Cuantificacin por cromatografa y espectrofotometra de un pigmento natural (Astaxantina)

Prctico BT30A Prof. AM Ronco

Introduccin. El anlisis de un compuesto (analito) generalmente requiere la separacin de otros compuestos y luego su identificacin por mtodos analticos. Una muestra puede ser separada usando sus diferencias en las propiedades fsicas y/o qumicas, como densidad, tamao, solubilidad. El objetivo de este trabajo prctico ser la utilizacin de la cromatografa como mtodo de separacin y la espectrofotometra como mtodo de anlisis. El analito que se utilizar ser la astaxantina. La astaxantina es un pigmento que est presente en una micro alga (Haematococcus pluvialis). Pertenece al grupo de los carotenoides que son compuestos coloreados de naturaleza lipdica, y poseen actividad antioxidante. Las algas que contienen una concentracin suficiente de este pigmento son utilizadas como suplemento nutricional natural en peces, especialmente en salmondeos ya que le proporciona a la carne el caracterstico color rosado.

Principios bsicos de cromatografa. La cromatografa es un mtodo de separacin basado en el grado de particin de un analito entre una fase mvil y una fase estacionaria lo que permite separar los componentes de una mezcla. Dentro de los mtodos cromatogrficos hay una gran variedad (GC, HPLC, LC, SEC y TLC) que se

diferencian entre s principalmente por el tipo de fase estacionaria. La cromatografa en capa fina (TLC) utiliza como fase estacionaria un adsorbente slido colocado sobre un soporte plano (placa de slica) y como fase mvil, un solvente orgnico o una mezcla de ellos. Se utiliza principalmente para separar y purificar compuestos orgnicos. La muestra lquida o disuelta en un solvente voltil se aplica como una mancha o gota sobre la fase estacionaria. Paralelamente se aplica el standard (analito puro de concentracin conocida). El borde inferior de la placa se sumerge en una cmara que contiene la fase mvil, el que migra por capilaridad a travs de la placa arrastrando la muestra. Cuando el solvente alcanza las 3/4 partes de la fase estacionaria, la placa se remueve. Las manchas separadas, que corresponden a las distintas muestras aplicadas, se revelan ya sea por su color, o por otros mecanismos, dependiendo del tipo de estructura qumica de la muestra. Los diferentes componentes de la mezcla se mueven a distintas velocidades debido a las diferencias en el grado de particin entre la fase mvil lquida y la fase estacionaria. Los compuestos de mayor grado de particin en la fase estacionaria demoran ms en migrar a travs de la placa y pueden separarse de los compuestos que tienen mayor grado de particin en la fase mvil. Un analito se caracteriza por su Rf, que es la relacin entre la distancia recorrida por el analito (R analito) y la distancia de migracin del solvente (R solvente) en la placa. (Rf= R analito/R solvente). Principios bsicos de la espectrofotometra . La espectrofotometra es una tcnica que permite conocer la concentracin de un compuesto. Se basa en la propiedad que tienen los compuestos de absorber energa a distintas longitudes de onda del espectro electromagntico de la luz. La energa de radiacin electromagntica se transmite en pequeos paquetes de energa llamados fotones, cuya energa depende de la longitud de onda. El espectro electromagntico comprende una inmensa gama de longitudes de onda o energas que van desde los 0.001 nm a los 100 m. La energa del fotn es inversamente proporcional a la longitud de onda. Es decir fotones de longitudes de onda elevadas, poseen menor energa. Dentro del espectro electromagntico total existe una zona que comprende un rango de

longitudes de onda entre los 380 y los 750 nm que constituye el espectro visible y a cuyas longitudes de onda absorben la mayora de los compuestos coloreados. La absorbancia (A) de un analito en solucin se define como: A= log10 (I0/I), donde I0 es la luz incidente, I es la luz transmitida. La absorbancia ( A) est relacionada con el coeficiente de absorcin molar (coeficiente de extincin) ( , expresado en cm-1M-1), la concentracin del analito ( c, expresado en M) y la distancia que recorre el haz luminoso (l , expresado en cm).

De modo que: A= lc.

Ley de Lambert-Beer.

La absorbancia (que representa la densidad ptica, D.O. de un compuesto) se puede leer en un espectrofotmetro y, conociendo el ancho de la cubeta en la cual est contenida la muestra (l) y el su concentracin. Cada compuesto posee un valor de

del compuesto, se puede determinar caracterstico a una determinada

longitud de onda y bajo condiciones especficas. Cuando se desconoce el valor de , es necesario realizar previamente una curva de calibracin para calcular la concentracin de una muestra desconocida. Curva de calibracin o curva standard: consiste en determinar las D.O. (lecturas en el espectrofotmetro a la longitud de onda de mayor absorcin para ese compuesto) de concentraciones conocidas de un compuesto. El compuesto que se utiliza para realizar la curva de calibracin se denomina standard. Con estos valores se grafica la relacin lineal entre D.O. vs distintas concentraciones del standard. Conociendo el valor de D.O de una muestra problema, es posible determinar su concentracin curva. por interpolacin en la

Experimento N 1 Aislamiento y separacin de la astaxantina a partir de una mezcla de sustancias por cromatografa en capa fina (TLC). Con este mtodo se va a aislar la astaxantina libre. Ud dispone de 2 soluciones: 1) astaxantina standard o pura y 2) una mezcla de compuestos que contienen astaxantina. . Procedimiento: Se toma una placa de TLC y se marca con un lpiz de grafito 2 lneas de 1 cm cada una en la parte inferior de la placa, a 2 cm aproximadamente del borde inferior y a 1.5 cm de los costados, y a una distancia de 1.5 cm entre ellas. En la primera lnea se agregar 0.1 ml de la astaxantina standard, tomada con el tubo capilar. El procedimiento debe ser gota a gota y esperando el secado de la primera gota antes de agregar la siguiente. En la segunda lnea, se coloca la mezcla que contiene la astaxantina siguiendo el mismo procedimiento que para la solucin standard. Una vez cargada la placa se coloca en una cmara para desarrollar cromatografa que contiene una mezcla de solventes orgnicos: 25% acetona y 75% de hexano. Se deja aproximadamente 1 hora para que la astaxantina migre a travs de la placa o hasta que el solvente alcance una distancia de 2/3 de la placa. Se saca la placa de la cmara y rpidamente se marca con un lpiz la altura alcanzada por el solvente, luego, se deja secar al aire. Como la astaxantina es un compuesto coloreado, Ud observar una mancha de color rosado en el lugar que migr la astaxantina standard. Mida con una regla las distancias de migracin y calcule el Rf de la astaxantina. Identifique en la muestra problema la mancha correspondiente a la astaxantina y mrquela con el lpiz de grafito. Recorte ese trozo con mucho cuidado (evitando que salten trozos de la slica) y rspelo con un cuchillo cartonero sobre un papel. Coloque la slica raspada en un tubo de ensayo y agregue 2 ml de acetona. Agite la solucin en un vortex y djelo en reposo por 10 min. Luego, vacie la solucin transparente a un tubo de ensayo, sllelo bien con parafilm y mantngalo cerrado hasta la determinacin de la D.O junto con los tubos de la curva standard que preparar a continuacin. Este tubo ser el tubo N 6 del Experimento N 2.

Experimento N 2. Determinacin de la concentracin de astaxantina de una muestra problema por espectrofotometra.

Procedimiento: Se realiza una curva standard con concentraciones conocidas de astaxantina. Ud dispone de una solucin que contiene 40 g/ml de una solucin standard de astaxantina. Prepare distintas diluciones de ella a partir del siguiente protocolo.

Tubo

Concentracin Astaxantina ( g/ml) St ml

Muestra ml

acetona ml

Vol final ml

D.O.

1 std 2std 3 std

0 0.1 0.3

2.0 1.9 1.7

2.0 2.0 2.0

4 std 5 std 6 muestra **

0.5 0.8 0

1.5 1.2 2.0 (tubo n 6 6 0

exp 2)

2.0 2.0 2.0

** Este tubo corresponde a la solucin preparada desde la placa cromatogrfica proveniente del Experimento N 1. Lea la densidad ptica (D.O.) de cada tubo en el espectrofotmetro a una longitud de onda de 475 nm. Con los datos obtenidos para los standards, grafique la curva de calibracin en el papel milimetrado: DO 470 (eje y) vs concentracin de astaxantina (eje x) en mg/ml. Luego, con la D.O. obtenida para la muestra, determine la concentracin de astaxantina por interpolacin del valor en la curva standard.