RESPUESTA HUMORAL Concepto La respuesta humoral pertenece al sistema inmune especfico o adaptativo y esta diseada para eliminar patgenos

extracelulares y evitar la diseminacin de los intracelulares. Engloba a los componentes de la respuesta inmune que van disueltos en los "humores" (lquidos del organismo), es decir a los anticuerpos y al complemento. Este tipo de respuesta es mediada por los linfocitos B que reconocen al antgeno a travs de inmunoglobulinas (anticuerpo) de membrana y de ciertas interleucinas que funcionan como estimulo antignico para las clulas B. Al darse la interaccin entre las clulas B con el antgeno se promueve su proliferacin y diferenciacin en clulas plasmticas (secretar anticuerpo) y en clulas de memoria. El anticuerpo acta como efector de la respuesta humoral, se une al antgeno y neutraliza o facilita su eliminacin.

Clasificacin de la respuesta humoral

Respuesta humoral primaria: Se produce la primera vez que se entra en contacto con el antgeno (a los 7 das de la primera infeccin). Las clulas plasmticas producen anticuerpos IgM en dosis moderadas hasta que cesa la infeccin.

Respuesta humoral secundaria: Se produce si se repite el ataque, al cabo de das incluso aos, se desencadena la respuesta secundaria, ms rpidamente. Las clulas de memoria producen en poco tiempo (unos 3 das) de 100 a 1000 veces ms anticuerpos del tipo IgG (en ciertas situaciones de los tipos IgA e IgE). Cabe mencionar que dicho tipo de respuestas se llevan a cabo gracias a la interaccin entre antgeno-anticuerpo (ag-ac) la cual est dada a travs de enlaces no covalentes como las fuerzas de van der Waals, uniones hidrofbicas, puentes de hidrogeno entre otras que van a permitir la neutralizacin o eliminacin del antgeno por medio de una serie de procesos desencadenados a raz de la unin. Hay que recalcar que dicha unin es reversible, depende de sus concentraciones y tambin de la afinidad, cuanto mayor sea sta, ms proporcin de molculas estarn unidas. Los anticuerpos son los efectores de la respuesta humoral y es el plasma sanguneo el medio adecuado para el diagnostico inmunolgico. Los derivados sanguneos son los ms utilizados ya que el suero y el plasma son fuente importante de protena y por lo tanto de anticuerpos que son fundamento en la respuesta humoral. Adems existen otras caractersticas que les hacen ser pruebas altamente utilizadas como por ejemplo: - Resultan en general de fcil realizacin

- Evitan procedimientos invasivos en ciertos casos - Aplicacin al diagnstico y a la realizacin de encuestas epidemiolgicas - Permiten el estudio de Ags y de Acs - Pueden emplearse de modo Cualitativo o Cuantitativo a) Cualitativo: Objetivo, conocer la presencia de un Ag o Ac determinado. El resultado se b) Cuantitativo: Permite realizar una dosificacin exacta (g de Ag o de Ac / ml) o aproximada expresa como + o -

Existen entonces un conjunto de tcnicas que permiten establecer la reaccin entre antgeno-anticuerpo, teniendo en cuenta los factores previamente mencionados. Entre estas encontramos ELISA, Aglutinacin, Precipitacin e Inmunoflorescencia. (Concepto) CATEGORIAS DE LA PRUEBAS INMUNODIAGNOSTICAS Pruebas de unin primaria Miden la cantidad de inmunocomplejos (unin antgeno anticuerpo) utilizando radioisotipos, colorantes fluorescentes o enzimas. Elisa Inmunofluorescencias RIA

Los anticuerpo o antgenos marcados reciben el nombre de conjugados. Los anticuerpos conjugados suelen ser monoclonales o anti inmunoglobulinas. Pruebas de unin secundaria Los complejos se agregan y originan fenmenos perceptibles visualmente. Son reacciones no reversibles. Depende de factores fsicos del antgeno, de la temperatura, de los electrolitos presente en la reaccin, de la afinidad y avidez en la interaccin antgeno-anticuerpo, proporcin entre ambos, tipo de inmunoglobulina presente. La reaccin antgeno anticuerpo va seguida de una segunda reaccin. Si el antgeno es soluble la reaccin que se da es de precipitacin. Si el antgeno es particulado (suspensin) la reaccin es de aglutinacin. Son de mayor sensibilidad que las anteriores Aglutinacin Precipitacin Hemaglutinacin Inhibicin de la hemaglutinacin Fijacin de complemento

Neutralizacin y seroneutrilizacin realizadas.

Fases de las pruebas inmunodiagnsticas Fase pre analtica: Se caracteriza por el registro de datos, recoleccin, preparacin y conservacin de la muestra. Va desde la solicitud de la prueba hasta que la muestra llega al laboratorio, comprendiendo la fase de la preparacin del paciente y toma de muestra hasta la preparacin de sta para su anlisis. El producto de esta etapa es la muestra. Fase analtica: Se caracteriza por el manejo de la muestra, la bioseguridad, la calidad operacional y el control de calidad interno y externo. Es todo el conjunto de operaciones que se relacionan con la medicin y cuantificacin de la prueba que se esta estudiando. Engloba las tcnicas necesarias para producir un resultado analtico, el cual es el producto de esta fase. Fase post-analtica:

Se caracteriza por el registro, la interpretacin y validacin de los resultados, la expresin de los resultados y la expresin de los valores de referencia. Es el conjunto de procesos necesarios para asegurar la calidad del informe del dato obtenido. Fase preanaltica (pruebas general sangre) Instrucciones generales para los anlisis de sangre No estar tomando antibiticos No haber consumido bebidas alcohlicas 48 horas antes de la prueba No tener gripa ni fiebre porque podra alterar el resultado Evitar el estrs antes y durante la toma de la muestra muestra. muestra. muestra. muestra.

No hacer ejercicios vigorosos durante 3 das antes de tomar la Permanecer en ayunas durante 12 horas antes de tomar la No fumar antes ni durante la toma de la - Los pacientes en reposo no debern cambiar de postura al tomares la - Suspender anticonceptivos orales durante 7 das. Muestra Suero o plasma en (EDTA, Heparina, Oxalato) Las muestras pueden almacenarse por 7 das de 2 a 8 C o por 30 das a -20C. La muestra se congela y descongela solo una vez. La muestra descongelada debe homogenizarse Eliminar cualquier sedimento por centrifugacin o filtracin

Anlisis de Inmunoabsorcin Ligado a Enzima (ELISA) Conceptualizacin Las pruebas de laboratorio para la deteccin de anticuerpos son principalmente tcnicas inmunoenzimticas. ELISA (Enzime Linked Immunosorbent Assay) fue la primera tcnica de este tipo y es ampliamente utilizada para el diagnstico de muchas enfermedades infecciosas. ELISA se identifica popularmente, como la prueba de deteccin de anticuerpos para el diagnstico presuntivo de la infeccin por VIH. Las pruebas presuntivas de deteccin de anticuerpos de este tipo, tienen una altsima sensibilidad pues son capaces de detectar mnimas cantidades de anticuerpos. Esto es muy importante, especialmente en los bancos de sangre. Sin embargo su especificidad nunca es del 100% lo que significa que eventualmente pueden resultar falsamente positivas. Los Anlisis de Inmunoadsorbencia Ligada a Enzimas (ELISA) estn tomando un rol importante en los laboratorios mdicos y de investigacin porque brindan una alternativa viable, mediante la cual es posible realizar la identificacin de muchos virus a nivel de gnero. Estas pruebas estn reemplazando a los radioinmunoensayos en muchos laboratorios, por su comparable sensibilidad sin los problemas de manejo, eliminacin y corto tiempo de vida de los materiales radioactivos. Entre otros aspectos, ELISA tambin es denominada o conocida como prueba de Inmunoensayos Ligados a Enzimas (EIA) Por su objetividad, facilidad de automatizacin y posibilidad de trabajar con un gran nmero de muestras, los anlisis inmunoenzimticos, vienen reemplazando parcialmente a una variedad de tcnicas en el laboratorio como son inmunofluorescencia y aglutinacin. Ventajas

Los reactivos marcados con enzima son de alta estabilidad. Permite una completa automatizacin. Los resultados son objetivos y pueden ser cuantificados por un espectrofotmetro. Los Ag o Ac marcados con enzima pueden ser manejados en condiciones normales de laboratorio. Posee una altsima sensibilidad pues esta prueba es capaz de detectar mnimas cantidades de anticuerpos Permite trabajar con gran numero de muestras

Desventajas Diferente afinidad de los Ag para adherirse a la fase slida Presencia de reacciones no especficas. FUNDAMENTO El fundamento de la prueba inmunodiagnstica de ELISA se basa en la reaccin antgeno-anticuerpo conjugados con una enzima que al interaccionar con el sustrato cromgeno (sustrato incoloro) especifico generan una reaccin de color cuantificable en espectrofotmetro a una longitud de onda apropiada (405 nm). A uno de estos componentes de la reaccin antgeno (Ag)-anticuerpo (Ac) se le adhiere la enzima que suele ser una peroxidasa o fosfatasa alcalina. Al tener lugar la reaccin Ag-Ac, la enzima se pone en contacto con un sustrato adecuado y da una reaccin que origina una coloracin especial que puede medirse espectrofotomtricamente. El color se genera por la interaccin del sustrato cromognico y la enzima que ha sido acoplada al anticuerpo detector. La prueba de Inmunoanlisis ligado a Enzimas son en este momento uno de las pruebas mas utilizadas para la deteccin de antgenos y anticuerpos. De todos los Inmunoanlisis es el ms preciso y permite medir concentraciones muy bajas de un Ag, droga u hormona.

Dentro de los parmetros fisicoqumicos que intervienen en la unin del antgeno con el anticuerpo tenemos: Fuerzas de Van der Walls producidas por el movimiento de tomos en la superficie de las molculas generado por un cambio elctrico. Son fuerzas dbiles presentes cuando la proximidad del Ag y el Ac es grande.

 Fuerzas electrostticas originadas por la fuerza de atraccin entre molculas de carga inica opuesta, como sucede con los grupos NH3+ que reaccionan vidamente con el grupo COOH-. Uniones por puentes de hidrgeno son de carga energtica baja entre tomos electropositivos de hidrgeno y tomos electronegativos de oxgeno o nitrgeno.

Por otra parte la clasificacin de varios tipos de Elisa: Elisa Directo Se utiliza para la deteccin de antgenos. La fase solida se sensibiliza con anticuerpos y se adiciona la muestra constituida por el antgeno conjugado con la enzima. Luego se le adiciona una sustancia cromgena que reacciona con la enzima al producirse la unin antgeno-anticuerpo. El color se observa con el espectrofotmetro. Elisa indirecto: Se utiliza para la deteccin de anticuerpos. La fase solida se sensibiliza con antgeno. Se adiciona la muestra donde se encuentra el anticuerpo especfico para el antgeno. Luego se adiciona un anticuerpo conjugado con la enzima y se adiciona posteriormente la sustancia cromgena. Elisa tipo sndwich: Se utiliza para la deteccin de antgenos. La fase solida se sensibiliza con anticuerpos. Se adiciona luego la muestra con el antgeno especifico. Posteriormente se adiciona el anticuerpo con la enzima conjugada que se une al antgeno que se encuentra fijado al anticuerpo de la fase solida. Se adiciona la sustancia cromgena que reacciona con la enzima para la posterior visualizacin en el espectrofotmetro.

METODOLOGA

GENERAL:

Los mtodos de ELISA dependiendo de la actividad enzimtica se dividen en dos tipos: competitivos y no competitivos. ELISA COMPETITIVO: En este mtodo, el anticuerpo de la muestra va a competir con el conjugado por un nmero limitado de sitios de unin del antgeno. Habr ausencia de color en una muestra positiva debido a que el sustrato no encontrar a la enzima porque el conjugado ha sido desplazado por el anticuerpo presente en la muestra.

ELISA NO COMPETITIVO: Consiste en enfrentar la muestra con el antgeno o anticuerpo que est en la fase slida. Si una muestra es positiva se formar el complejo antgeno-anticuerpo y al agregar el conjugado reaccionar con el respectivo sustrato desarrollandocolor. Dentro de los no competitivos tenemos, los directos que detectan antgenos y los indirectos que detectan anticuerpos. En la presente investigacin se utilizar la modalidad de ELISA no competitiva indirecta. PROCEDIMIENTO ESTANDAR ELISA Fijacin del Antgeno a la fase slida:

La reaccin inmunolgica tiene lugar en la fase slida, sta puede ser de plstico, vidrio o nitrocelulosa. Actualmente los ms usados son los de plstico, dentro de stos los de poliestireno gamma irradiados y los de cloruro de polivinilo porque tienen mayor capacidad para formar enlaces mas estables que los de poliestireno no tratados. Adems estos permiten procesar varias muestras simultneamente y requerir pequeas cantidades de cada uno de los reactivos. El antgeno diluido en buffer es adherido a la fase slida por enlaces electrostticos entre los sitios activos del plstico y regiones de la protena responsables de esta interaccin. El buffer puede ser carbonato a pH 9.6 o buffer fosfato salino (PBS 1X) a pH 7.4.

La estabilidad de los enlaces electrostticos, el tiempo de incubacin y la temperatura son factores importantes a tener en cuenta para evitar prdidas de las protenas y que pueden afectar la sensibilidad del ensayo. Reaccin con anticuerpo:

La reaccin del antgeno con el anticuerpo se debe realizar en condiciones similares a las fisiolgicas, pH 7.4, temperatura de 37C y concentracin salina equivalente a 0.15M de NaCl. Estas condiciones pueden variar dentro de un rango razonable sin afectar la reaccin. El tiempo puede variar entre 1 a 3 horas. Molculas no especficas en solucin pueden adherirse a la fase slida afectando el resultado final del ensayo, para disminuir este riesgo se suele agregar al medio de reaccin un exceso (0.1% a 1%) de una protena inerte para que compita eficientemente por los sitios de unin inespecficos en la fase slida. Esta protena puede ser seroalbmina bovina, casena, suero entero, gelatina u otros. Tambin es necesario aadir al medio tween 20 para evitar uniones inespecficas de macromolcula. Por este motivo es agregado en los tampones de dilucin y de lavado. Adicin del conjugado enzimtico:

El conjugado enzimtico se prepara por unin covalente de una enzima con el anticuerpo; esta enzima puede ser peroxidasa de rbano (HPR)con su sustrato Ortofenilendiamina, fosfatasa alcalina (AP) con su sustrato p-nitrofenol o dietanolamina en buffer carbonato PH a 9.6 o beta-galactosidasa con su sustrato o-nitrofenil-beta-galactosido. Los criterios a tener en cuenta en la seleccin de la enzima apropiada son su toxicidad, estabilidad, disponibilidad, viabilidad de conjugarla eficazmente con el anticuerpo elegido, sensibilidad y precio. Adems es importante valorar que la enzima debe reunir condiciones como la temperatura de catlisis, semejante a la reaccin antgeno-anticuerpo, dar productos coloreados y solubles al degradar el sustrato y por otra parte no dar productos intermedios de catlisis. Las condiciones de reaccin entre el conjugado y el complejo formado por la unin antgeno-anticuerpo son similares a las descritas en la etapa anterior. Adicin del sustrato:

La eleccin del sustrato va de acuerdo con el tipo de enzima presente en el conjugado. El sistema AP hidroliza al pnitrofenil fosfato o p-nitrofenol generando un producto soluble de color amarillo. El sistema HRP reduce al sustrato perxido de hidrgeno produciendo oxgeno que oxida a otros compuestos cromgenos tales como: Tetrametilbenzidina (TMB), cuya oxidacin genera un producto de color azul oscuro.

o-phenylene diamine (OPD), que es oxidado a un producto coloreado que vara del naranja al pardo oscuro. cido azino-(3-etil)-benzo-sulfnico (ABTS), cuya oxidacin genera un producto que va del verde al azul. La fosfasa presenta una alta estabilidad, razn por la cual es la enzima de eleccin en muchos procedimientos. La peroxidasa, por su parte presenta un costo mucho menor que las otras; sin embargo, la estabilidad de los productos es muy corta. La beta-galactosidasa es tal vez la mas estable en si misma y la que libera un producto de alta calidad de medicin pero es la mas costosa. La intensidad del color desarrollado es de acuerdo con la cantidad de enzima presente en la reaccin. La lectura se realiza en un espectrofotmetro a 405 nanmetros como lo habamos mencionado anteriormente.

FASES DE LA PRUEBA INMUNODIAGNOSTICA ELISA Fase solida Es el soporte de la reaccin. La fase solida consiste en la parte solida donde se fijan los anticuerpos para que se d la reaccin. Se han probado diferentes materiales pero los ms utilizados son los plsticos como el Poliestireno y el Polivinilo que pueden absorber protenas mediante interacciones hidrofbicas. Estos materiales se escogen en base a el tipo de anticuerpo o antgeno que se quiere determinar. La absorcin depende del tipo de protena, la concentracin de

esta, y caractersticas fsicas de la superficie del plstico, el pH, el tiempo y la temperatura. Las protenas a absorber, son diluidas en una concentracin de 1 a 50 micro gramos / ml en una solucin de buffer carbonato a pH 9.6. El tiempo y la temperatura de incubacin van desde 3 horas a 37 C hasta 18 horas a 4 C o una combinacin de los dos. Conjugados Dependiendo del ensayo, en la Elisa se utilizan anticuerpos o antgenos unidos a enzimas, lo que se conoce como conjugados. Diferentes formas de anticuerpos son empleados como: policlonales completos (obtenidos de conejo o cabra), isotopos de Ig purificadas, fracciones de anticuerpos como el FAB y anticuerpos monoclonales. Las propiedades deseables de una enzima incluyen alta propiedad de recambio, estabilidad , bajo costo, facilidad de conjugacin, ausencia endgena de la enzima en las muestras a analizar, de fcil deteccin y compatibilidad con las condiciones estndares utilizadas para Elisa. Las enzimas utilizadas en la marcacin son diversas: maleato deshidrogenasa, glucosa deshidrogenasa, peroxidasa, fosfatasa alcalina, betagalactosidasa. Las fuentes de obtencin son diversas como tejidos de animales, vegetales como el rbano picante y bacterias como E. coli. Las ms usadas en la actualidad son la fosfatasa alcalina y la peroxidasa de rbano picante. Sustratos El aspecto ms importante para la seleccin de un sustrato ptimo es que la accin de la enzima sobre el sustrato genere un producto soluble que pueda ser cuantificable. Habitualmente, se utilizan sustratos incoloros que cambian a una solucin coloreada que puede ser medida por espectrofotometra en unidades de absorbancia, a una longitud de onda determinada. Otros factores a tener en cuenta son: la sensibilidad, la estabilidad del componente, la toxicidad y el costo. Los sustratos para la peroxidasa de rabano son en general una mezcla entre el sustrato especifico H2O2 y un cromgeno o segundo sustrato, que cambia de color al ser oxidado por el O2 liberado. Los sustratos ms conocidos incluyen o-fenilendiamina (OPD) y tetrametilbenzidina (TMB). Para la fosfatasa alcalina el sustrato ms popular es el pnitrofenilfosfato (pNPP) del que se genera el o-nitrofenol de color amarillo. Lavados El lavado se utiliza para retirar los reactantes no unidos, se realizan pasos de lavado con una solucin como buffer fosfato salino (PBS) a pH 7.2 o con un detergente como el Tween 20. Anlisis del producto coloreado Algunas reacciones pueden ser visualizadas en forma ptica por el cambio de color, cuando solo se requiera conocer si el resultado es positivo o negativo para el problema en cuestin. Si se necesita conocer la cantidad de color generado en la reaccin, se recurre a la medicin de la intensidad de color mediante un espectrofotmetro. Para cada color debe estandarizarse la longitud de onda a la cual se presenta mxima absorcin. Para el OPD, la lectura se hace a 495 nm, el TMB se lee a 450 nm y el o- nitrofenol muestra mxima absorbancia a una longitud de onda de 405 414 nm Expresin de resultados Una vez cuantificado el color resultante, este valor debe transformarse en un dato que permita comprender el resultado final de la prueba. Para esto, se dispone de varias formas, dependiendo de las necesidades y de los recursos disponibles. Por ejemplo puede determinarse la concentracin del analito en peso (mg a ng). Otro mtodo comn es determinar el promedio de las absorbancias de muestras de individuos que no sufran estas patologas y establecer un punto de corte, agregndole el valor a las medias 2 o 3 desviaciones estndar. Ser considera positiva aquella muestra que se encuentre por encima al punto de corte y negativo cuando este por debajo. Los valores arrojados de la prueba de ELISA se presentan en unidades internacionales sobre mililitros (UI/ml) o ug/ml dependiendo de lo que se esta determinando. Estos valores se obtienen en ttulos de absorbancia o de densidad ptica (DO) y de ah se extrae un punto de corte. El valor del punto de corte o lmite de positividad se calcula a partir de las absorbancias promedio de los controles negativo y positivo.

Los resultados positivos indican DO mayores al punto de corte e implican la presencia de anticuerpos contra el virus. Interpretacin Reactiva: Indica valores positivos, lo que significa que se detectaron anticuerpos y es necesario confirmar su especificidad pues la prueba puede ser realmente reactiva o falsamente reactiva. Normalmente se debe realizar otra prueba de deteccin de anticuerpos y si esta resulta reactiva se debe hacer una prueba confirmatoria como el Western blot. No reactiva Indica valores negativos, lo que significa que no se encontraron anticuerpos detectables en el momento de la prueba. Es necesario tener en cuenta el llamado "perodo de ventana" y analizar la necesidad o conveniencia de repetir la prueba posteriormente. El perodo de ventana o ventana inmunolgica se refiere al tiempo en el que una persona infectada tarda en desarrollar los anticuerpos al virus. De esta manera, se expresa como el tiempo que se transcurre desde el momento del ingreso del virus al organismo y la produccin de anticuerpos detectables. (3 meses mximo) Si este periodo de ventana inmunolgica an no ha transcurrido totalmente es necesario realizarse otra prueba a los 3 meses para tener la plena seguridad de que esta primer prueba no es lo que se llama un -falso negativo- es decir que salga negativo porque el cuerpo an no ha reaccionado a la presencia del virus, es decir no ha creado anticuerpos y la prueba de sangre lo que analiza es si ya hay o no hay anticuerpos. No es posible hacer el diagnstico mediante el ELISA o las pruebas normales de deteccin de anticuerpos en el periodo de ventana. Las muestras que den absorbancia mayores o iguales al punto de corte se consideran positivas para inmunoglobulina M (IgM), en el caso de una infeccin temprana e inmunoglobulina G (IgG), para el caso de una infeccin tarda. Para ver reflejada la infeccin tarda debe repetirse el titulo de IgG, veinte (20) das mas tarde, para determinar el aumento significativo de este valor. En caso de mantenerse constante el titulo, se considerara negativa la produccin de anticuerpos contra el antgeno y por consiguiente se interpreta como ausencia de ese antgeno. INMUNOFLUORESCENCIA: CONCEPTO: Tcnica que emplea anticuerpos conjugados a fluorocromos, que al ser excitados con la energa de una determinada longitud de onda son capaces de emitir energa de una longitud de onda mayor. Consiste en una reaccin ag-ac que se hace visible por la incorporacin de un colorante fluorescente, ( isotiocianato de fluorescena o tetrametil rodamina) al anticuerpo, al ocurrir la reaccin se expone a la luz ultravioleta emitida por el microscopio y se evidencia por el fenmeno de la inmunofluorescencia. Fluorocromos Cuando la luz es absorbida por ciertas molculas denominadas fluorocromos, la energa de los fotones puede ser transferida a electrones, que asumen un nivel de energa mayor. Cuando el electrn retorna a su estado de energa -15 vibracional original (nivel de energa menor del estado exitado) algo de la energa se libera dentro de los 10 seg como energa calrica. La energa remanente se libera luego de pocos nanosegundos como un fotn de menor energa que el fotn inicial. Este fenmeno se conoce como fluorescencia y la eficiencia se describe con el trmino de rendimiento cuntico. Las longitudes de onda que son capaces de que una molcula fluoresca se llaman espectro de excitacin y las longitudes de onda donde se emite la fluorescencia se llaman espectro de emisin. El espectro de emisin es ligeramente desplazado a una longitud de onda superior que el espectro de excitacin. El isocianato de fluorescena(FITC) y la fluorescena muestran una fluorescencia verde manzana bajo la luz ultravioleta y la rodamina anaranjado brillante

La intensidad de la fluorescencia depende de las caractersticas fiscas del medio. Algunos fluorocromos son ms fluorescentes en medio acuoso (ej. FITC), mientras que otros lo son en medios no polares (ej.dimetilamino naftaleno). El espectro caracterstico de la fluorescencia tambin depende del pH.

Ventajas de la inmunofluorescencia: Rapidez en la obtencin de datos Las pequeas muestras de ag pueden ser fcilmente encontradas No se necesita esterilizar Alta posibilidad e dar un diagnostico correcto Su uso no es solo exclusivo para la identificacin de microorganismos, puede ser usada en otros estudios inmunolgicos.

Desventajas: Equipos y reactivos muy costosos Necesita personal especializado y debidamente entrenado Sus resultados no son 100% seguros (como cualquier otra prueba serolgica)

FUNDAMENTO: Compuestos fluorescentes + Anticuerpos = Conjugados Debe tener: Fluorescencia intensa Reaccin especfica con los antgenos

Esto depende de: Calidad y concentracin de los Acs en el suero Propiedades de la sustancia fluorescente Modificaciones que ambos pueden sufrir en el acople

Tambin influyen: Equipo: Microscopio con condensador de campo oscuro Fuente luminosa con bombillo de mercurio que produzca luz u.v Se necesita que la luz pase por varios filtros, uno para emitir luz que excite el fluorocromo y otro que excluya la luz excitante. La fluorescencia alcanza la mxima excitacin a 490 nm y emite luz fluorescente alrededor de 520 nm. Las lmparas mas utilizadas son las de tungsteno y mercurio. Intensidad de marcacin Homogeneidad de marcacin Presencia en el conjugado de otras molculas marcadas

Tipos de microscopios usados: Segn la forma en que los especmenes sean estimulados: De luz transmitida De luz incidente: ms modernos y mucho ms usados

Ver video: http://www.biocientifica.com.ar/es_arg/index.php?option=com_content&view=article&id=42&Itemid=44

TIPOS de inmunofluorescencia: I.F directa: Se usa para hallar ag directamente en la muestra, se emplean anticuerpos muy especficos contra el ag marcados con la sustancia fluorescente. Se usa tambin en la deteccin de linfocitos y sus subpoblaciones utilizando acs monoclonales. Es una tcnica que consiste en demostrar la presencia de un antgeno mediante reaccin directa con un anticuerpo especfico marcado con colorante fluorescente. I.F Indirecta: Se usa para encontrar la presencia de a.c especficos contra un determinado microorganismo, el ac puede ser del tipo M, G, A y se evidencian mediante un anti-anticuerpo marcado con la sustancia fluorescente. Es una tcnica de doble capa en donde se aplica el anticuerpo sin marcar directamente sobre el sustrato de tejido y se visualiza por tratamiento con un suero anti-inmunoglobulina conjugado con fluorocromo. El proceso consta de dos etapas: en la primera se fijan sobre un portaobjetos los antgenos que constituyen el substrato conocido especfico (clulas que contiene virus, T. gondii, T. pallidum, etc.) sobre l se coloca el suero de quien se sospecha la presencia de anticuerpos especficos, si la reaccin es positiva se dar formacin de complejo antgenoanticuerpo no visible ya que el anticuerpo no estaba marcado. En la segunda etapa se debe obtener una anti-inmunoglobulina humana marcada, que reaccionar con el anticuerpo del complejo producido en la primera etapa. La anti-inmunoglobulina se obtiene as: de una mezcla de varios sueros de personas normales, se precipitan las globulinas (anticuerpo), estn globulinas son inoculadas a un organismo (conejos, cabras), el organismo producir antiglobulinas humanas que se marcan con fluorescena o cualquier otro de los colorantes. Este anticuerpo marcado se unir al anticuerpo humano no marcado de la primera etapa que en esta momento se puede considerar como un antgeno, dando reaccin positiva de fluorescencia solamente si en la primera etapa se produjo unin entre el antgeno fija en la placa y el anticuerpo presente en el suero humano que estamos evaluando. La tcnica indirecta tiene como ventajas que la inmunofluorescencia es ms brillante que la deteccin directa debido a que varias anti-inmunoglobulinas fluorescentes se pueden unir a cada una de las molculas de Antgeno-anticuerpo presentes en la primera capa, adems dado que el proceso de conjugacin es largo, se ahorra tiempo cuando se estudian varios sueros para la determinacin de anticuerpo ya que slo es necesario prepara un nico reactivo marcado : la anti-inmunoglobulina. Microfluorometra de flujo: Tambin llamado citometria de flujo con separacin, permite el anlisis y la separacin de muestras basado tanto su florescencia como en sus propiedades de dispersin de luz. Para su anlisis las clulas se introducen en suspensin en un contenedor, por vibracin se separa las clulas a la hacer que pasen por un rayo laser basado en sus diferencias al dispersar la luz o por su emisin de fluorescencia tras la excitacin con el rayo. Muy usado en la cuantificacin exacta de subpoblaciones, adems puede separar la muestra por sus cargas y las distribuye en contenedores separados.

INTERPRETACION: Directa: Al utilizarse un anticuerpo marcado contra un determinado antgeno se puede conocer si el organismo est infectado con este virus, bacteria, etc. lo que se denota por la formacin de un complejo ag-ac que es visible con microscopio.

Indirecta:

dado que en este caso lo que se marca es un antisuero para reconocer la presencia de anticuerpos especficos contra antgeno en un husped, la formacin de un complejo que es visible al microscopio de fluorescencia informa que existen anticuerpos especficos para determinado antgeno.

PRECIPITACIN: Reaccin en la cual un anticuerpo y un antgeno soluble interactan formando un precipitado visible, es de tipo secundaria, en este tipo una sola unin entre ac-ag no es suficiente, se necesitan varias para que se forme un entrecruzamiento de muchas molculas de ag.ac lo que formara un precipitado, esto se da en cantidades iguales de acag. Si hay mucho anticuerpo se unir a una unidad antignica sin lograr el entrecruzamiento (prozona) Si hay mucho antgeno o poco anticuerpo habr muchos sitios libres de unin de a.g y tampoco habr entrecruzamiento (post-zona). Este tipo de prueba requiere grandes cantidades de ag y ac y no es muy sensible. FUNDAMENTO: Al mezclar cantidades suficientes de Ag soluble con Acs especficos, la interaccin Ag-Ac puede dar lugar a una red capaz de ser visualizada como un precipitado. Esa red de la que hablamos, no es otra cosa que grandes complejos inmunes (CI) formados por la interaccin Ag-Ac. Tal como se observa en la figura, cuando se agregan concentraciones crecientes de Ag soluble a una cantidad fija de suero conteniendo Acs especficos, a medida que la cantidad de Ag agregado aumenta, la cantidad de precipitado se incrementa hasta alcanzar un mximo, luego del cual declina. En un extremo de la curva de precipitacin, cuando se agregan pequeas cantidades de Ag, los CI se forman en exceso de Ac. En el otro extremo, al agregar grandes cantidades de Ag, los CI se forman en exceso de Ag siendo pequeos y probablemente constituidos por una molcula de Ac y dos de Ag. Entre estas dos situaciones extremas se encuentra la zona de equivalencia, en donde la relacin Ag-Ac permite la formacin de grandes redes de CI que precipitan. La reaccin de precipitacin depende de la VALENCIA del Ac y del Ag. La valencia del Ac da idea del nmero de sitios que posee para reconocer al Ag. De esta manera: La asociacin entre Ac bivalentes y Ag multivalentes permite la formacin de CI precipitantes. El Ag multivalente puede presentar un slo epitope repetido o varios epitopes distintos. La asociacin entre Ac bivalentes y Ag monovalentes (un nico epitope no repetido) no permite la formacin de CI precipitantes.

La formacin del precipitado se da en dos fases: 1. Rpida formacin de los complejos Ag-Ac. 2. Los complejos se agregan formando micelas o redes que al alcanzar determinado

tamao precipitan.

CLASIFICACION: Precipitacin en medios lquidos Esta reaccin se produce en dos etapas. En la inicial, que se desarrolla rpidamente y es influida muy poco por la temperatura y los electrolitos, se forman los complejos Ac/Ag primarios. A medida que el tiempo transcurre, esos complejos iniciales se agregan, originando micelas de diferentes tamaos, las que finalmente precipitan. Algunos complejos no alcanzan a hacerlo y quedan en solucin. La temperatura acelera esta segunda etapa, siendo adems electrolitodependiente. Es mucho ms lenta que la inicial, puede durar minutos, e incluso horas, para que se complete.

La formacin de agregados es una consecuencia de la bivalencia de los anticuerpos y la multivalencia de los antgenos. Con haptenos monovalentes o antgenos que poseen un solo determinante antignico por molcula, la precipitacin no se produce. Un hecho muy particular lo constituyen los anticuerpos monoclonales, que en su mayor parte no muestran actividad precipitante. Ello se debe a que en muchos casos, especialmente cuando estn dirigidos contra macromolculas en solucin, reconocen a un nico epitope no repetido, lo que les impide formar agregados. La formacin de estos diferentes complejos ha sido explicada mediante la llamada teora del enrejado, que considera que la composicin del precipitado formado es una consecuencia del modo en que anticuerpo y antigeno se han unido. Dada la bivalencia del anticuerpo y multivalencia del antigeno, las posibilidades de combinacin varan segn que en la mezcla exista exceso de antigeno, exceso de anticuerpos o equivalencia de ambos. En la zona de exceso de antigeno, los complejos son solubles. Si bien la precipitacin en medios lquidos es muy til para la identificacin de antgenos y anticuerpos, teniendo en cuenta lo anteriormente expuesto en lo relativo a la formacin de los precipitados, la misma puede usarse con fines cuantitativos y constituye un buen mtodo para la medida de la concentracin de los anticuerpos presentes en un suero. Puede usarse tambin para medir niveles de antgeno. Precipitacin en medios gelificados Las macromolculas pueden difundir libremente a travs de geles; dicha difusin esta limitada por la concentracin del gel. Empleando soportes adecuados, en especial aquellos que como base tienen agar disuelto en electrolitos, es posible hacer migrar antgenos y anticuerpos de modo que al encontrarse interaccionen. Pueden utilizarse tambin geles con base de pectina, alginatos, pliacrilamida y aun tiras de acetato de celulosa gelatinizado. Los precipitados que se originan se visualizan como ntidas bandas de precipitacin, que permanecern estables mientras un mayor aflujo de molculas de los reactivos no provoquen su redisolucin. Se han descrito numerosas tcnicas cualitativas y cuantitativas basadas en este principio, entre las que pueden citarse la difusin simple monodimensional, difusin doble monodimensional, difusin doble bidimensional, difusin radial, etc.. a.Difusin simple: Se realiza en un soporte-lamina, caja de petri u otro recipiente y se le agrega agarosa para inmudifusion, cuando esto se solidifica se le abren dos huecos equidistantes en los cuales se ubican el ag y en el otro el ac. Se incuba entre 24 y 72 hrs. Durante este tiempo los reactivos migran en el gel. b. inmunodifusion doble (outhterlony): los pozos se abren en posicin de margarita se puede comparar la identidad de ag o ac vecinos. Se pueden dar reacciones de: Identidad: las lneas de precipitacin forman un arco continuo No identidad: las lneas se cruzan Identidad parcial: semiarco con una espuela, algunos ag.ac se reconocen y otros no. Con esta tcnica puede tenerse una idea de las relaciones entre los pesos moleculares de los antgenos y anticuerpos reaccionantes. Trabajando con concentraciones ptimas de Ag y de Ac, si la banda de pecipitacin formada es recta, indica que los pesos moleculares de ambos son muy prximos. Si la banda es cncava con especto al reservorio del antgeno, seala que el peso molecular de ste es superior al del anticuerpo, siendo menor en el caso en que la banda presente convexidad. Cuando uno de los antgenos analizados tiene algn componente capaz de dar una reaccin cruzada con el anticuerpo elaborado por el otro (identidad parcial), las bandas de precipitacin de ambos sistemas se unen y funden parcialmente en una banda, apareciendo una prolongacin o espoln en la correspondiente al antgeno que se emple para la obtencin del antisuero. Esto indica que en este antgeno hay componentes antignicos no compartidos con el restante.

c. inmunodifusion radial: el antisuero es colocado en el agar y el ag en pozos abiertos sobre el gel. Mientras el ag se difunde un anillo de precipitacin se forma alrededor del pozo en el punto de equivalencia. Al ser estas pruebas cuantitativas se presentan segn controles de concentracin conocida con los cuales se elabora una curva en la que se extrapola el valor del suero problema. El hallazgo de este valor permite identificar patologas en las cuales se ve claramente el aumento o disminucin de lo que se quiera determinar. Tcnicas inmunoelectroforeticas: Se usa electroforesis y precipitacin en la identificacin de ag y ac. Se necesita que los ag migren mientras que los ac no se muevan o lo hagan muy poco, de esta forma se da la interacciona g-ac a.Inmunoelectroforesis: separacin electrofortica en gel de los ag de la muestra, seguida de una inmunodifusion frente antisueros especficos. Entre 24 y 48 horas despus se observan las bandas de precipitacin de la reaccin ag-ac y los geles se pueden lavar y colorear. Utilizados en analizar protenas sricas. b. inmunoelectroforesis en cohete: los mismos fundamentos de inmunodifusion radial se usa para el estudio de elementos de concentracin desconocida. Consiste en el transporte electrofortico de protenas antignicas a un ac especifico, a un PH en el que permanece inmvil frente al flujo d electrones Area debajo de la punta del cohete es directamente proporcional a la concentracin del ag. La agarosa mas usada es la mediana electroendosmosis. c. inmunoelectroforesis cruzada: los anticuerpos se separan por electroforesis de zona en gel de agarosa. Despus sucede una segunda electroforesis perpendicular a la primera n el mismo gel que tiene los ac. d. contrainmunoelectroforesis:

el ag debe estar cargado negativamente y el ac positivamente (efecto electroendesmotico) as que al aplicarse una corriente elctrica migraran en sentido contrario, aceleraran su encuentro y la formacin de una lnea de precipitacin. Muy sensible y fcilmente observable. INTERPRETACION: Se analiza basndose en la formacin de lneas de precipitacin, dado que anteriormente se haba colocado un control positivo y otro negativo, uno con anticuerpo especficos para el antgeno y el otro con ningn tipo de anticuerpo, la presencia de lneas de precipitacin entre la muestra de suero del paciente, y el control negativo con los antgenos indica la presencia de anticuerpos contra este antgeno y por ende la infeccin en el paciente seria positiva. Si se forma un alinea de precipitacin entre el control negativo y la muestra de antgeno significa un dao en la prueba.

AGLUTINACION CONCEPTO: Proceso por medio del cual se evidencia una reaccin antgeno anticuerpo por medio de la formacin de grumos permitiendo labores de clasificacin y diagnostico. El aglutinante es el trmino general que se utiliza para describir los anticuerpos que aglutinan las partculas antgenos, existe la posibilidad de transformacin de Ag soluble en Ag particulado.Todos los anticuerpos tericamente pueden aglutinar partculas de antgenos, debido a su elevada valencia, cabe destacar que la IgM es la mas eficiente aglutinando. APLICACIONES: Este es un mtodo rpido y sencillo usado ampliamente para identificar: virus, bacterias, grupos sanguneos. Cuando se usan antigenos conocidos se detectan anticuerpos especficos. Presencia de: Clulas completas - Bacterias - Protozoos - Eritrocitos Partculas inertes - Ltex - Bentonita Gelatina FUNDAMENTO: Para la realizacin de la prueba se hace necesario la utilizacin de suero, ya que los anticuerpos que se van a identificar se producen en este como respuesta a una infeccin. La reaccin de la aglutinacin se divide en dos fases, la primera en la que se produce el contacto antgeno-anticuerpo sobre la superficie de la partcula (o clula) empleada, y la segunda en la que las partculas se agregan y se puede visualizar la aglutinacin. Podra ocurrir que se produjese la primera fase, pero no la segunda, ello se debera a la presencia de anticuerpos incompletos (subaglutinantes o no aglutinantes) que podran generar falsos negativos. Ello puede solucionarse modificando las condiciones de reaccin. Por lo general la prueba de aglutinacion cualitativa se reaiza sobre un porta objeto. Las reacciones de aglutinacin pueden ser, adems de cualitativas, semicuantitativas, lo cual se consigue empleando diluciones seriadas de antisuero, valorndose como resultado la mayor dilucin a la que se produce la aglutinacin. Efecto Prozona Toda prueba de aglutinacin que se ve inhibida por exceso de anticuerpos. Alejando cada vez mas la reaccin de la zona de equivalencia. Ocasionalmente, se observa que cuando la concentracin de anticuerpos es alta (es decir, diluciones bajas), no hay aglutinacin y luego, cuando la muestra se diluye, se produce aglutinacin. La falta de aglutinacin en las altas concentraciones de anticuerpos se llama el efecto de prozona. La falta de aglutinacin en el prozona se debe al exceso de anticuerpos resultantes en los complejos de muy pequeas que no mata a la forma de aglutinacin visible. TIPOS DE AGLUTINACIN: 1.- Aglutinacin directa

se presenta cuando un antigeno es particualdo - como es el caso de hongos, bacterias y globulos rojos- y entra en contacto con antiacuerpo correspondiente. Se aplica para deteccin del grupo srico ABO, en reacciones fbriles para detectar la posible presencia de anticuerpos en sangre humana para estos antgenos 2.- Aglutinacin pasiva Cuando la molcula antignica con la que interacciona el anticuerpo especfico no forma parte de la estructura nativa de la partcula, sino que se incluye artificialmente en su superficie, la aglutinacin que tiene lugar se denomina genricamente aglutinacin pasiva o indirecta. Se utiliza antgeno soluble, que puede encontrarse adherido a partculas insolubles como ltex , polietileno o bentonita. Se aplica para determinacin de proteinas virales, bacterianas, micticas, las reacciones con latex para PCR, RA ( factor reumatoide) y prueba de embarazo a)Aglutinacin de ltex Es un mtodo de laboratorio para examinar ciertos anticuerpos o antgenos en una variedad de fluidos corporales, como la saliva, la orina, el lquido cefalorraqudeo o la sangre. La muestra se enva a un laboratorio donde se mezcla con gotas de ltex cubiertas con un anticuerpo o un antgeno especfico. Si la sustancia sospechosa est presente, las gotas de ltex se agruparn (aglutinarse). Los valores normales revelan que no hay aglutinacin, Si hay compatibilidad antgeno-anticuerpo, se presentar aglutinacin. b) Aglutinacin de partculas de gelatina c)Hemaglutinacin indirecta o pasiva Determinacin de grupos sanguneos por hemoaglutinacin Algunos virus tienen la propiedad de aglutinar eritrocitos de mamferos o aves permitiendo identificarlos y cuantificarlos. Grupos virales: orto y paramixovirus, alfa y flavirus, coronavirus, Mycoplasma gallisepticum. La glucoproteina sirve como el sitio de recepcin para la hemoaglutinina y como sustrato para la neuraminidasa viral. La hemoaglutinacin ocurre cuando la hemoaglutinina acta de manera reciproca con un receptor especifico en la superficie del eritrocito Prueba rutinaria de laboratorio, q emplea principios bsicos de aglutinacin para determinar presencia de aglutingenos de superficie eritrocitarios proceso de la muestra Extraccin venosa y recolecta en tubo (EDTA) Centrifugacin (5minutos a 400 g) Conservacin (temperatura optima ) Solucin salina ( 1L de agua + 8.5 gr de NaCl) Buffer fosfato Tcnica: Lavado y obtencin de glbulos en solucin Centrifugado Lavado ( 2 a 3 veces) suspensin de glbulos rojos al 3% (1gota globulos y 30 gotas de solucion salina) Determinacin en tubo o micro placas aadir Antisuero ( anti a, anti b, anti d) (10 uL) Aadir Glbulos en solucin al 3% ( 1 gota :50uL) Evaluar Lavado (se considera como punto critico)

Sustraer en tubo paquete globular Enrazar con sln salina Centrifugacin (2 minutosa 250g) Repetir tres veces el mismo proceso

PRUEBA DE INHIBICION DE LA HEMAGLUTINACION HI Los anticuerpos contra los virus hemoaglutinantes inhiben la hemaglutinacion al bloquear los lugares de unin. Esta prueba se usa para: Identificar el virus, para medir concentraciones de Ab. Titulo: mas alta dilucin que Inhibe la Hemaglutinacion por el No. de DHA Para la interpretacin considerar: Mtodo y va de vacunacin. Tipo de vacuna. Edad y fecha de vacunacin. Enfermedades inmunosupresoras. Posibles causas de error: Conservacin incorrecta, Formacin de pilas, Muestra contaminada, Auto anticuerpo y anticuerpos, Tcnica incorrecta. INTERPRETACIN Si al trmino del periodo de reaccin o sea en un tiempo dado no existiese ningn signo visible de aglutinacin, se interpretara como una reaccin negativa a ese antisuero. En cambio, si la reaccin es positiva se observa que las particulas aglutinan en segundos Por ejemplo: Determinacin de grupo sanguineo: Se considera de grupo A si el fenmeno de aglutinacin se aprecia solo en la gota a la que se agrego el suero anti A; grupo B si solo hay reaccin con al antiB; AB en caso de que la aglutinacin suceda en ambas gotas; y O si no se evidencia reaccin en ninguna. VENTAJAS: Muy utilizadas. Sencillas. Rpidas. Cuali o cuantitativas Econmicas DESVENTAJAS Muy sensibles. Reacciones hetero-especificas. Aglutinacin depende de: Relacin Ag-Ac Temperatura pH