09 Turma 4 1ª e 2ª Aula
10-03-09/17-03-09 Turma 1/Turma2 1ª e 2ª Aula
11-03-09/18-03-09 Turma 3/Turma 5 1ª e 2ª Aula
23-03-09 Turma 4 3ª e 4ª Aula
24-03-09/31-03-09 Turma 1/Turma 2 3ª e 4ª Aula
25-03-09/1-04-09 Turma 3/Turma 5 3ª e 4ª Aula
20-04-09 Turma 4 5ª e 6ª Aula
14-04-09/21-04-09 Turma 1/Turma 2 5ª e 6ª Aula
15-04-09/22-04-09 Turma 3/Turma 5 5ª e 6ª Aula
4-05-09 Turma 4 7ª e 8ª Aula
28-04-09/5-05-09 Turma 1/Turma 2 7ª e 8ª Aula
29-04-09/6-05-09 Turma 3/Turma 5 7ª e 8ª Aula
25-05-09 Turma 4 9ª e 10ª Aula
12-05-09/26-05-09 Turma 1/Turma 2 9ª e 10ª Aula
13-05-09/27-05-09 Turma 3/Turma 5 9ª e 10ª Aula
8-06-09 Turma 4 11ª e 12ª Aula
2-06-09/9-06-09 Turma 1/Turma 2 11ª e 12ª Aula
3-06-09/17-06-09 Turma 3/Turma 5 11ª e 12ª Aula

2. Avaliação

A frequência da cadeira é obtida através da realização com


informação positiva de todos os trabalhos práticos e na realização de
um exame prático, no final do semestre, com obtenção de
classificação igual ou superior a 10 valores.

A classificação final: 30% (nota prática) + 70% (nota teórica)

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1ª/2ª Aula

I. Resumo sobre ácidos nucleicos


I.I DNA/RNA

I.II Estrutura de um gene procariótico e eucariótico

II. HIV1-VIF
III. Objectivos das aulas práticas
1. Preparação de DNA cromossomal de células linfocitárias
infectadas com o HIV1.
2. Obtenção do gene VIF de HIV1 por PCR
3. Extracção de DNA plasmídico (no qual se clonou o gene VIF)
4. Confirmação da clonagem do gene VIF.
5. Transformação de E.coli para produção de VIF em larga escala.
6. Extracção e confirmação da produção de proteínas.
Estudo das tecnologias do DNA recombinante

I.I. Resumo sobre ácidos nucleicos

Os ácidos nucleicos são moléculas que armazenam e transmitem a


informação nas células. O primeiro dos ácidos nucleicos a ser
descoberto foi o DNA (ácido desoxirribonucleico).

O DNA (RNA no caso de alguns vírus) constitui o suporte universal


de toda a informação genética que define as características de cada
ser vivo.

Foi em 1953 que, com os trabalhos de James Watson e Francis


Crick, passou a ser possível entender o modo como na natureza se
encontra codificado todo o programa que comanda o
desenvolvimento dos organismos vivos – determinando as
características estruturais e funcionais próprias de cada célula e de

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cada espécie – e como essa informação é conservada de geração em
geração.

As células têm duas moléculas portadoras de informação: o ácido


desoxirribonucleico (DNA) e o ácido ribonucleico (RNA). Tal como as
proteínas, são polímeros lineares.

O DNA e o RNA são constituídos por 4 monómeros diferentes, os


nucleotídeos ou nucleótidos.

Cada nucleótido é formado por três partes distintas:

a) Ácido fosfórico

b) – Oses – pentose: ribose no RNA; desoxirribose no DNA


A: Adenina
c) Base orgânica nitrogenadas: Purinas
G: Guanina

C: Citosina
Pirimidinas
T: Timina
U: URacilo

Os nucleótidos estão ligados entre si por ligações fosfodiester.


Como um polipeptídeo, uma cadeia de ácido nucleico possui uma
orientação química: a extremidade 3’OH, com um grupo hidroxilo livre
ligado ao carbono 3’ de uma - ose; a extremidade 5’P, com um grupo
fosfato livre ligado ao carbono 5’ de uma – ose. Esta direccionalidade
dá origem à convenção de que sequências polinucleotídicas são
sintetizadas no sentido 5’→3’ (da esquerda para a direita). A
orientação de uma cadeia de um ácido nucleico é uma propriedade
extremamente importante.

→DNA

A estrutura da dupla hélice do DNA consiste em duas cadeias


polinucleotídicas enroladas uma à volta da outra, complementares,
antiparalelas, unidas entre si por pontes de hidrogénio através das
bases que se emparelham, respectivamente:

- A com T, através de duas pontes de hidrogénio (A=T)

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- G com C, através de três pontes de hidrogénio (GΞC)

O DNA encontra-se em diferentes locais na célula e pode assumir


diferentes configurações, tal como indicado na tabela I.

Tabela I- Localização e configuração do DNA na célula

Localização do DNA Configuração do


DNA

Cromossomas Eucariotas Linear em cadeia


dupla

“Cromossomas” Circular em cadeia


Procariotas dupla

Mitocôndrias Circular em cadeia


dupla

Cloroplastos Circular em cadeia


dupla

Plasmídeos Circular em cadeia


dupla

Em vírus (bacterianos e Linear em cadeia dupla


animais)
Linear em cadeia
simples

Circular em cadeia
dupla

→RNA

A –ose do RNA – a ribose – possui mais um grupo hidroxilo do que a


desoxirribose do DNA e a timina é substituída pelo uracilo. Pode
assumir as mesmas configurações do DNA e pode também formar
hélice híbrida com uma cadeia de RNA e outra de DNA durante a
transcrição, sendo uma forma transitória.

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⇒Os RNAs mais relevantes são:

• mRNA - RNA mensageiro


• tRNA - RNA de transferência
• rRNA - RNA ribossomal
• hnRNA - RNA heterogéneo nuclear (só nas células eucariotas)
• sRNA - pequeno RNA (só nas células eucariotas)

Os RNAs são cadeias simples de nucleótidos com uma extremidade


inicial 5’P e uma extremidade 3’OH.

⇒ As funções de cada tipo de RNA são:

• mRNA - transporte da informação contida no DNA.


• tRNA - ligação entre a linguagem nucleotídica (mRNA) e a
linguagem proteica (aminoácidos). Cada molécula de tRNA liga-se
ao mRNA e a um aminoácido.
• rRNA - molécula estrutural do ribossoma.
• hnRNA - conjunto de transcritos primários que existem no núcleo e
vão dar origem aos mRNA, tRNA, rRNA e sRNA.
• sRNA - papel importante no processamento (splicing).

I.II Estrutura de um gene procariótico e eucariótico


→ O gene procariótico

Em procariotas, os genes com funções relacionadas encontram-se


geralmente num grupo designado por operão. Um operão é um
conjunto de genes contínuo com funções relacionadas, controlados
por um único promotor que origina um mRNA contendo sequências
codificantes para mais do que uma proteína.

Os mRNAs resultantes da transcrição de genes procarióticos:

• não possuem intrões


• são policistrónicos

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Fig. 1: Estrutura de um gene procariótico.

Fig. 2: Regulação do operão lac em E. coli.

→ O gene eucariótico

Há três tipos básicos de genes eucariotas. Os genes transcritos


pela RNA polimerase I (rRNA), os genes transcritos pela RNA
polimerase II (mRNA) e os genes transcritos pela RNA polimerase III
(tRNA).

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Ao contrário dos mRNAs procarióticos, os mRNAs resultantes da
transcrição de genes eucarióticos:

• possuem intrões, logo têm que ser processados (splicing)


• são monocistrónicos- um polipéptido por mRNA
• processo de transcrição e tradução não acoplado

Fig. 3: Estrutura de um gene eucariótico que codifica uma proteína.

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Produção de uma Proteína recombinante pela
tecnologia do DNA recombinante

DNA cromossomal de
células linfocitárias
infectadas com o HIV1

Obtenção do gene
VIF de HIV por PCR.

Gene VIF

Clonagem
DNA do gene
plasmídico VIF
Gene VIF

Transformação de E. coli
para produção de VIF
em larga escala

Extracção e confirmação
da produção de proteína

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Extracção e purificação de DNA cromossomal de
Escherichia coli

Introdução

O DNA de origem bacteriana pode ser extraído por métodos


diferentes consoante se trata de DNA cromossómico ou de DNA
extracromossómico como é o caso de plasmídeos.
Na purificação de DNA cromossómico a parede celular da bactéria,
se for gram-positiva, é aberta por tratamento com lisozima, no caso
de bacilos, ou em conjunto com lisostafina no caso de estafilococos,
ambas são enzimas hidrolíticas que actuam sobre o peptidoglicano da
parede celular.
Em bactérias gram-negativas pode primeiro enfraquecer-se a
parede celular por congelamento e descongelamento e adição de
EDTA antes do tratamento com lisozima. A lise celular é completada
por adição de um detergente por exemplo SDS em solução salina
tamponada. Estes detergentes vão solubilizar as membranas
dissolvendo principalmente os lípidos. O lisado após este tratamento
deve ficar transparente.
Na solução de lise as células ficam num meio tamponado,
hipotónico e com pH óptimo para a actuação da lisozima
(normalmente tampões Tris-EDTA, pH 8,0). É importante a presença
de EDTA nesses tampões, uma vez que é um agente quelante. O
EDTA vai complexar os iões Mg2+ necessários à actividade das DNAses
celulares impossibilitando assim a sua acção sobre o DNA durante ou
após a lise.
Depois da lise a solução é tratada normalmente com uma RNAse
para hidrolisar o RNA, nomeadamente a RNAse I (a qual só é activa na
completa ausência de Mg2+ e quebra selectivamente as ligações
internucleotídicas entre os nucleotídeos pirimidicos 3’ e os
nucleotídeos adjacentes) e com uma protease de largo espectro
(proteínase K) para degradar as proteínas.
As proteínas residuais e oligopeptídeos podem ser removidas com
solventes orgânicos tais como o fenol e clorofórmio. Com este
tratamento a maior parte das proteínas será desnaturada e entrará
para a fase orgânica ou precipitará na interface das fases aquosa e
orgânica.
O DNA em solução, na fase aquosa com aspecto límpida e viscosa,
é precipitado com etanol ou isopropanol, sendo a precipitação
facilitada quando adicionado ao DNA 1/10 do volume de acetato de
sódio.
A precipitação tem como objectivo a concentração do DNA de alta
massa molecular e a remoção de pequenos oligonucleotídeos de DNA
e RNA (caso se tenha omitido o tratamento anterior com RNAse), de

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parte dos detergentes e solventes orgânicos usados na extracção das
proteínas.
O maior ou menor grau de purificação do DNA genómico depende
das experiências a que se destina. Se for para uma análise de
restrição ou ligação a um vector de clonagem é necessário obter
preparações puras.
Devido ao seu grande comprimento as moléculas de DNA em
solução são altamente susceptíveis de se fragmentarem. Assim a
agitação excessiva durante a purificação resultará numa redução do
peso molecular médio do DNA. A utilização de soluções tamponadas
contendo uma concentração de 10 a 25% (p/v) de sacarose poderá
ajudar a minimizar a quebra do DNA à medida que este é libertado da
célula.

Objectivo: Isolamento de DNA genómico de Escherichia coli.


Parte Experimental:

1. Inocular meio de cultura LB com E.coli; crescer durante a noite a


37ºC com agitação (200 rpm). (Realizado de véspera)

2. Retirar 1 ml da suspensão celular para um tubo eppendorf e


centrifugar a 10 000 rpm durante 5 minutos.

3. Lavar o sedimento 1 vez com 800 µl de NaCl 0,9% ou H2O.

4. Centrifugar durante 5 min a 10 000 rpm. Retirar o sobrenadante.

5. Ressuspender o sedimento celular em 700 µl de STET.

6. Adicionar 40 µl de uma solução de lisozima (10 mg/ml, em água


destilada), homogeneizar e incubar 10 minutos à temperatura
ambiente.

7. Juntar 5 µl de proteínase K (20 mg/ml) e incubar a 37ºC durante


15 minutos.

8. Proceder a duas extracções com 500 µl de fenol/TE.

9. Proceder a duas extracções com 500 µl de clorofórmio: álcool


isoamilico (24:1).

10. Adicionar à fase aquosa final 50 µl de acetato de potássio 3M e


500 µl de isopropanol (ou 2 volumes de etanol), homogeneizar e
incubar 5 minutos á temperatura ambiente.

11. Centrifugar a 10 000 rpm durante 15 minutos, para obter o


sedimento do DNA genómico. Em alternativa pode retirar com
um palito o DNA para um novo eppendorf.

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12.Retirar o etanol, inverter o tubo e deixar secar 5 minutos à
temperatura ambiente.

13. Dissolver o DNA em 50 µl de TE. Guardar a -20ºC.

Reagentes:

STET: 8% (p/v) sacarose


5% (v/v) triton x-100
50 mM EDTA
50mM de Tris-HCl (pH 8)

TE: 10mM Tris-HCl (pH 8)


1 mM EDTA (pH 8)

QUESTÕES:

1- Como é que o DNA está organizado nas células procariotas e nas


células eucariotas?

2- Quantas moléculas de DNA existem numa célula procariota e


numa célula humana?

3- A que tipo de moléculas é que o DNA está associado e como?

4- Quantos genes existem numa célula Humana? E quantos destes


codificam proteínas?

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5- Como é que os genes estão dispersos numa célula animal?

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