PRODUCCIN DE ENZIMAS XILANOLITICAS POR BACTERIAS AISLADAS DE LA LAGUNA BLANCA DEL ALTIPLANO BOLIVIANO 1.

INTRODUCCIN
Hoy en da la tecnologa enzimtica ocupa un lugar preponderante dentro de la biotecnologa y especficamente dentro del sector alimentario. Alrededor de un 65 % de enzimas que se producen industrialmente estn de una u otra manera relacionadas con la industria alimentara, aunque es conveniente sealar que slo las proteasas alcalinas empleadas en detergentes ocupan 25% del total de esta distribucin, 10% restante corresponde a aplicaciones en las reas farmacutica y anallitica. (Lpez, Barzana. 2002) Las xilanasas son enzimas hidrolticas que participan en el rompimiento de los enlaces glicosdicos -1,4 presentes en los polisacridos hemi-celulosa, respectivamente. El inters por las xilanasas empez alrededor de los aos 50 debido a su enorme potencial para convertir la lignocelulosa en glucosa y azcares solubles El progreso de la biotecnologa de celulasas y xilanasas ha llamado la atencin a nivel mundial, ya que los mtodos tradicionales de produccin de enzimas pueden ser demasiado prolongados hasta la obtencin de la enzima purificada. Por esta razn nace la necesidad de buscar nuevas alternativas que permitan la obtencin de enzimas en tiempos cortos y con propiedades bioqumicas adecuadas para el proceso en el cual va a usarse, una de ellas es la obtencin de cepas productoras de xilanasas. Se ha informado que las Xilanasas estn en bacterias marinas, en algas, hongos, en

invertebrado y plantas (Dekker y Richards 1976). Aunque la mayora del xilanasas del extracelular deriva de las bacterias del mesfilas, hongos del psicrfilos as como termfilos y halfilos en las que se han descrito produccin de xilanasas. (Waino, 2002)

Las xilanasas son producidas por una gran variedad de microorganismos entre los que se encuentran hongos y bacterias. La mayora de los microorganismos celulolticos son capaces de producir tanto celulasas como xilanasas; sin embargo, algunos otros slo producen celulasas o xilanasas. Actualmente existen diversos ecosistemas en nuestro planeta considerados como extremos para el hombre, como ser las regiones polares, lagos y ros cidos o alcalinos, las profundidades de los ocanos y muchos otros, que a pesar de estas condiciones se encuentran colonizados por microorganismos especialmente adaptados a estos habitats excepcionales. Desde hace 30 aos se han estado estudiando a aquellos microorganismos que viven bajo condiciones que los humanos podran llamar extremas, organismos que son conocidos como extremfilos (Madigan et al., 1999). La ltima dcada se ha visto un aumento en la investigacin de enzimas producido por microorganismos aislados de los hbitats extremos, en particular, aqullos de extremfilos y termfilos. Sin embargo, los recientes estudios han mostrado enzimas producido por los microorganismos halfilos. 2. OBJETIVOS 2.1 Objetivo General: Seleccionar microorganismos hlofilos/halotolerantes aisladas de Lagunas hipersalinas de la Regin Andina de Bolivia capaces de producir enzimas xilanoliticas. 2.2 Objetivos Especficos: Seleccionar microorganismo halfilo con mayor actividad xilanoltica, en medio de cultivo especfico (HM). Determinar los parmetros experimentales (temperatura, revoluciones por minuto (rpm), % NaCl), y nutricionales para obtener condiciones optimas de la produccin

enzimtica. Cuantificar la actividad enzimtica de las bacterias seleccionadas por el mtodo DNS (cido 3,5 dinitrosalicilico). Determinar las condiciones optimas del Optimizar el extracto crudo enzimtico con distintos parmetros (T, pH, %sal). Determinar la estabilidad de la enzima. Seleccionar levaduras con la capacidad de fermentar D-xilosa. Produccin de xilanasas en un birreactor discontinuo.??? 3. JUSTIFICACIN La Universidad Mayor de San Simn cuenta con el Centro de Biotecnologa el cual aisl microorganismos halfilos halotolerantes de lagunas hipersalinas ubicadas en la regin la Regin Andina de Bolivia. Estos microorganismos poseen la capacidad de producir enzimas hidrolticas extracelulares y su aplicacin en la produccin de alimentos e industrias es de gran importancia debido a que muchos procesos industriales requieren altas o bajas temperaturas o pH cidos o alcalinos, los extremfilos se han convertido para las industrias en atractivas fuentes de biocatalizadores (enzimas) estables a condiciones extremas. Las xilanasas son enzimas hidrolticas que participan en el rompimiento de los enlaces glicosdicos -1,4 presentes en los polisacridos y hemicelulosa. Hoy en da esta enzima es de gran significado en biotecnologa, con aplicaciones en la industria alimentara, fermentacin, textiles hasta la industria de papel. Al lado de la celulosa, el hemicelulosa es el segundo polisacrido renovable abundante en la naturaleza, se produce a una velocidad de 1010 toneladas por ao. El xilano siendo el ms importante del hemicelulosa, es normalmente un heteropolimero, compuesto de un espinazo de los residuos del b-D-xylopyranose 1,4-unidos y ramas de L-arabinofuranose, el cido de D-glucuronic, o 4-O-metilo-Dglucuronic. (Waino, 2002)

Por lo tanto el presente proyecto de grado plantea estudiar microorganismos capaces de producir Xilanansas que forman parte del Banco de bacterias halfilas del Centro de Biotecnologa, con el fin revelar su utilizacin en aplicaciones biotecnolgicas. 4. MARCO TEORICO 4.1 Microorganismos extremfilos Durante mucho tiempo se pens que era imposible encontrar algn organismo que viviera en sitios con condiciones extremas, inhabitables para la gran mayora de los organismos conocidos: temperaturas superiores a 80C, presiones aplastantes, oscuridad total, altas concentraciones de sales o minerales, ambientes muy cidos, o sitios de temperaturas extremadamente bajas. No obstante, cuando las tcnicas utilizadas para explorar esos nichos tan extremos se perfeccionaron, se pudo encontrar una diversidad de organismos que habitan en ellos. Se los conoce como extremfilos, amantes de las condiciones extremas, y pueden ser bacterias, plantas o animales. Los microorganismos extremfilos proveen a la industria un gran rango de herramientas biotecnolgicas en procesos en los que son requeridos enzimas termoestables por ejemplo. Otros extremfilos tienen aplicaciones en el tratamiento de minerales y degradacin de desechos txicos. (Ventosa, et al., 1998). Los extremfilos son mayoritariamente microorganismos procariontes pertenecientes a las Eubacterias y las Archaebacterias (o Arqueas). Si bien estos microorganismos comparten la caracterstica de ser unicelulares procariotas, estudios moleculares recientes han demostrado que las Arqueas tienen un funcionamiento a nivel molecular ms similar a las clulas eucariotas.

Los extremfilos que habitan en altas temperaturas son conocidos como termfilos, los que habitan a bajas temperaturas, psicrfilos, los que viven en altas concentraciones salinas son denominados halfilos, los que viven en sitios de pH cido, acidfilos y los de pH bsico, alcalfilos. (Pera, 2004) La supervivencia de los extremfilos es posible debido a que sus clulas tienen componentes y propiedades particulares que les permiten mantenerse estables en el entorno en el que viven. Algunas de estas propiedades se detallan a continuacin: Contienen enzimas estables. Por ejemplo, los termfilos tienen enzimas que no se desnaturalizan a altas temperaturas y protegen al ADN para evitar su degradacin. Estas enzimas, al igual que las que funcionan a bajas temperaturas o a pH extremos, son conocidas como extremozimas. La membrana celular no es una bicapa de lpidos, como en el resto de los seres vivos, sino una monocapa, con uniones qumicas distintas a las de las membranas convencionales, que le otorga mayor estabilidad. 4.2 Microorganismos halfilos/halotolerantes Los microorganismos halotolerantes y halfilos pueden ser encontrados en cada uno de los dominios de la vida: Arqueas, Bacterias y Eucariontes. Arqueas halfilas aerbicas de la familia Halobacteraceae, son halfilas extremas por excelencia y se desarrollan en lugares tales como el Mar Muerto, lagunas hipersalinas y salares. Entre los eucariotas los halfilos son escasos, el nico microorganismo eucariota de importancia presente en medio ambientes salinos es el alga Dunaliella que es un halotolerante ms que un microorganismo halfilo. El dominio de las bacterias contiene muchos diferentes microorganismos halotolerante y halfilos. La mayor parte de este tipo de bacterias son moderados halfilos; sin embargo, existen algunas bacterias que se asemejan a las arqueas halfilas de la familia Halobacteriaceae en sus requerimientos y tolerancia a la sal. En estos ecosistemas salinos, el dominio Bacteria est principalmente representado por halfilos moderados del grupo Proteobacterias (notablemente en -subdivisin), algunas Gram positivas, cianobacterias y

algunas mas (Oren,2002). Los microorganismos halfilos son aquellos que se encuentran en los ambientes hipersalinos, pero se diferencian de los halotolerantes porque son capaces de reproducirse y realizar sus funciones metablicas de una manera ms eficaz en presencia de altas concentraciones de sales que en su ausencia. Aunque las sales se requieren para todas las formas de vida, los microorganismos halfilos se distinguen o clasifican por el requerimiento de condiciones hipersalinas para su crecimiento: los halfilos ligeros muestran crecimiento ptimo dentro de una concentracin de NaCl que oscila entre 0.2 y 0.85 M (2-5%): los halfilos moderados, crecen entre 0.85 y 3.4 M (5-20 %) de NaCl, y por ltimo, los halfilos extremos, que crecen de 3.4 a 5.1 M (20-30%) de NaCl. En contraste, los organismos no halfilos slo pueden crecer por debajo de 0.2 M de NaCl. (Gonzles- Hernndez, 2002)

Los organismos halotolerantes son aquellos que pueden crecer en presencia y en ausencia de altas concentraciones de sal. Muchos organismos halfilos y halotolerantes pueden crecer dentro de un amplio margen de concentracin de sal, con requerimiento o tolerancia para algunas sales, dependiendo del medio y de los factores nutricionales. (Gonzles- Hernndez, 2002) Los microorganismos halfilos y halotolerantes son encontrados en diversos ambientes como en los charcos salados originados por evaporacin de agua de mar y contienen una composicin de sal similar a la del agua de mar, con iones de sodio y cloruro como los dominantes y con un pH cercano al neutro o ligeramente alcalino. Algunos ambientes salinos incluyen lagos salados y aguas salobres (Espaa, Chile, Bolivia, Djibouti y los Grandes Lagos Salados en Utah), suelos salinos (Mar rojo, Valles Secos Antrticos), alimentos salados (pescado, carne) y otros (Ventosa et al., 1998; Quillaguaman, et al, 2004).

4.3 Extremozimas Las enzimas son protenas que favorecen ciertas reacciones qumicas que, en otras circunstancias, tardaran mucho ms en ocurrir, o directamente nunca ocurriran. Intervienen en la respiracin, la fotosntesis y un sin nmero de reacciones de sntesis y degradacin. O sea: son esenciales para que un organismo se mantenga vivo. Las extremozimas cumplen funciones similares a sus anlogas no extremfilas. Pero presentan diferencias estructurales que les permiten funcionar en condiciones donde las otras se desorganizaran por completo. El termino extremozima ha sido acuado para referirse a enzimas que funcionan a

temperaturas estremadamente altas (o enzimas que funcionan de forma ptima bajo cualquier condicin ambiental extrema; por ejemplo en el fro, a elevada concentracin salina, o a pH muy cido o muy alcalino) extremofilos. Las primeras extremfilas fueron descubiertas hace cosa de 40 aos. La gran mayora, en los ltimos tiempos. Al principio se pens que se trataba de casos raros. Nadie las buscaba, porque viven en ambientes que se crean incompatibles con la vida. Hoy estn en la mira de los cazadores de bacterias. Y es evidente que constituyen un linaje profusamente ramificado del rbol de la vida. La industria imagina otras aplicaciones para las extremozimas. Por ejemplo, aadirlas a los detergentes para que contribuyan a la degradacin de las grasas. O incorporarlas a la comida de los animales para que faciliten la digestin. Existen muchas enzimas que pueden realizar estas funciones, pero solamente las extremozimas pueden hacerlo en el medio alcalino de los detergentes o en el cido aparato digestivo de los animales. ( Alzogaray, 1999) 4.4 Xilanasas Las xilanasas son enzimas hidrolticas que participan en el rompimiento de los enlaces y a los oprganismos que las producen se les denomina

glicosdicos -1,4 presentes en los polisacridos. El inters por las xilanasas empez debido a su enorme potencial para convertir la lignocelulosa (celulosa, hemicelulosa y lignina) en glucosa y azcares solubles. Las xilanasas son producidas por una gran variedad de microorganismos entre los que se encuentran hongos y bacterias. La mayora de los microorganismos celulolticos son capaces de producir tanto celulasas como xilanasas; sin embargo, algunos otros slo producen celulasas o xilanasas. La produccin microbiana de estas enzimas est sujeta a diferentes mecanismos de regulacin. (Ponce, 2001) Las xilanasas realiza la degradacin total de la xilano para producir xilosa o arabinosa es llevada a cabo, por un grupo de enzimas que participan sinergsticamente. Las ms conocidas son las endo--D-xilanasas (E.C. 3.2.1.8), las cuales rompen al azar los enlaces glicosdicos de la cadena principal de la molcula. La arabinofuranosidasa (E.C. 3.2.1.55) hidroliza las cadenas laterales de arabinosa, mientras quelas acetil xilan esterasas (E.C. 3.1.1.72) liberan grupos acetatos. La glucoronidasa (E.C. 3.2.1.139) remueve las cadenas laterales de cido glucornico a partir de unidades de xilosa. Las -xilosidasas (E.C. 3.2.1.37) son enzimas activas sobre oligosacridos cortos, llevando a cabo la hidrlisis de los enlaces -1,4-arilxilopiransido produciendo xilosa. (Ponce, 2001) 4.5 Xilano El material que forma las paredes celulares de las plantas es una matriz compleja de celulosa, lignina y hemicelulosa. Las hemicelulosas son una clase de polmeros que se distinguen por producir al ser hidrolizados una serie de pentosas, cidos glucurnicos y algunas formas desoxi de azcares. Las interrelaciones entre los componentes de la pared celular no son conocidas con detalle pero existen con seguridad enlaces fsicos y covalentes entre ellos. La hemicelulosa ms abundante presente en los alimentos posee en esqueleto de tipo xilano compuesto por unidades (1 -4) -D-Xilopiranosilo, estas ejercen probablemente su mayor efecto en los productos de panadera, en los que mejoran la capacidad de retencin del agua de la harina. (Fennema, 1996)

Las xilanas son heteropolisacridos y su degradacin total para producir xilosa y/o arabinosa es llevada a cabo, como en la celulosa, por un grupo de enzimas que participan sinergsticamente. Las ms conocidas son las endo--D-xilanasas, las cuales rompen al azar los enlaces glicosdicos de la cadena principal de la molcula. (Ponce, 2001) El xilano es el componente mayoritario de la hemicelulosa, la b-1,4-endoxilanasa y la bxilosidasa son las enzimas responsables de la hidrlisis de la cadena principal y representan los principales componentes del sistema xilanoltico. (Ponce, 2001) Segn la bibliografa (Martnez et al, 2002), las materias primas usadas que tiene ms xilano son: paja de arroz, bagazo de caa de azcar, virutas de madera. La corteza de los rboles y la paja contienen hasta 30% de xilano, la madera de conferas 7 12% y la de rboles de hojas caducas 20 - 25%. La cadena consta de 30 - 100 unidades de bD-xilopiranosa con enlaces 1,4 -glicosdicos. 4.6 Aplicacin industrial de las Xilanasas La biotecnologa de las celulasas y xilanasas empez al principio de los aos 80, primero en la alimentacin animal seguida por aplicaciones en la industria de alimentos. Posteriormente estas enzimas empezaron a usarse en las industrias de lavandera, textil y de la pulpa y papel. En las ltimas dos dcadas su uso se ha incrementado en forma considerable y actualmente representan cerca del 20% del mercado mundial de las enzimas. Una de las aplicaciones ms importantes de las xilanasas es en la industria de la pulpa y del papel. El pulpeo Kraft involucra el cocimiento alcalino de la pulpa para remover el 95% de la lignina presente en la madera. El 5% remanente le confiere a la pulpa el color caf pardo oscuro. Por razones estticas y para mejorar las propiedades del papel es necesario un paso del blanqueo, el cual tradicionalmente se haca por un proceso multietapas, que utiliza cloro o dixido de cloro. Las xilanasas, como las celulasas, tambin se usan en la industria alimentaria en la

clarificacin de jugos y vinos, licuefaccin de muclago de caf; extraccin de saborizantes y pigmentos, aceites de plantas y semillas; maceracin de materia vegetal; acondicionamiento de piensos para aves y cerdos y en la industria de la panificacin, entre otras. (Ponce, 2001) En la industria de la panificacin las xilanasas, especialmente la endo-1,4--xilanasa, se adicionan a la masa para mejorar su calidad, obtenindose productos de panadera con mejor textura y sabor. El efecto de las xilanasas es incrementar el volumen especfico de los panes, sin provocar un efecto colateral negativo en el manejo de la masa. (Ponce, 2001) 4.7 Materiales Para la ejecucin del presente trabajo de investigacin, se utilizarn cepas de bacterias halfilas y halotolerantes del banco de microorganismos del Centro de Biotecnologa (FCyTUMSS) y los siguientes equipos y reactivos: 4.7.1 Equipos: Shaker incubator Autoclave Incubadora. Espectrofotmetro UV-Vis Centrifuga Vortex Balanza analtica Bioreactor Bao maria

4.7.2 Reactivos Acido dinitrosalicilico (DNS) NaCl p.a MgSO4.7H2O

CaCl2.2H2O KCl NaBr NaOH p.a Almidn de Yuca Extracto de levadura Agar granulado Xilano Xilosa Tris-HCl Glicina Fosfato de potasio Paja de cebada

5. DESARROLLO EXPERIMENTAL 5.1 Seleccin del mejor microorganismo que produzca xilanasas El Banco de Microorganismos del Centro de Biotecnologa reporta a tres cepas halofilas productoras de xilanasas: LB-4, LC-7 y VS-2. Las cuales sern sembradas en medio liquido al 1% paja de cebada, extracto de levadura 1 % (g/l), NaCL 5% (g/l), sales sintticas como: KCl 0.05% (g/l), NaBr 0.006% (g/l), MgSO47H2O 0.025% (g/l), CaCl2H2O 0.009% (g/l), Llevar a pH = 7.5 con OHNa 0.1N. (Quillaguamn, et al., 2004). Se tomara muestras cada 12 horas y se realizan pruebas de azucares reductores y actividad enzimtico. 5.1.1 Cuantificacin de la actividad enzimtica La actividad xilanolitica se realizar usando xilano al 1%, mediante la determinacin de carbohidratos liberados mediante usando acido 3,5 dinitrosaliclico (DNS). Se cuantificara la

desaparicin del sustrato por espectrofotometra a 540 nm de longitud de onda. Este mtodo tiene una sensibilidad de 0.2 a 2 mg por ml de muestra. (Miller 1952) 5.1.1.1 Procedimiento La cuantificacin de la actividad xilanolitica se coloca 200l de la muestra en tubos de ensayo con tapa rosca, luego se aade la solucin del sustrato (400 l buffer Tris-HCl 50 nM + 1% xilano); se tapan los tubos y se incuba a 30C en un bao mara por 10 minutos. Inmediatamente se aade 1 ml de DNS y se lleva a ebullicin en bao mara por 10 minutos. Luego se enfra los tubos en agua a temperatura ambiente, se agrega 5.33 ml de agua destilada y se agita. Se mide la absorbancia a 540 nm de longitud de onda frente a un blanco que se remplaza la muestra por la solucin buffer y sigue el mismo procedimiento. 5.1.1.2 Curva patrn La curva de calibracin se prepara una solucin madre de xilosa 10 mM. Se disuelve 150.13 mg de xilosa en un matraz aforado de 100ml y diluir de siguiente forma:
Dilucin 1:1 (0,15013g/100ml) 1:2 (25ml/50ml) 1:3 (16ml/50ml) 1:5 (10ml/50ml) Xilosa mol/ml 10 5 3,2 2

En tubos de tapa rosca distribuir 1.5 ml de cada dilucin, aadir 3 ml de la solucin DNS. Llevar a bao mara por 5 minutos, enfriar los tubos y aadir 16 ml de agua destilada. Agitar los tubos y medir la absorbancia a 540 nm de longitud de onda frente a un blanco. 5.2 Caracterizacin de las bacterias halfilas con actividad xilanoltica: Se llevara a cabo un estudio Morfolgico de cada una de las colonias seleccionadas, examinando los bordes, forma, color, elevacin y textura, utilizando cultivos celulares jvenes, de no ms de 24 horas de crecimiento, se realizara una tincin de Gram en los

mismos, posteriormente las clulas seran observadas bajo el microscopio con el objetivo de aceite de inmersin con una magnificacin de x 1000 veces el tamao original; de esta forma, se determinara se el microorganismo es Gram positivos o Gam negativos 5.3 Crecimiento bacteriano a diferentes pH y % sal Se utilizara matraces con 30 ml de medio de cultivo (HM) liquido estril y se ajustara el pH a 6,7,8,9 y 0,5,10 % sal; se incubara a 30C y 200 rpm. El crecimiento ser seguido mediante la medicin de la DO (densidad ptica) a 600 nm en un espectrofotmetro, en intervalos de tiempo de 12 horas desde el momento de su inoculacin por 60 horas con el fin de obtener curva de crecimiento bacteriano. 5.4 Optimizacin de la produccin enzimtica mediante un diseo factorial 2n Una vez obtenidos las curvas de crecimiento microbiano, se implementara un diseo factorial 2n, que describe los experimentos ms adecuados para conocer simultneamente que efecto tienen n factores sobre una respuesta (actividad xilanolitica) y descubrir si interaccionan entre ellos. Donde n representara el nmero de factores seleccionados con el fin de definir la influencia de las diferentes factores en el proceso de obtencin xilanasas hidroliticas extracelulares, este diseo permitir estudiar todas las combinaciones de las distintos factores. Para la obtencin de enzimas xilanoliticas los factores seleccionados sern los sguientes: Velocidad de agitacin (rpm) Temperatura % sal

Se elegir la velocidad de agitacin por que los nutrientes que dispone el microorganismo se dispersan en toda la superficie del recipiente que los contiene y hay menor gasto de energa de la propia bacteria y esto les motiva a crecer ms rpido. La concentracin de NaCL por lo siguiente: por que son halotolerantes, aquellas bacterias capaces de crecer en ausencia de sal

tan bien como en presencia y halfilos aquellos que requieren sal para crecer. La temperatura porque para cada bacteria existe una temperatura ptima en la cual el microorganismo se desarrolla de forma ms rpida y un espectro de temperatura en el cual el desarrollo puede producirse. Los factores considerados: Factor Velocidad de agitacin (rpm) T C %sal Menor 100 30 0 Mayor 200 37 5

Debido a que el diseo factorial presenta 3 factores, el nmero mnimo de experiencias que debern llevarse a cabo es de: 2n = 23 = 8, de la siguiente forma:

# Experimentos 1 2 3 4 5 6 7 8

%NaCl 0 0 0 0 5 5 5 5

T C 30 30 37 37 30 30 37 37

rpm 100 200 100 200 100 200 100 200

El parmetro medible ser determinado por crecimiento bacteriano

la actividad xilanolitica en el trascurso del

5.5 Optimizacin de la actividad enzimtica del extracto crudo (enzimtico) Una vez determinadas las condiciones optimas de la produccin enzimtica, se proceder a obtener el extracto enzimtico, que se llevara a cabo centrifugando el medio inoculado. El parmetro medidle ser la actividad enzimtica, pero a diferentes temperaturas (4,23,30,40,50,60,70)C, pH ( 7,8,9,10) y % sal (0,5,10,15). Esta prueba tiene como fin

determinar las condiciones optimas de la actividad enzimtica (con que factores hidroliza ms la enzima.)

5.6 Fermentacin de la D-xilosa El Centro de Biotecnologa cuanta con un banco de levaduras las cuales ser utilizada para determinar si alguna de estas levaduras pueden fermentar la xilosa en etanol. El mtodo empleado ser en platos donde se utilizara medio solid compuesto por: extracto de malta 2%, agar 2% y xilosa 2%. Se sembrara las levaduras por picadura, luego incubarlas a 30C por 48 horas. Las levaduras que puedan fermentar la xilosa presentaran un halo alrededor de la colonia.

6. CRONOGRAMA DE TRABAJO

Actividades Revisin bibliogrfica Seleccin del MO Pruebas de DNS Caracterizacin del MO Diseo factorial 2 Optimizacin del extracto Aplicacin Anlisis de resultados Redaccin del proyecto

Mayo Junio Julio

Agost o

Septiembre Octubre Noviembre Diciembre