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Bioqumica I DNA e PTNS

Dogma Central da Biologia Molecular


DNA RNA Protena Traduo

Transcrio Replicao

DNA esttico: caracterstica do DNA em originar clulas filhas com material gentico fidedigno. A base do Dogma Central o fluxo de informaes do DNA s protenas. Watson e Crick foram os responsveis pela caracterizao do DNA, que consiste em: fita dupla formando uma dupla hlice; dimetro constante, o que sugere que as bases nitrogenadas apontam para o interior da molcula e que as pirimidinas pareiam com as purinas; as fitas so antiparalelas, com o pareamento de bases complementares A=T e CG. A composio qumica do DNA de um grupamento fosfato associado com a pentose desoxirribose e as bases nitrogenadas adenina, timina, guanina e citosina . Sendo a adenina e a citosina purinas, enquanto a timina e guanina pirimidinas. A molcula de DNA apresenta uma polaridade de 5PO4 e 3OH. Apresentam pH 7 e carga negativa. Um DNA com maior proporo de C G mais estvel, j que a ligao entre as bases nitrogenadas do tipo pontes de hidrognio. As bases esto no interior das molculas de DNA, a fim de serem protegidas do contato da H2O. A molcula de DNA apresenta as seguintes estruturas: primria- sequencia de nucleotdeos, secundria-hlice, e terciria-cromossomos. A estrutura terciria e o prprio empacotamento do DNA s so possveis pela ao das histonas, as quais compem o nucleossomo, que o primeiro nvel de empacotamento. O material gentico deve ter a capacidade de: replicar; controlar a expresso de caractersticascontrole da expresso gnica e a capacidade de mudar- sofrer mutaes. Define-se gene como: segmento do DNA que contm as informaes necessrias sntese do produto biolgico. Replicao e Transcrio O ciclo celular constitudo de duas grandes fases, a mitose e a interfase. Na interfase h trs subfases: G1, S e G2. Na fase G1 h a sntese de protenas que sero utilizadas na replicao, as quais sero degradadas na fase G2, na qual haver a sntese demais protenas que sero utilizadas na diviso celular. Na fase S h a duplicao do material gentico. REPLICAO: o A replicao semiconservativa, ou seja, h a manuteno de uma fita parental molde em associao com a fita complementar recm-sintetizada. o A replicao acontece apenas uma vez a cada ciclo celular. o A replicao acontece em forquilhas de replicao, as quais so as regies em que acontece a replicao; H uma sequncia especfica que induz o inicio da replicao, a qual acontece bidirecionalmente, com forquilhas simultneas.

o o o

ORC o stio especfico de reconhecimento das protenas iniciadoras (cdt1, cdc6, complexo pr-replicativo), no qual tais protenas se ligaro e determinaro o momento e o local de inicio da replicao. Dentre as protenas que esto no complexo pr-replicativo consta a helicase, responsvel pela abertura das fitas de DNA. A sntese acontece na direo 3-5 com a leitura da DNApolimerase 3-5. DNApolimerase catalisa a adio sucessiva de desoxrribonucleotdeos. Isso acontece por um molde de fita parental. O molde iniciado por primer 3OH livre, possibilitando que a DNApolimerase incorpore os nucleotdeos; primers so sintetizados pela primase. Os primers so constitudos por RNA, o que ser responsvel pela formao do hibrido de DNA-RNA. H especificidade na seleo de bases complementares, onde bases complementares promovero a atividade de sntese 5-3. Caso no sejam complementares so removidas por atividade exonuclesica 3-5. Enzimas Topoisomerase SSBs Helicase Primase DNApolimerase III DNA polimerase I DNAligase Ao Alivia a tenso de enovelamento das fitas de DNA Evita unio das fitas de DNA, estabiliza o DNA em fita simples Desenovela em pequenas regies Sintetiza os primers Sintetiza nova fita de DNA Remove os primers Liga os fragmentos de Okasaki aps a retirada dos primers

Comparao entre Replicao e Transcrio Replicao Polaridade 5-3 Fita molde Sequncia de iniciao Iniciao, Elongao e Terminao Com primer 2 fitas de DNA replicadas Transcrio Polaridade 5-3 Fita molde Sequncia de iniciao Iniciao, Elongao e Terminao Sem primer 1 fita de DNA transcrita

TRANSCRIO: o Na transcrio h o desenovelamento das fitas de DNA. o No h forquilha de transcrio, e esta acontece unidirecionalmente. o Nem todo DNA transcrito, apenas algumas regies do DNA so transcritas em mRNA , e apenas em momentos necessrios. o O RNA apresenta estrutura secundria, em funo da presena de bases com alta negatividade, que tendem a se dobrar. Tal estrutura confere proteo e estabilidade ao RNA, mas no est inativo, apesar de no conseguir ser traduzido. No entanto, h os micros RNA so traduzidos mesmo com a estrutura secundria. o Mitocndrias e cloroplastos possuem RNApolimerase prprias. o O RNA apresenta alta frequncia de erros, o que no ruim, pois no transmitido as clulas filhas, alm de ser sintetizado e degradado com maior frequncia , o que no pode e no ocorre com o DNA. o A maioria dos pequenos RNAs responsveis pela expresso genica. o Nos procariotos transcrio e traduo so processos acoplados.

o O mRNA produzido na transcrio igual a fita codante e complementar a fita molde. o hmRNA

Promotor Intron o Exon Intron Exon mRNA SPLICING Retirada dos introns

Promotor Exon o Exon mRNA Modificaes ps-transcricionais

5UTR 3UTR Promotor Cap G Cauda poli A o O mRNA final vai possuir regies que no sero transcritas, so as regies 5UTR e 3UTR, as quais so reguladores da traduo. o No Splicing alternativo exons podem ser transformados em introns, o que desencadeia a produo de diferentes produtos biolgicos, em clulas diferentes, pelo mesmo gene. o As modificaes ps-transcricionais conferem estabilidade a molcula de RNA. o A direo da transcrio 5-3, a partir da leitura 3-5 da fita molde de DNA. o Na transcrio o DNA ser aberto apenas na regio referente a dado gene, no havendo transcrio de todo o DNA, bem como no acontece apenas uma vez. Tipos RNA mRNA rRNA tRNA snRNA(nuclear) snoRNA(nucleolar) scRNA miRNA(micro) siRNA Funo Codifica protenas Estrutura bsica dos ribossomos Transporta aas at o ribossomo Atua em processos nucleares, Splicing Processamento e modificaes qumicas do RNA Modifica snRNA e snoRNA Regulao da expresso gnica, bloqueio a traduo do mRNA Desliga a expresso gnica por degradao do mRNA e enovelamento da cromatina

Regulao da Expresso gnica


O DNA apresenta todas as informaes, mas nem todo transcrito em mRNA, bem como nem todo mRNA traduzido. A seleo de quais genes sero transcritos e traduzidos a regulao da expresso gnica. Quais genes so expressos? Quando so expressos? NUNCA todo DNA est sendo expresso. O conjunto de genes expressos na clula em dado momento o que determina a diferena entre os organismos. DNA RNA mRNA mRNA ptn ptn ativada Transcrito Controle da transcrio Controle do processamento controle controle controle da ativao

do transporte da traduo

Ncleo

Citosol

A intensidade da transcrio (quantas vezes dado gene transcrito) um regulador da transcrio, bem como a presena de uma regio promotora no DNA, que antes da transcrio vai regular a expresso gnica da sequncia que a sucede, visto que ela prpria no ser transcrita. Genes constitutivos so aqueles que so bsicos ao funcionamento de quaisquer clulas, sendo expressos a todo o momento. Genes regulados so aqueles que so ligados e desligados. Dependem: Do estgio do desenvolvimento - genes expressos no embrio sero desligados no adulto; Do tipo celular; De estmulos externos. Grande parte da regulao da expresso gnica est no promotor do gene . No promotor haver uma regio com abundncia de T e A, que determinar o stio de incio da transcrio TATAbox. No TATAbox chegaro vrios fatores de transcrio, que recrutaro a RNApolimerase, determinando o inicio da transcrio, j que essa no possui afinidade com o DNA. Os promotores no so iguais em todos os genes, visto que dependendo de quais fatores de transcrio se ligaro, a ao destes pode ser repressora ou indutora, regulando de fato a expresso do gene. E se os promotores fossem iguais em todos os genes haveria induo ou represso total.

Cdigo gentico
O incio da traduo dado pelo reconhecimento do cdon AUG, do RNAm, pelo RNAt. No sero traduzidas as extremidades 5UTR e 3UTR. Nos procariotos um mesmo RNA d origem a protenas diferentes - policistrmico. O RNA de procariotos no apresenta processamento. J o RNA dos eucariotos monocistrmico, visto que para cada RNAm h uma protena. Deve-se ter cautela, visto que devido ao Splicing alternativo um mesmo RNAm origina protenas diferentes. H 4 nucleotdeos para 20 aas. Logo, como soluo para tal paradoxo, h a associao de 3 nucleotdeos, formando um cdon, que ser responsvel por codificar 1 aas. No total so 64 cdons. Na traduo no h enzimas para adio de cdons, os mesmos sero adicionados pela ao do RNAt. O RNAt ser capaz de identificar, atravs do pareamento com os cdons( pareamento antiparalelo), o aas correspondente aquele cdon. o O RNAt apresentar alas que possuiro os anticdons correspondentes aos cdons do RNAm. Na regio 3 final do RNAt que acontece a ligao com o aas correspondente. Isso sem existir RNAt especfico a cada aas. H cdons de incio AUG e de trmino UAA, UAG e UGA. O fato de o cdigo gentico apresentar 64 cdons referentes a apenas 20 aas, configura o cdigo gentico como degenerado, no qual para cada aas h mais de um cdon. o O cdon AUG codifica o aas Metionina, alm de ser cdon de iniciao, diferente dos stop cdons, que no codificam aas, apenas sinalizam o trmino da traduo . Geralmente, em um cdon, os 2 primeiros nucleotdeos no variam, apenas o 3, com isso pode-se afirmar que os 2 primeiros nucleotdeos apresentam maior especificidade e fora de ligao ao anticdon. O cdigo gentico universal! No entanto, h certas excees quanto a mitocndrias. Pelo fato do cdigo gentico ser degenerado, pequenas mutaes que levam a troca de um nucleotdeo no alteram a protena, isso se o nucleotdeo for o terceiro de seu cdon. Caso tal troca acontea no 1 ou no 2 nucleotdeo, a protena vai ser defeituosa.

Aminocidos
Sua estrutura composta por grupamentos carboxila e amino terminal alm de um radical varivel. So molculas assimtricas, logo opticamente ativas. o Estereoismeros: L- aminocidos (levogiro) D-aminocidos (destrgiro) Presentes em humanos presentes em alguns antibiticos

A sua funo vai estar relacionada ao radical que apresente: o Radicais polares: tendem a se aglomerar, estabilizando a estrutura proteica atravs de interaes hidrofbicas, Ex: Glicina, Alanina, Prolina, Valina, Metionina, Leucina e Isoleucina; o Radicais aromticos: relativamente hidrofbicos Ex: Fenilalanina, Tirosina e Triptofano; o Radicais polares no carregados: muito solveis em gua, passiveis de pontes de hidrognio, ex: Serina, Treonina, Cistena, Aspargina, Glutmico; o Radicais polares carregados: Positivamente: caractersticas mais bsicas: Ex: Lisina, Arginina, Histidina; Negativamente: caractersticas bsicas: ex: Aspartato e Glutamato. s vezes a mudana da protena, mas manuteno do radical , isso no altera necessariamente a funo da protena, visto que a funo est mais relaciona ao radical do que a sequencia de aas. Excluindo as enzimas. Dependendo do meio na qual se encontrem, os aas podem ser: + o cidos: doam H ; + o Neutros: doam e recebem H , equilbrio; + o Bases: recebem H . Para cada aas h um ponto isoeltrico, geralmente quando o aas est neutro. O ponto isoeltrico obtido: pI = (pK1 +pK2/2); considerando que pK1 e pK2 esto relacionados a tendncia de doao dos prtons das pores carboxila e amino terminais. Quando o radical tambm estiver disponibilizando prtons PI = (pK1+pK2+PK3/3) PH no qual a carga eltrica total da molcula nula! Os aas fazem ligaes covalentes entre si a fim de constituir a protena, tais ligaes so as ligaes peptdicas. As ligaes peptdicas consistem na unio da poro amino terminal de um aas com a carboxila terminal de outro aas, com liberao de gua. + + H3N - CH C - OH + H N CH COO H3N - CH C O N CH COO | || | | | || | | R1 O H R2 R1 O H R2

Ligao Peptdica

Protenas: estrutura e propriedades


Extremidade amino terminal H3N e carboxi terminal COO . A sequncia de aas em uma cadeia polipeptdica se converter na estrutura tridimensional da protena. A estrutura da protena vai definir sua funo . A estrutura estabilizada por ligaes no covalentes, o que possibilita as mudanas Conformacionais. o Estrutura primria: cadeia linear de aas. Importante para a definio da conformao da protena. o Estrutura secundria: enovelamento da protena em -hlice ou folha . H o arranjo de aas particularmente estveis dando origem a padres estruturais recorrentes. So estabilizadas por pontes de hidrognio. A carga nas cadeias laterais determina a forma da estrutura secundria, que a cadeia polipeptdica vai assumir.
+ -

-hlice Ligaes levam a dobra da cadeia polipeptdica Hlice no oca, porm compacta pelas ligaes

Folha Estrutura mais linear

Volta Conformao em forma de loop quando as cadeias mudam de posio

Pontes de hidrognio entre as cadeias vizinhas formando pregas Podem ser paralelas ou antiparalelas

H3N

H3N COO + H3N


-

COO

H3N COO
-

COO

Antiparalelas o Estrutura terciria: conjunto de diversas estruturas secundrias, ligadas por pontes dissulfeto. Na estrutura terciria, ocorrer um rearranjo tridimensional dos tomos. A estrutura se dobrar e ser estabilizada por interaes entre os radicais dos aas (pontes de hidrognio, ligaes inicas ligaes eletrostticas entre grupamentos de cargas diferentes-, ligaes hidrofbicas na cadeia de hidrocarbonetos -, foras de Van der Walls e as ligaes dissulfeto. Ligaes covalentes conferiro durabilidade estrutura terciria. As pontes dissulfeto so exemplos de ligaes covalentes, acontecendo entre tomos de enxofre do resduo do aas de cistena. Raramente vo acontecer na superfcie da protena. As estruturas tercirias apresentam associao entre as estruturas secundria, podem ser: 1. Fibrosas: so protenas alongadas, insolveis em gua visto que apresentam muitos resduos hidrofbicos. So derivadas dos empacotamentos da cadeia polipeptdica. Ex. queratina (forma de hlice), colgeno (tripla hlice). Tendem a repetir uma das estruturas secundrias. 2. Globulares: so protenas de forma compacta e esferoidal, desencadeada pelas vrias interaes entre as estruturas secundrias. Podem atuar como enzimas,

protenas motoras, reguladoras e imunoglobulinas . Ex. Mioglobina compactada por ligaes hidrofbicas. o Estrutura quaternria: subunidades ligadas covalentemente determinando a funo. Apresentam interaes entre as subunidades proticas, exigindo mais de uma cadeia polipeptdica para se tornarem ativas. No so todas as protenas que apresentam estrutura secundria. Ex. Hemoglobina. o A carga dos aas importante na definio da estrutura tridimensional. necessrio que a protena esteja empacotada e estvel para que exera sua funo. As enzimas apresentam conformao espacial complementar a seu substrato , o que otimiza sua ao de catlise. As protenas estruturais devem sofrer estresse mecnico, e mesmo assim manter uma matriz firme para a adeso das clulas. Devem apresentar maior fora de ligao. As protenas motoras devem transformar energia qumica em mecnica, a fim de que seja possvel o movimento. Desnaturao: h o rompimento das ligaes, desenovelando a cadeia polipeptdica, tornando-a inativa. Dependendo de quais ligaes forem rompidas, pode ser possvel a reverso da desnaturao. o Agentes desnaturantes: FSICOS Variao de temperatura Raios X Ultrassom QUMICOS PHs extremos Detergentes Solventes orgnicos Ureia Mercaptoetanol

Os solventes orgnicos rompem as ligaes hidrofbicas. Os extremos de PH alteram a carga lquida da protena, provocando repulso eletrosttica, que desencadeia o afastamento das cadeias polipeptdicas e rompimento das ligaes de hidrognio. o Em uma protena desnaturada: 1. Reduzida solubilidade - leva a precipitao; 2. Aumento da digestabilidade tende a ser degradada; 3. Perda da atividade biolgica por no reconhecimento do substrato, como acontece com as enzimas, os hormnios e as imunoglobulinas. Predio da estrutura e funo da protena: a partir de uma sequncia primria, h o sequenciamento de peptdeos a partir do DNA e com relaes de bioinformtica h a possibilidade de descobrir a estrutura terciria da protena. Relao de distncia entre start e stop cdons. Nem sempre sequncias diferentes levam a funes diferentes, visto que se a estrutura de duas protenas for semelhante, suas funes tambm podem ser semelhantes.

Genmica
Genoma o conjunto de genes de uma espcie. A genmica investiga o genoma com o objetivo de catalogar cada gene. Tcnicas de genmica: o Sequenciamento: 1. Fragmentar o genoma, pela fragmentao dos cromossomos; 2. Determinar a sequncia de nucleotdeos; 3. Montagem ordenamento das sequncias de nucleotdeos nas suas posies equivalentes nos cromossomos; 4. Anotao atribuio de funo biolgica, dizendo que um gene equivalente a determinado produto biolgico, ou se uma sequncia promotora, ect. A montagem e a anotao dependem de programas de bioinformtica. Para o DNA ser fragmentado h duas maneiras: a fragmentao direcionada com utilizao de enzimas e a aleatria com quebra mecnica do DNA. DNA fragmentado amplificado sequenciado separadamente por fragmentos bioinformtica procura sequncias sobrepostas (como quebra cabea) entre os fragmentos. Aps o DNA ser fragmentado ele precisa ser amplificado antes que possa ser sequenciado. Uma das principais formas de amplificao de DNA o PCR, a chamada Reao de Polimerase em Cadeia. Com a amplificao feita pelo PCR h um auxilio na anlise do DNA, visto que seu grande tamanho e variabilidade so obstculos ao seu isolamento e sequenciamento. O PCR vai amplificar e selecionar o DNA, segundo os primers que so utilizados. O mtodo de PCR consiste em: 1. Primers de DNA (de comprimento de mais ou menos 16 a 24 nucleotdeos) se ligam a extremidade 3OH do DNA. Como os primers so de DNA, diferente da replicao natural, no h necessidade da atuao da DNAligase nem da Topoisomerase. 2. Nucleotdeos livres so adicionados pela ao da TAQpolimerase, que uma DNApolimerase que resiste a altas temperaturas e variaes destas. Isso porque o mtodo consiste em ciclos de amplificao a diferentes temperaturas. 3. A abertura das fitas no acontece pela ao da helicase e sim por desnaturao por alta temperatura, entre 90C e 95C. 4. Duplicao do fragmento isolado pela ao da TAQpolimerase na direo 5 3. 5. Reduo da temperatura para a faixa de 50C a 65C afim de que haja o pareamento\anelamento da dupla hlice. Vai depender da proporo A-T, C-G. 6. Como so replicados fragmentos em isolado no h necessidade de ORC 7. Diferente da replicao natural, h primers diferentes para cada extremidade 3, logo h a existncia de 2 fitas contnuas. 5 3 3 5 8. A etapa de adio de primers seleciona a regio que ser amplificada. 1 Ciclo
O primer complementar a sequncia da outra fita da hlice.

DNA
dATP, dTTP

Desnaturao

Hibridizao/Pareamento

dGTP, dCTP

50 - 65C/30min 94 - 95C / 3 -5min 68 - 72C 1min|1000nucleotide

No prximo ciclo sero 4 fitas moldes, caracterizando a amplificao como exponencial. Para genomas simples ou pequenos fragmentos o tempo de amplificao menor, no entanto para genomas mais complexos demanda mais tempo. Nos primeiros ciclos as sequncias so longas, pois a TAQpolimerase no sabe onde parar, mas com o decorrer dos ciclos h a delimitao da regio de fim da atuao da TAQ. PCR Vrios ciclos. Sem helicase Abertura das fitas por desnaturao. Primer de DNA. Sem regies de fim ou de incio (ORC). Acontece por fragmentos. Replicao normal 1 ciclo. Presena da helicase. Primer de RNA. Presena de ORC e delimitao do fim da replicao. Acontece em todo o genoma.

Tipos de sequenciamento: Sequenciamento de toda a extenso do genoma. Haver o sequenciamento das regies codificantes, das no codificantes, dos promotores. DNAgenmico clivagem Biblioteca Genmica(in vivo) clonagem ampl. Bact.

PCR (in vitro) sequenciamento Sequenciamento de ESTs. Sequenciamento da parte expressa do genoma. feito a partir de RNAm, com a produo de DNAcomplementar (cDNA), logo no sero sequenciados todos os genes. Transcriptoma. RNAm transcriptase reversa DNA Sequenciamento Transcriptoma: Permite o sequenciamento de cDNA, de genes que esto sendo expressos em dado momento, logo no h presena de ntrons ou promotores, j que corresponde ao RNAm que j sofreu Splicing. I. II. 5 3 RNAm Ao da transcriptase reversa: 5 3 III. 5 3 fita complementar fita molde Amplificao ou Biblioteca Genmica A transcriptase reversa deixa o DNA em ncora, permitindo a ao de outras polimerases para sintetizar a fita molde, no precisando de primers. Sequenciamento qumico. Sequenciamento enzimtico - mtodo de terminao da cadeia, ou de Sanger. 1. Adio de dideoxinucleotdeos (nucleotdeos modificados sem a extremidade OH livre no carbono 3), tais nucleotdeos inibem as ligaes fosfodister com o prximo

3 5 cDNA

nucleotdeo terminando a cadeia. No momento que os dideoxinucleotdeos entrarem em contato com a polimerase, ela paralisa a sntese. 2. Primer DNA polimerase Dideoxinucleotdeos. Para o mtodo enzimtico, que data da dcada de 1970, h a adio de cada tipo de nucleotdeo em um tubo, junto com uma pequena proporo de dideoxi. T T DNA molde amplificado A ddA Adenina normal dideoxiadenina 3. O DNA sequenciado vai apresentar tamanhos diferentes, pois o pareamento com o dideoxi aleatrio, podendo ocorrer em qualquer ponto, terminando a cadeia. A proporo de dideoxi ajuda a restringir o tamanho do DNA sequenciado, atendendo os diferentes objetivos em pesquisa. 4. No h uma molcula de DNA molde apenas, este j foi amplificado. Em cada tubo h ATP, GTP, CTP e TTP, mas em menor proporo, em torno de 15% h ddATP, ddGTP, ddCTP e ddTTP, marcados com radioatividade. 5. Colocar em gel de poliacrilamida, sob a ao de campo eltrico, onde os nucleotdeos migraro do polo (-) para o polo (+). Nucleotdeos menores correm mais rpido. 6. Ler o gel de baixo para cima. Sequenciamento automtico. Substitui a marcao radioativa dos nucleotdeos por marcao fluorescente. 1. Os dideoxinucleotdeos so marcados com fluorescncia de cores diferentes misturados em um mesmo tubo. Otimiza espao em relao ao mtodo de Sanger que utilizava 1 tubo para cada tipo de nucleotdeo. 2. Atualmente este tubo um capilar com gel de poliacrilamida, partindo do mesmo principio que fragmentos menores correm mais rpido. 3. Abaixo do tubo h um laser que capta os picos de fluorescncia, transmitindo-os ao computador que identifica qual a sequncia da fita complementar, e consequentemente da fita molde. Estes picos se referem ao tamanho do fragmento de DNA, visto que percebem onde terminou a sntese, j que os nucleotdeos marcados so os dideoxi. 4. uma forma de visualizao indireta, j que os fragmentos so separados por tamanho. Sequenciamento de 2 gerao: se comparado ao mtodo de Sanger, este apresenta -6 3 corrida de no mximo 10 MB por corrida, enquanto o de 2 gerao at 3x10 MB. Um dos mtodos de sequenciamento de 2 gerao o ILUMINA. 1. Quebra de DNA ligao de adaptadores nas extremidades do DNA extremidades ligadas a uma lmina, onde uma das extremidades se curva para se ligar ao da DNApolimerase( h presena de primer) amplificao do DNA (tipo PCR, mas em matriz slida). 2. Sntese j marcada. 3. No h separao pelo tamanho, pois o DNA j est quebrado em pedaos muito pequenos (grande diferena para os outros mtodos de sequenciamento). 4. Sntese e leitura em tempo real. Possvel ler vrias amostras ao mesmo tempo, a partir das posies na lmina. A matriz slida evita confuso entre os fragmentos na hora da leitura, visto que cada fragmento corresponder a uma posio. Com esse mesmo mecanismo possvel sequenciar RNA - RNAseq! Isso pela transformao do RNAm em cDNA, onde apenas sero sequenciados os genes que esto sendo expressos.

i. No sequenciamento de RNA, utiliza-se RNAm j processado, logo no h presena de ntrons ou promotores. Apenas 2% do genoma codificante, os demais 98% correspondem a promotores e reguladores da expresso gnica. Quando maior a complexidade o organismo maior ser a quantidade de fatores de transcrio (reguladores). Em suma, mais importante maior quantidade de reguladores da expresso gnica do que de genes que codificam produto biolgico.

Protemica
Mapeamento de todas as protenas expressas e suas modificaes ps-transcricionais (glicosilao, etc.) que possibilitam a ativao da protena, em dado momento. Funciona como o Transcriptoma, no qual s analisada a parte expressa do genoma, no toda informao a cerca de protenas. uma anlise empregada em tecidos, rgos ou fluidos. Baseia-se na comparao entre o doente e o sadio, o grupo controle e o grupo tratado (no caso de medicamentos). Modificaes morfolgicas e funcionais em distintas clulas so reflexo do conjunto de protenas, logo dos genes que foram expressos. Para estudos amplos sobre determinada doena h a execuo do transcriptoma e do proteoma, os quais so complementares. O proteoma til ao diagnstico de doenas e sua purificao possibilita o estudo e o desenvolvimento de drogas que combatem a protena defeituosa. Tcnicas de Protemica: o Purificao: consiste em tcnicas que so capazes de separar e identificar as protenas e suas modificaes ps-transcricionais. Existem tcnicas diferentes adequadas s especificidades das caractersticas das protenas (solvel\insolvel; ptns de membrana; ptns de ncleo; secretadas, etc.). a) A amostra a ser coletada no amplificada, logo deve ser grande. A coleta acontece por meio de bipsia, o que implica em alterao da expresso por no estar mais in vivo. b) Extrao das protenas e sua marcao com radioatividade ou fluorescncia. c) Separao das protenas: anlise em gel bidimensional (anlise das imagens capturadas) ou digesto do pool de protenas. d) Posterior a anlise em gel bidimensional h a digesto das protenas individualmente. Posteriormente a digesto do pool de protenas h a cromatografia e) Espectrometria de massa identifica e quantifica as protenas purificadas Coleta Extrao Marcao (fluorescncia ou radioatividade) Separao Anlise em gel bidimensional digesto individual das protenas Digesto do pool de protenas cromatografia Espectrometria de massa 1. Eletroforese: ao de um campo eltrico na separao das molculas por tamanho (peso molecular). A velocidade vai ser determinada de acordo com a carga. A migrao acontece do polo (-) para o polo (+). a) Desnaturao com SDS: protena linear + aquecimento, ou gel no desnaturante para anlise da estrutura secundria. Como a migrao pela carga no espalha. b) Aplicar em gel de acrilamida sob ao de campo eltrico. Menores pesos moleculares migram mais rpido, sendo marcados por marcadores de peso molecular, o que confere apenas uma ideia da massa, quem a determina a espectrometria de massa. 2. Eletroforese bidimensional:

a) Separao por ponto isoeltrico, no qual as protenas so separadas por PH, migrando at ter carga neutra. b) Separao por peso molecular necessria, pois h protenas com mesmo ponto isoeltrico, no entanto a separao por peso molecular confere maior especificidade determinao da protena. 3. Cromatografia: separa de acordo com as propriedades das protenas (peso molecular, composio qumica, funcionalidade, arquitetura). Pode ser acoplada diretamente ao espectrmetro de massa. a) Digesto da protena; b) Separao; Cromatografia 2D: a. Por tamanho: protenas maiores descem mais rpido, visto que as menores ficam presas em esferas de polmero. Separao de cada frao, j que so fraes lquidas. b. Por carga: apresenta tampes prprios. Cada frao vai entrar em contato com o polmero, que estar carregado (-) ou (+), no qual as protenas com carga oposta a do polmero migram mais rpido. 4. Espectrometria de massa: quantifica a massa da protena. a) Bombardeia a protena com eltrons, ionizando-a; b) Atravessa o campo magntico; c) Massa determina diferentes trajetrias. d) Menor peso molecular migra mais rpido. e) Um detector determina os picos de massa, no entanto no so picos de massa de aas e sim de peptdeos. Para identificar qual proteoma deve ser feito em um genoma (porque pode se presumir qual a sequencia de aas): Genoma Banco de dados Enzimas proteolticas clivam entre aas especficos Simulao gene a gene da digesto de tal enzima peptdeos com determinados pesos moleculares. Uma vez que se tenham os pesos moleculares dos peptdeos, colocam estes dados no banco de dados e o computador determina quais protenas equivalem aquele peso molecular. Concluindo: Protemica estudo do conjunto, estrutura e funo de protenas produzidas por uma clula em condies determinadas abre grandes possibilidades cientficas e tecnolgicas. Da compreenso de como uma doena evolui ou uma clula responde a mudanas no seu ambiente externo at a identificao de novos alvos para medicamentos, vacinas e kits de diagnstico, a protemica considerada o passo seguinte genmica.

Farmacogenmica
Busca um medicamento ideal a um determinado individuo ou grupo. o estudo da variabilidade da expresso de cada gene relativo sensibilidade/resistncia a doenas, bem como resposta a determinada droga. vantajoso, pois aumenta os benefcios do medicamento e reduz seu custo e o tempo de tratamento. Alm de minimizar efeitos colaterais Tenta relacionar das diferenas genticas s diferentes respostas a dado medicamento. Acontece atravs da anlise dos polimorfismos genticos, antes de aplicada a terapia. o Os polimorfismos podem ser marcadores, bem como podem influenciar na atuao de frmacos e na assimilao de nutrientes.

SNPs (polimorfismos singulares de nucleotdeos): acontece em apenas 21 nucleotdeos. diferente de mutao, visto que mutao apresenta uma frequncia de 1% e os polimorfismos apresentam maiores frequncias na populao. o Os polimorfismos so abundantes no genoma humano, podendo acontecer em regies codificantes ou no codificantes. Quando acontecem nas regies codificantes podem ser: Sinnimos: no altera a protena. No sinnimos: a) No conservativo: altera a protena. b) Conservativo: no altera a protena. Polimorfismo na regio codificante Altera estrutura protena Relacionado ao proteoma Polimorfismo no promotor Altera a expresso gnica Relacionado ao transcriptoma

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o Avalia a proporo das diferenas nas protenas entre os indivduos. 35000 SNP so os responsveis pelas diferenas entres genes correspondentes determinada doena e os diferentes modos de resposta. Polimorfismos no promotor afetam o parmetro de resposta, visto que o promotor responsvel pela regulao da expresso gnica, e nele se ligam fatores de transcrio, que no se ligaro caso haja polimorfismos. o Avaliar o transcriptoma (quais e como os genes esto sendo transcritos) para avaliar polimorfismos no promotor. Conjunto de polimorfismos corresponde determinada caracterstica. Sequenciamento do maior nmero possvel de genes em uma amostra populacional, pois se trata de uma abordagem comparativa. Escolhe-se dado segmento de DNA e amplifica-o por PCR. Sequenciamento do fragmento amplificado. Observar os hapltipos: observar a dupla fita de um dos cromossomos. Olhas em todos os cromossomos possveis para identificar polimorfismos. Pode ocorrer mais de um polimorfismo em um hapltipo, sem necessariamente ter relao com determinada caracterstica, caso no se repitam na populao. Quanto maior a probabilidade melhor a avaliao do SNP. Analisar e comparar 2 grupos Observao dos hapltipos Identificar onde h polimorfismos Identificar qual nucleotdeo presente no grupo responsivo e qual presente no no responsivo