Pesq. Vet. Bras.

27(1):13-17, janeiro 2007

Linfadenite granulomatosa em sunos: linfonodos afetados e diagnstico patolgico da infeco causada por agentes do Complex o Mycobacterium avium1 Complexo
Nelson Mors2*, Lauren Ventura3, Valria Dutra4, Virgnia S. Silva2, Waldomiro Barioni Jr5, Salete R. Oliveira2, Beatris Kramer2 e Jos S. Ferreira Neto6
ABSTRACT ABSTRACT.- Mors N., Ventura L., Dutra V., Silva V.S., Barioni Jr W., Oliveira S.R, Kramer B. & Ferreira Granulomatous lymphadenitis in swine: lymph nodes affected and pathologic Neto J.S. 2007. [Granulomatous diagnosis of the infection caused by Mycobacterium avium Complex agents agents.] Linfadenite granulomatosa em sunos: linfonodos afetados e diagnstico patolgico da infeco causada por agentes do Complexo Mycobacterium avium. Pesquisa Veterinria Brasileira 27(1):13-17. Embrapa Sunos e Aves, Cx. Postal 21, Concrdia, SC 89700-000, Brazil. E-mail: mores@cnpsa.embrapa.br A study to evaluate the distribution of granulomatous lesions in the lymph nodes of swine carcasses was accomplished. The main objective was to compare the methods of isolation of mycobacteria of the Mycobacterium avium Complex (MAC), Ziehl-Neelsen (ZN) staining, histopathological examination and immunohistochemistry (IHC) for the diagnosis of granulomatous lymphadenitis caused by MAC. A total of 431 samples of lymph nodes from 394 swine carcasses kept in 12 cold storage rooms of southern Brazil, which had the Service of Federal Inspection (SFI), were analyzed. Lymph nodes with granulomatous lesions were submitted to histological examination, ZN staining and IHC with monoclonal antibody produced with cellular extract of M. avium. The agreement between the exams was measured by the Kappa test at a 95% confidence level. The macrocospic examination done by SFI correctly identified 90.3% of granulomatous lesions, when compared with histological examination, and the majority of carcasses (92.5%) showed the lesions only in lymph nodes of the alimentary chain. Histological examination confirmed the presence of granulomatous lesions in 90.3% of the lymph nodes. The agreements between histological examination, ZN staining (Kappa: 0.342), IHC and the isolation of MAC (Kappa: 0.102) were low, however high between IHC and histology with typical presence of granulomas in the lymph nodes (Kappa: 0.973). IHC together with histological examination revealed to be efficient for identification of the granulomatous lymphadenitis caused by MAC.
INDEX TERMS: Swine, granulomatous lymphadenitis, Mycobacterium avium, immunohistochemistry.

RESUMO RESUMO.- Realizou-se um estudo com o objetivo de avaliar a distribuio de leses granulomatosas nos linfonodos das carcaas de sunos abatidos e de comparar os mtodos de isolamento do Complexo Mycobacterium avium (MAC), colorao de
em 18 de agosto de 2006. Aceito para publicao em 8 de setembro de 2006. 2 Embrapa Sunos e Aves, BR 153 Km 110, Cx. Postal 21, Concrdia, SC 89700-000. *Autor para correspondncia: mores@cnpsa.embrapa.br 3 CEDISA, BR 153, Km 110, Cx. Postal 273, Concrdia, SC 89700-000. 4 Universidade Federal de Mato Grosso, Av. Fernando Corra da Costa s/n, Bairro Coxip, Cuiab, MT 78060-900. 5 Embrapa Instrumentao Agropecuria, Rua XV de Novembro 1452, So Carlos, SP 13560-970. 6 Depto Medicina Veterinria Preventiva e Sade Animal, FMVZ-USP, Av. Professor Dr. Orlando Marques de Paiva, Cidade Universitria, So Paulo, SP 05508-270. 13
1 Recebido

Ziehl-Neelsen (ZN), exames histopatolgico e de imunohistoqumica (IHQ) para o diagnstico da linfadenite granulomatosa causada por micobactrias do MAC. Foram utilizadas 431 amostras de linfonodos colhidos de 394 carcaas de sunos abatidos em 12 frigorficos da Regio Sul do Brasil, com o Servio de Inspeo Federal (SIF). Os linfonodos que apresentavam leses granulomatosas foram submetidos aos exames histolgicos, ZN e IHQ com anticorpo monoclonal produzido com extrato celular de M. avium. A concordncia entre os exames foi medida pelo teste Kappa, com nvel de confiana de 95%. O exame macroscpico realizado pelo SIF identifica corretamente 90,3% das leses granulomatosas, quando comparado com o exame histolgico e a maioria das carcaas (92,5) apresentam leses apenas nos linfonodos cadeia alimentar. O exame histolgico confirmou a presena de leses granulomatosas em 90,3% dos linfonodos. As concordncias entre os

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exames histopatolgico e colorao de ZN (Kappa: 0,342) e de IHQ e o isolamento do MAC (Kappa: 0,102) foram baixas, porm alta entre os exames de IHQ e histolgico com a presena de granulomas tpicos nos linfonodos (Kappa: 0,973). O exame de IHQ associado ao exame histopatolgico mostrou-se eficiente na identificao das leses de linfadenite granulomatosa causadas pelo MAC.
TERMOS DE INDEXAO: Sunos, linfadenite granulomatosa, Mycobacterium avium, imunohistoqumica.

INTRODUO
A linfadenite granulomatosa em sunos, causada por micobac-trias do Complexo Mycobacterium avium (MAC), uma doena que no altera o desempenho dos animais, mas de importncia econmica devido condenao ou destino condicionado das carcaas afetadas. Seu impacto econmico para a suinocultura da Regio Sul do Brasil foi estimado em 5,8, 7,0 e 8,0 milhes de reais em 1997, 1998 e 1999, respectivamente (Martins 2001). Em rebanhos sunos, o diagnstico presuntivo da infeco pelo MAC in vivo pode ser feito com o teste de tuberculina pareada, utilizando-se PPD aviria e mamfera (Mors et al. 2006), o que permite distinguir tuberculose clssica por Mycobacterium bovis das infeces causadas pelo MAC. Entretanto, h dificuldades para o diagnstico etiolgico por isolamento do agente; pois isso exige procedimentos especiais de laboratrios, demanda muito tempo, tem baixa sensibilidade e custo elevado de execuo (Thoen 1992). As leses observadas nos linfonodos so do tipo granulomatosas (Balian et al. 1995), mas tambm no so conclusivas, uma vez que podem ser provocadas por outras bactrias, como Mycobacterium bovis e Rhodococcus equi (Thoen 1992, Silva et al. 2001). A imunohisto-qumica (IHQ), associada ao exame histopatolgico, poder fornecer um diagnstico etiolgico seguro e rpido, favorecendo a tomada de deciso para seu controle. O objetivo deste trabalho foi estudar a distribuio das leses granulomatosas nos linfonodos das carcaas e comparar tcnicas de identificao do agente em cortes histolgicos de tecidos includos em parafina, para diagnstico da linfadenite granulomatosa causada pelo MAC.

IHQ para colorao das lminas, utilizou-se a tcnica do complexo Avidina-Biotina-Peroxidase (Vectastain Kit ABC). Como anticorpo primrio foi utilizado um anticorpo monoclonal (IgG1) produzido com extrato celular de Mycobacterium avium (QED Bioscience Inc. Cat. 18104). Para revelao da reao, utilizou-se o substrato 3,3diaminobenzidine (DAB) e, como colorao de fundo, a hematoxilina de Harris. Em cada bateria de exame foram includas uma lmina controle positiva obtida de sunos inoculados com micobactrias do MAC, uma lmina negativa obtida de suno SPF (Specificy Pathogens Free) para micobactrias e, para cada lmina testada, incluiu-se uma lmina do mesmo bloco de tecido, substituindo-se o anticorpo monoclonal 18104 por PBS. Para interpretao da reao, considerou-se a quantidade de antgeno com reao positiva na lmina: reao negativa, + reao positiva com pouca quantidade de antgeno, ++ positiva com quantidade moderada de antgeno, +++ reao positiva acentuada presena de antgeno. Para controle de especificidade para o anticorpo 18104 foram usados os fgados de cinco hamsters inoculados com Mycobacterium bovis, com leses granulomatosas. A concordncia entre os exames histopatolgico e de Ziehl-Neelsen, entre o isolamento do MAC e a IHQ, e entre a IHQ e exame histolgico foi medida pelo teste Kappa, com nvel de confiana de 95% (WIN Episcope 2.0 2004)

RESUL TADOS E DISCUS SO RESULT DISCUSSO

O Quadro 1 apresenta os resultados dos linfonodos afetados, no exame macroscpico realizado pelo SIF, compatveis com linfadenite granulomatosa (Fig.1). Os linfonodos da cadeia alimentar (ceflicos e/ou mesentricos) foram os mais afetados, ocorrendo em 95,2% das carcaas. Em 4,5% das carcaas observaram-se leses, ao mesmo tempo, nos linfonodos da cadeia alimentar e nos mediastnicos. Em apenas uma carcaa os linfonodos ceflicos e/ou mesentricos no estavam envolvidos, onde se encontraram leses isoladamente nos linfonodos inguinais. A predominncia de leses nos linfonodos ceflicos e/ou mesentrico nas infeces pelo MAC fato observado por outros autores (Ferreira Neto et al. 1989, Balian et al. 1995, Pavlik et al. 2003, Matlova et al. 2004). Das 394 carcaas apreendidas pelo SIF, devido presena de linfadenite granulomatosa, foram examinados 431 linfonodos pela histologia de rotina e a presena de BAAR (Quadro 2). Destes, confirmou-se a presena de leses granulomatosas em 389 deles (90,3%), indicando boa confiabilidade do exame macrosc-pico realizado na inspeo das vsceras, concordando com os achados de Ferreira Neto et al. (1989). Os granulomas eram constitudos de macrfagos diferenciados em clulas epiteliides, arranjados concentricamenQuadro 1. F reqncia de linfonodos com leses de linfadenite Freqncia granulomatosa em 394 carcaas afetadas e seus respectivos destinos (avaliao macroscpica feita pelo mdico veterinrio do SIF)
Linfonodos afetados Mesentricos Ceflicos Mesentricos + ceflicos Mesentricos + ceflicos + mediastnicos (Me) Mediastinicos Mediastinicos + ceflicos Mesentricos + mediastnicos Inguinais Totais Freqncia (%) 267 (67,8) 24 (6,1) 84 (21,3) 4 (1,0) 0 (0,0) 4 (1,0) 10 (2,5) 1 (0,3) 394 (100,0)

MA TERIAL E MTODOS MATERIAL

Foram utilizadas 394 carcaas de sunos abatidos em 12 frigorficos que tinham Servio de Inspeo Federal (SIF), localizados nos Estados do Paran, Santa Catarina e Rio Grande do Sul. Esses sunos provinham de granjas com histrico de condenaes de carcaas por linfadenite granulomatosa. Para cada carcaa afetada anotaram-se os linfonodos que apresentavam leses granulomatosas, e fragmentos destes foram colhidos em formol a 10% tamponado e processados para exame histolgico de rotina (Luna 1968), e outros fragmentos foram acondicionados sob refrigerao para isolamento microbiolgico, cujos resultados j foram publicados (Silva et al. 1998). Lminas histolgicas foram usadas para pesquisa de bacilos lcoolcido-resistentes (BAAR), pela colorao de Ziehl-Neelsen (Luna 1968). Para exame de imunohistoqumica (IHQ) foram utilizados linfonodos com leses granulomatosas de 216 sunos apreendidos pelo SIF e selecionados das 394 carcaas descritas anteriormente, dos quais 112 eram positivos e 104 negativos para o Complexo Mycobacterium avium (MAC) no exame microbiolgico (Silva et al. 2001). Os linfonodos foram fixados em formalina 10% tamponada e processados conforme rotina para obteno de cortes histolgicos de 5 micra. No exame de
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Quadro 2. Concordncia entre os exames histopatolgicos pela colorao de hemato xilina e eosina e a presena de BA AR na hematoxilina BAAR colorao de Ziehl-Neelsen (ZN) de 431 linfonodos classificados como linfadenite granulomatosa pelo SIF na linha de abate, oriundos de 394 carcaasa
Exame histopatolgico Leso granulomatosa Outro tipo de leso Sem leso Total
a

Freqncia (%) 389 (90,3) 38 (8,8) 4 (0,9) 431 (100,0)

Exame de colorao de ZN %) Positivo Negativo 283 (72,8) 0 0 283 (65,7) 106 (27,2) 38 (100,0) 4 (100,0) 148 (34,3)

Concordncia global observada entre os exames: 0,754; Kappa: 0,342 0,036.

te com ou sem reas centrais necrticas caseificadas e/ou calcificadas e com proliferao de tecido fibroso (Fig.2), s vezes formando uma cpsula externa (Fig.3), conforme j descrito (Senk et al. 1992, Balian et al. 1995). Houve concordncia de 75,4% entre o exame histopatolgico e a presena de BAAR nas leses. Margolis et al.

Fig.3. Granuloma com cpsula fibrosa (seta branca) e necrose de caseificao e mineralizao (seta preta), em linfonodo de suno infectado pelo MAC. HE, obj.25.

Fig.1. Granuloma em linfonodo mesentrico de suno (setas) infectado com micobactrias do Complexo Mycobacterium avium (MAC), com leso.

Fig.2. Necrose de caseificao com mineralizao (seta branca) e incio de proliferao conjuntiva (seta preta), em granuloma de linfonodo de suno infectado pelo MAC. HE, obj.25.

(1994) encontraram sensibilidade de 86% para o exame histopatolgico e apenas de 15% para a colorao cida, considerando o isolamento de micobactrias como teste padro. Neste trabalho, foi possvel encontrar BAAR em 72,8% dos linfonodos com leses granuloma-tosas no exame histolgico. No Quadro 3, esto os resultados de IHQ dos linfonodos lesados, oriundos de sunos com e sem isolamento do MAC. Dos 112 sunos em que micobactrias do MAC foram isoladas, 93 (83,0%) foram positivos e 19 (17,0%) negativos no teste de IHQ. Entretanto, os 93 sunos, cujos linfonodos apresentaram leses caracterizadas por granulomas tpicos com necrose de caseifi-cao e/ou mineralizao (Senk et al. 1992), todos foram positivos no teste de IHQ e os 19 que no tinham granuloma tpico de infeco por micobactrias, todos foram negativos. Por outro lado, dos 104 sunos em que o MAC no foi isolado, 76 (73,1 %) foram positivos e 28 (26,9%) negativos no teste IHQ, e dos 76 sunos que foram positivos no teste de IHQ, apenas dois (2,6%) no apresentavam leses granulomatosas tpicas da infeco por micobactrias (Senk et al. 1992). Quando foram comparados os exames de IHQ com o de isolamento do MAC, houve fraca concordncia entre os testes (Kappa igual a 0,102 0,057) (Quadro 4). Entretanto, houve forte concordncia (Quadro 5) entre os exames de IHQ em corte de tecido e a presena de leses histopatolgicas caracterizadas pela presena de granulomas tpicos nos linfonodos (Kappa igual a 0,973 0,068). A reao positiva no teste de IHQ estava localizada na massa necrtica no interior dos granulomas, principalmente no citoplasma de macrfagos degenerados, localizados na periferia das reas de necrose e/ou mineralizao, e que apresentavam diferentes quantidades de antgenos marcados (Fig.4-6). Isso sugere que o anticorpo utilizado identifica antgenos de secreo do MAC, que so fagocitados pelos macrfagos. Os resultados indicam que o exame histopatolgico, com presena de gra-nuloma tpico e necrose e/ou mineralizao da massa necrtica, seguido do teste de IHQ com o anticorpo monoclonal 18104, foi o procedimento mais adequado para o diagnstico da linfadenite pelo MAC. Os resultados do teste de IHQ nos tecidos de hamsters foram todos negativos, indicando que o anticorpo monoclonal no reconhece antgenos de Mycobacterium bovis no mtodo utilizado. Leses macroscpicas semelhantes tuberculose freqentemente so encontradas, pelo servio de inspeo sanitria de
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Quadro 3. Exame imunohistoqumico (IHQ) em linfonodos de sunos com leso o Complexo granulomatosa no abate, com e sem isolamento de micobactrias do Complex Mycobacterium avium (MAC)
Isolamento de MAC Positivo Resultados do exame de IHQ Negativo (n = 19) Positivo (n = 93) Totais Negativo (n = 28) Positivo (n = 76) Totais
a

Tipos de alteraes histopatolgicasa a b c d 0 16 20 37 93 0 27 17 30 74 5 0 0 0 5 1 0 0 0 1 1 0 0 0 1 15 0 0 0 15 13 0 0 0 13 12 2 0 0 14

Totais 19 16 20 37 112 28 29 17 30 104

-b + ++ +++ + ++ +++

Negativo

a = Granuloma tpico com necrose de caseificao e mineralizao, b = Granuloma com presena ou ausncia de clulas gigantes, mas sem necrose de caseificao e mineralizao, c = Presena de vesculas com delgada cpsula conjuntiva e/ou apenas fibrose, d = Linfonodo sem leso no exame histopatolgico. b - Reao ausente, + positiva fraca, ++ positiva evidente, +++ positiva.

Quadro 4. R esultados comparativos do exame Resultados imunohistoqumico (IHQ) e de isolamento de micobactrias do Complex o Mycobacterium avium (MAC) de sunos de abate com Complexo leso macroscpoica de linfadenite granulomatosaa
Exames Isolamento de MAC Totais
a Concordncia

Exame IHQ + (%) - (%) + 93 (43,05) 76 (35,18) 169 (78,24) 19 (8,80) 28 (12,96) 47 (21,76)

Totais (%) 112 (51,85) 104 (48,15) 216 (100,00)

global observada: 0,560; Kappa: 0,102 0,057.

Quadro 5. R esultados comparativos entre o exame Resultados histopatolgico e imunohistoqumico (IHQ) para identificao da infeco por MAC em sunos de abate com leso macroscpica de linfadenite granulomatosaa
Exames Exame histopatolgicob + Totais Exame de imunoperoxidase + (%) - (%) 167 (77,31) 2 (0,93) 169 (78,24) 0 (0,00) 47 (21,76) 47 (21,76) Totais (%) 167 (77,31) 49 (22,69) 216 (100,00)

Fig.4. Restos celulares com reao positiva (+) para Mycobacterium avium na imunohistoqumica, em granuloma de linfonodo de suno. Tcnica da Avidina-Biotina-Peroxidase, obj.100.

a Concordncia global observada: 0,991; Kappa: 0,973 0,068. b Granuloma tpico com necrose de caseificao e mineralizao.

carnes, em linfonodos do trato digestivo de sunos oriundos de granjas modernas. Dessas leses tm sido isolados, predominantemente, microorganismos pertencentes ao MAC (Szab et al. 1975, Silva et al. 2001, Pavlik et al. 2003, Matlova et al. 2004). As leses macro e microscpicas, encontradas no presente estudo, no so diferentes daquelas provocadas por Mycobacterium bovis e M. tuberculosis (Thoen 1992), no sendo, portanto, o exame histopatolgico suficiente para identificar as espcies de micobactrias e estabelecer relao entre o tipo de micobactria envolvida e as caractersticas das alteraes histopatolgicas (Ferreira Neto 1989, Thoen 1992). As leses observadas em sunos infectados naturalmente, a exemplo daquelas encontradas no presente trabalho, so idnticas quelas provo-cadas em sunos inoculados com o MAC (Senk et al. 1992, Silva 1998). SegunPesq. Vet. Bras. 27(1):13-17, janeiro 2007

Fig.5. Restos celulares com reao positiva (++) para Mycobacterium avium na imunihistoqumica, em granuloma de linfonodo de suno. Tcnica da Avidina-Biotina-Peroxidase, obj.100.

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teste seguro, rpido e econmico para o diagnstico das alteraes patolgicas.

Agradecimentos.- Aos veterinrios do Servio de Inspeo Federal dos 12 abatedouros onde o trabalho foi realizado, pelo auxlio no exame macroscpico das carcaas e coleta dos linfonodos para exames laboratoriais. O Projeto foi financiado pelo Sindicato Catarinense de Carnes e Derivados de Santa Catarina, pela Embrapa e pela FAPESP.

REFERNCIAS
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Fig.6. Restos celulares com reao positiva (+++) para Mycobacterium avium na imunohisoqumica, em granuloma de linfonodo de suno. Tcnica da Avidina-Biotina-Peroxidase, obj.50

do Szab et al. (1975), os dados epizootiolgicos podem fornecer informaes mais conclusivas sobre a etiologia das leses granulomatosas encontradas nos linfonodos de sunos na linha de abate, do que apenas o exame histolgico. Nos rebanhos, o teste de tuberculinizao pareada (Mors et al. 2006) pode fornecer informao importante sobre o grupo de micobactrias envolvidas. Ademais, a presena de leses granulomatosas limitadas aos linfonodos da cadeia digestiva, a origem dos sunos de uma gran-ja fechada, sem contato com outros mamferos, e a ausncia de produtos lcteos na dieta so sugestivos de infeco pelo MAC. A localizao das leses nos tecidos dos sunos afetados importante e define o destino das carcaas nos matadouros. Neste trabalho, os linfonodos da cadeia digestiva (mesentricos e ceflicos) foram os mais afetados. A ocorrncia exclusiva de leses nesses linfonodos sugere fortemente o envolvimento de micobactrias do complexo MAC (Ferreira Neto et al. 1989, Balian et al. 1995, Pavlik et al. 2003, Matlova et al. 2004), demonstrado nesse estudo pelo teste de IHQ; em 18 carcaas foram encontradas leses nos linfonodos mediastnicos, em associaes com leses nos linfonodos ceflicos e mesentricos, mas sem envolvimento do pulmo e de linfonodos do aparelho respiratrio. provvel que a origem das leses nos linfonodos mediastnicos dessas carcaas tenha sido via digestiva, atravs do esfago, e no via respiratria, pois a poro torcica do esfago drenada pelos linfonodos mediastnicos (Clair L.S. St 1967). Isto difere da infeco por M. bovis que, alm de afetar rgos parenquimatosos, como os pulmes, usa, como principal via de infeco, a respiratria (Thoen 1992).

CONCLUSES
O exame macroscpico feito pelo Servio de Inspeo Federal (SIF) nos matadouros onde esse trabalho foi realizado, identificou corretamente 90,3% das leses granulomatosas nos linfo-nodos, quando comparado com o exame histolgico. A linfa-denite granulomatosa causada por bactrias do Complexo Mycobacterium avium (MAC) atinge predominantemente os linfonodos mesentricos e/ou ceflicos. O exame de Imuno-histoqumica (IHQ) das leses de linfadenite granulomatosa mostrou-se eficiente na identificao das infeces causadas pelo MAC, constituindo-se num