UNIVERSIDAD AUTNOMA BENITO JUAREZ DE OAXACA ESCUELA DE VETERINARIA Y ZOOTECNIA

ASIGNATURA: LABORATORIO DE GENETICA APLICADA Y BIOLOGIA MOLECULAR

RESPONSABLE(S): DR. ALEJANDRO CISNEROS SOLANO REGLAMENTO En el laboratorio se maneja materiales potencialmente peligrosos como biolgicos provenientes de muestras de animales y reactivos qumicos de diferente naturaleza. La mayor defensa de nuestra vida depende de nosotros, solo los buenos hbitos, el respeto por las normas de seguridad y el conocimiento de donde reside el peligro servirn para apreciar, valorar y disfrutar del enriquecedor trabajo del laboratorio. Para efectuar un trabajo sin riesgo, as como para lograr una mayor eficiencia posible, es necesario tomar en cuenta ciertas medidas de seguridad, se recomiendan las siguientes: 1.-Es obligacin usar bata blanca debidamente abotonada al estar dentro del laboratorio, principalmente como medida de seguridad. No se les permitir el acceso a los alumnos que no la porten. 2.-Conservar la disciplina y atencin durante los trabajos de laboratorio, para evitar errores as como tomar toda clase de precauciones para impedir accidentes y daos a las personas o al equipo de laboratorio. 3.- Antes de comenzar los experimentos no debe haber ningn mechero encendido ni llave de agua abierta. 4.-No debern efectuarse experimentos que no estn debidamente autorizados por el profesor titular o auxiliar. 5.-No abandonar el lugar de trabajo, solo se podr hacerlo una vez terminada la prctica y con previo aviso. 6.- Atencin especial merecern los experimentos en que se utilicen sustancias inflamables, toxicas o corrosivas. 7.-Los productos inflamables (alcohol, ter, benceno, entre otros) deben estar lejos de fuentes de calor. Si hay que calentar estos productos, se har con bao mara. 8.-Todos los accidentes que resulten en heridas o lesiones, por leves que estas sean, deben informarse inmediatamente a los profesores responsables de la prctica. 9.-Esta prohibido; fumar, comer o beber, maquillarse as como masticar golosinas (muchas sustancias son inflamables, voltiles y/o venenosas). Cualquier sustancia colocada sobre la

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RESPONSABLE(S): DR. ALEJANDRO CISNEROS SOLANO mesa y posteriormente llevada a la boca, puede ser causante de la transmisin de alguna enfermedad o intoxicaciones que pueden llevar, incluso a la muerte. 10.-Nunca se debe llevar los productos qumicos a la boca para probarlos, ni aun en pequeas cantidades. Para oler algo, no hacerlo directamente con la nariz; utilizar la mano semicerrada para arrastrar los vapores hacia ella. 11.-Los desperdicios tales como: Materiales insolubles, trozos de vidrio y fsforos deben desecharse en los cestos de basura. En los lavabos y drenajes no deben dejarse desechos slidos. 12.-Las sustancias qumicas y muestras deben conservarse en frascos bien cerrados, destinados propiamente para ello. 13.-No dejar caer muestras de ninguna ndole al suelo, ni en las manos o la ropa, ni tampoco en el exterior o interior de los aparatos. 14.-Todas las muestras deben aspirarse Preferentemente con una pipeta provista de una perrilla de goma o propipeta, pues muchas sustancias pueden introducirse por error en la boca e infectar o intoxicar al que trabaja en el laboratorio. 15.-Todo recipiente que haya contenido muestras debe desecharse, en caso de querer reutilizarlo, antes de lavarlo debe ser esterilizado en olla de presin o autoclave. Las muestras llevan consigo muchos microorganismos peligrosos. 16.- Al desechar productos qumicos por el desage, dejar que circule abundante agua, aun cuando ya estn neutralizados. 17.-Tocar nicamente las partes del material que sea necesario evitando aquellas que puedan contaminarse, conduciendo a resultados errneos; sobre todo cuando de material estril se trate. 18.-Memorizar la localizacin y el uso de todos los dispositivos de seguridad. Botiqun, regadera, extinguidor de incendios, telfonos de emergencia. 19.-Al trmino de la prctica y antes de salir del laboratorio, lavarse las manos con suficiente agua y jabn microbicida.

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RESPONSABLE(S): DR. ALEJANDRO CISNEROS SOLANO

INDICE 1.- DETERMINACIN DE GRUPOS SANGUNEOS Y TITULACIN DE ANTISUEROS

2.- TITULACIN DE ANTISUEROS (CONTINUACIN DE LA PRACTICA 1).

3.- REGULACIN GENTICA.

4.- MITOSIS Y MEIOSIS.

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RESPONSABLE(S): DR. ALEJANDRO CISNEROS SOLANO 5.- INMUNODIFUSIN RADIAL.

6.- MANEJO DE METODOLOGAS BIOTECNOLOGICAS EXTRACCION DE ADN PLASMIDICO. - CRECIMIENTO ASINTTICO DE POBLACIONES BACTERIANAS. - EXTRACCIN Y PURIFICACIN DEL ADN PLASMDICO. - USO DE ENDONUCLEASAS PARA CARACTERIZAR ADN PLASMIDICO. - OBSERVACIN DE LA DIGESTION EN GELES DE AGAROSA. PRACTICA 1 DETERMINACIN DE GRUPOS SANGUNEOS Y TITULACIN DE ANTISUEROS 1.- INTRODUCCIN La determinacin del grupo sanguneo es una prctica habitual e imprescindible para la transfusin de componente hemticos. La razn est en que el sistema inmune de algunos individuos rechaza los hemates de otros. Esta reaccin inmunolgica est mediada por anticuerpos y es fcilmente visualizable in vitro mediante reacciones de aglutinacin. Se conocen ms de 20 grupos de antgenos eritrocitarios codificados en otros tantos loci gnicos, para los cuales existen mltiples variantes allicas. El resultado son ms de 200 antgenos eritrocitarios identificables. Estos antgenos varan en su inmunogenicidad. Los ms importantes a efectos transfusionales son los antgenos del sistema H / ABO y los del sistema Rhesus (Rh). Sistemas H y ABO Los eptopos responsables son carbohidratos que aparecen en glicoesfingolpidos y glicoprotenas de membrana. El gen H codifica la enzima fucosil-transferasa, que adiciona fucosa a una cadena oligosacardica precursora. Los tres ltimos azcares de la cadena se denominan antgeno H (Fig. 1). En otro locus est el sistema ABO, con tres alelos. El alelo A codifica una transferasa que une N-acetil galactosamina a la cadena H, mientras que el

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RESPONSABLE(S): DR. ALEJANDRO CISNEROS SOLANO alelo B codifica una transferasa que une una galactosa. El alelo O no produce transferasa y por tanto no modifica la sustancia H. El azcar unido al carbono 3 de la galactosa determina la actividad antignica. La galactosa no acepta azcar en el carbono 3 a no ser que haya fucosa unida al carbono 2.

Fig. 1.- Antgenos que distinguen los grupos sanguneos (sistema ABO) Es importante destacar que estos genes son codominantes. Los individuos que expresan los alelos A y B tendrn oligosacridos con los dos tipos de modificaciones. As, se distinguen 4 grupos: A, B, AB y O. La importancia transfusional de estos antgenos radica en que los individuos de un grupo sintetizan anticuerpos frente a los oligosacridos que no estn en sus hemates (Tabla 1). Estos anticuerpos, que se denominan isoaglutininas y que suelen ser IgM, aparecen en grandes cantidades en circulacin sin necesidad de exposicin previa a sangre de otros grupos. La razn parece estar en la reactividad cruzada de sustancias presentes en bacterias de la flora intestinal. Grupo sanguneo Genotipo Ag eritrocitarios A IAIA, IAi A B IBIB, IBi B AB AB II AyB O Ii H Tabla 1.- Grupos sanguneos, genotipo, antgenos y ab sricos Sistema Rhesus Se han identificado ms de 40 antgenos del sistema Rh aunque no se sabe cuntos genes son responsables de este sistema. Son protenas integrales de membrana con un contenido lipdico alto. D es el antgeno Rh ms inmunognico y por tanto el ms Ab sricos Anti-B Anti-A Anti-A, Anti-B

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RESPONSABLE(S): DR. ALEJANDRO CISNEROS SOLANO importante a efectos transfusionales. La presencia de D da lugar al Rh+, mientras que la ausencia (d) da lugar al Rh-. Los anticuerpos anti D, que son IgG, aparecen en la circulacin de los individuos Rh- slo tras una exposicin previa a sangre D, por ejemplo por una transfusin de hemates o tras la gestacin de un feto D. Determinacin de antgenos eritrocitarios y anticuerpos sricos. Antes de una transfusin se analizan los eritrocitos del receptor para ABO y D mediante antisueros anti-A, anti-B y anti-D. Simultneamente se analiza el suero para detectar anticuerpos contra antgeno eritrocitarios (isoaglutininas), mediante hemates A y B previamente tipados. Las reacciones positivas dan lugar a la aglutinacin de los hemates. Para asignar un grupo sanguneo, ambas pruebas deben dar un resultado coincidente. Los resultados discrepantes deben analizarse cuidadosamente. Un test adicional es la prueba cruzada, que examina la compatibilidad entre suero del receptor con los hemates del/los donantes. Para ello, hemates lavados del donante se mezclan con suero del receptor, se incuban, se centrifuga y se examina para hemlisis y aglutinacin 2.- OBJETIVOS. Al finalizar la prctica el alumno ser capaz de: - Interpretar reacciones de aglutinacin. - Determinar los grupos ABO y Rh (D) en hemates. - Determinar ABO en suero. - Obtener antisueros para tipaje. - Titular un antisuero. 3.- EQUIPAMIENTO. - Centrfuga con rotor para tubos de 12x75 10x70 (alternativamente, con rotor para placas microtiter) - Centrfuga para tubos Eppendorf (tipo Minifuge) - Microscopio - Transiluminador - Portaobjetos o placa microtiter de fondo en U - Tubos Eppendorf

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RESPONSABLE(S): DR. ALEJANDRO CISNEROS SOLANO Tubos de 10x70 mm Pipetas de 5-40, 40-200 y 200-1000l y puntas Lancetas de un solo uso.

4.- REACTIVOS Y MUESTRAS - Antisueros anti-A, anti-B y anti-D - Suero salino fisiolgico (NaCl 0.85%) - Muestras de sangre anticoagulada con EDTA (tubos de 2 ml descartes rutinarios de los hemogramas). Se emplearn 5 o ms tubos por pareja de alumnos. - Algodn y alcohol etlico de 70 5.- PROCEDIMIENTO PRECAUCIN: Todas las muestras deben considerarse potencialmente infecciosas 5.1 Determinacin de ABO y Rh (D) en hemates. 1) Preparar un portaobjetos y un tubo Eppendorf rotulado con las iniciales del alumno. En este ltimo se pipetea 1 ml de suero salino fisiolgico. 2) Se limpia un dedo con un algodn humedecido en alcohol y se pincha con la lanceta. 3) Sobre un portaobjetos se depositan 3 gotas de aproximadamente 0.5 cm de dimetro (50 l) separadas. 4) Tomar 10 l de sangre y pipetearlos en el tubo Eppendorf. Guardar a temperatura ambiente, se procesar al final. 5) En cada gota de sangre se pipetean 25 l de antisuero. El orden recomendable es anti-A, anti-B, anti-D. 6) Mezclar con una punta de pipeta durante unos segundos. 7) Determinar la aglutinacin e interpretar el resultado. Puede visualizarse en el transiluminador o utilizar un microscopio en caso de reaccin muy dbil. 8) Determinar la frecuencia de cada grupo en la clase y compararla con las frecuencias establecidas. Grupo % en la clase

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RESPONSABLE(S): DR. ALEJANDRO CISNEROS SOLANO

A B AB O Rh negativo

5.2 Lavado y preparacin de hemates al 2% 1) Rotular el tubo eppendorf de los 10 l de sangre con el grupo hemtico obtenido (A, B, AB, O). 2) Centrifugar el tubo 1 minuto en la Minifuge a velocidad alta. 3) Descartar el sobrenadante con bomba de vaco. 4) Resuspender el pellet y aadir 1ml de suero fisiolgico. 5) Repetir los pasos 2 y 3. 6) Resuspender en 490 l de suero fisiolgico. A esto se denomina hemates al 2% (v/v). Estos hemates sern compartidos por todos los alumnos del grupo.

5.3 Determinacin de ABO en suero o plasma (opcional) 1) Centrifugar la sangre 5 minutos a 400xg. 2) Extraer el suero (o plasma) y depositarlo en un tubo eppendorf. 3) Lavar y diluir hemates A y B al 2% (v/v) en suero fisiolgico (Protocolo 5.2). 4) Pipetear 50 l de suero en dos tubos de poliestireno de 10x70 o en dos pocillos. Pueden tambin prepararse controles negativos (suero fisiolgico) y positivos (suero anti-A, B). 5) Pipetear 25 l de hemates A en un tubo (o pocillo) y hemates B en el otro y mezclar. 6) Centrifugar a 400xg 15 segundos. 7) Dispersar el pellet y determinar aglutinacin.

5.3 Obtencin y titulacin de antisueros anti-A, anti-B y anti-A,B a partir de muestras de plasma. 1) Tomar 5 tubos de sangre anticoagulada con EDTA elegidos al azar.

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RESPONSABLE(S): DR. ALEJANDRO CISNEROS SOLANO 2) Centrifugar la sangre 5 minutos a 400xg. 3) Extraer cuidadosamente el plasma y depositar en un tubo eppendorf rotulado con el nmero de la muestra. El pellet celular se reserva por si fuera necesario posteriormente. 4) En una gradilla colocar 15 tubos de poliestireno de 10x70 (5 filas x 3 columnas) (o utilizar una microplaca (microtiter de fondo en U) 5) Pipetear 50 l de cada plasma en los 3 tubos (pocillos) de cada fila (Tabla de resultados). 6) En los 5 tubos de la primera columna pipetear 25 l de hemates A. En las columnas 2 y 3 pipetear 25 l de hemates B y O respectivamente. Puede procesarse una 4 columna de tubos si se hubieran encontrado hemates AB (ser un control positivo). 7) Incubar 5 minutos. 8) Centrifugar a 400xg 15 segundos. 9) Dispersar el pellet y determinar aglutinacin. (Si se ha trabajado en placa, dispersar el pellet con una pipeta y observar al microscopio invertido, centrndose en el fondo del pocillo). Calificar cada tubo o pocillo con -, + y ++ segn la aglutinacin observada y anotar en la tabla de resultados. 10) Preparar pools de antisueros anti-A, anti-B y anti-A, B mezclando todos los obtenidos en el grupo de prcticas. 11) Titular los pools de antisueros obtenidos (uno cada pareja de prcticas). Para ello, llevar a cabo una dilucin seriada 1/2 y analizar la aglutinacin de una cantidad constante de hemates A o B, tal y como se describe a continuacin. 12) Tomar 8 tubos y rotular 1, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64 y 1/128. 13) Pipetear 50 l de suero salino fisiolgico en todos los tubos excepto en el rotulado 1. 14) Pipetear 50 l de antisuero en el primer y segundo tubo y mezclar. Del segundo tubo tomar 50 l y pasarlos al siguiente, y as sucesivamente. Descartar 50 l del ltimo tubo. 15) Pipetear 25 l de hemates que correspondan y mezclar. 16) Incubar 5 minutos. 17) Centrifugar a 400x g x 15 segundos. 18) Dispersar el pellet y determinar aglutinacin. Anotar en la tabla. 19) El ttulo del antisuero ser la inversa de la mxima dilucin aglutinante. Tabla de resultados HEMATES PLASMA

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Plasma 1 Plasma 2 Plasma 3 Plasma 4 Plasma 5 Titulacin Dilucin: Aglutinacin (++, +, +/- ,- ) Eptopes ABO se encuentran en muchas otras clulas aparte de los eritrocitos. Se han descrito 11 subgrupos de A. Los ms importantes son A1 y A2. Las diferencias son cuantitativas. Los hemates A1 tienen en membrana aprox. un milln de copias, mientras que los A2 tienen 250 000. Aproximadamente un 78% de los individuos A son A1 y 22% son A2. La sangre AB tambin puede dividirse en tipos A1B y A2B. Los A o B dbiles darn aglutinacin con anti-AB pero no con los otros antisueros. Aproximadamente el 1% de las muestras de sangre elegidas al azar contienen aglutininas que pueden dar anormalidades en la determinacin de anticuerpos sricos. Pueden ser anti-A1, anti-H, -anticuerpos, o sueros de mieloma que producen roleaux o bien anticuerpos adquiridos por transfusiones o de origen materno en nios. En otros casos los anticuerpos pueden no detectarse, por ejemplo en inmunodeficiencias o en ancianos o en recin nacidos. En algunos individuos el gen H est ausente. Este fenotipo h homozigtico se denomina Bombay. Los individuos de fenotipo

1/8

1/16

1/32

1/64

1/128

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RESPONSABLE(S): DR. ALEJANDRO CISNEROS SOLANO Bombay tienen ttulos altos de anti-A, anti-B y anti-H en su circulacin. Antgeno A: Existen variantes dbiles de D denominadas Du que pueden no detectarse en anlisis rutinarios, si se identifican con antiglobulina. No hay peligro ya que los individuos Rh- no se sensibilizan con eritrocitos Du positivos. La mayora de los antgenos sanguneos restantes raras veces participan en reacciones transfusionales. Los anticuerpos contra los sistemas Kidd, Duffy, Kell y MNS pueden originar hemlisis si un individuo sensibilizado recibe sangre positiva para estos antgenos. En general, los anticuerpos hemolticos son IgG y reaccionan a 37 C. Casi nunca producen hemlisis los anticuerpos IgM o de reaccin en fro. Los antgenos Rh estn tan separados en la membrana de los RBC que los Ac-IgG anti-Rh no fijan complemento ni aglutinan los eritrocitos Rh (+). Lisan los RBC por opsonizacin. Para detectarlos se emplea anti-IgG humana (test de Cooms indirecto) si aglutinan los IgM. Estas pruebas de aglutinacin se llevan a cabo en solucin salina. Se sabe que esto disminuye la sensibilidad a la hora de detectar anticuerpos IgG debido a las fuerzas inicas de repulsin entre los eritrocitos. Para incrementar la sensibilidad puede aadirse albmina o solucin de baja fuerza inica o polibreno o tratar a los hemates con enzimas. La mejor prctica transfusional es dar sangre isogrupo siempre (clulas, plasma y plaquetas). Cuando esto no se puede, los receptores A o B pueden recibir hemates O y los AB de cualquier grupo. Los receptores O slo reciben hemates O. El plasma con anti-A o anti-B raramente causa problemas salvo en nios muy pequeos. El plasma O es ms probable que cause problemas y debe ser la ltima eleccin en pacientes de grupo distinto del O. Para concentrado de plaquetas (que tienen ABH y aprox. 50 ml de plasma) se siguen las mismas indicaciones que para hemates. FRECUENCIAS Grupo sanguneo A B AB

Frecuencia (%) en caucsicos USA 40 11 4

Frecuencia (%) en asiticos USA 28 27 5

Frecuencia (%) en negros USA 27 20 4

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O Rh negativo

45 15%

40 Menor del 15%

49 Menor del 15%

ISOINMUNIZACIN Rh La prevalencia de la formacin de Ab -Rh depende de la dosis de clulas recibidas. 1ml de clulas sensibiliza al 15% de individuos expuestos, mientras que 250 ml sensibilizan al 6070%. Despus de la exposicin, tan pronto como a las 4 semanas, se detectan Ab IgM dbiles, seguido de una conversin rpida a IgG. Una segunda exposicin a tan solo 0.03 ml de eritrocitos puede desencadenar una formacin rpida de IgG. La enfermedad hemoltica del RN ocurre por paso de sangre del feto Rh+ a la madre Rh(durante el embarazo o durante el parto). Los Ab IgG pueden atravesar la placenta produciendo la hemlisis de los eritrocitos fetales. Inmunizacin Rh se presenta en el 89% (16% segn Rosen) de las mujeres Rh- tras el parto del primer hijo Rh+ ABOcompatible y en el 1.5-2% (7% segn Rosen) cuando el hijo Rh+ es ABO-incompatible. La inmunizacin Rh puede evitarse casi totalmente si se administra una dosis alta de anti Rh (Rh Ig) a las 28 semanas de gestacin (300 g, que no elevan el ttulo de anti Rh materno por encima de 1/4 y no daa al feto) y a las 72 horas del parto (o de la dosis potencialmente sensibilizante de clulas Rh+). Una dosis de 300 g de Rh Ig intramuscular previene la inmunizacin por exposicin a hasta 30 ml de clulas Rh+. Puede utilizarse como profilaxis en casos de aborto o amniocentesis. La administracin de Rh Ig a mujeres embarazadas no tiene efecto perjudicial para el feto. Una vez que el individuo est inmunizado, la administracin de Rh Ig es ineficaz. PREGUNTAS Qu proporcin de tipos sanguneos encontr entre los integrantes del grupo? Cmo explicara el resultado? Cules son ttulos promedios para las aglutininas y , entre los integrantes del grupo?

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PRCTICA 2 PROCESOS GENTICOS. EXPRESIN GNICA EN PROCARIOTAS (OPERN) I.- Introduccin El objetivo de esta prctica es el de observar procesos clave del funcionamiento de los seres vivos, como son, en primer lugar, respuestas de regulacin de la expresin gnica frente a estmulos ambientales, concretamente la accin de un inductor sobre una serie de genes bacterianos organizados en un opern. En segundo lugar, se estudiarn los procesos destinados al crecimiento y reproduccin asexual (mitosis) o sexual (meiosis), que, en organismos eucariotas conllevan una condensacin de los cromosomas y posterior reparto de los mismos, tras un intercambio de material gentico en el caso de la meiosis. La evolucin de la estructura de los cromosomas se puede seguir mediante tinciones especficas y el uso del microscopio ptico. II.- Induccin de genes nod de Sinorhizobium meliloti por flavonoides exudados por la raz de alfalfa (Medicago sativa) Las rizobiceas (rizobios) son un grupo muy heterogneo de bacterias que comparten la caracterstica de establecer simbiosis fijadoras de nitrgeno atmosfrico con leguminosas. Para establecer esta relacin, las bacterias han de encontrarse en las inmediaciones de la raz de la planta (rizosfera) e interactuar con la misma, originando una serie de reacciones en la planta que desencadenarn la formacin de un rgano mixto nuevo, el ndulo simbitico, en el cual se proporciona un entorno controlado, as como los nutrientes necesarios para que la bacteria pueda efectuar el proceso de fijacin de N2.

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RESPONSABLE(S): DR. ALEJANDRO CISNEROS SOLANO La capacidad nodulativa de los rizobios deriva de la actividad de los genes nod, organizados en un nico opern, incluido en el plsmido simbitico o pSym. Algunos compuestos exudados por la raz de las leguminosas, fundamentalmente flavonoides, interaccionan con un receptor en la membrana del rizobio (protena NodD). La protena NodD activada por flavonoides acta como inductor del promotor de los genes nod. La interaccin rizobio-leguminosa es en general muy especfica entre un gnero bacteriano y una especie vegetal determinados, entre otras razones, porque flavonoides especficos de una leguminosa y no de otra, inducen de forma especfica a su bacteria y no a otras. As, la luteolina es un flavonoide exudado por la raz de alfalfa, que induce a los genes nod de Sinorhizobium meliloti, que nodula alfalfa y no otras leguminosas que no secretan estos flavonoides. Prctica Se observar la induccin por luteolina del promotor de los genes nod de S. meliloti aprovechando una cepa a la que se le ha introducido el gen lacZ, que codifica para la actividad b-galactosidasa, bajo el control de dicho promotor. La -galactosidasa hidroliza el enlace O-glucosdico de la lactosa, entre b-galactosa y glucosa. En la prctica, como sustrato se utilizar Xgal (5-bromo-4-cloro-3-indolil- b-galactosa), que tambin contiene un enlace Oglucosdico con la b-galactosa. Al separarse de la galactosa, el 5-bromo-4cloro-3-indol dimeriza espontneamente generando un compuesto de color azul (5,5-dibromo-4,4-dicloro-ndigo). III.- Mtodo Tomar dos tubos Eppendorf y aadir a cada uno de ellos 1mL del cultivo de Sinorhizobium meliloti

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RESPONSABLE(S): DR. ALEJANDRO CISNEROS SOLANO Aadir a uno de los tubos 10 mL de luteolina (que se encuentra disuelta en metanol) y al otro 10 mL de metanol. Aadir a ambos tubos 5 mL de X-gal. Incubar a 28C durante media hora.

IV.- Preguntas 1. Qu se observa tras la incubacin? 2. Por qu tambin toma color azul la muestra sin luteolina? 3. Qu tipo de opern es el de los genes nod? Dibuja un esquema

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MITOSIS Y MEIOSIS

1. Mitosis en clulas del meristemo apical de raz de cebolla: Mediante el proceso de mitosis, el ncleo de las clulas eucarticas se divide, repartiendo de forma equitativa el material gentico, previamente duplicado; asmismo, el citoplasma tambin se dividir, repartiendo los orgnulos celulares en dos clulas hijas. Habitualmente, la mitosis se estudia en 5 fases, que tienen su reflejo en la observacin al microscopio de clulas mitticas. En clulas que no se encuentran en la fase de mitosis del ciclo celular, clulas en interfase, se puede observar un ncleo muy definido por su membrana nuclear. Cuando estas clulas entran en mitosis, las distintas fases se diferencian como: Profase: el material cromosmico se condensa y comienzan a hacerse visibles los cromosomas. La membrana nuclear y los nucleolos se desorganizan, por lo que el material nuclear ocupa gran parte de la clula. Prometafase: los cromosomas estn completamente condensados y buscan su ubicacin en el plano ecuatorial de la clula. Metafase: los cromosomas estn situados en el plano ecuatorial de la clula, formando la placa madre. Anafase: las cromtidas hermanas se separan, migrando un juego hacia cada polo de la clula. Telofase: cada juego de cromosomas, situado en cada polo de la clula se descondesa. Se organiza la membrana nuclear y los nucleolos.

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Durante el proceso de final de telofase, se puede observar la citocinesis, por estrangulamiento en clulas animales o por formacin de un tabique en clulas vegetales.

Prctica Se observar el proceso de mitosis en clulas del meristemo apical de la raz de cebolla. Este tejido est formado por clulas indiferenciadas que se dividen activamente. Para la observacin del proceso, se realizar una tincin previa del material gentico, con orcena actica.

Mtodo 1.- Pretratamiento con HCl (8%) - Cortar 2 cm de los extremos apicales de la raz - Sumergir por 10 min., en HCl al 8% - Secar los pices en papel secante 2.- Fijacin y tincin de la muestra -cortar el extremo apical de la raz y colocarlo sobre un vidrio de reloj. - aadir gotas de orcena hasta cubrir la raz. - calentar el vidrio de reloj hasta observar vapor blanco. Cuidar que nunca se seque la raz. - dejar enfriar durante 5 min y repetir la operacin. - dejar enfriar 10 min. 3.- Preparacin de la muestra. - colocar el meristemo teido sobre un portaobjetos. - cortar en 5-6 trozos con un bistur. - aadir una gota de orcena fresca y colocar un cubreobjetos.

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RESPONSABLE(S): DR. ALEJANDRO CISNEROS SOLANO - colocar una almohadilla de papel de filtro sobre el cubre y realizar el aplastamiento para extender las clulas, presionando fuertemente con el dedo pulgar. - retirar la almohadilla de papel y observar la preparacin. Preguntas 1. 2. 3. 4. Qu porcentaje de clulas se encuentra en mitosis? Por qu realiza el pretratamiento con HCl al 8%? Se observa el huso acromtico? Por qu? Qu tipo de colorante es la orcena?

2. Meiosis en testculos del saltamontes Corthippus jucundus El establecimiento de la reproduccin sexual llev implcito el desarrollo de un tipo de divisin celular que redujera el nmero cromosmico de las especies para evitar su poliploidizacin: la meiosis. Mientras la mitosis ocurre potencialmente en cualquier momento de la vida y en todos los tipos de clulas, tejidos y rganos de un organismo, la mayora de los organismos vivos con reproduccin sexual utilizan parte de su vida o tejidos especializados, que clsicamente se encuentran en las gnadas, para, mediante la meiosis producir clulas esencialmente diferentes de las progenitoras en cuanto a las combinaciones posibles de su material hereditario, su nmero cromosmico y su cantidad de ADN. Este proceso especial de divisin celular se basa en la sucesin de dos divisiones nucleares precedidas de un nico periodo S de duplicacin del ADN. Durante la profase de la primera divisin se establece un proceso de intercambio gentico entre cromosomas homlogos y en la segunda divisin se sigue un proceso mittico, en el que se reparten las cromtidas hermanas. Profase I: Tras la fase de replicacin del ADN, la cromatina se condensa para visualizar los cromosomas. Durante la Profase I tiene lugar el evento clave de la meiosis, como es el

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RESPONSABLE(S): DR. ALEJANDRO CISNEROS SOLANO apareamiento de los cromosomas homlogos. Durante ella, pueden reconocerse varios estadios: Leptoteno (del griego cintas delgadas): el ncleo aumenta de tamao y se comienzan a visualizar los cromosomas Zigoteno (del griego cintas unidas): se produce la unin o sinapsis de los cromosomas homlogos, mediante la formacin de un complejo proteico, que acta a modo de cremallera, o complejo sinaptonmico. El cromosoma resultante se denomina ttrada, por estar formado por 4 cromtidas (dos de cada homlogo) o bivalente (dos cromosomas homlogos). Paquiteno (del griego cintas gruesas): se produce el entrecruzamiento o crossing-over de las cromtidas no hermanas en las ttradas. Durante este proceso pueden intercambiarse fragmentos de cromtida La presencia del fenmeno de entrecruzamiento se visualiza en una estructura especial llamada quiasma. Diploteno (del griego cintas dobles): los cromosomas homlogos se separan y permanecen unidos por los quiasmas, que entonces se pueden visualizar. Diacinesis: los quiasmas se desplazan hacia los telmeros, a modo de cremallera y se separan totalmente los cromosomas homlogos, cuya condesacin ha aumentado. Se forma el huso acromtico y se disuelve la membrana nuclear.

Metafase I: las ttradas se alinean en el ecuador de la clula. Las fibras del huso se enlazan al centrmero de cada par homlogo y los eventos subsiguientes son similares a la mitosis. Anafase I: las ttradas se separan y los cromosomas son arrastrados a los polos opuestos por las fibras del huso. Los centrmeros en la Anafase I permanecen intactos. Telofase I: es similar a la de la mitosis, salvo que al final cada clula slo posee un grupo de cromosomas replicados. Dependiendo de la especie, se puede formar (o no) la nueva membrana nuclear. Algunos animales pueden dividir sus centrolos durante esta fase.

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RESPONSABLE(S): DR. ALEJANDRO CISNEROS SOLANO

Profase II: la membrana nuclear (si se form durante la Telofase I) se disuelve, y aparecen las fibras del huso, al igual que en la profase de la mitosis. Metafase II: es similar a la de la mitosis, con los cromosomas en el plano ecuatorial y las fibras del huso unindose a las caras opuestas de los centrmeros, en la regin del cinetocoro. Anafase II: el centrmero se divide y las cromtidas, ahora cromosomas, son segregadas a los polos opuestos de la clula. Telofase II: es idntica a la Telofase de la mitosis. La citocinesis separa a las clulas. La consecuencia de la meiosis es la formacin a partir de una nica clula diploide (2n cromosomas), de cuatro distintas con un nmero cromosmico n (haploide). Prctica Se observarn las diferentes fases de la meiosis tras teir con orcena lacto-propinica preparaciones obtenidas por aplastamiento a partir de testculos de ortpteros, clsicamente empleados para estudios citogenticos debido a que estas especies son de fcil adquisicin y mantenimiento en el laboratorio. Adicionalmente, poseen un nmero reducido de cromosomas de gran tamao y se pueden distinguir con facilidad las diferentes etapas de la meiosis. En el tbulo seminfero de ortpteros las clulas que cursan la espermatognesis se encuentran en grupos denominados CISTOS. Todas las clulas que componen un mismo cisto son sincrnicas, es decir, estn en el mismo estadio de la meiosis por lo que resulta relativamente fcil visualizar las distintas etapas meiticas en una misma preparacin.

Mtodo 1. Tincin de la muestra

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RESPONSABLE(S): DR. ALEJANDRO CISNEROS SOLANO Separar un tbulo seminfero de un testculo de ortptero fijado en etanol: cido actico 3:1 y colocarlo sobre un portaobjetos. Colocar inmediatamente sobre l una gota de orcena y dejar unos 5 minutos. Cuidado, no dejar secar el material!

2. Preparacin de la muestra - Colocar sobre el tbulo un cubreobjetos y utilizando la punta de un lpiz y con presin muy suave dispersar el material. - Con un trozo de papel de filtro, eliminar la orcena que ha rebosado por los laterales del cubreobjetos y, con cuidado de no moverlo, realizar el aplastado presionando fuertemente con el dedo pulgar sobre una superficie plana. - Observar la preparacin

Preguntas 1. Por qu no es necesario en este caso calentar la muestra durante la tincin con orcena? 2. Cuntos cromosomas tiene el saltamontes Corthippus jucundus macho? 3. Adems de las fases de la meiosis, qu otros procesos se observan? 4. Se aparean todos los cromosomas durante la profase I?

UNIVERSIDAD AUTNOMA BENITO JUREZ DE OAXACA

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RESPONSABLE(S): DR. ALEJANDRO CISNEROS SOLANO ESCUELA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA LABORATORIO DE GENETICA APLICADA Y BIOLOGA MOLECULAR INMUNODIFUSION RADIAL I.- INTRODUCCION Las tcnicas de inmunoprecipitacin pueden emplearse para la deteccin de anticuerpos o antgenos. La inmunodifusin doble de Ochterlony es la tcnica semicuantitativa ms usada para determinar la especificidad de los mismos. A pesar de no ser una tcnica sofisticada y sensible, es la mas popular y se utiliza en ensayos de produccin de anticuerpos contra antgenos solubles en animales como ratn, rata o conejo. Las muestras de anticuerpo y antgeno se colocan en dos pocillos separados en una matriz de agar; siendo la matriz de soporte inerte en donde se difunden ambas muestras. Cuando el anticuerpo se encuentra con el antgeno estos forman complejos antgenoanticuerpo, los cuales son visibles con una lnea blanca de precipitacin entre los pocillos. El agar debe tener un pH de 8.0, este favorece la precipitacin especfica de los complejos antgeno-anticuerpo, ya que las inmunoglobulinas presentan menos interacciones inicas no especficas con el antgeno y menos fuerza de repulsin entre ellas mismas. Si dos antgenos similares en diferentes pocillos difunden hacia un anticuerpo, el patrn de precipitacin puede llegar a formar espolones, lo cual signifia que el anticuerpo a pesar de ser especfico para un antgeno es capaz de reacciones con otro con las mismas caractersticas estructurales.

II.- MATERIAL - Portaobjetos - Agarosa

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RESPONSABLE(S): DR. ALEJANDRO CISNEROS SOLANO - Suero hiperinmune - Gotero - Antigenos - Cmara hmeda - Palillos - Alcohol al 70% - Torundas de algodn III.- PROCEDIMIENTO 1.- En un portaobjetos limpio y desengrasado, caja de Petri o en una placa, se vierte agarosa al 1.0%. 2.- Una vez solidificado se perforan pequeos pozos en el agra separados algunos milmetros. 3.- Las muestras que contengan antgeno o anticuerpo se colocan en pozos opuestos. 4.- Color el material que contiene la agarosa en una cmara hmeda durante 24 h. 5.- Observar presencia o ausencia de lneas de precipitacin por el complejo Ag-Ab visiblemente a la luz directa IV.- PREGUNTAS 1.- Hubo semejanzas entre los 2 antgenos, cmo se infiere esto? 2.- Esquematice los resultados y la forma de interaccin al formarse el complejo Ag-Ab. 3.- Existen cambios en los radios de inmunoprecipitacin. Por qu?

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RESPONSABLE(S): DR. ALEJANDRO CISNEROS SOLANO OBTENCIN DE DNA PLASMDICO BACTERIANO OBJETIVO.- Aislar DNA plsmdico de E. coli y realizar los anlisis moleculares correspondientes, e identificarlo como una poderosa herramienta Biotecnologca. I.- INTRODUCCIN Los plsmidos son molculas de DNA circular, doble hebra, extracromosmico, que se replican de forma independiente al genoma y que pueden ser separados fcilmente del DNA cromosmico debido a su pequeo tamao. La funcin de muchos de ellos es desconocida, pero algunos de ellos confieren ventajas selectivas al organismo, como la resistencia a agentes antimicrobianos (antibiticos). La presin selectiva que se induce al aplicar un antibitico no especfico para el tratamiento de una infeccin en particular puede generar un resultado adverso: al aplicar un antibitico para el cual las bacterias poseen un plsmido que les confiere resistencia al mismo, se est seleccionando precisamente una poblacin bacteriana que sobrevive al tratamiento y que eventualmente puede causar un brote infeccioso difcil de controlar. Los plsmidos son fcilmente transmitidos entre poblaciones de bacterias, de modo que las bacterias resistentes pueden transmitir esta informacin gentica a su progenie o bacterias vecinas. Debido a algunas caractersticas de los plsmidos como su peso molecular (en comparacin con el cromosoma bacteriano), su replicacin independiente del cormosoma y su alto nmero de copias por clula, los plsmidos han sido modificados en el laboratorio para su uso como herramientas de la Biologa Molecular. Estos plsmidos modificados son llamados vectores. Los vectores se utilizan como portadores de informacin gentica exgena que puede ser fcilmente aislada y amplificada en las bacterias en un procedimiento denominado clonacin de genes. El hecho de que la secuencia de nucletidos es conocida (en la mayora de los vectores plasmdicos) lo que permite su corte especfico con enzimas de restriccin para la posterior insercin de un DNA de inters. La bacteria de uso ms comn para el uso de los plsmidos en el laboratorio con fines de clonaje es la Escherichia coli. Esta bacteria es un husped comn

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RESPONSABLE(S): DR. ALEJANDRO CISNEROS SOLANO del tracto digestivo de mamferos ya que forma parte de la flora intestinal, por lo que el riesgo de infeccin por manipulacin de E. coli es muy bajo. Las tcnicas de aislamiento y purificacin de plsmidos han tenido gran desarrollo lo que permite obtener preparaciones de cantidad y calidad adecuadas que son la base de la mayora de los protocolos en Biologa Molecular. Uno de los mtodos ms utilizados es la desnaturalizacin alcalina en presencia del detergente duodecil sulfato de sodio (SDS), el cual se basa en las diferencias con respecto a la forma y tiempo de desnaturalizacin y renaturalizacin del DNA de plsmido versus DNA cromosomal. Los plsmidos al tener un tamao menor, pueden ser separados fcilmente de las molculas de DNA cromosomal que son grandes y precipitan ms rpidamente. El primer paso consiste en crear un ambiente osmtico hostil para la bacteria y lograr as su lisis y consecuente liberacin del material gentico. Para ello, las bacterias son puestas en contacto con una solucin de alta concentracin de sales, glucosa y cido etilendiamino tetractico (EDTA) (solucin I). Este ltimo es un agente quelante de calcio (el calcio es un in estabilizador de las membranas bacterianas). Posteriormente se agrega una solucin (solucin II) con una alta concentracin de SDS e hidrxido de sodio: en condiciones alcalinas (pH 11) el DNA se desnaturaliza. Sin embargo, el DNA cromosomal al no ser tan compacto se desnaturaliza ms rpidamente que el DNA de plsmido. Cuando a esta solucin se le agrega acetato de potasio (solucin III), el DNA desnaturalizado (cromosomal) forma un agregado junto con el SDS y las protenas bacterianas, el cual precipita, mientras que el DNA del plsmido se mantiene en solucin. La separacin de la fraccin soluble se logra mediante centrifugacin. Finalmente, el DNA del plsmido es concentrado por precipitacin con etanol. Debido a que este procedimiento no garantiza una alta pureza, es posible que la muestra final contenga trazas de DNAsas bacterianas que se acarrean durante el proceso de extraccin. Para evitar la degradacin de las molculas de ADN por estas enzimas, se aconseja trabajar de forma rpida y con soluciones a baja temperatura. Una persona adems tambin es portador de DNAsas en sus manos, saliva, lgrimas que pueden contaminar la muestra por lo que se recomienda mucha atencin y cuidado en la extraccin.

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RESPONSABLE(S): DR. ALEJANDRO CISNEROS SOLANO Para que un plsmido pueda ser utilizado como vector, se le inserta un fragmento de DNA de inters, para ello primero es digerido con enzimas (endonucleasas) de restriccin, se agrega el fragmento de inters y finalmente es ligado. Las endonucleasas de restriccin son enzimas que reconocen secuencias especficas de DNA de doble cadena y cortan ambas hebras de la molcula. El corte se produce dentro de la secuencia de reconocimiento, originando fragmentos con extremos romos o fragmentos con extremos cohesivos. Esta propiedad es muy importante porque permite unir fcilmente dos fragmentos de DNA de orgenes distintos, siempre que hayan sido cortados con un mismo enzima de restriccin. Esto se traduce en la formacin de molculas de DNA hbridas, lo que constituye la base de la Tecnologa del DNA Recombinante. El anlisis de los fragmentos de DNA generados por la digestin con enzimas de restriccin se realiza en electroforesis en geles de agarosa. Este anlisis se basa en que, a pH neutro o alcalino, los grupos fosfato del DNA confieren a la molcula carga neta negativa que est uniformemente distribuida. Para molculas de DNA de la misma conformacin, sometidas a unas mismas condiciones electroforticas, la velocidad de migracin de los fragmentos de DNA en el gel depende slo de su tamao, puesto que las molculas mayores tendrn ms dificultad para atravesar los poros del gel que las ms pequeas. II.- MATERIALES Y REACTIVOS -Medio Luria Bertani. -Bacteria E. coli conteniendo un vector plasmdico. Antibiticos para la seleccin del plsmido. -Ampicilina -Solucin I: 50 mM Tris.Cl, pH 8, 10 mM EDTA, 20 mM glucosa 60 -Solucin II: 200 mM NaOH, 1% SDS -Solucin III: 3 M Acetato de potasio -Etanol al 70% y al 95% -Buffer TE -Hielo

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RESPONSABLE(S): DR. ALEJANDRO CISNEROS SOLANO -Tubos de 15 ml -Micropipetas y pipetas. -Cmara de electroforesis III.- PROCEDIMIENTO PARTE I.- Crecimiento asinttico de poblaciones bacterianas. -Preparar el medio enriquecido Luria Bertani. Para ello, aadir a 950 ml de agua destilada 10 g de bactotriptona, 5 g de extracto de levadura y 10 g de NaCl. Mezclar hasta disolver los componentes y ajustar el pH a 7 con NaOH 5 N. Ajustar el volumen a 1 l con agua destilada. Esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 min. Con la ayuda de un asa de cultivo esterilizada al calor, tomar de la placa una colonia aislada y sembrarla en un tubo con 3 ml de medio de cultivo LB conteniendo 100 g/ml de ampicilina. Incubar a 37 C durante 24 horas en agitacin. PARTE II.- Extraccin y purificacin del ADN plasmdico. -Poner en un tubo Eppendorf 1,5 ml un cultivo de E. coli que ha sido sembrado el da anterior. Centrifugar dicho tubo 2 min en una microcentrfuga. A continuacin, eliminar el sobrenadante procurando dejar la pastilla de clulas lo ms seca posible. Con una micropipeta, resuspender las clulas en 100 l de solucin I (resuspender pipeteando). -Aadir al mismo tubo 200 l de la disolucin alcalina de lisis (Solucin II). Aqu es importante no mezclar pipeteando sino mezclar invirtiendo el tubo varias veces. La muestra debe quedar clara y viscosa. Incubar 23 min a temperatura ambiente. -Neutralizar aadiendo 150 l de la Solucin III. Agitar de nuevo por inversin. Aparecern agregados blancos al precipitar el DNA cromosmico. Incubar 23 min a temperatura ambiente.

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RESPONSABLE(S): DR. ALEJANDRO CISNEROS SOLANO -Centrifugar durante 5 min a mxima velocidad (de ser posible a 4 C). -Pasar cuidadosamente el sobrenadante con una micropipeta (aproximadamente 400 l) a otro tubo eppendorf limpio evitando tocar el sedimento. En este sobrenadante se encuentra el DNA plasmdico. -Precipitar el DNA aadiendo al sobrenadante 1 ml de etanol absoluto fro (refrigerado a 20 C). Mezclar bien por inversin. -Centrifugar durante 20 min a mxima velocidad (de preferencia a 4 C). -Desechar el sobrenadante utilizando una micropipeta evitando tocar el fondo. Si es necesario, repetir la centrifugacin 1 min para retirar todo el sobrenadante posible. El plsmido se encuentra en el sedimento junto con RNA fragmentado. -Evaporar todo el sobrenadante remanente secando los tubos conteniendo el precipitado de plsmido al vaco o en una estufa a 60 C durante 15 min. -Resuspender en 20 l de buffer TE. PARTE III.- Uso de endonucleas para caracterizar ADN plasmdico Digestin del ADN con las BamHI, EcoRI y HindIII. La reaccin de digestin se lleva a cabo en tubos eppendorf. Para la reaccin de digestin seguir el protocolo establecido por la empresa que generalmente es: aadir a un tubo 10 l de la solucin de DNA plasmdico, 10 l de una mezcla que contiene agua destilada, el buffer respectivo de la enzima y una de los siguientes enzimas de restriccin (EcoRI, HindIII o BamHI ) en proporcin 7:2:1 (7 l de agua, 2 l de buffer y 1 l de enzima . Agitar suavemente golpeando el tubo con el dedo e incubar en un bao Mara a 37 C durante al menos dos horas (puede hacerse el d a anterior y dejarse incubando durante la noche).

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RESPONSABLE(S): DR. ALEJANDRO CISNEROS SOLANO PARTE IV. Observacin de la digestin en gel de agarosa. -Se utilizar un gel de agarosa al 0.8 % en buffer TBE o TAE (solo se debe usar un buffer, NO combinaciones). Para preparar 100 ml (preparar lo necesario, p. ej. 300 ml) se deben pesar 0.8 g de agarosa, colocarla en un matraz Erlenmeyer y aadir 100 ml del buffer TBE o TAE, luego fundir en un horno microondas evitando que la agarosa hierva y se derrame. Una vez fundida la agarosa se agrega bromuro de etidio (0,25 g/ml final) (tener mucho cuidado ya que esta sustancia es altamente cancergena). Colocar la mezcla en el carro de electroforesis y colocar el peine cerca de uno de los bordes de la misma. Dejar que la agarosa solidifique sin mover el carro. Una vez solidificado el gel, retirar el peine y observar los pocillos formados. Colocar el carro en al cmara de electroforesis y agregar buffer TBE o TAE hasta que el gel quede completamente sumergido. Si no se va a utilizar el gel hasta el da siguiente, envolverlo en un plstico y dejarlo en la nevera hasta entonces. -La razn por la que se utiliza el bromuro de etidio es porque este se intercala entre las bases del DNA y emite fluorescencia en el rango visible del espectro electromagntico, tras ser irradiado con luz ultravioleta, permitiendo visualizar los fragmentos de DNA. -Tomar 10 l de la muestra digerida y aadirle, antes de cargarla en el gel, 5 l del mismo buffer utilizado para la elaboracin de la agarosa (TAE o TBE) y azul de bromofenol (un colorante de pequeo tamao molecular que sirve para controlar la migracin del frente de la electroforesis). Colocar cuidadosamente cada muestra en un pozo distinto del gel con una micropipeta automtica. Dejar libre un pozo para colocar un marcador de peso molecular (contiene fragmentos de DNA de tamao conocido). Por ltimo, conectar los electrodos de la cmara de electroforesis a la fuente de alimentacin, aplicando un voltaje constante de 120 V una media hora. Una vez terminada la electroforesis, se coloca el gel sobre un transiluminador que emite radiacin ultravioleta para observar el tamao de los fragmentos obtenidos IV.- PREGUNTAS.- Se contestaran varios reactivos durante transcurso y avance de la prctica