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1) INTRODUO: Conseguimos obter atravs de cultura de microorganismos, diversas reaes qumicas que precisariam de condies extremas ou remotas para

ocorrer, enquanto diversos microorganismos realizam essa reao naturalmente. Para atingirmos este patamar de conhecimento necessrio antes aprendermos mtodos de higiene, manipulao e cultura dentro dos laboratrios de microbiologia. Neste relatrio abordaremos as diversas formas de realizar tais procedimentos citados anteriormente, em teoria, para ns. 2) OBJETIVOS: Aprender a manipular materiais com amostras microbianas na zona de segurana visando minimizar ou extinguir contaminaes diversas; Preparar culturas diferenciadas utilizando meios de cultura seletivos; Coletar material para cultura; Observar e descrever o crescimento microbiano das amostras coletadas; Transferncia de cultura entre meios; Identificar crescimento microbiano em condies adversas; Identificar agentes fsicos e qumicos que influenciam no desenvolvimento microbiano; Quantificar o crescimento microbiano.

3) MATERIAL: 1 aula prtica: 3 placas Petri com Agar cetrimida, citrato de Simmons e EMB; 3 tubos de ensaio com caldo nutritivo e diferentes pHs; 3 tubos de ensaio com caldo nutritivo com pH=7,0; Ala microbiana; Tubo de ensaio com cultura de Serratia marcescens; Tubo de ensaio com cultura de Escherichia coli; Tubo de ensaio com cultura de Pseudomonas aeruginosa; Bico de Bunsen; Fsforos 2 aula prtica: Nenhum material utilizado. 3 aula prtica: 2 Placas de Petri com gar nutritivo; Ala microbiana; Tubo de ensaio com cultura de Escherichia coli; Tubo de ensaio com cultura de Bacillus cereus; Bico de Bunsen; Fsforos; Swab descartvel; 4 discos de papel de filtro; Amostras de Pinho Sol, detergente, eosina e violeta genciana 0,1%. 4 aula prtica: Nenhum material utilizado. 5 aula prtica: 7 Pipetas; Tubo de ensaio com cultura de Escherichia Coli; 7 Tubos de ensaio com soluo salina; Ala de Drigalsky;

6 Placas de Petri com gar nutritivo

4) PROCEDIMENTOS: 1 aula prtica: Como procedimento primrio e essencial de todas as prticas, ao entrarmos no laboratrio, lavamos as mos com gua abundante e detergente, e tambm limpamos a bancada de trabalho com papel toalha e lcool. Esta primeira aula foi dividida em duas partes. Na primeira parte ns inoculamos E. coli, S. marcescens e P. aeruginosa em trs placas de Petri com Agar cetrimida, citrato de Simmons e EMB. Dividimos cada placa em trs reas, marcando com retroprojetor a superfcie externa da placa, e numeramos cada rea com os nmeros 1, 2 e 3, referentes aos microorganismos utilizados. Tambm a identificamos com turma e grupo (G3). Acendemos o bico de Bunsen e flambamos a ala microbiana ao rubro para esteriliz-la. Na zona de segurana, abrimos o tubo de ensaio com cultura de E. coli, flambamos a entrada do tubo, recolhemos com a ala microbiana uma gota da cultura, flambamos a entrada do tubo e o fechamos. Abrimos a placa com gar cetrimida e estriamos a gota da cultura de E. coli na zona 1. Repetimos este procedimento em todas as placas com a E.coli e, depois com os demais microorganismos, sendo a S. marcescens inoculada nas zonas 2 e a P. aeruginosa inoculada nas zonas 3 de cada placa segundo a imagem:

Em seguida iniciamos a segunda parte da prtica, onde deveramos inocular E. coli em tubos de ensaio. Identificamos os tubos com diferentes valores de pH com turma e grupo (G3), do mesmo modo, identificamos os tubos com mesmo pH com etiquetas contendo turma e grupo (G3) e a temperatura em que seriam conservados, segundo a figura a seguir:

Feito isso, com o bico de Bunsen j aceso, flambamos a ala microbiana, abrimos o tubo de ensaio na zona de segurana contendo a cultura de E. coli, flambamos a entrada do tubo,recolhemos uma gota da amostra, flambamos a entrada do tubo e o fechamos. Em seguida abrimos na zona de segurana o tubo contendo meio de cultura com pH 3,0, flambamos a entrada do tubo, depositamos a amostra da cultura, flambamos a entrada do tubo novamente e o

fechamos. Repetimos este procedimento com os demais tubos com pHs diferentes e com os tubos de mesmo pH. Depois do procedimento, recolhemos qualquer lixo originado durante a prtica, limpamos a bancada, lavamos as mos e samos do laboratrio. 2 aula prtica: Como procedimento primrio e essencial de todas as prticas, ao entrarmos no laboratrio, lavamos as mos com gua abundante e detergente, e tambm limpamos a bancada de trabalho com papel toalha e lcool. Observamos o crescimento microbiano das inoculaes feitas na 1 aula prtica. Discutimos resultados entre grupos e comparamos o crescimento das diferentes culturas obtidas. 3 aula prtica: Como procedimento primrio e essencial de todas as prticas, ao entrarmos no laboratrio, lavamos as mos com gua abundante e detergente, e tambm limpamos a bancada de trabalho com papel toalha e lcool. Antes de qualquer manobra acendemos o bico de Bunsen e flambamos a ala microbiana ao rubro para esteriliz-la. Dividimos uma placa de Petri com gar nutritivo em duas partes, marcando com retroprojetor a rea externa da placa. Posteriormente esta placa seria exposta a raios UV com metade tampada e metade aberta. Em seguida abrimos o tubo de ensaio com cultura de B. cereus, flambamos a entrada do tubo, recolhemos com a ala microbiana uma gota da cultura, flambamos novamente a entrada do tubo e o fechamos. Na rea de segurana, abrimos a placa de Petri e estriamos a amostra da cultura em uma metade da placa. Repetimos esse procedimento para estriar a outra metade da placa, como mostra a figura a seguir:

Em seguida abrimos o tubo com cultura de E. coli na zona de segurana, flambamos a entrada do tubo, molhamos o swab no meio liquido, flambamos novamente a entrada do tubo e o fechamos. Feito isso expalhamos a amostra no gar nutritivo, de modo a cobrir toda a superfcie do gar. Mergulhamos cada um dos quatro discos de papel de filtro em quatro agentes qumicos diferentes (pinho sol, detergente, eosina e violeta gienciana), abrimos a placa de Petri na zona de segurana e colocamos os discos em quatro pontos separados em cima do gar, como mostra a figura:

Depois do procedimento, recolhemos qualquer lixo originado durante a prtica, limpamos a bancada, lavamos as mos e samos do laboratrio. 4 aula prtica: Como procedimento primrio e essencial de todas as prticas, ao entrarmos no laboratrio, lavamos as mos com gua abundante e detergente, e tambm limpamos a bancada de trabalho com papel toalha e lcool. Observamos o crescimento microbiano das inoculaes feitas na 3 aula prtica. Discutimos resultados entre grupos e comparamos o crescimento das diferentes culturas obtidas. 5 aula prtica: Como procedimento primrio e essencial de todas as prticas, ao entrarmos no laboratrio, lavamos as mos com gua abundante e detergente, e tambm limpamos a bancada de trabalho com papel toalha e lcool. Nesta aula, iniciamos a quantificao bacteriana e para isto, foi escolhido o mtodo de spread plate para a contagem de crescimento microbiano. Para isto, usou-se um tubo de ensaio contendo uma soluo concentrada da cultura de E. Coli e dela retirou-se com uma pipeta uma alquota de 1 ml que foi transferida para um tubo contendo 9 ml de uma soluo salina, e a partir dessa soluo diluda (10-1) foi retirado uma alquota de 1 ml e transferido para um tubo contendo 1 ml de uma soluo salina, possuindo assim no tubo uma diluio de 10-2 sendo que este procedimento de se transferir sempre uma alquota de 0,1 ml de um tubo para outro com 0,9 ml de soluo chamado de diluio seriada, este procedimento foi feito at que se houvesse 7 tubos diludos (10-1 at 10-7). Como mostrado na figura abaixo.

importante ressaltar que aps cada transferncia foi utilizada uma pipeta nova para que vestgios restantes da diluio anterior na pipeta no contaminasse a nova diluio, e para evitar contaminao do material, flambamos a abertura de cada tubo antes e depois de seu uso . Aps esta diluio seriada, iniciamos de fato o mtodo spread plate para a contagem de crescimento microbiano em placas. Este mtodo consiste em se transferir 0,1 ml do inculo do tubo para uma placa de Petri que j contenha o meio de cultura, e aps isto feito o espalhamento do inculo com a ala de Digalsky na placa. Dessa forma, retiramos uma alquota de 0,2 ml de um tubo com diluio de 10-5 e transferimos para 2 placas de Petri (0,1 ml para cada placa) e em seguida espalhamos a alquota

na placa com o auxlio da ala de Drigalsky. Este procedimento foi realizado tambm com os tubos contendo as diluies de 10-6 e 10-7. Para que no houvesse contaminao, a ala de Drigalsky foi esterilizada aps cada espalhamento na placa de forma que aps o uso ela era posta num becker com lcool e quando usada, era flambada e s aps que a chama se extinguisse da ala seu uso era permitido. Feito o espalhamento, a ala retornava ao becker com lcool. Depois do procedimento, recolhemos qualquer lixo originado durante a prtica, limpamos a bancada, lavamos as mos e samos do laboratrio. 6 aula prtica: Como procedimento primrio e essencial de todas as prticas, ao entrarmos no laboratrio, lavamos as mos com gua abundante e detergente, e tambm limpamos a bancada de trabalho com papel toalha e lcool. Observamos as placas que foram incubadas na prtica anterior e ento foi iniciado a penltima etapa da quantificao bacteriana que a contagem. Para a contagem, as placas do Rodrigo (10-5) no foram contadas, pois houve contaminao e nas placas do Michel (10-7) ainda havia uma concentrao alta de bactrias. Como nas placas de 10-5 e 10-6 no houveram contagem, apenas as 2 placas de 10-7 foram contadas, e foram encontradas 124 e 33 UFC (unidade formadora de colnia), respectivamente em cada placa. Aps a contagem, foi realizada a ltima etapa da quantificao que o clculo para se saber a concentrao de bactrias/ml. O clculo para se encontrar a concentrao de bacterias na amostra original consiste na seguinte expresso: N contado x 1/diluio x 1/ volume pipetado (ml), como houve 2 placas para a diluio de 10-7, foi feito ento uma mdia aritmtica entre os valores e assim, o numero contado da mdia foi de 79 UFCs. Depois do procedimento, recolhemos qualquer lixo originado durante a prtica, limpamos a bancada, lavamos as mos e samos do laboratrio.

5) RESULTADOS: Observamos os resultados da 1 aula prtica somente na 2 aula prtica, e assim sucessivamente. Como resultados da primeira aula, observamos que os resultados da 1 parte da prtica no foram satisfatrios. Apenas a placa de colorao amarela (meio de gar cetrimida) atingiu o resultado esperado. Esperava-se que as culturas de E. coli e S. marcescens no se desenvolvessem neste meio, e de fato no observamos crescimento microbiano nas reas correspondentes a estas duas bactrias (reas 1 e 2). Entretanto era esperado o crescimento da P. aeruginosa. Esta cultura se desenvolveu muito bem, como podemos visualisar na imagem a seguir:

Ainda na 1 parte da prtica ao analisarmos a placa com meio de cultura de citrato de Simmons, notamos que ele mudou de cor, de verde para azul, e que houve crescimento de todas as culturas. Entretanto este resultado no era esperado. Somente a cultura de S. marcescens deveria crescer. Apesar de no ser possvel visualizar com preciso os crescimentos microbianos em todas as reas na imagem a seguir, podemos afirmar que houve difuso de algum material da S. marcescens para as outras reas. As outras culturas (E. coli e P. aeruginosas) aproveitaram algo expelido pela S. marcescens e cresceram. A nica fonte de carbono presente neste meio era o citrato, logo se a bactria era capaz de metaboliz-lo, alterava o pH do meio de 7,0 para maior que 7,0, tornando-o bsico. Isso seria comprovado pela mudana na cor de verde para azul, pois o meio possua indicador de pH, o azul de bromotimol. Sendo assim somente a rea 2 (S. marcescens) ficaria azul, mas como toda a placa sofreu alterao de cor, podemos afirmar que houve difuso como mostra a figura abaixo:

Na placa com meio de cultura gar EMB (eosina+ azul de metileno) era esperado o crescimento todas as colnias, porm elas deveriam adquirir aspectos diferentes, de modo que a cultura de E. coli deveria ficar verde metlico, mas ficou preto, como podemos ver na imagem a seguir:

Apesar da baixssima qualidade da imagem, possvel ver que as demais culturas ficaram dentro do esperado e tiveram aspectos bastante parecidos. Ambas ficaram rosadas com aspecto gelatinoso, porm os estriamentos no foram feitos de maneira correta, logo ficou uma mancha compacta nas reas 2 e 3 (S. marcescens e P. aeruginosa, respectivamente). Como resultados da segunda parte da prtica pudemos observar que temperatura de 36C, aps 36 horas, houve um crescimento mnimo da cultura de E. coli no tubo de pH 3,0, enquanto no tubo de pH 7,0 houve um bom crescimento, semelhante ao encontrado no tubo de pH 10,0. Pudemos chegar a essas concluses observando a turbidez de cada tubo. Logo, o primeiro estava quase translcido, mas era possvel observar resduos do meio lquido, que indicava a presena de desenvolvimento microbiano. J no tubo de pH 7,0 e 10,0 o meio se encontrava bastante turvo, indicando um crescimento padro para a E. coli. Conclumos ento que a bactria E. coli no se desenvolve em condies cidas, mas em condies neutras e alcalinas seu desenvolvimento no afetado). Quanto aos tubos diferenciados pela temperatura de conservao, observamos que aquele que foi conservado a 4C durante 36 horas no apresentou crescimento microbiano, uma vez que a soluo nutritiva do meio no apresentava nenhuma turbidez. J no tubo que seria conservado a 28C houve um bom crescimento, pois o tubo estava translcido, porm menos que o tubo conservado a 36C, uma vez que neste pudemos visualizar o meio turvo, indicando assim um excelente crescimento microbiano. Veja as imagens abaixo:

Com base em nossos resultados e nos resultados de toda a turma (que foram muito prximos aos nossos), chegamos ento concluso que a bactria E. coli no cresce em ambientes cidos ou de baixa temperatura, e que seu pice de crescimento encontrado sob temperatura ambiente e pH neutro. Como resultados terceira aula prtica, observamos que a placa dividida em duas partes apresentou muito crescimento na parte protegida pela tampa da placa e pouco crescimento na parte no protegida. Este resultado era esperado, portanto pudemos concluir que o procedimento foi realizado corretamente. Como possveis motivos para este resultado temos: - Bactria sensvel a UV. - Com relao ao pouco crescimento na parte exposta: Posicionamento errado da placa de teste, formao de endosporos que posteriormente, em condies no extremas, germinaram.

Tambm observamos os resultados do procedimento com agentes qumicos na cultura de E. Coli. Tivemos como Amostras testadas na prtica anterior: eosina, pinho sol, detergente e violeta gensiana; e como resultados obtivemos os seguintes valores para os halos (regio de efeito bactericida) em cm:

Todos aceitos como falhas, valores encontrados no correspondem a um teste positivo. Temos como possveis justificativas para o erro: - O papel foi "arrastado" na placa de teste, comprometendo a validade da amostra; - Contaminao da amostra; - Agente qumico testado estava em baixa concentrao/qualidade para o devido teste; - Bactrias testadas eram resistentes ao agentes qumicos utilizados; - "Tapete microbiano" mal executado; - Placa de incubao no era ideal para teste quantitativo. Na 1 aula prtica de quantificao microbiana, observamos que a diluio seriada uma boa estratgia para se quantificar um crescimento microbiano, pois a cada diluio o nmero de bactrias reduzido exponencialmente, e a partir de uma determinada diluio, seu nmero j suficiente para que a contagem seja efetuada. Na 2 aula prtica de quantificao microbiana, observamos que nossos resultados eram prximos ao dos outros grupos, e que a contaminao das placas do Rodrigo (10-5) pode ter sido causado pelos seguintes fatores: - Pipeta contaminada no momento da diluio seriada; - Uso da pipeta e/ou ala de Drigalsky fora da zona de segurana; Enquanto que as placas do Michel (10-6) possua um nmero de UFCs que extrapolavam o nmero permitido, sendo que esta extrapolao ocorreu na maioria dos grupos.

Placas de diluio 10-6 com numero de UFCs acima do permitido.

Logo, apenas as placas da Raquel (10-7) foram contadas, tendo em vista que no houve contaminao e nem extrapolao do nmero de UFCs permitidas (de 20 a 200 UFCs), demonstrando ento xito na realizao da prtica. Aps a contagem, foi encontrado um valor de 124 UFCs numa placa e 33 UFCs na outra placa. Assim, foi calculado a mdia aritmtica e chegou-se no valor de 79 UFCs.

Placas de diluio 10-7 contadas.

Para se determinar a concentrao de bacterias na amostra original, foi feito o seguinte clculo: Concentrao = N contado x 1/diluio x 1/volume pipetado (ml) Desta forma, a concentrao na amostra original foi de 7,9x108 bacterias/ml

6) PESQUISAS: Meios de cultura diferenciados: EMB (azul de metileno e eosina): o EMB Teague gar um meio seletivo e diferencial empregado no isolamento de bactrias Gram negativas. A seletividade do EMB Teague gar assegurada pela presena da eosina e do azul de metileno , que inibem o crescimento de bactrias Gram positivas. O carter diferencial obtido atravs da leitura da fermentao da lactose. Vrios tipos de amostra podem ser inoculadas no EMB Teague gar, devendo portanto o usurio definir seus critrios de coleta, armazenamento e rejeio para cada tipo de amostra usada. Citrato de Simmons: utilizado para diferenciar gneros e espcies de enterobactrias e no fermentadores. Verifica a capacidade da bactria de utilizar o citrato de sdio como nica fonte de carbono, juntamente com sais de amnia, alcalinizando o meio. O indicador o azul de bromotimol. Deve ser conservado de 4 a 10 C, de 6 a 8 semanas. Aps este perodo realizar controle negativo e positivo semanalmente, onde: -Positivo: Klebsiella pneumoniae. -Negativo: Escherichia coli. Cor original do meio: verde -Positivo: cor azul ou crescimento no local do inoculo. -Negativo: no h crescimento e a cor permanece inalterada.

gar cetrimida: O Agar Cetrimide Base usado como um meio seletivo para o isolamento de Pseudomonas aeruginosa, de pus, catarro, dreno, etc. Composio em g/L: Digesto Pancretica de gelatina: 20.0 Cloreto de Magnsio: 1.4 Sulfato de Potssio: 10.0 Cetrimide: 0.30 Agar: 15.0 pH Final (a 25C): 7.2 0.2 Caractersticas da cultura depois de 24-48 horas a 35-37C. Organismos (AATC) Crescimento Pseudomonas aeruginosa abundante Pseudomonas maltophila inibido Staphylococcus aureus inibido Escherichia coli inibido Aparncia do meio preparado: Cor amarelo claro, soluo clara sem precipitados, apresentando solidificao firme, comparvel com um gel agar 1.5%.

7) BIBLIOGRAFIA: As fontes utilizadas foram: -Cadernos de laboratrio; -Meio de cultura EMB: http://www.proanalise.com.br/produtos/16853/emb_teague_agar_meio_cultura_em_placa_laborclin -Meio de cultura citrato de Simmons: http://www.microclinica.ufsc.br/index.php/metodo/agar_citrato_de_simmons/ -Meio de cultura gar cetrimida: http://www.biogen.net.br/products/AGAR-CETRIMIDE-BASE-Meio-de-Cultura-Desidratado%252d-C%F3d.-M024%3B-500-gramas.html