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Resumo No Brasil, os produtos minimamente processados sofreram, na ltima dcada, um grande aumento de consumo pela procura por produtos

de boa qualidade e fcil preparo. O processamento mnimo inclui operaes de seleo, lavagem, corte, sanitizao, centrifugao, embalagem, armazenamento e comercializao, sendo que o prazo de validade varia entre 7 e 14 dias, dependendo do alimento envolvido. Esse processo pode causar contaminao por microrganismos deteriorantes ou patognicos, em razo do manuseio e aumento dos danos aos tecidos. Os microrganismos patognicos mais comuns transmitidos para os seres humanos por esses produtos so E. coli O157:H7 e Salmonella. Segundo a Resoluo N12 de 02/01/2001 da ANVISA, foi estabelecido que em hortalias in natura, a contagem de coliformes termotolerantes (CT) deve ser de, no mximo, 102 e em 25 g do produto deve haver ausncia de Salmonella. Este trabalho teve como objetivo pesquisar a presena de Salmonella e Staphylococcus aureus e avaliar a qualidade higinico-sanitria em 50 amostras de horti-fruti minimamente processados. Para as anlises (APHA), 25 g da amostra foram pesados e homogeneizados em 225 ml de gua peptonada (35C/24h). Para deteco de Salmonella, uma alquota de 1 mL do homogeneizado foi semeado em caldo tetrationato (35C/24h) e outra de 0,1 mL, em caldo Rappaport-Vassiliadis (42C/24h). A seguir, uma alada de cada caldo foi semeada em placas de Petri com gar XLD e com gar Salmonella-Shigella e as colnias caractersticas foram confirmadas pelo API 20E. Para S. aureus, 0,1 mL da diluio 10-1 foi depositado em placas de Petri com gar Baird-Parker. Para CT, as diluies foram semeadas em caldo lauril (48h/35C), com confirmao pelo caldo EC (45C/24h). Salmonella no foi detectada, entretanto 76% estavam fora das recomendaes quanto ao nmero de CT, cuja contaminao variou de <3 a >1,1 x 107 NMP/g. S. aureus esteve presente em 1 amostra (2,3 x 102 UFC/g). A partir dos dados obtidos, pode-se concluir que esses produtos apresentaram condies higinico sanitrias insatisfatrias e, apesar de no apresentarem os patgenos pesquisados, podem apresentar risco sade dos consumidores.

1) INTRODUO Doenas de origem alimentar so definidas pela Organizao Mundial de Sade como Infeces ou intoxicaes causada pelo consumo de comida ou gua. Os sintomas variam muito de acordo com o agente etiolgico, sendo diarria e vmitos, os mais freqentes. Em muitos pases, as organizaes nacionais de sade retratam surtos de doenas de origem alimentar quando dois ou mais indivduos exibem sintomas semelhantes resultantes da ingesto de um alimento em comum. A verdadeira incidncia dessas doenas de difcil avaliao, pois muitos casos no so relatados (LOIR, 2003). Os consumidores procuram por produtos de boa qualidade e de fcil preparo e consumo. Sendo assim, a indstria alimentcia lanou no mercado os chamados produtos minimamente processados. As frutas e hortalias minimamente processadas mantm seus tecidos vivos, porm no exibem a mesma resposta fisiolgica que o tecido inteiro (WILEY, 1994), sendo mais perecveis do que quando intactos, pois so submetidos a severos estresses fsicos, provenientes, principalmente, do

descascamento e do corte (BRECHT, 1995). Esses alimentos podem ser elaborados mediante uma nica ou vrias operaes, tais como descascamento, corte em rodelas, fragmentao, obteno de suco, etc., associada a um tratamento parcial de conservao no definitivo, como o uso de aquecimento mnimo, conservantes, irradiao ou sanitizantes (OLIVEIRA, 2000). Ainda pode-se utilizar atmosfera controlada/modificada, envase a vcuo ou exposio dos produtos sob temperaturas

reduzidas (WILEY, 1994). O prazo de validade desses alimentos varia entre 7 e 14 dias dependendo do tipo de verdura.(GARCIA e ZURERA COSANA, 1997). No Brasil, os alimentos minimamente processados sofreram, na ltima dcada, um grande aumento de consumo, encontrando-se em franca expanso devido facilidade que proporcionam. O processamento mnimo favorece a contaminao por microrganismos deteriorantes e patognicos, em razo do manuseio e do aumento dos danos aos tecidos ( WILEY, 1994) . Os alimentos minimamente processados podem apresentar microrganismos deteriorantes que podem multiplicar-se rapidamente durante

estocagem inadequada, e alm disso, podem conter espcies patognicas ao homem (NGUYEN-THE & CARLIN,1994). Entre os microrganismos patognicos mais comuns que podem ser transmitidos para humanos por esses produtos so Listeria monocytogenes, Escherichia coli O157:H7 e Salmonellla (FRDER et al, 2007). A contaminao por bactrias patognicas e sua multiplicao durante estocagem preocupante, pois muitos vegetais minimamente processados so consumidos crus. Vrios surtos de gastrenterites tm sido relacionados ao consumo de vegetais frescos contaminados. Saladas contendo vegetais crus foram identificadas como veculos causadoras da diarria do viajante (doena que atinge visitantes de paises desenvolvidos), sendo Escherichia coli enterotoxignica uma das bactrias mais comuns. (BRACKET ,1987 e BEUCHAT, 1996). Em 1996, BEUCHAT relatou o desenvolvimento da anlise de perigos e pontos crticos de controle (HACCP/APCC) em um esforo para minimizar o risco de doena associada ao consumo de produtos frescos. Exemplos de microrganismos patognicos

associados aos produtos frescos assim como procedimentos que podem ser usados para reduzir sua incidncia na hora do consumo foram discutidos. Segundo ROEVER (1998) onde??, em um estudo de 1973 a 1992, Salmonella foi responsvel por 18 surtos de origem alimentar devido ao consumo de produtos frescos, seguidos de Staphylococcus aureus, com 4 e Shigella e Bacillus cereus com 3 cada um. Ocorreram 58 surtos com esses alimentos onde o agente etiolgico no foi detectado. Em 1994, em Illinois e outros estados americanos, ocorreu um surto de Shigella flexneri 6A devido ao consumo de cebolinhas contaminadas(COOK et al, 1995). Nesse mesmo Estado e em Connecticut, em 1996, ocorreu um surto causado por E.coli O157:H7, devido consumo de alface, com um total de 46 pessoas envolvidas.(biblio). Nesse ano, esse mesmo alimento causou um surto envolvendo 29 pessoas contaminadas por E.coli O157:H7, em Montana, EUA (CDC, 1995). No Japo, em 1996 ocorreu um surto envolvendo 6.000 pessoas, sendo considerado o maior surto de origem alimentar j relatado neste pas e o alimento envolvido foi broto de rabanete cru e o patgeno isolado foi E. coli O157: H7. (MICHINO et al, 1996). O broto de alfafa tem sido responsvel por vrios surtos. Em 1995, ocorreu um surto com Salmonella Stanley, envolvendo 23 estados americanos e a Finlndia (MAHON, 1997). Em 1996, outros surtos causados por Salmonella Newport no Oregon (VAN BENEDEN, 1996) e por Salmonella Montevidu, na Califrnia, envolveram mais de 500 pessoas. Em 1997, em Kansas e Missouri ocorreu um surto, causado por S. Infantis e S. Anatum, com 90 indivduos.(biblio)

WJCIK-STOPEZYNSKA (2004) no encontrou nenhuma bactria patognica (Salmonella, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus). Entretanto, a contaminao por microrganismos saprfitas foi alta nas saladas e a contagem total das bactrias mesfilas foi maior do que a recomendada na maioria das saladas. Um estudo feito por MANANI et al., 2006 mostrou que todos os vegetais tem coliformes numa faixa entre 0 e 104 NMP/grama e revelou a presena de patgenos oportunistas em vegetais prontos para o consumo. Se E. coli um indicador de segurana e aceitabilidade, os consumidores podem ser expostos a doenas causadas por alimentos.

1.1.

Qualidade Higinico-Sanitria

Cada vegetal possui uma microbiota caracterstica, sendo que espcies da famlia Enterobacteriaceae e Pseudomoneaceae so as mais encontradas nesses produtos (NGUYEN-THE & CARLIN, 1994). Ocorre tambm a presena de bactrias cido-lticas e pectinolticas. (OLIVEIRA, 2000) Segundo a RDC n 12 (02/01/2001) do Ministrio da Sade, foi estabelecido que, para as hortalias frescas in natura, a contagem mxima de coliformes termotolerantes deve ser de at 102/g com exigncia da ausncia de Salmonella em 25 g do produto. No Brasil no existem muitos trabalhos a respeito, mas COELHO et al (2001) relataram que 100% das amostras de alface pesquisadas estavam contaminadas com coliformes totais e 50% apresentavam coliformes termotolerantes e foi encontrada

contaminao por Pseudomonas, de 23NMP/gramas (Nmero Mais Provvel).

Segundo FERREIRA et al (2001), 30% das amostras de verduras e legumes analisados apresentaram at 103 UFC/grama (Unidades Formadoras de Colnias) e, em 15% das amostras encontrou-se Staphylococcus aureus, numa concentrao de at 102 UFC/gramas. Segundo FRDER et al(2007) em um estudo feito na cidade de So Paulo, 73% das amostras de minimamente processadas analisadas apresentavam

concentrao de coliformes fecais maiores que 102 UFC/g e foi detectado a presena de Salmonella em 3% das amostras.

1.2. Patgenos:

Segundo BRACKETT(1999),

todos os tipos de frutas e vegetais podem ser

contaminadas por microrganismos patognicos. J foram registradas contaminaes de alface por Salmonella, Staphylococcus, Aeromonas e Escherichia coli O157: H7, de batatas e pepino por Listeria monocytogenes, de alcachofra, beterraba, couve-flor, escarola, erva-doce, tomate e melo por Salmonella, de brcolis por Aeromonas, etc. Nos Estados Unidos, DOYLE (2000) observou Salmonella em 7,7% das amostras de hortalias e E. coli em 16,7% das amostras de alface.

1.2.1. Staphylococcus aureus O gnero Staphylococcus apresenta-se na forma de cocos Gram-positivos, isolados ou agrupados em cachos. So anaerbios facultativos, no formadores de

esporos, imveis e catalase positivos, so bactrias mesfilas, com temperatura de crescimento variando entre 7C a 47,8C, com produo de enterotoxina entre 10C a 46C (FRANCO & LADGRAF, 1996). O gnero Staphylococcus est subdividido em 40 espcies, que se dividem de acordo com a sntese ou no da enzima coagulase, sendo a maioria, coagulasenegativa, com exceo do S. aureus, S. schleiferi subsp. coagulans, S. intermedius, S. hyicus e S. delphini (BANNERMAN et al. 2003). Dentre as espcies desse gnero, S. aureus considerada a mais importante em funo da sua alta patogenicidade ao homem (VON EIFF et al., 2001). Na intoxicao alimentar estafiloccica, os sintomas ocorrem entre 2 e 4 horas aps a ingesto da toxina pr formada no alimento e os mais comuns so vmito, nuseas, dores abdominais e diarria (HALPIN-DOHNALEK & MARTH, 1989). Alguns indivduos podem no apresentar todos os sintomas associados doena e, em casos mais graves, dor de cabea, contraes musculares e mudanas transitrias na presso sangnea e na pulsao podem acontecer. Os casos de bito so raros, embora a reposio de eletrlitos possa ser necessria para compensar a perda de fludos pela diarria e vmito. Porm, existem registros de morte por intoxicao estafiloccica entre idosos, crianas e pessoas severamente debilitadas (HALPINDOHNALEK & MARTH, 1989; ICMSF, 1996). Embora 0,1 1,0 g/kg da toxina possa causar sintomas em humanos, o tempo de aparecimento e a severidade dos sintomas dependem da quantidade de toxina ingerida e da susceptibilidade do indivduo. Devido curta durao dos sintomas, poucos casos so reportados e somente surtos que envolvem grande nmero de pessoas ganham ateno das autoridades (BRYAN, 1980; ICMSF, 1996). Segundo

Tranter (1996), a quantidade mnima de enterotoxina necessria para causar a doena no conhecida, mas a ingesto de, pelo menos, 1 g de toxina em 100g de alimento j induz o aparecimento de sintomas clnicos e este nvel de toxina alcanado quando a populao de S. aureus excede 105 por grama. Segundo Balaban & Rasooly (2001), a dose mnima de enterotoxinas ingerida para a ocorrncia desses sintomas menor, de 10 ng. As enterotoxinas estafiloccicas clssicas so exoprotenas hidrossolveis, com peso molecular de 26 a 29 KDa, caracterizadas por uma ponte dissulfeto, prximo ao centro da molcula. Os cinco tipos sorolgicos clssicos foram identificados e designados pelas letras A, B, C, D e E (BERGDOLL & ROBBINS, 1973). Apresentam grandes quantidades de lisina, cido asprtico, glutmico, tirosina, dois resduos de triptofano e cistinas, formando a cistena, qual, provavelmente, se atribui o stio de toxicidade. A composio dos aminocidos das toxinas A, D, E, B, C 1, C2 e C3 so semelhantes (BERGDOL, 1989). Entretanto, entre essas enterotoxinas, os tipos A, D e E compartilham uma maior seqncia de homologia (53 a 81%) enquanto B e C apresentam homologia de 50-66% (STILES & KRAKAUER, 2005). So consideradas superantgenos, que se caracterizam por ligaes simultneas ao Complexo Maior de Histocompatibilidade (CMH) de classe II na clula apresentadora de antgeno e aos receptores de clulas T, sem a presena de antgenos especficos. Com essa ligao, ocorrem efeitos sistmicos como febre alta, vmito, diarria e disfunes hepticas e renais (FERNANDEZ et al., 2006). A enterotoxina estafiloccica do tipo A (SEA) a mais comumente implicada nos casos de intoxicao alimentar. O gene entA composto por 771 pares de base e

carreado por um bacterifago temperado (BORST & BETLEY, 1994). A toxina produzida na fase exponencial de crescimento e, ao contrrio das enterotoxinas tipos B, C e D, no tem sua produo regulada pelo gene acessrio agr (TREMAINE et al., 1993). O gene entB regula a produo da enterotoxina do tipo B (SEB), que apresenta, aproximadamente, 900 nucleotdeos (JOHNS & KHAN, 1988). Esse gene pode estar integrado ao DNA bacteriano, no caso de amostras clnicas ou carreado por um plasmdio de 750Kb, em amostras de outras origens (SHALITA, 1977; SHAFER & IANDOLO, 1978). O grupo da toxina C (SEC) formado por trs subtipos antigenicamente distintos e denominados de SEC1, SEC2 e SEC3. Esses tipos apresentam estrutura protica altamente preservada, onde o SEC3 tem homologia de 98% na seqncia de nucleotdeos, em relao a SEC1. O SEC3 difere da SEC2 e SEC1, por 4 e 9 aminocidos, respectivamente (COUCH & BETLEY, 1989). Segundo Marr et al. (1993), a enterotoxina C heterognea e apresentas variaes antignicas e em sua seqncia molecular, ocorrendo ainda, as variantes SEC bovina e SEC ovina, cuja classificao baseada em diferenas antignicas e no animal hospedeiro da qual foi isolada. A enterotoxina estafiloccica tipo D (SED) o segundo tipo mais comum, associado a casos de intoxicao alimentar. O gene responsvel por essa toxina o entD, estando localizado no plasmdio PIB 485 (BAYLES e IANDOLO, 1989). O gene para a enterotoxina E (SEE) o entE e codifica uma protena de 29 Kda, que apresenta grande seqncia homloga com SEA, de 81%

(VANDENBUSSCHE et al., 1993). Assim como a SEA e SEP, este gene tambm carreado por um fago (BAYLES & IANDOLO, 1989). Em 1992, Betley et al. caracterizaram a toxina G e REN et al. (1994), seqenciaram o gene da toxina H. SU & WONG (1995) purificaram uma toxina emtica com a mesma seqncia do N-terminal da toxina H, porm sem a capacidade de induzir vmito. A enterotoxina estafiloccica tipo G (SEG) codificada pelo gene entG, constituda por 233 aminocidos e apresenta similaridade com SEB (39,1%) e SEC (37,8%), embora esteja mais intimamente relacionada ao superantgeno estreptoccico A (SSA) e com a enterotoxina pirognica A de Streptococcus (SPEA), apresentando 41,6 e 40,3% de similaridade, respectivamente (MUNSON et al., 1998). Mempel et al. (2003) observaram que os genes para as toxinas G, I, M, N e O pertencem ao mesmo cluster e a deteco de um desses genes, geralmente indica a presena dos outros quatro. A toxina tipo H (SEH) apresenta massa molecular de 27,3 Kda e homologia de apenas 36-38%, em relao aos outros tipos (SU & WONG, 1995), embora a enterotoxina tipo I (SEI), codificada pelo gene entI apresente a menor homologia entre as enterotoxinas, apresentando 218 nucleotdeos e, junto com a SEG, ambas tm a capacidade de causar resposta emtica e proliferao de clulas T, com produo de Interleucina II e Interferon gama (MUNSON et al., 1998). A enterotoxina tipo J (SEJ) carreada pelo mesmo plasmdio que a SED e os 269 aminocidos que constituem a SEJ apresentam similaridade de 64-66%, em relao SEA, SEE e SED (ZHANG et al., 1998). Recentemente, SEI tem sido agrupada com SEL, SEK, SEM e SEQ, baseado nas seqncias de homologia (ORWIN et al., 2003).

Mais recentemente, vrias outras toxinas tm sido descritas e seus genes seqenciados, sendo nomeadas como enterotoxinas K, L, M, N, O, P, Q, R e U (JARRAUD et al., 2001; KURODA et al., 2001; ORWIN et al., 2001 e 2003; LETERTRE et al., 2003; OMOE et al., 2003). Porm, at o momento, a relao entre as novas enterotoxinas e intoxicaes de origem alimentar ainda no est completamente esclarecida, pois a maior incidncia desses genes foi observada a partir de isolados clnicos ou cepas de colees de cultura (OMOE et al., 2002; BECKER et al., 2003). Essas novas enterotoxinas tm sido designadas como membro da famlia das enterotoxinas estafiloccicas baseadas na seqncia de similaridade com as enterotoxinas clssicas. O Comit Internacional de Nomenclatura para Superantgenos de Staphylococcus (INCSSN) recomendou que somente superantgenos que induzam emese por administrao oral em experincias utilizando primatas sejam chamadas de enterotoxinas, enquanto outras toxinas relacionadas, mas que no causam emese nesse modelo experimental sejam designadas como enterotoxina estafiloccica semelhante a superantgeno (staphylococcal entrotoxin-lihe (Sel) superantigens) (LINA et al., 2004). Baseando-se nas recomendaes do INCSSN, as toxinas SEJ, SEK, ..., SEU deveriam ser renomeadas como SElJ, SElK, ..., SElU, respectivamente (OMOE et al, 2005). Com exceo de SElH, SElI e SElG, que j apresentaram atividade emtica (SU & WONG, 1995; MUNSON et al., 1998), o envolvimento das outras SEl em surtos de origem alimentar ainda no est totalmente esclarecido. Existem poucos estudos sobre intoxicao estafiloccica envolvendo essas novas enterotoxinas (AKINEDEM et al., 2001; ROSEC & GIGAUD, 2002), em contraste com a extensa literatura sobre surtos causados pelas cinco enterotoxinas clssicas

(AKINEDEN et al., 2001; FUEYO et al., 2001; HOLECKOVA et al, 2002, ROSEC & GIGAUD, 2002; ERCOLINI et al, 2004).

1.2.2. Salmonella O gnero Salmonella tem a forma de bastonetes curtos Gram-negativos, anaerbios facultativos, no esporulados, sendo a maioria das espcies mveis, com exceo de S. Gallinarum e S. Pullorum. So organismos mesfilos, com temperatura tima de crescimento entre 35C a 37C, evidenciando certo crescimento entre 5c a 47C, embora a velocidade do mesmo seja reduzida abaixo de 10C (DOYLE & CLIVER, 1990). A patogenicidade das salmonelas varia de acordo com o tipo sorolgico, idade e condies de sade do hospedeiro. A concentrao e a nomenclatura das salmonelas sofreram vrias modificaes nos ltimos anos e ainda no esto totalmente definidos. A classificao atual, que baseada em caractersticas bioqumicas, divide o gnero Salmonella em duas espcies: Salmonella enterica e Salmonella bongori. O esquema Kauffmann & White divide o gnero em tipos sorolgicos, com base na composio antignica das salmonelas com relao aos seus antgenos O (somtico), Vi (capsular) e H (flagelar). Sorologicamente, o gnero se distribui em de cerca de 2000 sorotipos de salmonelas considerados como patgenos e sua presena no alimento inadmissvel ( PARDI et al., 1995 e SILVA et al., 1997). As principais sndromes clnicas associadas com infeces por Salmonella so a febre entrica (tifide) e gastrenterites (Miller, 2000). A febre entrica uma doena sistmica devido infeco por sorotipos exclusivamente humanos, S.Typhi e

S. Paratyphi. As manifestaes clnicas incluem febre, dor abdominal, diarria ou constipao. Sem tratamento, a taxa de mortalidade de 10% a 15%. Em contraste, muitas cepas de Salmonella no tifide, como S. Enteritidis e S. Typhimurum, infectam um amplo espectro de animais, como bovinos, sunos e freqentemente causam enterites em humanos. Todas as infeces gastrentestinais por Salmonella comeam com a ingesto do microrganismo em alimentos e gua contaminados (GIANELLA, et al., 1992). Doenas causadas por Salmonella vm crescendo a cada dcada desde a Segunda Guerra Mundial, e h estimativas de que apenas de 1% a 5% dos casos so reportados (TAUXE, 1997). No nordeste dos Estados Unidos, o isolamento de Salmonella Enteritidis aumentou de 1,12 por 100.000 habitantes em 1976 para 7,6 em 1986 (ST LOUIS, 1988). A S.Typhi o agente da febre tifide e a S.Typhimurium, um dos maiores responsveis pelas infeces de origem alimentar. De modo geral, os demais sorotipos de Salmonella causam, no adulto normal, apenas uma enterocolite que evolui sem complicaes e desaparece dentro de uma semana mais ou menos. Em crianas de at um ano, ou portadoras de certas patologias, a infeco causada por estas salmonelas pode evoluir de maneira diferente e ser bastante grave(TRABULSI, 2002). Aps a recuperao de uma infeco por Salmonella, alguns indivduos permanecem assintomticos, eliminando salmonelas nas fezes, e contribuindo para a disseminao, principalmente quando so manipuladores de alimentos(TRABULSI, 2002). A Salmonella possui muitas fimbrias que contribuem com sua habilidade de aderir s clulas epiteliais do intestino (BAUMLER, 1996). Alm de invadir a barreia

epitelial, os sorotipos associados com enterite induzem uma secreo do epitlio intestinal e inicia o recrutamento e migrao de neutrfilos para o lmen intestinal (GALYOV, 1997). Alm do epitlio intestinal, a Salmonella encontra outro obstculo da imunidade inata, os macrfagos da submucosa. Sorotipos de Salmonella causam infeco sistmica atravs de macrfagos, aparentemente por induo de

macropinocitose e subseqentemente ativao do mecanismo de virulncia que permite a fuga dos fagcitos, permitindo a sobrevivncia e replicao intracelular. A migrao de fagcitos contaminados para outros rgos do sistema reticuloendotelial provavelmente facilita a disseminao da bactria no hospedeiro (Alpuche Aranda, 1994). A adeso de Salmonella Typhimurium em cultura de clulas causa uma alterao na superfcie da clula hospedeira, caracterizada por alongamento e dilatao da membrana celular. Este processo denominado de Ruffling, pois a membrana da clula passa a apresentar um aspecto ondular. Esta alterao temporria e aps a internalizao da bactria, a superfcie da clula epitelial recupera sua aparncia normal (TRABULSI, 2002). Atravs da membrana da clula hospedeira, a Salmonella produz uma molcula sinalizadora ainda no conhecida, mas parece induzir uma cascata de transduo de sinal no interior da clula, com a fosforilao de vrias protenas que resulta em um aumento de Ca++ intracelular. O Ca++ , por sua vez, ativa protenas que promovem a despolimerizao da actina com o subseqente rearranjo do citoesqueleto e a formao de Ruffing. Isso causa a internalizao da bactria nas clulas intestinais. (TRABULSI, 2002).

Acredita-se que a diarria que ocorre nas infeces decorrente de Salmonella seja decorrente da produo de leucotrienos, induzindo o aumento de AMP cclico que ativa a secreo de fluidos (TRABULSI, 2002). A capacidade invasora das salmonelas um processo complexo, que envolve tanto genes cromossmicos como plasmidiais. Alm dos genes cromossmicos, as salmonelas contm um plasmdio que codifica genes essenciais de virulncia. Estes genes so necessrios para que a salmonela cause infeco sistmica (TRABULSI, 2002). O diagnstico das infeces por Salmonella realizado pelo isolamento e identificao da bactria. O material clnico a ser examinado depende do local da infeco, isto , fezes nas enterocolites, sangue nas septicemias, lquor nas meningites e assim por diante (TRABULSI, 2002). Antibiticos so recomendados para as salmoneloses com complicaes sistmicas e nos casos de febre tifide, tanto na fase aguda da doena como na fase de portador. (TRABULSI, 2002).

1.2.3. Escherichia coli O gnero Escherichia, juntamente com os gneros Enterobacter, Citrobacter e Klebsiella, formam o grupo denominado coliformes. O habitat desses trs gneros o trato intestinal do homem e de outros animais, alm do ambiente. O ndice de coliformes utilizado para avaliar as condies higinicas, sendo que altas contagens significam contaminao ps-processamento, limpezas e sanificaes deficientes, tratamentos trmicos ineficientes ou multiplicao durante o processamento ou estocagem. A presena de coliformes termotolerantes empregado como indicador de

contaminao fecal, ou seja, de condies higinico-sanitrias deficientes levando se em conta que a populao deste grupo constituda de uma alta populao de E.coli, pode indicar outros patgenos internos (PARDI, 1995 e SIQUEIRA, 1995). At recentemente, E.coli no era considerada a maior causadora de doenas gastrentestinais nos pases em desenvolvimento. No entanto, a toxina de Shiga produzida por esse microrganismo apresentada como uma das causas mais comuns de diarria hemorrgica nos Estados Unidos (MENG, 1997). Surtos em Oregon e Michigan, em 1982, estabeleceu E.coli O157:H7 como a causa de colite hemorrgica e sugeriu o consumo de bifes mal cozidos como o mais importante modo de aquisio (LUO, 1994). Desde ento o numero de casos aumentou dramaticamente. No entanto, outros alimentos como folhas de alface e suco de ma causaram pequenas epidemias (TAUXE, 1997). difcil determinar exatamente como a contaminao ocorre, mas exposio do homem a vacas ou ao estrume de vacas est freqentemente envolvida. Gados que esto infectados com STEC so assintomticos (MENG, 1997). E. coli compreende grande nmero de grupos e tipos sorolgicos, identificados por meio de anti-soros preparados contra as trs variedades de antgenos que ocorrem na espcie, ou seja, os antgenos O, K e H. Nem todas as amostras de Escherichia coli, provenientes seja do intestino humano como de qualquer ouro local do organismo, apresentam os trs tipos de antgenos ao mesmo tempo (TRABULSI, 2002). No momento, a nica indicao de rotina do estudo sorolgico de amostras de e. coli diz respeito ao diagnstico de infeces intestinais (TRABULSI, 2002). Nenhuma outra espcie bacteriana parece ser to verstil em sua patogenicidade como a Escherichia coli, uma vez que ela pode causar infeces intestinais, urinrias, septicemias, meningites entre outros (TRABULSI, 2002).

Com relao s infeces intestinais, pelo menos seis categorias de Escherichia coli so conhecidas: E. coli enteroinvasora (EIEC), E. coli enterotoxignica (ETEC), E. coli enteropatognica (EPEC), E. coli enterohemorrgica (EHEC), E. coli enteroagregativa (EaaggEC), e E. coli que adere difusamente (DAEC) (TRABULSI, 2002).

a. Eschechiria coli enteroinvasora (EIEC) A infeco intestinal causada pelas EIEC consiste em inflamao e necrose da mucosa do clon. Clinicamente, as infeces se manifestam por diarria sanguinolenta ou no, com a presena de muco e leuccitos, sendo ainda freqentemente acompanhada por dores abdominais e febre (TRABULSI, 2002). A patogenicidade das EIEC consiste na capacidade de invadir o epitlio intestinal e se espalhar lateralmente para as clulas adjacentes da mucosa do clon, onde proliferam causando morte celular(TRABULSI, 2002). As infeces intestinais provocadas por EIEC so mais freqentes em crianas maiores de dois anos de idade e no adulto. O reservatrio da bactria o prprio homem e a transmisso se faz pela ingesto de gua e alimentos contaminados e tambm pelo contato pessoal(TRABULSI, 2002). A cura para essas infeces costuma ser espontnea, mas quando a gravidade dos sintomas exige tratamento, o antibitico mais indicado a ampicilina(TRABULSI, 2002).

b. Escherichia coli enterotoxignica (ETEC)

As ETECs produzem as enterotoxinas termolbil (LT) a 100C/30 min e termoestvel (ST) (TRABULSI, 2002). A LT atua aumentando os nveis intracelulares de AMP cclico e estudos recentes sugerem que durante a infeco intestinal a toxina sai da clula bacteriana para a mucosa intestinal, devido ao efeito de sais biliares e de tripsina presentes no suco entrico. Isso gera uma reao em cascata que resulta em produo de AMP cclico em grande quantidade, com alterao profunda do metabolismo hidrossalino da clula, que se caracteriza por uma menor absoro de sdio pelas clulas das microvilosidades e maior excreo de cloro e bicarbonato pelas clulas das criptas intestinais, com acmulo de lquido no lmen intestinal e diarria(TRABULSI, 2002). O mecanismo de ao da ST envolve sua fixao e ativao da guanilato ciclase, com conseqente produo de elevados nveis de GMP cclico no citoplasma da clula. Assim, ocorre alteraes profundas no metabolismo celular, inclusive com relao atividade das bombas inicas(TRABULSI, 2002). A infeco intestinal causada por ETEC ocorre na superfcie das clulas, j que as bactrias so aderentes superfcie. E sua aderncia no provoca qualquer alterao nas microvilosidades (TRABULSI, 2002). Esse tipo de infeco ocorre tanto na criana quanto no adulto, sendo uma importante causa da diarria do viajante e o prprio homem reservatrio para as ETEC (TRABULSI, 2002). A infeco se transmite pela gua ou alimentos contaminados e pode ser transmitida atravs de contato pessoal. O diagnstico se faz pela pesquisa das enterotoxinas LT e ST e o tratamento para as infeces dispensa antibioticoterapia na maioria das vezes(TRABULSI, 2002).

c. Escherichia. coli enteropatognica (EPEC) So capazes de causar diarria em crianas de at um ano, sendo a infeco mais freqente e mais grave naquelas que no se alimentaram com leite materno. O mecanismo de transmisso das EPEC no foi estabelecido mas parece que o reservatrio o prprio homem e em hospitais e berrios a bactria transmitida por contato pessoal(TRABULSI, 2002). Estas bactrias aderem s clulas formando agrupamentos ou microcolnias na superfcie da clula, sendo esse padro de adeso localizada(TRABULSI, 2002). A resposta da clula adeso da EPEC envolve aumento de clcio intracelular, fosforilao de vrias protenas e condensao de microfilamentos de actina logo abaixo do local onde a bactria se encontra aderida. Vrios estudos sugerem que o aumento de clcio pode explicar a destruio das vilosidades, uma vez que ativa uma protena que corta os filamentos de actina, responsveis pela formao daquelas estruturas. As causas da diarria no so conhecidas, mas poderia ser resultante da perda das microvilosidades, m absoro; ativao de mediadores intracelulares do transporte de ons: clcio, protena cinase C, tirosina cinase(TRABULSI, 2002). O diagnstico realizado pelo isolamento de EPEC das fezes e a antibioticoterapia quase sempre desnecessria nestas infeces(TRABULSI, 2002). inositol fosfato e denominado de adeso

d. Escherichia. coli enterohemorrgica (EHEC)

Estas bactrias podem causar diarria branda, sanguinolenta (colite hemorrgica) e sndrome urmica hemoltica em crianas e adultos, e produzem citotoxinas: Shiga like toxin (SLT I e SLT II) (TRABULSI, 2002). As EHEC aderem intimamente s clulas, produzindo leso

attachment/effacement (adeso e invaso) o que j provoca a diarria. Devido a isso, o papel das citotoxinas na induo da diarria ainda no est comprovado. Mas essas substncias poderiam explicar o desenvolvimento da capacidade de causarem a sndrome urmica hemoltica (TRABULSI, 2002). E.coli O157:H7 tem um amplo espectro de manifestaes clnicas, podendo ser encontrado em pacientes com diarria hemorrgica ou no, sndrome urmicahemoltica ou em portadores assintomticos. Estudos revelam que 23% dos pacientes com E.coli O157:H7 so hospitalizados e 6% tem sndrome urmica-hemoltica sendo 1,2% fatais (BOYCE, 1995).

e. Escherichia. coli enteroagregativa (EaaggEC) Formam um padro agregativo de adeso, lembrando a disposio de tijolos empilhados, sendo bactrias freqentes em fezes de crianas normais e com diarria aguda (TRABULSI, 2002). Recentemente foram descritas duas toxinas em amostras de EaaggEC; uma termoestvel,semelhante a enterotoxina ST de ETEC que provoca aumento de GMP cclico intracelular e outra, relacionada antigenicamente com uma hemolisina de E. coli, que induz o aumento de clcio intracelular e a fosforilao de vrias protenas da clula hospedeira (TRABULSI, 2002).

A identificao parece ser realizada apenas pela identificao do padro de adeso em cultura de clulas, por sondas genticas ou por PCR (TRABULSI, 2002).

f. Escherichia coli que adere difusamente (DAEC) Esse grupo adere difusamente superfcie das clulas e estudos quanto participao dessa bactria na diarria so controversos. Enquanto algumas pesquisas apontam que capaz de causar diarria, outros no demonstraram uma associao da DAEC com a diarria (TRABULSI, 2002).

2. OBJETIVOS

Devido ao aumento do consumo de produtos minimamente processados e pelo fato de alguns destes produtos serem consumidos crus, alm da falta de dados sobre a qualidade dos alimentos comercializados na nossa cidade, os objetivos desse trabalho foram: 2.1. Pesquisar a presena de patgenos como Salmonella e Staphylococcus aureus em 50 amostras de legumes, verduras e frutas minimamente processadas. 2.2. Avaliar a qualidade higinico-sanitria dessas amostras, pela determinao do Nmero Mais Provvel de coliformes termotolerantes.

3. MATERIAL E MTODOS:

3.1. Obteno das amostras para anlises As amostras de produtos minimamente processados (legumes, verduras e frutas) foram coletadas em supermercados e quitandas da cidade de Botucatu SP. As amostras foram mantidas sob refrigerao, em caixa isotrmica contendo gelo reciclvel, at o momento do processamento no laboratrio. Foram coletadas, preferencialmente, amostras de vegetais consumidos crus, como alface, rcula, cenoura e beterraba raladas cruas para saladas e frutas picadas. Alimentos picados que foram submetidos coco tambm foram submetidos s anlises, como couve, brcolis e espinafre.

3.2. Anlises microbiolgicas 3.2.1. Preparo das amostras e suas diluies: Para a anlise, 25 gramas da amostra foram pesados e homogeneizados em 225 ml de gua tamponada esterilizada, em sacos plsticos apropriados, que foram levados ao Stomacher Lab Blender 400 por trinta segundos. A partir desta diluio inicial de 10-1, foi preparada uma srie de diluies decimais, utilizando-se salina.

3.2.2. Determinao do Nmero Mais Provvel (NMP) de coliformes termotolerantes (KORNACKI & JOHNSON, 2001) Cada diluio da amostra foi inoculada em volumes de 1 mL, em cada srie de trs tubos por diluio, contendo 10 mL de caldo lauril sulfato com um tubo de Durham invertido. Os tubos foram incubados a 35C por 24-48 horas. Os inculos positivos

revelaram-se pela observao da produo de gs no tubo de Durham. A seguir, trs aladas de cada tubo positivo foram repicadas em tubos de ensaio com 5 mL de caldo EC para a confirmao de coliformes termotolerantes (CT). Todos os tubos de EC continham tubos de Durham invertidos. O caldo EC foi inoculado a 45C por 24 horas. Aps o perodo de incubao, a leitura foi realizada pela observao da presena de gs no tubo de Durham invertido. A seguir, utilizando-se a tabela do NMP, foram calculados os NMP de CT por grama de amostra analisada.

3.2.3. Enumerao de estafilococos coagulase positiva (LANCETTE & BENNETT, 2001) Para a enumerao dos estafilococos, foi utilizado o mtodo da semeadura em superfcie, onde 0,1 mL das diversas diluies da amostra foi depositado em placas de Petri com gar Baird-Parker suplementado com telurito de potssio e soluo de gema de ovo e o inculo foi espraiado com o auxlio de um basto de vidro em L. Aps a incubao a 35C por 48 horas, foi realizada a contagem da placa que apresentava entre 25 e 250 UFC (Unidades Formadoras de Colnias). As colnias suspeitas de estafilococos coagulase positiva apresentam cor negra, com ou sem halo e um mximo de cinco colnias foram isoladas e repicadas para tubos com TSA inclinado, que foram incubados por 24 horas a 35C. Foi realizado o teste da produo de catalase e colorao pelo mtodo de Gram. Aps estes testes iniciais, foi realizado o teste da coagulase em tubo e termonuclease. Para identificao de S. aureus, as cepas positivas nas duas provas anteriores foram submetidas ao kit "Staphytect Test Dry Spot", onde partculas azuis de ltex so

recobertas com fibrinognio humano e imunoglobulinas tipo G contra a protena A de S. aureus, o Fator Clumping e a cpsula de S. aureus meticilina-resistente..

3.2.4. Deteco da presena de Salmonella (ANDREWS et al, 2001) Para a deteco da presena de Salmonella, 25 gramas da amostra do alimento foram homogeneizados em 225 mL de gua peptonada tamponada, em um saco plstico no "Stomacher" durante dois minutos. Aps esse perodo, o homogeneizado foi transferido a um Erlenmeyer e incubado a 35C por 24 horas. A seguir, 1 mL foi semeado em um tubo de ensaio contendo 10 mL de caldo tetrationato ao qual foi adicionado um volume de 0,2 mL de iodeto de potssio imediatamente antes do uso. O tubo foi incubado a 35C por 24 horas. Outra alquota de 0,1 mL foi transferida para um tubo com 10 mL de caldo Rappaporte-Vassiliadis e foi incubado a 42C por 24 horas. Aps este perodo, uma alada de cada tubo foi semeada em placas de Petri contendo gar xilose-lisina-desoxicolato (XLD) e placas contendo gar Salmonella-Shigella. Aps incubao de 24 horas a 35C, as colnias caractersticas de Salmonella foram isoladas e repicadas para tubos de ensaio contendo gar tripticase soja inclinado (TSA), sendo consideradas as cepas estoque. Os tubos foram incubados a 35C por 24 horas. A partir desse crescimento foram feitos repiques em tubos de ensaio contendo gar trplice acar ferro inclinado (TSI) e em tubos com gar fenilalanina inclinado. Os tubos foram incubados a 35C por 18-24 horas. Aps os resultados esperados nestes 2 testes, a cepa foi submetida ao sistema API-20E (Biomrieux), que apresentava 20 provas bioqumicas para enterobactrias. Aps leitura positiva no API, as cepas suspeitas de serem Salmonella foram testadas frente ao soro polivalente somtico e depois da positividade deste, ao soro flagelar.

4. RESULTADOS

Foram analisadas 50 amostras de legumes, hortalias e frutas minimamente processadas como abobrinha, repolho, beterraba, pepino, cenoura, brcolis, pimento, mandioquinha, ervilha, chuchu, chicria, couve, acelga, agrio, couve-flor, mandioca, alface, vagem, salsinha, cebolinha, cebola, manga, abacaxi, mamo e ma obtidos de 5 produtores diferentes. A Tabela 1, apresenta os resultados das anlises microbiolgicas realizadas em amostras de alimentos minimamente processados, coletados em quitandas e supermercados, na cidade de Botucatu. Pode-se verificar que apenas uma amostra (2%) apresentou Staphylococcus aureus. Tambm foi pesquisada a presena de Salmonella, que foi negativa em todas as amostras. Em relao ao NMP de coliformes termotolerantes, 76% das amostras estavam fora dos padres microbiolgicos da

RDC N12 (2001) e a contaminao variou de < 3 a > 1,1 x 107 NMP/g.

Tabela 1. Resultados das anlises microbiolgicas realizadas em amostras de alimentos minimamente processados, coletados em quitandas e supermercados, na cidade de Botucatu (2007). Amostra 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 Salmonella ausncia ausncia ausncia ausncia ausncia ausncia ausncia ausncia ausncia ausncia ausncia ausncia ausncia ausncia ausncia ausncia S. aureus (UFC/g) < 100 1,0 x 102 < 100 < 100 < 100 < 100 < 100 < 100 < 100 < 100 < 100 < 100 < 100 < 100 < 100 < 100 CT (NMP/g) >2,4x107 3,6 4,3x104 >2,4x107 >2,4x107 1,1>107 >2,4x107 >2,4x107 >2,4x107 1,1x107 1,1x107 2,1x106 >2,4x107 2,1x106 >2,4x107 >2,4x107 Situao de consumo Imprpria Prpria Imprpria Imprpria Imprpria Imprpria Imprpria Imprpria Imprpria Imprpria Imprpria Imprpria Imprpria Imprpria Imprpria Imprpria

Legenda: NMP: Nmero Mais Provvel; UFC: Unidades Formadoras de Colnias; CT: Coliformes Termotolerantes.

Tabela 1. Resultados das anlises microbiolgicas realizadas em amostras de alimentos minimamente processados, coletados em quitandas e supermercados, na cidade de Botucatu (2007). (Continuao) 17 18 19 20 21 22 23 24 25 ausncia ausncia ausncia ausncia ausncia ausncia ausncia ausncia ausncia < 100 < 100 < 100 < 100 < 100 < 100 < 100 < 100 < 100 >2,4x107 4,6x106 >2,4x107 >2,4x107 1,5x106 210 1,1x107 1,1x107 9,3x105 Imprpria Imprpria Imprpria Imprpria Imprpria Prpria Imprpria Imprpria Imprpria

26 27 28 29 30 31 32 33

ausncia ausncia ausncia ausncia ausncia ausncia ausncia ausncia

< 100 < 100 < 100 < 100 < 100 < 100 < 100 < 100

>2,4x107 2,1x105 2,8x105 >2,4x107 >2,4x107 2,1x106 9,3x105 2,1x106

Imprpria Imprpria Imprpria Imprpria Imprpria Imprpria Imprpria Imprpria

Legenda: NMP: Nmero Mais Provvel; UFC: Unidades Formadoras de Colnias; CT: Coliformes Termotolerantes.

Tabela 1. Resultados das anlises microbiolgicas realizadas em amostras de alimentos minimamente processados, coletados em quitandas e supermercados, na cidade de Botucatu (2007).(Continuao) 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 ausncia ausncia ausncia ausncia ausncia ausncia ausncia ausncia ausncia ausncia ausncia ausncia ausncia ausncia ausncia ausncia ausncia < 100 < 100 < 100 < 100 < 100 < 100 < 100 < 100 < 100 < 100 < 100 < 100 < 100 < 100 < 100 < 100 < 100 210 210 4,6x106 7,5x104 >2,4x107 2,1x105 15 9,1x103 3,6x103 3,6x103 15 93 0 0 0 0 0 Prpria Prpria Imprpria Imprpria Imprpria Imprpria Prpria Imprpria Imprpria Imprpria Prpria Prpria Prpria Prpria Prpria Prpria Prpria

Legenda: NMP: Nmero Mais Provvel; UFC: Unidades Formadoras de Colnias; CT: Coliformes Termotolerantes.

6. DISCUSSO Devido facilidade que os minimamente processados trazem ao

consumidor, seu consumo est crescendo. Como a manipulao durante o processo muito intenso, as verduras e frutas minimamente processadas podem ser contaminadas por coliformes

termotolerantes e bactrias patognicas, necessitando de boas prticas de higiene e armazenamento para prevenir a contaminao e o crescimento de bactrias. Por serem consumidos, na maioria das vezes, cru. Os padres microbiolgicos da RDC n12 da ANVISA permitem at 10 2 NMP/g de coliformes termotolerantes e exigem a ausncia de Salmonella em 25 gramas de alimento. A partir dos resultados obtidos pelas anlises microbiolgicas observou se que 76% das amostras estavam contaminadas com coliformes termotolerantes e fora dos padres. Valores semelhantes foram observados por Frder et al (2007), em um estudo realizado na cidade de So Paulo, onde verificaram que 73% das amostras de frutas e verduras minimamente processadas analisadas apresentavam concentrao de coliformes termotolerantes maiores que 102 UFC/g. As amostras de Rall et al. (2005) verificaram que 60,6% esto fora das recomendaes quanto ao nmero de coliformes termotolerantes, cuja contaminao variou de < 3 a > 1,1 x 10 6 NMP/g. COELHO et al (2001) relataram que 100% das amostras de alface pesquisadas estavam

contaminadas com coliformes totais e 50% por coliformes termotolerantes. Comparando esses resultados com os obtidos nesse trabalho, percebe - se que em muitas regies do Brasil, grande parte dos produtos minimamente processados comercializados no pas est imprpria para o consumo.

Valores menores foram observados por PINHEIRO et al (2005) em Fortaleza que verificaram 28% das amostras estavam imprprias ao consumo em relao coliformes termotolerantes e FERREIRA (2001)onde?? encontrou 30% das amostras de verduras e legumes estudados que apresentaram contagem de bactrias na ordem de 103 UFC/grama (Unidades Formadoras de Colnias) mas 100% das amostras estavam dentro dos padres da RDC numero 12. Mostrando que h regies em que a higienizao feita de forma correta. Em outros pases, DOYLE (2000) encontrou E. coli em 16,7 % das amostras dos Estados Unidos e LITTLE (2004) na Inglaterra em 0.9%. Dados que podem ser considerados baixo em relao com a maioria dos estudos feitos no Brasil. Nenhuma amostra apresentou Salmonella, assim como nos estudos de WJCIK-STOPEZYNSKA (2004) e LITTLE (2004). Nos estudos realizados no comrcio brasileiro RALL et al.(2005) observou que 1,8% das amostras estavam contaminadas por Salmonella e FRDER et al (2007) em So Paulo encontraram 3%. Valores maiores foram observados na cidade de Fortaleza por PINHEIRO et al. (2005) que relataram a presena de Salmonella em 25% das amostras. Nos Estados Unidos, DOYLE (2000) observou Salmonella em 7,7% das amostras e, na Inglaterra, SAGOO (2003) relatou que 0,2% de suas amostras apresentavam esse patgeno. Isso mostra que tanto no Brasil quanto no exterior a presena dessa bactria patognica pode variar. S.aureus foi encontrada em 1 amostra em concentrao de 10 2 UFC/g. PINHEIRO (2005), WJCIK-STOPEZYNSKA (2004) e RALL (2005) tambm

observaram baixa frequencia de S.aureus. Porm 15% das amostras de Ferreira apresentaram Staphylococcus Considerando se os parmetros da Anvisa, 76% das amostras estavam fora dos padres., FRODER (2007) (74.5%) e RALL (2005) (62.4%), obtiveram resultados semelhantes e PINHEIRO (2004) revelou que somente 43% estavam insatisfatrias. SAGGO (2003) ma Inglaterra encontrou apenas 0,5% das amostras fora dos padres. Isso pode ser justificado pelo Brasil ser um pas menos desenvolvido que a Inglaterra e aqui no h fiscalizao adequada para esse tipo de produto, uma vez que ele relativamente novo no mercado sendo sua legislao feita em 2001.

6. CONCLUSO

A partir dos dados obtidos, pode-se concluir que esses produtos apresentaram condies higinico sanitrias insatisfatrias e, apesar de no apresentarem os patgenos pesquisados, podem apresentar risco sade dos consumidores.

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