1 SILVA, M. M. P; SILVA, A. G; SOUSA, J. T; CEBALLOS, B. S. O; LEITE, V. D. Avaliao da remoo de ovos de helmintos em codisposio de Lodo anaerbio e resduos slidos orgnicos.

In Anais Eletrnico do 24 Congresso Brasileiro de Engenharia Sanitria e Ambiental. Belo Horizonte-MG: ABES, setembro de 2007 1.0. EQUIPAMENTOS: Destilador de gua Estufa de secagem Densmetro (leitura da densidade de sulfato de zinco) Balana analtica Centrfuga (2500 rpm para tubos de 50 mL) Vortex (agitador) kit para filtrao: bomba de vcuo e presso e sistema de filtrao Microscpio binocular com capacidade de aumentar at 100X (de preferncia com cmera digital) Cmara de MacMaster com reticulado impresso 2.0. MATERIAL: Frascos de vidro mbar com tampa para armazenamento de solues Balo de vidro com capacidade para 1000 mL(preparo das solues) Sacos plsticos zipper para coleta de amostras Cadinho de porcelona Tubos de centrfuga graduada com capacidade de 50 mL Becker graduado de 150 mL Basto de vidro Estante para tubos de centrfuga Proveta graduada de alta preciso com capacidade de 100 mL Proveta graduada de alta preciso com capacidade de 500 mL Proveta graduada de alta preciso com capacidade de 1000 mL Picetas com bico curvo graduadas transparente com capacidade de 500 mL (frasco lavador) Pipeta de vidro graduada com capacidade de 10 mL Pipeta de vidro graduada com capacidade de 1 mL Pipetador de segurana Pipetador automtico Ponteira para pipetador automtico Depsitos de plsticos para armazenar os tubos de centrfuga Depsitos de plsticos para armazenar os demais materiais lamnula Placa de petri pequena Membrana filtrante millipore 45m Pina em ao inox serrilhada Toalha em algodo para secagem da cmara de MacMaster Escova para lavagem dos tubos de centrfuga Recipientes para lavagem dos demais materiais
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2 Escorredor de plstico para secagem dos materiais 3.0. SOLUES UTILIZADAS: Soluo de gua sanitria a 50% Soluo de detergente Tween 80 a 0,01% Soluo de sulfato de zinco a 33% Soluo de safranina a 0,1% Soluo de formol a 10%

3.1. Preparo das solues 3.1.1. Soluo de gua sanitria: Diluir 1000 mL de gua sanitria para 1000 mL de gua. Homogeneizar a soluo e armazenar em frasco. A finalidade desta soluo permitir a lavagem e, por conseguinte, a recuperao de ovos de helmintos. 3.1.2. Soluo de detergente Tween 80: Diluir 1 mL de detergente tween 80 para 1000 mL de gua. A gua deve ser adicionada aos poucos, de forma a proporcionar melhor diluio do detergente. O objetivo desta soluo realizar a lavagem da amostra, permitindo visualizao dos ovos de helmintos. 3.1.3. Soluo de sulfato de zinco (ZnSO4): Pesar 330 g de sulfato de zinco, dissolver e diluir para 1000 mL de gua destilada. medida que a gua destilada acrescentada, homogeneza-se a soluo, at que todo contedo slido seja dissolvido. Coloca-se numa proveta de 1000 mL e realiza-se a verificao da densidade. A densidade da soluo de 1,18. Esta densidade indispensvel flotao de ovos de helmintos. A utilizao desta soluo objetiva promover a flotao dos ovos de helmintos. 3.1.4. Soluo de Safranina 3.1.4.1. Soluo estoque Pesar 2,5 g de safranina e dissolver em 100 mL de lcool etlico a 95%. 3.1.4.2. Soluo de trabalho Diluir 10 mL da soluo estoque de safranina em 100 mL de gua destilada. O objetivo da utilizao da soluo de safranina observar a viabilidade de ovos de helmintos. Este procedimento denominado na literatura por tcnica de colorao rpida, a qual se baseia no uso de corante biolgico para detectar as trocas de permeabilidade da membrana vitelina dos ovos. Um ovo vivel impermevel a certos tipos de corantes, o que impossibilita a colorao. 3.1.5.Soluo de formol Diluir 50 mL de formol para 500 mL de gua. O uso de soluo formal objetiva conservao das amostras para posterior anlise Observaes:
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3 Toda soluo utilizada deve seguir trs princpios bsicos aps preparao: identificar, datar e armazenar protegido da luz.

4.0. Coleta da amostra Para a representatividade do material a ser analisado, deve-se constituir uma amostra composta a partir de dez amostras simples, as quais devem ser coletadas de pontos diferentes do sistema em estudo. 4.1. Lodo de esgoto sanitrio Coleta-se o lodo de esgoto sanitrio de dez diferentes pontos. A partir da amostra composta, pesa-se a quantidade necessria para realizar a anlise de ovos de helmintos (25g). 5.0. Anlise de slidos totais A anlise de slidos totais da amostra que ser investigado os ovos de helmintos indispensvel expresso dos resultados. O procedimento aplicase a lodo de esgoto, resduos slidos orgnicos e co-substrato e tem como base as recomendaes do APHA (1992). Pesa-se 25 g da amostra Leva-se a amostra estufa a 105 C por 24 horas Retira-se a amostra da estufa e encaminha-se ao dessecador Pesa-se outra vez verificando a diferena entre o peso inicial e o peso final. A diferena entre o peso inicial e o peso final corresponder a umidade perdida (gua evaporada ) O peso final corresponder ao total de slidos totais. 6.0. Procedimento de anlise Antes de proceder anlise da amostra, deve-se observar as seguintes etapas: preparao das solues; organizao do material a ser utilizado; verificao dos equipamentos e coleta da amostra. a) Preparao das solues: as solues devem ser preparadas previamente conforme item 4.1. de forma a propiciar agilidade as anlises e evitar transtornos de ltima hora, tais como: falta de solues (Figura 04). b) Organizao do material: todo material que ser utilizado na anlise deve ser previamente separado, higienizado e identificado (Figura 05). c) Verificao dos equipamentos: todos os equipamentos necessrios para realizar as anlises devero ser antecipadamente averiguados, visando evitar problemas de ltima hora. Por exemplo: lmpada do microscpio queimada. d) Coleta do material: a coleta da amostra deve ocorrer sempre que possvel no mximo 24 horas antes de iniciar a anlise. 6.1. Procedimento de anlise para lodo de esgoto sanitrio Pesar-se 25 g de lodo mido num becker de 150mL Acrescenta-se 50 mL de soluo de gua sanitria (1:1) e homogeneizase com auxlio de um basto de vidro, realizando a limpeza dos slidos presentes no lodo, desprendendo ovos de helmintos. Este procedimento

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4 deve ser rigoroso, de forma a permitir a recuperao de maior nmero possvel de ovos de helmintos. Transfere-se o lodo com soluo de gua sanitria para os tubos de centrfuga (50mL), lavando com cuidado o becker, para no perder ovos de helmintos. Ter o cuidado para no exceder 100 mL de soluo de gua sanitria (geralmente so usados dois tubos de centrfuga) (Figura 06) Levam-se os tubos de centrfuga com as amostras preparadas a centrfuga. Centrifugar por cinco minutos a 2400 rpm (Figura 07); Descarta-se o sobrenadante dos tubos de centrfuga, evitando a perda de material slido decantado, pois este material pode conter ovos de helmintos; Organizam-se lado a lado os tubos de centrfugas que correspondem as mesmas amostras e desprende-se o sedimento de cada tubo com um pouco de gua de torneira, em seguida transferem-se os sedimentos correspondentes as mesmas amostras para um nico tubo de centrfuga. Esta transferncia deve ser realizada de forma cuidadosa para no perder sedimentos. A utilizao de gua de torneira e o processo de homogeneizao propiciam esta transferncia. Ter a devida ateno para no deixar sedimento no base do tubo. Lavam-se as paredes do tubo com gua de torneira, para recuperar todos os sedimentos presentes e acrescenta-se 2mL de detergente Tween 80 (Figura 09). Realiza-se a homogeneizao de preferncia no vortex. O total de gua de torneira usada mais o detergente Tween 80 no deve ultrapassar a 50mL (total correspondente ao um tubo de centrfuga). Ter cuidado para no perder sedimentos que esto impregnados as paredes dos referidos tubos. Encaminha-se o tubo a centrifugao por cinco minutos a 2400 rpm; Descarta-se o sobrenadante, evitando perder material decantado e acrescenta-se gua de torneira, visando realizar a lavagem para retirar o excesso de detergente Tween 80; Encaminha-se o tubo a centrifugao por cinco minutos a 2400 rpm Descarta-se o sobrenadante e adiciona-se gua de torneira mais uma vez, repetindo-se o mesmo procedimento de lavagem com a finalidade de retirar o excesso de Tween 80; Encaminha o tubo de centrifuga a centrifugao por cinco minutos a 2400 rpm Descarta-se o sobrenadante e acrescenta-se aos poucos ao sedimento soluo de sulfato de Zinco at completar a capacidade do tubo de centrfuga (50mL). medida que adicionado o sulfato de Zinco, realiza-se ao desprendimento dos sedimentos que esto impregnados na base do tubo e nas paredes; em seguida homogeneza-se com auxlio do vortex 1 (na ausncia do vortex, realiza-se a homogeneizao atravs de movimentos circulares, conforme Figura 10); O sulfato de Zinco tem por objetivo permitir a flotao dos ovos de helmintos; ou seja, propiciar que os ovos sejam suspensos;

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5 Levam-se os tubos a centrifugao por dois minutos a 2400 rpm; ter o cuidado para no descartar neste momento o sobrenadante (lembrar que no sobrenadante podem estar os ovos de helmintos); Filtra-se o sobrenadante em membrana de filtro com dimetro de 45m Lavam-se as paredes do equipamento de filtrao com gua de torneira para evitar a perda de ovos de helmintos. (pode interferir nos resultados). Retira-se a membrana filtrante e coloca-se numa placa de petri pequena cobrindo com soluo de sulfato de zinco; este procedimento permitir a suspenso dos ovos filtrados. Raspa-se cuidadosamente com uma lamnula a membrana filtrante para remover os ovos de helmintos que possivelmente foram filtrados. Lava-se a membrana filtrante e a lamnula com soluo de sulfato de zinco; no devendo exceder 5 mL; Transfere-se a amostra para um tubo de centrfuga, previamente identificado, rinsando a placa de petri e a membrana de filtrao com soluo de sulfato de zinco. O volume final no deve ultrapassar a 10 mL; Anota-se o volume final, pois este far parte da frmula que calcular o nmero de ovos de helmintos identificado; Para distinguir ovos viveis dos no viveis, adiciona-se uma gota de soluo de safranina (0,5 mL) e homogeneza-se bem, de preferncia no vortex 2; rapidamente enche-se os dois compartimentos da Cmara de MacMaster (volume por compartimento: 0,15 mL; volume total da Cmara: 0,30 mL) Coloca-se sob a lente (primeiro a 10X, depois 40X) do microscpio e esperam-se alguns segundos at a flotao; Visualiza-se, identifica-se e conta-se os ovos, anotando-se e distinguindo-se os viveis dos no viveis; Finaliza-se a anlise aplicando o nmero de ovos identificado a seguinte formula 3: Z= N x VF = ovos/gMS (VC + ST) Onde: Z=nmero total de ovos presentes na amostra; N= nmero de ovos identificados; VF= volume final; VC= volume da cmara (0,30 mL); ST= slidos totais presentes na amostra
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. Na impossibilidade de concluir a anlise no mesmo dia, recomendvel interrompe-la antes de acrescentar o sulfato de zinco. Aps a ltima lavagem com gua de torneira, despreza-se o sedimento e conserva-se o material em geladeira. No dia seguinte, continua-se acrescentando o sulfato zinco e seguindo as demais etapas. 2. Havendo necessidade de conservar a amostra, sugere-se no adicionar a soluo de safranina. Recomenda-se que a soluo de safranina seja aplicada no momento da leitura, ou seja, quando for realizada a identificao de ovos de helmintos; A conservao da amostra pode ser feita adicionando-se uma gota de soluo de formol. Porm,
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6 recomendvel evitar longos perodos de conservao, pois muitos ovos de artrpodes apresentam caractersticas morfolgicas semelhantes aos de ovos de helmintos. Ao observar o material recm coletado e preparado, diminuem os riscos de confundi-los. Em geral, o material permanece vivo durante trs dias. Sendo possvel observar a ecloso de ovos de artrpodes no momento da identificao.
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. De acordo com a frmula necessrio verificar a quantidade de slidos totais presente na amostra. Este procedimento pode ser realizado no momento da coleta, conforme item 6.0.

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