PRINCPIOS BSICOS DO FUNCIONAMENTO DE ALGUNS EQUIPAMENTOS USADOS NA ECOFISIOLOGIA VEGETAL

GRUPO 2

2002

GRUPO 2

PRINCPIOS BSICOS DO FUNCIONAMENTO DE ALGUNS EQUIPAMENTOS USADOS NA ECOFISIOLOGIA VEGETAL

7 Relatrio apresentado a disciplina Laboratrio de Bioqumica de Plantas como parte das exigncias do curso de Agronomia/Fisiologia Vegetal em nvel de Mestrado

Composio do Grupo: Andrea Yu Kwan Villar Shan Cristiano Martinotto Ins Anglica Cordeiro Gomes Teresa Cristina L. L. de S e M. Marques Ms/Agroqumica Agrnomo Biloga Ms/Agronomia

Luiz Edson Mota de Oliveira (Professor da Disciplina)

LAVRAS MINAS GERAIS - BRASIL

1 INTRODUO

A necessidade de se conhecer as taxas de fotossntese est bem documentada, visto sua sensibilidade a variveis ambientais e culturais. Da mesma forma, essas medies se tomam relevantes no exame de gentipos contrastantes ou incidncia de parasitas. No mtodo tradicional de medio da FS, uma folha colocada em uma cmara, com passagem forada de ar a uma taxa conhecida. Por meio da medio da concentrao de CO2 no ar antes e aps a passagem na cmara, pode-se medir diretamente a taxa de assimilao de CO2. A anlise de CO2 em plantas intactas geralmente conduzida em analisador infravermelho de gs (IRGA). Outro mtodo o eletrodo Clark, que mede a taxa fotossinttica e a fluorescncia da clorofila a em discos foliares destacados. O uso moderno da bomba de presso para avaliar as relaes hdricas em tecidos vegetais foi estabelecido por Scholander et al. (1965). O mtodo requer a aplicao de presso pneumtica ao tecido, para aumentar artificialmente seu . A presso necessria para elevar o do tecido para zero aceita como o negativo do do tecido antes da pressurizao. Se for assumido que os gradientes de em um dado rgo so desprezveis, ento pode-se tambm assumir que do xilema = da parede celular = dentro do tecido. A medida da evoluo do oxignio em um sistema fechado um dos meios mais fceis e mais baratos de demonstrar o processo de fotossntese de uma folha. Baseia-se em dispositivo projetado por Delieu e Walker (1983), que foi desenvolvido para monitorar a troca de oxignio de amostras intactas em uma cmara de reao especialmente construda.

2 OBJETIVOS

O objetivo desta aula foi o de obter informaes bsica sobre o funcionamento e utilizao da bomba de presso para avaliar as relaes hdricas em tecidos vegetais, do alisador infravermelho de gs (IRGA), o eletrodo Clark para medir a taxa fotossinttica, fluorescncia da clorofila a em discos foliares destacados, o eletrodo de O2 para medir a evoluo do O2 e o PEA para anlise da fluorescncia clorofila a.

3 MATERIAL E MTODOS

3.1. PRINCPIO DA CMARA DE PRESSO

Para a medio do com base na presso de balanceamento (ou seja, aquela necessria para forar a gua do tecido para fora da superfcie cortada do pecolo), o rgo destacado da planta e colocado na bomba de presso, com a extremidade onde est o xilema (corte no pecolo) estendendo-se para fora da cmara, envolta pelo sistema de vedao. A presso aplicada at que a seiva aparea na superfcie do corte (Figuras 1 e 2). O negativo da presso necessria para produzir a exsudao (quando a presso do xi1ema se iguala presso atmosfrica) considerado igual ao do tecido, no momento do corte. Nesse mtodo, como apenas uma aplicao de presso feita, usa-se N2 ou ar como instrumento de presso (Passos, 1996). Alm de medir o , possvel empregar a bomba de presso para estimar o do tecido, com base no fato do turgor ser zero, quando = . Um mtodo para extrapolar medies feitas nessa condio, de maneira a obter cada correspondente a valores positivos de p, tem sido usado em inmeros estudos desde ento. A tcnica tem o seguinte fundamento: se medies de so feitas em uma amplitude de teores hdricos e ento lanadas em grfico, tendo o inverso do potencial hdrico (1/) como funo do teor relativo de gua (TRA), a extrapolao da linha reta desenhada, para P < 0, fornecer uma estimativa do em valores de TRA localizados acima de P = 0 (Passos, 1996). Na prtica, a exsudao coletada, na medida em que a amostra submetida a aumentos graduais de presso, causando aumentos correspondentes no do tecido. A curva assim obtida chamada de curva presso-volume, ou P-V. Nessa abordagem, visto que a mesma amostra submetida a vrias presses, uma mistura de N2 e O2 usada como vetor de presso, para evitar oxidao da membrana celular. De acordo com Angelocci (2002), uma folha transpirando apresenta presso hidrosttica negativa (tenso) no xilema e se o pecolo for cortado em certo ponto,

tenso desprendida e a coluna lquida retrocede no xilema para o interior da folha. Se a folha for, ento, colocada rapidamente em uma cmara de presso hermeticamente fechada e pressurizada gradualmente com um gs (Figuras 1 e 2), a coluna tende a

retomar para a superfcie cortada do pecolo, podendo-se visualizar o momento do retorno com uma lupa. Demonstra-se que nesse ponto, a presso aplicada balanceia a tenso do xilema no momento do corte. O valor negativo da presso de balanceamento representa o potencial mdio da gua da folha, visto que no devem ocorrer diferenas significativas de entre o apoplasto e o simplasto.

Figura 2: Esquema detalhado de uma cmara de presso e seus principais componentes (Angelocci, 2002).

Figura 3: Diagrama de uma bomba de presso empregada para a obteno das medidas de e curva P-V (site PMS instrument). Medio da Tenso no Xilema Ajustes preliminares na bomba de presso A - Desprenda a tampa. O anel de selagem em posio desde o dia anterior poder estar muito preso, inicialmente. Mova a tampa para frente e para trs vrias vezes e ento remova o anel. Verifique se o anel est limpo e bem lubrificado. Normalmente, vaselina usada como lubrificante. B - Insira uma rolha de borracha adequada na tampa e instale-a na cmara. C - Conecte as extremidades da mangueira bomba e ao tanque de nitrognio (presso mxima de 2.200 psi). D - Mova a vlvula de controle no instrumento para a posio de desligamento. E - Abra a vlvula do tanque de nitrognio. Meia volta ou uma volta geralmente ser suficiente. F - Examine a vlvula de presso. Instale e gire a tampa no sentido horrio at o fim da rosca. Ato contnuo, gire-a em 15, no sentido anti-horrio de maneira que a roda com salincia pressione o mbolo da vlvula de segurana para baixo. G - Gire a vlvula de operao para a posio de pressurizao da cmara. A vlvula de segurana se abrir antes que a presso na cmara atinja 200 psi. A presso na cmara cair para prximo a zero.

H - Gire a vlvula de controle para a posio de exausto, pressione o mbolo da vlvula de segurana e teste novamente. Se a vlvula de segurana no funcionar a 25 psi ou menos, remova o parafuso de reteno e verifique se o mbolo apresenta problemas. Mantenha o anel de vedao do mbolo sempre bem lubrificado. I - Ajuste a vlvula de vazo. Gire a tampa no sentido horrio, at o fim. Ao mesmo tempo, o mbolo da vlvula de segurana da tampa ser empurrado para baixo pela roda com salincia. J - Gire a vlvula de controle para pressurizar a cmara (Figura 2). K - Ajuste a vlvula de controle de vazo at que a presso na cmara aumente at a taxa desejada. A taxa poder ser mudada a qualquer momento, mesmo durante as medies. L - Use taxas baixas (ex. 5 psi.s-1 ) para plantas sob baixo estresse hdrico. M. Gire a vlvula de controle para a posio de exausto e remova a rolha de borracha da tampa (Figuras 1 e 2). Procedimento Especfico A - Destaque uma folha, juntamente com o pecolo, usando lmina afiada. Quanto mais lisa a superfcie do corte, melhor. B - Insira, imediatamente, o pecolo em uma rolha de borracha com orifcio central e pressione a rolha na abertura da tampa da cmara com a ponta do pecolo ficando de fora, em comprimento suficiente para visualizao de exsudaes. Observe que: a) A insero de tecidos frgeis ou suculentos pode ser conseguida com o uso de uma ferramenta apropriada (disponvel comercialmente). b) Selecione uma rolha com furo em dimetro apropriado para permitir um encaixe de frico. C - Coloque a tampa na cmara e gire-a no sentido horrio at o fim da rosca. D - Gire a vlvula de controle para a posio cmara. Observe a superfcie do corte no pecolo. Use lupa manual para rgos pequenos. Ajuste a vlvula de vazo, conforme necessrio. E - Gire a vlvula de controle para a posio de desligamento, quando um filme de gua aparecer na superfcie do corte. A exsudao , geralmente, acompanhada por uma mudana na cor do corte, de esbranquiado para escuro (marrom) e aparncia espelhada. Pequenos vazamentos de gs em volta do pecolo no so objeto de alarme. F - Anote a presso do manmetro. Ela equivale, em sinal trocado, tenso existente no xilema. G - Gire a vlvula de controle para a posio de exausto. Remova a tampa da cmara e descarte a amostra. O instrumento est pronto para outra medio (Figuras 1 e 2).
6

Procedimento aps as medies A - Feche a vlvula do tanque de nitrognio. B - Faa a exausto da presso remanescente na mangueira, girando a vlvula de controle para a posio cmara", na medida em que a tampa removida. Abra a vlvula de vazo para apressar o processo. C - Certifique-se de que a mangueira no est pressurizada (verifique o indicador do manmetro no tanque de nitrognio). Desconecte a rosca que prende a mangueira ao tanque e, em seguida, o conector da mangueira bomba de presso (Figuras 1 e 2 ). Troca da pea de insero da tampa A pea de insero da tampa pode ser trocada, para se obter encaixe de pecolos ou hastes de dimetro variado (Passos, 1996). Para isso: A - Remova os quatro parafusos de reteno na tampa da cmara. B - Certifique-se de que os quatro anis de borracha para vedao esto no lugar certo, no corpo da tampa. Caso contrrio, haver vazamento. C - Instale a insero de tamanho desejado. D - Encaixe os quatro parafusos de reteno por meio da nova pea de insero e aperte bem, mas sem excessos. Limitaes do uso da bomba de presso Assume-se que a presso aplicada igual ao do xilema e que este o da folha inteira. Caso existam gradientes de na folha (gerados pela corrente transpiratria), esse pressuposto poder no ser vlido.

As relaes de com o crescimento no podem ser estabelecidas, porque impossvel amostrar-se a regio de crescimento da folha. Volume apoplstico, obtido pela curva P-V, s vezes, muito elevado, no condizendo com clculos baseados em observaes anatmicas. Gradiente de presso destri a presso de balanceamento inicial e os balanos subseqentes no refletem um equilbrio real (Passos, 1996).

3.2 FLUXOS DE DIXIDO DE CARBONO (Princpio do IRGA)

Embora outros mtodos venham sendo usados como o condutimtrico e o fotoqumico, a anlise gasosa por infravermelho ("IRGA") aquele que vem sendo utilizado na maioria dos estudos, pela maior repetibilidade e exatido das medidas quando se compara com os outros mtodos. O princpio do "IRGA" baseia-se no fato de que o CO2 e a gua absorvem radiao na banda do infravermelho. O analisador constitudo por uma fonte emissora de radiao nessa banda de comprimentos de onda, sendo que uma lente direciona o feixe para que este no se disperse. Um disco com orifcios ("shutter disk" ou "choper") interposto entre a fonte e as "clulas" (cmaras que contm o gs). Uma das clulas recebe o gs com concentrao conhecida ("referncia") (Figuras 3 e 4. O disco gira com alta freqncia, permitindo a medida alternada das clulas com modulao, estabilizao e alta sensibilidade do sinal de sada. A radiao, aps passar pelas clulas direcionada por uma lente ao detector, passando antes por um filtro tico que seleciona a passagem para a banda de absoro de 4260 nm, mais efetiva para o CO2 do que para o vapor d'gua e outros gases, minimizando a interferncia destes. O detector de semicondutor de estado slido estabilizado termicamente para que sua sensibilidade seja mantida constante (Angelocci, 2002). H modelos de analisadores que possuem um separador do feixe de radiao, dirigindo parte dele ao detector de CO2 e outra parte a um detector de vapor d'gua. Desse modo, alm da concentrao do anidrido carbnico, possvel determinar a umidade relativa e, portanto, a concentrao de vapor d'gua no da cmara. Na operao do sistema, deve-se considerar se o modelo usado est configurado para trabalhar no modo absoluto ou no diferencial, ou em ambos. No modo absoluto, a clula (cmara) de referncia mantida com um gs isento de CO2. Para medidas de

fotossntese, pode-se utilizar o modo absoluto para determinaes transientes, encerrando-se a planta dentro de uma cmara fechada e monitorando a diminuio da concentrao de CO2 do ar devido a absoro fotossinttica (Figura 4).

No modo diferencial, a planta colocada em uma cmara que no selada, sendo que o ar ambiente levado a passar pela cmara de referncia antes de ser fornecido planta. A medida feita por comparao (diferena) entre as concentraes do ar de sada (da cmara com planta) e o de entrada (cmara de referncia), sendo considerada uma medida em condies de equilbrio dinmico ("steady-state") (Angelocci, 2002).
Para que as determinaes pelos analisadores tenham preciso e confiabilidade, a sua operao demanda procedimentos adequados, principalmente quanto

calibrao. De acordo com Passos (1996), antes de ocorrer injeo da amostra, o nitrognio passa atravs da clula de referncia e da clula de amostra, de maneira que o analisador permanece zerado. Para analisar uma amostra, um dado volume de gs injetado na corrente de nitrognio, no ponto mostrado (Figura 4 e 5), por meio de uma seringa. O aumento sbito no nvel de CO2 faz com que a leitura mxima obtida seja menor do que a observada em fluxo contnuo de amostra gasosa. A deflexo do ponteiro indicador e seu subseqente retorno ao zero so rpidos o bastante para representar um pico no registrador potenciomtrico. Nesse sistema, a leitura obtida do analisador proporcional quantidade total (e no concentrao) de CO2 na amostra. Todavia, mantendo-se o volume da amostra injetada constante, pode-se determinar seu teor de CO2. Para medir a absoro diferencial de energia infravermelha, o instrumento usa um sistema tico de feixe duplo, contido na seo do analisador (vide diagrama na Figura 4). Duas fontes infravermelhas so usadas, sendo uma para o feixe da amostra e a outra para o feixe da referncia. Os feixes so bloqueados, simultaneamente, 10 vezes por segundo, pela hlice (lmina de dois segmentos, girando a 5 rps). Sem bloqueio (Figura 4), cada feixe passa pela respectiva clula e pelo detector.

A clula da amostra um tubo de passagem que recebe um fluxo contnuo de amostra. A clula de referncia um tubo selado que contm o gs de referncia, que selecionado para exibir absoro mnima de radiao infravermelha nos comprimentos de onda absorvidos pelos componentes da amostra nos quais h interesse de estudo (Pearcy et al., 1994). O detector formado por dois compartimentos selados, separados por um diafragma metlico flexvel. Cada compartimento possui uma janela para transmisso de radiao infravermelha, que permite a entrada do feixe energtico correspondente. Em ambas as cmaras, o componente de interesse mantido na forma gasosa, sob presso subatmosfrica. Durante a operao, a presena desse componente na amostra provoca uma diferena de nvel energtico, entre a seo da amostra e a seo da referncia, a qual detectada, conforme a seguinte seqncia: (a) na clula da amostra, parte da energia radiante original do feixe absorvida pelo componente de interesse, sem alteraes detectveis na clula de referncia; (b) dentro do detector, cada feixe aquece o gs presente na respectiva cmara. Todavia, o gs na cmara da referncia apresenta maior aumento de temperatura, por apresentar maior energia liquida: (c) o maior aquecimento da cmara de referncia aumenta sua presso acima dos nveis observados na cmara da amostra: e(d) essa presso distende o diafragma em direo cmara da amostra. Portanto, o incremento energtico gasto na flexo do diafragma. Essa flexo medida em unidades de capacitncia. O diafragma e o boto estacionrio adjacente constituem um capacitor. O afastamento do diafragma do boto estacionrio (causado pela flexo) reduz a capacitncia (Passos, 1996).

10

Figura 4- Esquema geral da medio da FS (A) em que se usa o IRGA (Passos, 1996).

Sistema IRGA com microprocessador Esse aparelho tem sido muito empregado (ex. Nicolodi et al. 1988, citados por Passos, 1996) e consiste de um analisador de CO2, um console e um compartimento de sensores, com cmara de amostra trocvel (opes de 0.25; 1,00 ou 4,00 L de capacidade). O analisador calibrado para a faixa de 0-1.500 ppm e a circulao do ar forada por meio de uma bomba. O console um microprocessador que gerencia os dados (logging, armazenamento, clculos e comunicao com impressora ou computador). O sistema possui ainda sensores para temperatura (da folha e do ar). U.R. e

11

quantum. A presena de baterias recarregveis assegura seu uso em condies de campo. O aparelho apresenta o seguinte modo de operao: O ar retirado da cmara da amostra (contendo a folha), passa atravs do analisador e retoma a cmara da amostra, fechando o circuito. No analisador, o ar passa por dois caminhos paralelos: (a) rota com dessecante para respostas rpidas no medidor do fluxo (1s); e (b) rota de escape, com uma vlvula que desvia o fluxo do dessecante e do medidor de fluxo. Isso permite controle proporcional do fluxo de ar atravs do dessecante, sem afetar o fluxo total do sistema e a rapidez de resposta. Variando a taxa de passagem do ar pelo dessecante, pode-se manter a U.R. da cmara da amostra constante. Para medir a taxa de troca lquida de CO2, uma folha colocada em cmara hermtica e a taxa de mudana na concentrao deCO2 monitorada em um curto espao de tempo (10-20 s). A taxa de FS lquida ento calculada pelo microprocessador, usando essa taxa de mudana de concentrao e outros fatores, tais como rea foliar, volume da cmara e temperatura. Erros ficam, tipicamente, abaixo de 0,2 ppm.

12

Figura 5- Esquema simplificado ilustrando como a fotossntese medida trs tipos bsicos de sistemas de trocas gasosas. As taxas de trocas gasosas em todos os sistemas so determinadas pelo balano de massa. O calculo da fotossntese em um sistema fechado baseado na taxa de troca da concentrao de CO2. Note que o sistema fechado utiliza um absoluto, em relao ao diferencial, analisador de gs infravermelho (IRGA) e no requer dispositivo de medida de flux. Um sistema

diferencial calcula a fotossntese pela depleo de CO2 que acontece com o flux de ar em uma taxa conhecida de uma folha fotossintetizando. No sistema compensatrio, a depleo de CO2 pela fotossntese compensado por uma injeo de CO2 de modo que a concentrao d CO2 no ar que sai da cmara mesma quantidade de ar que entra na cmara (acima). Cmara de ambiente controlado de um sistema porttil. A temperatura nesta cmara controlada por Peltier, e a circulao da gua atua como um dreno de calor ou fontes de mdulos Peltier.

13

A medio da condutncia estomtica conduzida da seguinte forma: aumento compensado pela entrada de ar parcialmente seco, procedente do analisador. A taxa transpiratria calculada a partir da mudana da U.R. dentro da cmara, em razo do tempo, e da poro do fluxo total que passa atravs do dessecante. A taxa transpiratria e as temperaturas do ar e da folha so usadas para calcular a resistncia total da folha, da qual a BL subtrada, resultando no valor de resistncia e condutncia dos estmatos.

A U.R. da cmara da amostra aumenta, medida que a folha transpira. Esse

A frao de moles de CO2 presente na fase gasosa pode ser estabelecida com margem de erro < l%, usando CO2 puro (99,99%) e um cilindro volumtrico misturador para calibrao de gs. Este usado para misturar padres e compar-los a gases comerciais. Assim, os valores da concentrao de gases mais baratos, no calibrados, podem ser corrigidos. As medidas de trocas gasosas utilizando o analisador de gs por infravermelho (IRGA), sistema aberto, porttil, modelo LCA-4 (Hoddesdon, UK) em folhas intactas, so as seguintes: taxa fotossinttica lquida (A), concentrao subestomtica de CO2 (Ci), condutncia estomtica (gs) e transpirao (E), entre outras. A eficincia de carboxilao (CE) e a eficincia instantnea no uso da gua (EUA) podem ser obtidas pelas relaes A/Ci e A/E, respectivamente. CUIDADOS - O analisador de CO2, o sensor de U.R. e o medidor de fluxo requerem calibrao peridica. Geralmente, o fornecedor recomenda que o sistema completo seja remetido anualmente a fabrica ou ao representante autorizado, para calibrao e manuteno. - O zero e a amplitude do analisador de CO2 devem ser verificados diariamente. Embora o analisador fornea gs livre de CO2, um tanque com CO2 puro
14

necessrio para a ajustar amplitude. O nvel de CO2 deve estar entre 500 e 1.000 ppm. - A calibrao de fbrica do sensor de U.R. deve ser verificada diversas vezes ao ano, usando-se um psicrmetro ou higrmetro de ponto de orvalho. - O dessecante deve ser de perclorato de magnsio anidro granulado, por apresentar pouca interao com o CO2. Outros dessecantes, como slica-gel e sulfato de clcio no devem ser usados, porque interagem com o CO2.

Observao:
Os dados coletados ficam armazenados na memria do aparelho, em pginas numeradas.Tipicamente, o programa oferece uma marcha padronizada para as manipulaes e aplicativos adicionais, que permitem ao usurio selecionar funes de sua preferncia, tais como definio de teclas, colocao de cdigos para execuo de tarefas programadas, conexo a sensores adicionais, delineamento do formato de sada dos dados, edio dos dados armazenados e controle externo, para operao remota por computador (com uso de conector RS-232C e programa de comunicaes) (Passos, 1996). IRGA acoplado ao cabeote do sensor Nesta recente modalidade, a bancada tica do analisador aberta diretamente para o volume da mistura da cmara da amostra, onde a folha est posicionada. Conseqentemente, no h tubulao de retorno (entre a cmara da amostra e o console), eliminando o tempo de espera que pode confundir correlaes que envolvem a troca gasosa e mudanas ambientais. Essa caracterstica tambm elimina o lapso de tempo requerido para equilbrio por causa da adsoro de vapor nas paredes dos tubos.

15

O aparelho possui analisadores de rota dupla que medem as concentraes absolutas de CO2 e H2O continuamente, eliminando consideraes sobre as entradas gasosas. Portanto, os analisadores da referncia e da amostra podem ser comparados a qualquer momento, manual ou automaticamente, sem alterar as condies existentes na cmara da amostra. 3.3 O PRINCPIO DE MEDIDA DA EVOLUO DO OXIGNIO
Taxa Fotossinttica Potencial sem limitao de luz e CO2

mede a taxa de evoluo de O2 em mol O2 .m-2.s-1; Na fotossntese, a energia da luz absorvida pela folha e usada para a

reduo do CO2 a carboidrato e oxidao da H2O a O2. O produto final principal da fotossntese pode ser: mono (gli e fru), di (sacarose) e polissacardeos (amido). O amido formado freqentemente um produto de armazenamento temporrio, mas ambos carboidratos (sacarose e amido) so derivado de um acar de trs carbono. Para simplificar, todos estas substncias podem ser representados por um carboidrato puramente nominal, CH2O, e o processo global pela equao:
hv CO2 + H 2O CH 2O + O2

Na qual a energia da luz necessria para promover este processo representada atravs de "hv" (h = a constante de Planck e uma letra "grega" que representa o smbolo da freqncia de luz). Ento, o O2 que acumula na fase gasosa durante a fotossntese ento detectado, polarograficamente, pelo eletrodo tipo Clark. Quando uma folha inclusa na cmara de reao em contanto com CO2 (ou bicarbonato como uma fonte de gs carbnico) e luz, ento, o oxignio ser evoludo. Na cmara de reao do Hansatech, o bicarbonato de sdio (que dissocia em soluo) a fonte de CO2 na fase gasosa para um disco de folha.

16

NaHCO3 NaOH + CO2

A ponte de eletrlito entre o ctodo e o nodo estabelecida colocando uma gota de eletrlito (KCl) sobre o topo da cpula. Quando uma pequena voltagem aplicada pela caixa de controle sobre os eletrodos, inicia-se a fase eletroqumica no sensor, onde o nodo de prata reage com os nions do eletrlito, formando o cloreto de prata e a liberao de eltrons, que mais tarde sero usados pelo ctodo de platina para catalisar a reduo do O2. O ctodo de platina torna-se negativo em relao ao nodo de prata, pois o fluxo de corrente no princpio do processo desprezvel, e com isso, a platina polarizada (i.e. adota o potencial externamente). Como este potencial aumentado para 600-700 mV, o O2 reduzido na superfcie da platina, inicialmente a perxido de hidrognio H2O2, pois os eltrons (do nodo) foram doados ao O2, que age como um aceptor de eltrons. O fluxo de corrente estequiometricamente relacionado ao consumo de oxignio no ctodo. Esta a base de medida polarogrfica de oxignio. Quando o plo negativo de uma bateria preso a um eletrodo (normalmente platina, mas tambm pode ser usada prata), eltrons (e -) tendem a mover da bateria a esta superfcie de metal, tornando-o carregado negativamente (um ctodo). Semelhantemente, quando um segundo eletrodo (normalmente prata) preso ao plo positivo da bateria, os eltrons tendem a mover para a bateria, carregando-o positivamente o nodo. Quando os circuitos completaram por um filme de eletrlito (uma soluo como KCI que ioniza a K+ e Cl -), a aplicao desta voltagem polarizada (i.e, uma voltagem que cria plos positivos e negativos) promove a reduo do O2 no ctodo, iniciando um fluxo de eltrons ou corrente eltrica . Esta corrente eltrica gerada pela reduo de oxignio no ctodo convertida a um sinal de produo de voltagem pela caixa controle Hansatech CB1 ou CB1-D, e transmitido para uma caneta registradora.
17

Em sntese: -

aumento de voltagem converge para O2 produzido (mol O2 .m-2.s-1): Voltagem fotossntese evoluo do O2 Voltagem respirao consumo de O2

Protocolo do Eletrodo de O2

Montagem do eletrodo O eletrodo nodo de prata oxida lentamente com o tempo. Por isso, recomendado que o eletrodo seja cuidadosamente limpo antes do uso ou armazenamento. Ento, pegue um eletrodo limpo (a limpeza melhor realizada polindo com uma pasta com bom grau de xido alumnio) e coloque uma gota de eletrlito no sensor da cpula (ctodo de platina). Posteriormente, coloque um papel mais espacial (papel de cigarro) com aproximadamente 2 cm2 em cima de eletrlito. Uma vez tenha adicionado o papel espacial sobre o eletrlito, cubra com uma similar rea de membrana permevel ao O2. Colocar o O-ring para segurar a membrana. Este procedimento facilitado utilizando um aplicador. Inicialmente, o O-ring colocado no final do aplicador, que ento, colocado sobre a cpula, e o cilindro apertado verticalmente para baixo, sobre o centro da cpula e o cone do aplicador deslocado para baixo do eixo, escorregando o O-ring para fora do aplicador e em cima da cpula, deixando a membrana suavemente esticada. A membrana segurada nesta posio com Oring contraindo o pescoo da cpula, formando uma camada uniforme e lisa entre os eletrodos. O disco de eletrodo pode ser testado conectando o eletrodo a caixa de controle (CB1-D) e respirando em cima do eletrodo. A reduo da concentrao de O2 causar uma grande mudana no sinal registrado. O papel espacial usado para prover uma camada uniforme de eletrlito entre o nodo e o ctodo. Papel de cigarro fino e uniforme e, por isso, freqentemente usado para este propsito (Precauo evite a parte colada!). Um buraco no papel espacial imediatamente sobre o ctodo, aumenta a sensibilidade

18

do eletrodo, mas pode conduzir a desigualdade do filme de eletrlito e levar mau funcionamento. Se a membrana est muito enrugada, ela deve ser rejeitada e o procedimento repetido. A membrana em cima do disco de eletrodo suficiente para lacrar o eletrlito em cima dos eletrodos, permanecendo permevel o bastante, para permitir difuso de oxignio. Isto assegura que a concentrao de oxignio no
eletrlito permanece em equilbrio com o ar da cmara de reao e assim, conseqentemente, o sinal eltrico gerado atravs da fase eletroqumica no disco de eletrodo seja diretamente proporcional concentrao de oxignio de ar vedado ao redor da amostra na cmara de reao.

Preparo da caixa controle CB1-D

Uma vez conectado e seguindo a montagem da frente do painel, visando o preparo da caixa de controle CB1-D, segue com as seguintes colocaes na parte dianteira: Colocar as baterias (4 baterias AA) ou fonte externa na tomada 12 V d.c. (atrs da caixa); Conectar o registrador caixa CB1 D via cabo BNC; Conectar o eletrodo a CB1 D via conector tipo SMB; Ajustar o interruptor OUTPUT para posio X1; Ajustar o interruptor OUTPUT (<) na posio mnima; Ajustar o interruptor BACK OFF na posio CANCEL e Ligar a caixa CB1-D (posio ON).

Quando a caixa de controle ligada, uma alta produo voltagem pode ser obtida inicialmente, que deve declinar gradualmente em minutos, dando uma leitura estvel em ar de 400 - 800 mV. A sensibilidade da preparao de eletrodo para a mudana no contedo de O2 do ar ao redor do eletrodo pode ser testado exalando ar suavemente no cho da cmara de reao. O contedo de O2 do ar

19

exalado significativamente menor que a concentrao do O2 do ambiente. Conseqentemente, o sinal registrado na CB1-D3 deve cair durante exalao e gradualmente deve voltar ao nvel inicial, pois o ar ambiente se difunde na cmara de reao. Fluorescncia da Clorofila a em Sistema com Eletrodo Clark Tambm importante a medida da fluorescncia emitida pela clorofila a, nos cloroplastos associados ao PSII, durante o processo de absoro de luz. A cintica circadiana da emisso dessa fluorescncia complexa e depende, primariamente, das mudanas e integridade do sistema de membranas tilaquides. As caractersticas da curva de emisso de fluorescncia so modificadas por qualquer ocorrncia que influencie o metabolismo fotossinttico, sendo um indicador direto dos efeitos ambientais sobre o complexo de captao de luz (Passos, 1996). Por monitorar a produo ou consumo de O2 em uma cmara vedada, contendo um disco ou segmento foliar, o eletrodo Clark (Delieu e Walker, 1983) permite a medio da FS e da respirao (Adhikary et al. 1990, citados por Passos, 1996). Visto que os cloroplastos so mantidos saturados sob alta concentrao de CO2 a medio no influenciada pelo fechamento dos estmatos. A temperatura mantida constante, por meio de circulao de gua. 0 aparelho calibrado pela injeo de um volume conhecido de ar dentro da cmara da amostra e da medio da variao na sada de corrente eltrica. A fluorescncia da clorofila a (Delieu e Walker, 1983) simultaneamente monitorada atravs de janela lateral, usando-se uma fonte luminosa, detectar e filtro apropriado (Figura 6). O equipamento utilizado para comparar as respostas fotossintticas em gentipos contrastantes e para verificar os efeitos de estresses ambientais, dentre outros usos (Passos, 1996).

20

Descrio Geral - Eletrodo Clark: o catodo de Pt montado em uma redoma de araldite, por meio da qual uma membrana de Teflon esticada. - Cmara da amostra: feita de alumnio anodisado, permitindo controle da temperatura por circulao de gua. - Luz actnica: lmpada 12 V. 150 W com refletores parablicos internos, que favorecem a luz visvel, com filtrao de calor adequada; ou LED de densidade mxima de fluxo de ftons, ao nvel do disco foliar, de 235 mol.m-2.s-1 (medida com sensor quntico) e pico em 660 nm. - Calibrao: a cmara saturada com N2 ar ou outra mistura gasosa. Ento, a diferena entre o sinal eltrico do eletrodo no ar e no N2 aceita como uma medida da presso parcial de O2 na atmosfera. Para preciso absoluta, a presso baromtrica deve ser considerada.
Operao Tpica

A - Coloque a amostra, feche a cmara hermeticamente e faa a calibrao. Para a curva de calibrao, coloque 400 L de soluo de ditionito de sdio sobre a cobertura de espuma de borracha do eletrodo. Aps aspirao da soluo, faa a leitura, que refletir a concentrao de O2 na atmosfera (21%). B - Espere pelo equilbrio trmico (2-3 min), em que uma assimilao aparente de O2 registrada. Mantenha a temperatura a 20oC. Vrios autores deixam o tecido incubado na cmara por 20-30 min, sem iluminao. Em seguida, a luz ativada e os dados registrados na memria do console, ou em registrador potenciomtrico. C - Abra o disparador, iniciando a evoluo do O2. A fluorescncia registrar um aumento inicial e depois comear a decair (Figura 6) (Passos, 1996). Essa dissipao registrada.

21

Figura 6: Diagrama do conjunto eletrodo Clark-sonda para medio da fluorescncia. O disco foliar se apia sobre uma tela de ao inoxidvel. O eletrodo se situa abaixo da cmara da amostra, com seu catodo de Pt exposto atmosfera da mesma. o tecido foliar pressionado levemente contra o teto da cmara por um disco de espuma de borracha, o qual tambm separa a amostra do tampo de carbonato-bicarbonato presente no tubo capilar de juno. O tecido eliminado pela janela lateral, a qual tambm permite que a fluorescncia atinja a sonda (inserida em um ngulo de 40o), onde monitorada por um fotodiodo. A luz actnica azul proporcionada diretamente ou atravs de fibra tica (topo do diagrama), com ativao por disparador eletrnico. O fotodiodo protegido da actnica por um ou mais filtros. As torneiras laterais so para calibrao e ajustes da fase gasosa (adaptado de Delieu e Walker, 1983, Passos, 1996).

22

3.4 FLUORESCNCIA DA CLOROFILA a (MEDIO-PEA)

Anlise do quenching
Uma srie de informaes sobre o funcionamento do sistema fotossinttico pode ser obtido atravs de uma anlise da fluorescncia e do quenching. Vrios parmetros da fluorescncia os quais pode ser obtido usando um modulado sistema e o mtodo de calculo dos diferentes coeficientes do quenching ilustrado na Figura 7 e resumido na Tabela 1. Em particular alguns autores usam a Fm ou um termo similar apenas para se referir fluorescncia mxima aps um longo perodo de escuro, no entanto, outros autores usam esta para descrever a mxima obtida com um flash saturante em um determinado tempo (Jones 1991).

Figura 7: Uso de um sistema modulado de fluorescncia para anlises de quenching, mostrando as variveis medidas. F(t) o nvel de fluorescncia em

23

um determinado tempo t, Fo o nvel de fluorescncia com apenas uma baixa irradincia (1 mol.m-2.s-1), fonte de luz modulada, Fm a fluorescncia com o pulso de luz saturada (anotada como necessria - Fm (1 h escuro) refere-se para Fm aps 1 h de luz penetrante), Fo um valor do quenching da Fo. Parmetros medidos no PEA Fo - nvel de fluorescncia quando o pool de aceptor de eltron da plastoquinona Qa oxidado completamente. Fm - nvel de fluorescncia quando Qa completamente reduzido. Fv - fluorescncia varivel (Fm-Fo). Fv/Fm - eficincia mxima de quantum do fotossistema II. Tfm - tempo ao qual Fm acontece. rea - rea em cima da curva entre Fo e Fm, relacionada ao tamanho de pool de eltron transporte acepteres do PSII.

A florescncia da clorofila a pode ser utilizada na avaliao de danos causados por estresse hdrico. O principal parmetro utilizado na avaliao destes danos ao sistema fotossinttico a rao Fv/Fm, onde Fv a

24

fluorescncia varivel e Fm a fluorescncia mxima, que indica a eficincia fotoqumica do fotossistema II. Embora, esta rao normalmente decresa em plantas submetidas a um tipo de estresse (Krause e Weis, 1991), alguns no detectaram redues na eficincia fotoqumica do fotossistema II em plantas sob dficit hdrico.

25

4 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

ANGELOCCI, L. R. gua na planta e trocas gasosas/energticas com a atmosfera:

Introduo ao tratamento biofsico: Piracicaba - SP, 2002. 272p.

DELIEU, T; WALKER, D. A. Simultaneous mesurement of oxygen evolution and chlorophyll fluorescence from leaf pieces. Plant Phytologist, v.73, p.534541, 1983. DELIEU, T; WALKER, D. A. The use of oxygen electrode and fluorescence probs in simple measurements of photosynthesis. New Phytologist, v.89, p.165178, 1983. JONES, H. G. Plants and microclimate: A quatitative approach to environmental plant physioligy. Second edition, 1991. 428p. KRAUSE, G. H.; WEIS, E. Chlorophyll fluorescence and photosynthesis: the basics. Annual Review of Plant Physioligy and Plant Molecular Biology, Palo Alto, v.42, p. 313-149, 1991. PASSOS, L. P. Mtodos analticos e laboratoriais em fisiologia vegetal. Coronel Pacheco: EMBRAPA-CNPGL, 1996. 223p. PEARCY, R. W. et al. Plant Physiological Ecology: Field methods and instrumentation. 1994. 457p. SCHOLANDER, P.F; HAMMEL, H. T; BRADSTREET, E. D; HEMMINGSEN, E. A. Sap pressure in vascular plant. Science, Washington, v.148, p.339-346, 1965.

5 SUMRIO

1 INTRODUO-------------------------------------------------------------------------1 2 OBJETIVOS-----------------------------------------------------------------------------2 3 MATERIAL E MTODOS------------------------------------------------------------3 4 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS----------------------------------------------26

27