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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEAR KARILANE MARIA SILVINO RODRIGUES

AO DO LINALOL SOBRE O SISTEMA CARDIOVASCULAR DE RATOS NORMOTENSOS

FORTALEZA-CEAR 2010

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KARILANE MARIA SILVINO RODRIGUES

AO DO LINALOL SOBRE O SISTEMA CARDIOVASCULAR DE RATOS NORMOTENSOS

Dissertao ao Curso de Mestrado Acadmico em Cincias Fisiolgica da Universidade Estadual do Cear, como requisito parcial para a obteno do grau mestre em Fisiologia. rea de Concentrao: Fisiologia.
Orientadora: Profo. Dr. Mohammed Saad Lahlou

FORTALEZA CEAR 2010

R696a

Rodrigues, Karilane Maria Silvino Ao do linalol sobre o sistema cardiovascular de ratos normotensos. / Karilane Maria Silvino Rodrigues Fortaleza, 2011. 146 p. : il. Orientador: Profo. Dr. Mohammed Saad Lahlou Dissertao Mestrado Acadmico em Cincias Fisiolgicas Universidade Estadual do Cear, Centro de Cincias da Sade. 1. Linalol. 2. Sistema cardiovascular. 3. Msculo liso vascular. 4. Aorta. I. Universidade Estadual do Cear, Centro de Cincias da Sade . CDD: 574-1

KARILANE MARIA SILVINO RODRIGUES

AO DO LINALOL SOBRE O SISTEMA CARDIOVASCULAR DE RATOS NORMOTENSOS

Dissertao ao Curso de Mestrado Acadmico em Cincias Fisiolgica da Universidade Estadual do Cear, como requisito parcial para a obteno do grau mestre em Fisiologia.

rea de Concentrao: Fisiologia.


Aprovada em: 30/ 09 /2010.

BANCA EXAMINADORA

________________________________________________ Prof. Dr. Mohammed Saad Lahlou (Orientador) Universidade Estadual do Cear UECE

________________________________________________ Prof. Dr. Pedro Jorge Caldas Magalhes Universidade Federal do Cear - UFC

________________________________________________ Profa. Dra. Andrelina Noranha Coelho de Souza Universiade Estadual do Cear - UECE

A Deus, por tudo e a minha amada av Eridan Tabosa ( In Memoriam ) por me fazer acreditar que tudo posso.

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AGRADECIMENTOS

Aos meus pais Jaime e Edineide Rodrigues, minhas razes.

A minha irm Kesiane, que mesmo distante se faz presente em todos os momentos da minha vida.

A minha tia Auri, sinnimos de persistncia e coragem.

Ao meu orientador professor Saad Lahlou, por aceitar-me como orientanda, pela amizade, disposio, prestatividade e inteligncia na conduo deste trabalho.

As minhas queridas amigas Diana e Dieniffer, no s pela contribuio valiosa para execuo deste trabalho, mas tambm por se fazerem presente em todos os momentos.

A professora Ediara, por ter despertado em mim o amor pela pesquisa. Aos meus amigos, Jones, Leidiane, Neto, Davi, Loeste, Estela, Tiago, Vanessa e Patrick por me ensinarem a arte da amizade.

Ao aluno de doutorado Rodrigo Siqueira, pela ajuda eficaz.

Ao amigo professor Walter Zin, pelo exemplo de competncia e correo.

Ao professor Henrique Leal Cardoso, pelo auxlio inestimvel e incansvel disponibilidade com que sempre me recebeu.

Ao professor Pedro Magalhes, pela acolhida e constante incentivo.

As professoras Andrelina Noronha e Crystianne Callado, pela amizade e pelas orientaes sbias e oportunas.

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A todos os professores do Mestrado que contriburam para minha formao.

A minha querida paciente Maria Ceales ( In Memoriam ), pelas lies de vida e por haver despertado em mim o desejo de superao.

A Ecila e Lindalva, pela afetuosidade e presteza.

Ao amigos de laboratrio Luiz Junior, Kerly Shamyra, Walber Ferreira e Roseli Barbosa, pelo apoio incessante. Ao LEF E LAFAMULI, laboratrios que realizei a parte experimental deste trabalho.

Ao Pedro Melites, por sua imensa solicitude no auxlio desta pesquisa.

Ao Frank, pelo empenho para com os animais.

Aos guardas da Universidade Estadual do Cear e da Universidade Federal do Cear, pela sentinela constante.

Ao Biotrio Central da Universidade Federal do Cear, por ceder animais para que esta pesquisa fosse realizada.

O Senhor fez a terra produzir os medicamentos: O homem sensato no os despreza Eclesistico 31-4.

RESUMO O linalol, um monoterpeno, constituinte de diversos leos essenciais e possui atividades antiinflamatria, antinociceptiva e anti-microbiana, j comprovadas. No entanto, pouco se conhece sobre seus efeitos no sistema cardiovascular, sendo este, portanto, o objetivo deste estudo. Avaliamos o efeito do linalol in vivo em ratos normotensos e anestesiados, e in vitro em aorta isolada de rato. Para isso utilizamos ratos Wistar machos, (250-350g). Nos experimentos in vivo estes animais foram anestesiados com pentobarbital sdico para canulao da aorta abdominal e da veia cava inferior. O linalol foi injetado manualmente em bolus no volume de 0,1 ml, seguido de injeo de 0,2 ml de soluo salina. Cada animal recebeu uma srie crescente de doses (1, 5, 10 e 20 mg/kg, n = 6) atravs do cateter intravenoso e o curso temporal das alteraes de PAM e FC foi registrado. Um procedimento similar foi realizado em outro grupo de ratos (n = 7) que foram submetidos 15 minutos antes a uma bivagotomia realizada a nvel cervical. O linalol em ratos intactos foi capaz de provocar hipotenso e bradicardia de forma dose-dependente (P < 0,01; ANOVA a uma via). Na dose de 10 e 20 mg/kg as respostas hipotensoras e bradicardizantes foram bifsicas.Similarmente em ratos bivagotomizados injees i.v. de doses crescentes do linalol (1, 5, 10 e 20 mg/kg) induziram uma hipotenso e bradicardia (fase 2) de forma dose-dependentes (P < 0.01, ANOVA a uma via) que se tornam significativas tambm nas doses de 1 e 5mg/kg, respectivamente. Entretanto, a fase 1, para hipotenso e bradicardia, induzidas pelo linalol nas doses de 10 e 20 mg/kg foi complemente abolida (P <0,01, teste t de Student pareado) em ratos bivagotomizados. Na investigao in vitro os animais foram sacrificados com cmara de CO2 e a aorta retirada e seccionada em anis uniformes montados em cmaras de perfuso para rgo isolado contendo soluo Krebs, a 37C, pH 7,4 e aerado com mistura carbognica. Os anis de aorta foram presos por uma haste a uma extremidade fixa e a um transdutor de fora acoplado a um polgrafo computadorizado que registra qualquer alterao mecnica provocada pela adio de substncias ao banho. Os tecidos foram estabilizados por 1 hora antes do incio dos protocolos. O linalol apresentou ao relaxante significante tanto no acoplamento eletromecnico como farmacomecncico cujas IC50s preparaes de aorta com endotlio intacto. Estes resultados no foram estatisticamente diferentes daqueles encontrados com em preparaes de aorta com endotlio intacto. Linalol tambm, mostrou ao via VOCCs j que conseguiu nas concentraes de 300 (n=5) e 1000 M (n=5) reduziu de forma estatisticamente significante (p < 0,05, ANOVA a duas vias seguido de HolmSidak) a amplitude mxima da curva de CaCl2. Foi avaliada a ao do linalol sobre os canais de K + dependente de voltagem e notou-se que na presena do 4 AP (n=6) com IC50 de (1407 47,0 M) o que sugere que esta pode ser uma via usada pelo linalol para provocar seus efeitos relaxantes. Com isso, percebe-se que o linalol apresenta efeitos sobre o sistema cardiovascular tendo efeitos hipotensores e antiespasmdicos. Palavras Chave: Linalol, Sistema Cardiovascular, Msculo Liso Vascular, Aorta.

ABSTRACT Linalool a monoterpene, constituent of several essential oils, and has proven antiinflammatory, antinociceptive, anti-microbial activities. However, little is known about its effects on the cardiovascular system, so this is the objective of this study. We evaluated the effect of linalool in vivo in anesthetized normotensive rats and in vitro in isolated rat aorta. We used male Wistar rats (250-350g). In vivo experiments these animals were anesthetized with sodium pentobarbital for cannulation of the abdominal aorta and vena cava. Linalool was injected manually in a bolus volume of 0.1 ml followed by injection of 0.2 ml of saline. Each animal received a series of incrementing doses (1, 5, 10 and 20 mg / kg, n = 6) via the intravenous catheter and the time course of changes in MAP and HR was recorded. A similar procedure was performed in another roup of rats (n = 7) which underwent a bilateral vagotomy be performed at cervical level. Linalool in intact rats was able to cause hypotension and bradycardia dose-dependently (P <0.01, ANOVA one way). At a dose of 10mg and 20 mg / kg hypotensive and bradycardia responses were biphasic. Similarly in rats with bilateral vagotomy i.v injection of increasing doses of linalool (1, 5, 10 and 20 mg / kg) induced hypotension and bradycardia phase 2) dose-dependently (P <0.01, ANOVA one way) that become significant also in doses of 1 and 5mg/kg, respectively. However, Phase 1, to hypotension and bradycardia induced by linalool at doses of 10 and 20 mg / kg was completely abolished (P <0.01, paired t test) in rats with bilateral vagotomy. In in vitro investigation the animals were sacrificed with chamber of CO2 and aorta was removed and sectioned into uniform rings which were mounted in perfusion chamber for isolated organ chamber containing Krebs at 37 C, pH 7.4 and aerated with carbogen mixture. Aortic rings were attached to a fixed end and to a force transducer a computerized coupled to polygraph that records any mechanical change caused by adding substances to the bath. Tissues were stabilized for 1 hour before the start of the protocols. Linalool presented significant relaxing action both in electromechanical and pharmacomechanical coupling whose IC50s were 334.9 17.9 (n = 6) and 695.3 88.2 M (n = 4), respectively (p <0.05 , one way ANOVA followed by Holm -Sidak test) in intact endothelium aortic preparation.These results were not statisticaly different those found in endothelium-denuded aortic preparations. Linalool also showed activity via VOCCs since, at 300 (n = 5) and 1000 M (n = 5) concentrations, it significantly reduced (p <0.05, two-way ANOVA followed by Holm-Sidak) the maximal amplitude of CaCl2 concentration-effect curve. We evaluated the action of linalool on voltagedependent K+ channels and it was noted that in the presence of 4-AP (n = 6) the IC50 of the relaxion of K+ induced contraction was altered (1407 47,0 M) suggesting that this may be a target of linalool relaxing effects. In conclusion, linalool has hypontensive and antispasmodic effects on the cardiovascular system. KEY WORDS: Linalool, Cardiovascular System, Vascular Smooth Muscle, Aorta

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LISTA DE TABELAS

TABELA I. Lista de plantas medicinais permitidas pela ANVISA no Brasil e suas aes teraputicas. TABELA II. Denominao dos terpenos.

20 22

TABELA III. Valores mdios do tempo de latncia (em segundos) para a induo dos efeitos hipotensores e bradicardizantes (fases 1 e 2) pelo LIN intravenoso nas doses estudadas, em ratos intactos ou submetidos bivagotomia cervical. 57

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LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1. Acoplamento Eletromecnico e Farmacomecnico do msculo liso vascular. 28 FIGURA 2. Representao da ativao da protena monomrica G. FIGURA 3. Representao esquemtica do relaxamento do msculo liso vascular. FIGURA 4. Estrutura qumica do Linalol. FIGURA 5. Sistema de registro das contraes mecnicas. 32 39 47 31

FIGURA 6. Representao esquemtica do efeito relaxante do linalol em contraes sustentada por K80 com endotlio. 48 Figura 7. Representao esquemtica do efeito relaxante do linalol em contraes sustentada por K80 sem endotlio. 48 Figura 8. Representao esquemtica do efeito relaxante do linalol em contraes sustentada por FE (0,1mM) com endotlio. 49 Figura 9. Representao esquemtica do efeito do linalol sobre as contraes de CaCl2 na presena de K60 sem Ca2+. 49 Figura 10. Representao esquemtica do feito relaxante do linalol sobre a contrao sustentada de fenilefrina na presena de bloqueadores de canais de potssio (TEA 5mM). 50 Figura 11. Representao esquemtica do feito relaxante do linalol sobre a contrao sustentada de fenilefrina na presena de bloqueadores de canais de potssio (4-AP 3mM). 50 FIGURA 12. Mudanas mximas da presso arterial media (PA M) e da freqncia cardaca (FC) induzidas pela administrao intravenosa do linalol (1mg/kg) em ratos anestesiados antes ou depois da bivagotomia. 53 FIGURA 13. Mudanas mximas da presso arterial media (PAM) e da freqncia cardaca (FC) induzidas pela administrao intravenosa do linalol (5mg/kg) em ratos anestesiados antes ou depois da bivagotomia. 54 FIGURA 14. Mudanas mximas da presso arterial media (PAM) e da freqncia cardaca (FC) induzidas pela administrao intravenosa do linalol (10mg/kg) em ratos anestesiados antes ou depois da bivagotomia. 55 FIGURA 15. Mudanas mximas da presso arterial media (PAM) e da freqncia cardaca (FC) induzidas pela administrao intravenosa do linalol (20 mg/kg) em ratos anestesiados antes ou depois da bivagotomia. 56

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FIGURA 16. Traado representativo mostrando as alteraes bifsicas na presso arterial media (A; MAP) e a freqncia cardaca (B; FC) induzidas pela administrao intravenosa do linalol (10 mg/kg) em ratos anestesiados. 58 FIGURA 17. Efeito do linalol (1mantida por K80 mM em anis isolados de aorta de ratos com endotlio (END+). FIGURA 18. Efeito do linalol (1mantida por K80 mM em anis isolados de aortas de ratos sem endotlio (END-). 59 60

FIGURA 19. Comparao do efeito vasorrelaxante do linalol (1anis isolados de aorta de ratos pr-contridos com K80 com endotlio (END+) e sem endotlio (END-) ratos. 61 FIGURA 20. Efeito do linalol (1mantida por fenilefrina (FE 0,1 M) em anis isolados de aorta de ratos com endotlio (END +). 62 FIGURA 21. 20mM) em anis isolados de aorta de ratos mantidos em meio sem Ca2+. FIGURA 22. mM) em anis isolados de aorta mantidos em meio sem Ca2+.
2 2

(0,164

(0,1- 20 64

FIGURA 23. Efeito do linalol (1000 M) sobre a contrao induzida pelo CaCl 2 (0,1- 20 mM) em anis isolados de aorta mantidos em meio sem Ca2+. 65 FIGURA 24. Efeito do linalol (1mantida por fenilefrina (FE 0,1 M) em anis isolados de aorta de ratos com endotlio na presena de 4 AP (3 m M). 66 FIGURA 25. Efeito do linalol (1a contrao induzida e mantida por fenilefrina (FE 0,1 M) em anis isolados de aorta de ratos com endotlio na presena de 4-AP (3m M). 67

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LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

[Ca2+]i Concentrao intracelular de clcio ACh Acetilcolina AMPc 3'-5' adenosina monofosfato cclico ANOVA Anlise de Varincia AT1- Receptor de angiotensia II ATP Adenosina Trifosfato Ca2+ Clcio CaCl2 Cloreto de Clcio DAG Diacilglicerol EC50 Concentrao capaz de gerar 50% do efeito mximo END- Endtelio Vascular EGTA cido etileno-bis (-amino-etil-ter)-N,N,N,N-tetractico FHDE Fator hiperpolarizante do endotlio FE - Fenilefrina GMPc- guanosina monofosfato cclico IP3 1,4,5-trifosfatidilinositol K+ Potssio KB Krebes Hanseleit KCl Cloreto de Potssio K60 60 mM de Cloreto de Potssio K80 80mM de Cloreto de Potssio L-NAME - N -Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride MLCK Quinase cadeia leve de miosina MLCP Fosfatase de cadeia leve de miosina MLV Msculo Liso Vascular MYPT1- Miosina fosfatase subunidade alvo 1 NO xido ntrico NOS xido ntrico sintetase OEAc leo Essencial de Aniba Canelilla OEAzr leo Essencial Aniba zerumbet OECn leo Essencial de Croton nepetaefolius ORCz leo Essencial de Croton Zenhtneri OEMv leo Essencial de Mentha villosa OEOg leo Essencial Ocimum gratissimum OMS Organizao Mundial de Sade PAM Presso Arterial Mdia PIP2 Inositol Difosfato PGI2 Prostaciclinas PKC Protena quinase C PLC Fosfolipase C rMCL cadeia leve regulatria da miosina Rho Protena monomrica G Rhok- Rho-quinase ROCCs Canais de clcio operados por receptor RS Retculo Sarcoplasmtico

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SACs Canais Ativados por Estresse SERCA bomba de clcio do retculo sarcoplasmtico SOCs Canais para clcio operados por receptor UECE Universidade Estadual do Cear UFC Universidade Federal do Cear VOCCs Canais de clcio operados por voltagem 0Ca2+ - Soluo sem Cloreto de Clcio

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Sumrio

Pgina Resumo Abstract Lista de Tabelas Lista de Figuras Lista de Siglas e Abreviaturas 09 10 11 12 14

1. INTRODUO 1.1 Consideraes Gerais

18 18

1.2 Plantas Medicinais

19

1.3 Olos Essenciais e Constituintes Terpnicos

20

1.4 Sistema Cardiovascular e Constituintes Terpnicos 1.4.1 Estrutura e funo do sistema cardiovascular 1.4.2 Regulao da Presso Arterial 1.4.3 Msculo liso vascular 1.4.4 Msculo liso vascular e canais de potssio 1.4.5 Ativiadade cardiovascular de terpenos

23 23 25 27 34 36

1.5 Atividade Biolgica e Farmacolgica do Linalol

39

16

2. OBJETIVOS

42 42

2.1 Objetivo Geral

42

2.2 Objetivos Especficos

42

3. MATERIAL E MTODOS 3.1 Animais 3.2 Extrao do linalol

43 43 43

3.3 Solues e drogas

43

3.4 Experimentos In vivo

44

3.4.1 Cateterizao dos animais

44

3.4.2 Sistema de registro

45

3.4.3 Protocolos Experimentais

45

3.5 Experimentos In vitro 3.5.1 Registro da atividade contrtil e, aorta isolada 3.5.2 Protocolos Experimentais 3.6 Anlise Estatstica

46 36 47 50

17
4. RESULTADOS 4.1 Experimentos In vivo 51 51

51 Estudo dos efeitos cardiovasculares do linalol em ratos anestesiados: influncia da vagotomia bilateral.

4.2 Experimento In vitro

58

Efeito relaxante do linalol sobre a contrao sustentada e induzida por potssio em anis de artria aorta isolada de ratos. Efeito relaxante do linalol sobre a contrao sustentada e induzida por fenilefrina em anis de artria aorta isolada de ratos. Efeito Inibitrio do Linalol na Contrao Induzida por CaCl 2 na Presena de K60 em soluo 0Ca2+. Efeito relaxante do linalol sobre a contrao sustentada de fenilefrina na presena de bloqueadores de canais de potssio em artria aorta isolada de rato. 5. DISCUSSO 6. CONCLUSO REFERNCIAS

58 61 62

65 68 73 74

18
1. INTRODUO

1.1 Consideraes Gerais

De

acordo

com

Hanse

Lambert

(2007)

as

patologias

cardiovasculares tornam-se cada vez mais comuns no mundo atual, tendo uma maior prevalncia na populao idosa. Isso acontece devido a diversos fatores, dentre eles destacam-se a mudana no estilo de vida e a longevidade, alm da interferncia de fatores genticos. Conforme pesquisa realizada Organizao Mundial de Sade (OMS) em 2003 essas patologias so responsveis por 30% de mortes por ano no mundo. Em funo desses dados o sistema cardiovascular tem sido um dos principais focos de pesquisas, que buscam incessantemente por medidas curativas e at mesmo preventivas, a fim de oferecer maiores benefcios para a sociedade. Dentre esses estudos destacam-se os que tm como foco central o efeito das plantas medicinais ou produtos naturais e suas aes no sistema cardiovascular. As substncias ativas encontradas nessas plantas so responsveis pelos efeitos biolgicos e farmacolgicos nos tecidos orgnicos. Como relatado por Calixto (2000) aproximadamente 25% dos medicamentos conhecidos so originrios de plantas. No Brasil apenas 5% dos medicamentos so de origem vegetal, mesmo com a grande diversidade de plantas medicinais conhecidas nesse pas. Com isso, percebe-se que a sociedade cientfica pouco tem dado valor enorme fonte de conhecimento que as plantas e seus derivados fornecem, j que elas podem ser utilizadas no s como instrumentos farmacolgicos, mas tambm terapeuticamente findando na melhora da qualidade de vida da populao. Portanto, pesquisas neste sentido levam ao crescimento da cincia, e tambm, a busca de se tentar minimizar os efeitos lesivos das diversas patologias que

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acarretam danos ao sistema orgnicos e mais precisamente ao sistema cardiovascular.

1.2

Plantas Medicinais

As plantas, desde a antiguidade, vm sendo utilizadas pelo homem como fontes teraputicas. Isso acontece em conseqncia ao fcil acesso, baixo custo e principalmente, pelo empirismo . O estudo sobre medicamentos derivados de plantas comum em pases subdesenvolvidos, devido biodiversidade da flora e a aceitao popular (SIXEL e PECINALLI, 2005). Algumas destas plantas e seus derivados j foram investigados com o intuito de compreender suas possveis aes nos sistemas orgnicos. Estima-se que existam aproximadamente 200.000 espcies de plantas no mundo, das quais cerca de 20.000 espcies so utilizadas na medicina tradicional, entretanto, a maioria delas no foi avaliada quimicamente ou farmacologicamente (SARTORATTO et al., 2004; BERTINI et al., 2005). O Brasil conhecido mundialmente no s por ser uma potencia

economicamente emergente, mas tambm por apresentar uma flora bastante diversificada e pouco explorada pela sociedade cientfica. Conforme relatado por Dias (1996) o pais com uma das maiores variaes genticas vegetais do mundo. O Nordeste brasileiro, no foge a regra, apesar da baixa pluviosidade, uma regio formada predominantemente por vegetao da Caantiga sendo caracterizada por plantas de pequeno porte, na sua maioria arbustos, alm disso, apresenta riqueza em plantas medicinais. As plantas medicinais podem ser estudadas de duas maneiras: atravs da Farmacologia dos Produtos Naturais que leva em considerao as caractersticas bioqumicas e farmacolgicas das plantas e atravs da Etnofarmacologia que envolve um estudo de acordo com a medicina popular, ou seja, leva em considerao aspectos tnicos e culturais de uma

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determinada populao e/ou de uma dada regio que utiliza as plantas com fins teraputicos (SIXEL e PECINALLI 2005). A populao utiliza plantas medicinais para preveno ou cura de doenas na forma de chs, inalaes e/ou lambedores ou at mesmo na forma de cataplasma (MATOS, 2000). No Brasil a Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria (ANVISA) regulamenta o uso de algumas plantas medicinais nos servios de sade pblica (Tabela 1). Ressalta-se que este uso deve ter sua eficcia e segurana teraputicas comprovadas previamente por pesquisas, para que assim se possam obter os reais efeitos das plantas estudadas (MATOS, 2000).

Nome popular da planta Alho Babosa Erva doce Gengibre Hortel Maracuj Melissia

Forma de uso leo ou extrato seco Creme Gel Infuso Infuso Infuso Infuso Infuso

Indicao teraputica Hepatoproteror Queimaduras Antiespasmdico Prfilaxia de nuseas Expectorante Sedativo Sedativo e Antiespasmdico

Tabela I: Lista de plantas medicinais permitidas pela ANV ISA no Brasil e suas aes teraputicas (ANV ISA, 2000).

21
1.3 leos Essenciais e Constituintes Terpnicos

As atividades biolgicas de uma planta medicinal so influenciadas pela composio qumica do leo essencial (OE). Este ltimo pode ser extrado das flores, folhas, caules, frutos ou razes e definido como um conjunto de substncias volteis, derivada dos metabolismos secundrios, que produzem o aroma da planta. So encontrados, especialmente nas plantas labiadas, mirtceas, conferas, rutceas, laurceas e umbelferas (LAVABRE, 1993). A gnese dos OEs dada por clulas especiais, glndulas ou ductos localizados em um rgo particular ou distribudos em vrias partes da planta sendo encontrados na forma de pequenas gotas. As funes principais desses leos so de proteger as plantas de doenas e parasitas, auxiliar na polinizao alm, de ajud-las na adaptao s mudanas que acontecem no meio ambiente (LAVABRE, 1993). Segundo Simes et al. (1999) h cinco mtodos de extrao de OE so eles: enflorao, prensagem, extrao com solventes orgnicos, extrao por fludo supercrtico e extrao por arraste de vapor dgua. O mais empregado (para obteno do OE) o ltimo, devido ao baixo custo (CRAVEIRO et al., 1981). Neste processo o leo evaporado e condensado por resfriamento (CRAVEIRO et al., 1976, 1981). Bertini et al (2005) ressaltam, que a composio dos OEs sofre influncias do clima, da estao do ano, das condies geogrficas, do perodo da colheita, dos fatores genticos da espcie e da tcnica de destilao. Os OEs so substncias largamente utilizados na indstria, como aromatizantes, para preparao de perfumes, sabes, desinfetantes e cosmticos, na preparao de alimentos como doces caseiros, licores, bebidas aromticas e refrescantes, conferindo o odor caracterstico destes produtos (JACOBS, 1948; LE MOAN, 1973; CRAVEIRO et al., 1977; LE BOURHIS, 1968, 1970; ITOKAWA et al., 1980, 1981, 1988, BAKKALI et al., 2008). Alm das propriedades aromatizantes, os OEs apresentam atividades biolgicas e farmacolgicas que variam conforme seus constituintes (BAKKALI et al., 2008).

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Atualmente, alm dos OEs seus constituintes esto sendo

estudados com o objetivo de compreender qual das substncias em si responsvel pelos efeitos biolgicos conferido aos leos. Os constituintes comearam a ser isolados no final do sculo XIX, sendo o primeiro relato datado de 1833. Apesar disso, estruturas qumicas s foram determinadas partir 1958. A identificao de constituintes pode ser feita por cromatografia gs-liquido (CRAVEIRO et al., 1981). Os constituintes qumicos mais comuns dos OEs so formados por uma combinao de terpenos, fenis, aldedos alcois, steres, cetonas, nitrognio e enxofre (LAVABRE, 1993). Os terpenos so formados por unidades isoprnicas, contendo apenas hidrognio e carbono em usa estrutura. As molculas dos terpenos encontrados nos OEs possuem entre 10 a 30 tomos e so classificados confrome mostrado na tabela II:

Denominao Monoterpenos Sesquiterpenos Diterpenos Sesterpenos Triterpenos


Tabela II: Denominao dos terpenos

Nmero de Carbonos 10 tomos de carbono 15 tomos de carbono 20 tomos de carbono 25 tomos de carbono 30 tomos de carbono

Os terpenos, por sua diversidade, so bastante estudados e so capazes de produzir diversos efeitos farmacolgicos e biolgicos (LEALCARDOSO e FONTELES, 1999). Adicionalmente, os OEs so utilizados pela populao com finalidades sedativas, estomquicos, antiespasmdicos, antidiarricos

(FREISE, 1935; ITOKAWA et al., 1981; KIUCHI et al., 1992; BEZERRA, 1994), antiparasitrios, antimicrobianos, analgsicos, diurticos, hipotensores (LUZ et al., 1984; MENDONA, 1989, MENDONA et al., 1991), antimalricos (KLAYMAN, 1985), antisfilitico (MENDONA, 1989), nos tratamentos da asma,

23
das doenas respiratrias, da rinite alrgica (BEZERRA, 1994; SILVA et al., 2003), da clica menstrual, da diarria sanguinolenta, da amebase e giardase (MATOS, 1994), alm de outras aplicaes. Diversos farmacolgicas j OEs e constituintes terpnicos apresentam aes

comprovadas

cientificamente,

podendo -se

destacar:

atividades antibacteriana, pr-inflamatria, pr-nociceptiva, anti-inflamatria, antinociceptiva, analgsica, antioxidante, anticonvulsivante e moduladora contrtil do msculo esqueltico, cardaco e liso (ALBUQUERQUE et al., 1995; MAGALHES, 1997, 2002; COELHO-DE-SOUZA, 1997; COELHO-DE-SOUZA et al., 1997, 1998; SANTOS e RAO, 1997, 1998; BEZERRA et al., 2000; LEALCARDOSO et al., 2002; MADEIRA et al., 2002; C; MAGALHES et al., 1998a,b, 2003, 2004; HAJHASHEMI et al., 2004; COELHO-DE-SOUZA et al., 2005; LIMA-ACCIOLY et al., 2006; EVANGELISTA et al., 2007; BATISTA et al., 2008; SOUSA et al., 2009; PINTO et al., 2009 MELO et al., 2010; PEIXOTONEVES et al., 2010). Bakkali et al (2008) afirma que os OEs so formados por uma mistura de 20 a 60 constituintes. Os majoritrios em concentraes, em geral, so capazes de determinar os efeitos e as propriedades biolgicas. Por exemplo, o OE da Aniba rosaeodora Ducke (OEAr) rico em um monoterpeno denominado linalol que apresenta diversas aes j comprovadas. Outros constituintes merecem destaque pelos seus efeitos j comprovados

cientificamente tais como: 1,8 cineol e metil-eugenol para o OE do Croton nepetaefolius (OECn), trans-anetol e estragol para o OE do Croton zehntneri (OECz) , xido de piperitenona para o OE mentha villosa (OEMv), eugenol para o OE de Ocimum gratissimum (OEOG), 4 terpineol para o OE de Alpinia zerumbet (OEAz) e o 1-nitro-2-feniletano para o OE da Aniba canelilla (OEAc) (BERTINI et al., 2005; SARTORATTO et al., 2004; BERIC et al., 2008 e BAKKALI et al., 2008).

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1.4 Sistema Cardiovascular e Constituintes Terpnicos

1.4.1 Estrutura e funo do sistema cardiovascular

O sistema cardiovascular um dos principais sistemas responsveis pela homeostasia corporal, pois a nutrio e a remoo de escria (resduos metablicos) dos tecidos orgnicos so mantidas por ele atravs de um suprimento sanguneo adequado (BERNE et al., 2004). Segundo Berne e colaboradores (2004), um sistema composto por uma bomba propulsora de sangue, chamada de corao e pelos vasos sanguneos. O corao dividido em duas bombas em srie, composta de um trio e um ventrculo cada, sendo estes capazes de distribuir o sangue para o pulmo (circulao pulmonar) e para os demais rgos corporais (circulao sistmica). Essas duas circulaes acontecem em uma nica direo, devido existncia de estruturas formadas de tecido conjuntivo denominadas de valvas cardacas. Estas, por sua vez, esto localizadas entre as cmaras cardacas (valvas atrioventriculares), e dentro das artrias pulmonar e artica em relao aos ventrculos direito e esquerdo (valvas de semilunares), respectivamente . O fluxo de sangue que ejetado do corao em um adulto saudvel aproximadamente de 5 l/min, e resultante da soma dos volumes ejetados durante a sstole ventricular (momento em que o msculo cardaco contrai) que acontece de forma intermitente de acordo com os eventos conhecido como ciclo cardaco. Este fluxo suficiente para nutrir os sistemas corporais em condies de repouso, sendo necessrio que o sangue passe por um circuito de tubos denominados de vasos sanguneos (BERNE et al., 2004; NETTER, 2004). Os vasos sanguneos so formados por trs camadas de tecidos distintas: camada adventcia, camada mdia e camada ntima. A camada adventcia a mais externa e mais forte das trs, sendo composta de tecido

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conjuntivo denso, mas rico em componentes celulares como fibroblastos e macrfagos. A tnica mdia a mais espessa formada principalmente de tecido muscular, alm de elastina e colgeno. A camada ntima constituda por uma nica camada de clulas, o endotlio e suas fibras elsticas elas recobrem a luz do vaso, tendo contato direto com o fluxo sanguneo, encontrase dispostas longitudinalmente e imersas em substncias intracelular amorfa (BERNE et al., 2004) A aorta a principal artria conectada ao ventrculo esquerdo. A partir dela surgem as outras artrias do corpo humano. o primeiro vaso a receber o sangue, recm ejetado e com a maior quantidade de oxignio alcanada aps a recente passagem pela circulao pulmonar. O fluxo sanguneo dentro da aorta, em decorrncia a sua retrao elstica, torna-se mais contnuo sendo, tambm, responsvel pela presso diastlica e pelo fechamento da vlvula artica o que impede o retorno do sangue para a cavidade ventricular. Em uma regio chamada de leito mesentrico, a aorta comea a se ramificar para dar origem s mdias (artrias distribuidoras), pequenas artrias e as arterolas que oferecem maior resistncia ao fluxo sanguneo. O prximo caminho percorrido pelo sangue at chegar aos tecidos alvos so os capilares. Estes tubos, de pequena espessura, so responsveis pela irrigao dos tecidos propriamente dita. Em conseqncia a sua estrutura, os capilares proporcionam uma baixa velocidade ao fluxo sanguneo. Aps as trocas homeostticas impulsionadas pelos gradientes qumicos e pelas foras de Starling o sangue retorna ao corao passando pelas vnulas at chegar s veias de maiores calibres (conhecidas por apresentarem maior capacitncia) as quais desembocam no trio direito. As veias e vnulas so estruturas de baixa presso hidrosttica e possuem vlvulas que direcionam o fluxo sanguneo at seu destino, o trio direito (BERNE et al., 2004; NETTER, 2004). Como se pode perceber h uma mudana na constituio das estruturas vasculares, conforme estes vasos se afastam da bomba propulsora, so submissos ao controle do sistema nervoso central e local, alm de

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sofrerem interferncias diretas de hormnios, nervos autonmicos, e de uma variedade de drogas (BERNE et al., 2004). O controle local acontece em decorrncia presena do msculo liso vascular (MLV) que d aos vasos sanguneos a capacidade de alterar seu dimetro conforme a necessidade corporal. Cabe ressaltar que este sistema de vasos sanguneos e seus controles so fundamentais para o controle da presso arterial mdia e esta para a homeostasia.

1.4.2 Regulao da presso arterial

Presso arterial, conforme detalhado por Berne e colaboradores (2004), a fora que o fluxo sanguneo exerce sobre as paredes dos vasos sanguneos. Para tentar manter a presso em seus nveis fisiolgicos o organismo faz uso de diversos mecanismos que sero descritos a seguir. O equilbrio da presso arterial mdia (PAM) mantido pela regulao permanente entre o dbito cardaco e a resistncia vascular perifrica (KATZUNG, 2003). Esta regulao deve ocorrer em faixas temporais diferentes, ou seja, respostas orgnicas acontecem em diferentes tempos (curto, mdio e longo prazos) que se unem para ajustar os nveis pressricos (GUYTON, 2006). Os barorreceptores so responsveis pelas respostas rpidas (reflexos) s variaes de presso. Eles esto localizados em pontos estratgicos (devido sua alta irrigao sangunea), precisamente no arco artico e seio carotdeo. So estruturas sensveis s eventuais alteraes na presso. (BERNE, et al., 2004 e GUYTON, 2006). Quando estes receptores especiais so estimulados, os impulsos originados neles so emitidos at o ncleo do trato solitrio, no bulbo, cuja estimulao pro voca reduo da PAM atravs do sistema nervoso autnomo. Como por exemplo, em casos de aumento da PAM, a frequncia de impulsos nervosos emitidos pelos

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barorreceptores, ser maior e causar, por conseguinte, vasodilatao, inibio cardaca e reduo da presso arterial (BERNE, et al., 2004). Em mdio prazo, tem-se como principal evento a liberao de renina pelas clulas justaglomerulares dos rins. Esta enzima chega circulao e catalisa a quebra do angiotensinognio, que produzido no fgado, em angiotensina I, que, por sua vez, atravs da lise de sua molcula pela enzima conversora de angiotensina, forma um potente vasoconstritor denominado de angiotensina II (BERNE, et al., 2004 e GUYTON,2006). Este sistema reninaangiotensina normalmente acionado quando h reduo dos nveis pressricos e refora as aes do barorreflexo. Convm salientar que os vos sanguneos que ajudam a controlar os nveis pressricos o fazem atravs do mecanismo conhecido como auto-regulao que dividido em: endotelial, metablico e miognico. O primeiro feito por substncia liberados pelo endotlio vascular, como xido ntrico e fator relaxante derivado pelo endotlio que atuam nos vasos sanguneos (CARVALHO et al., 2001; STANKEVICIUS, 2003). O controle metablico governado conforme a demanda e /ou necessidade de um rgo, ou seja, respostas vasodilatadoras ou vasoconstritoras so efetuadas conforme o catabolismo ou anabolismo dos tecidos corporais (BERNE, 1980). O controle miognico outro mecanismo essencial para o controle do fluxo sanguneo. Este mecanismo explica como o MLV capaz de contrair ou relaxar conforme as alteraes na presso transmural (BERNE, et al., 2004). Por esta razo o MLV torna-se indispensvel no controle da resistncia perifrica total, do tnus arterial e venoso, bem como na distribuio do fluxo sanguneo corporal. Enfatizando o que foi descrito por Webb e Hilgers (2005), o MLV apresenta clulas altamente especializadas contendo canais inicos e protenas contrteis e reguladoras responsveis pe los processos de contrao relaxamento, resultando em um equilbrio das necessidades orgnicas.

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1.4.3 Msculo liso vascular

msculo

liso

vascular

(MLV)

composto

por

clulas

histologicamente mononucleadas com formato fusiforme. Conforme o vaso e a estrutura por ele irrigada, o arranjo de suas clulas varia entre helicoidal ou circular. Este ltimo e mais comum arranjo o que provoca a reduo do lmen do vaso durante o processo de contrao (ou seja, atravs desta disposio celular o MLV contra de maneira simultnea) (BERNE et al.,2004). Na luz vascular encontram-se as clulas endoteliais que se projetam para o interior do MLV (junes mioendoteliais) permitindo assim, a transferncia de ons entre si e explicando a interao entre ambas as estruturas (BERNE et al.,2004; FLTOU e VANHOUTTE, 2006). O MLV participa do controle da resistncia perifrica total e de extrema importncia para que os vasos sanguneos apresentem um tnus (estado contrado do MLV que influenciado pela mnima concentrao de Ca2+ no interior da clula muscular lisa). Este estado de semi contrao uma caracterstica vascular que permite os vasos modularem seu dimetro conforme a situao metablica (MISSIANE et al., 1991). O tnus vascular mantido por mecanismos intrnsecos do MLV, mas pode sofrer alteraes mediadas por fatores neurognicos, biognicos endcrinos, parcrinos, alm de outros sinais como frmacos ou liberao circulante de Ca 2+ (KNOT et al., 1996). Para o processo contrtil do MLV, necessria interao entre os miofilamentos (actina e miosina) e, para tanto, o aumento da concentrao de clcio intracelular ([Ca2+]i ), torna-se indispensvel (KNOT et al., 1996). Fato que necessrio acontecer de forma oposta para que o MLV relaxe, ou seja, os ons de clcio (Ca2+) devem ser retirados do mioplasma, por diversos mecanismos a fim de retornar os nveis de Ca 2+ as concentraes de repouso. O Ca2+ necessrio para a contrao provm de fontes distintas: do meio extracelular e do meio intracelular. Para acontecer o influxo destes ons a membrana celular das clulas musculares lisas composta por diversos canais

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que auxiliam nestes mecanismos, so eles: canais para Ca2+ operados por voltagem (VOCCs), canais para Ca2+ operados por receptor (ROCCs); canais operados por estoque (SOCs), e aqueles ativados por estresse mecnico (SACs) (MCFADZEAN e GIBSON, 2002). Em relao ao Ca2+ proveniente do meio interno da clula s possvel pela existncia dos estoques intracelulares como o retculo sarcoplasmtico (RS), que mesmo no sendo bem desenvolvido capaz de acumular diversos ons de Ca2+ participando na regulao deste on no sarcoplasma (SPERELAKIS, 1993; MCFADZEAN e GIBSON, 2002;). No msculo liso, os principais canais para Ca2+ do tipo VOCCs so os canais lentos ou do tipo L, caracterizados pela alta seletividade este on (KNOT et al., 1996). Quando acontece uma despolarizao da membrana e a consequente abertura desses canais, tem-se o aumento da [Ca2+]i com o desenvolvimento de contrao e fora muscular, pelo deslizamento entre as protenas contrteis (actina e miosina). Este processo conhecido como acoplamento eletromecnico (Figura 1). A outra forma de promover a contrao atravs da sinalizao do Ca2+, no necessita de uma despolarizao e conhecido como acoplamento farmacomecnico que pode ser provocado por vrios agentes que elevam o Ca2+ no interior da clula muscular lisa (Figura 1) (HERMSMEYER et al., 1988; REMBOLD, 1992; WEBB, 2003).

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Figura 1 Acoplamento eletromecnico e farmacomecnico do MLV. PIP2 (inositol difosfato) rMLC (cadeia leve regulatria da miosina) Adaptado de: Webb, 2003.

Conforme referido acima, o acoplamento eletromecnico depende de uma despolarizao da membrana que deve ser suficiente para ultrapassar o limiar de excitabilidade, gerando um potencial de ao (BERNE et al., 2004, HERMSMEYER et al., 1988; MCFADZEAN e GIBSON, 2002). A propagao do potencial de ao ocorre atravs dos canais juncionais (gap junctions), acarretando na ativao dos diversos canais inicos e catinicos, promovendo o influxo de Ca2+ para o interior da clula o que resulta na contrao da musculatura lisa (REMBOLD, 1992; WEBB, 2003). Este mesmo mecanismo pode ser intensificado pela liberao de mais Ca2+ do RS atravs dos receptores de rianodina, presente nesta estrutura. Os receptores de rianodina so compostos por estruturas tetramricas com um grande domnio citoslico e dois segmentos transmembrana -helicoidal (KATZ, 1996). Quando se trata do acoplamento farmacomecnico imprescindvel a ao de um agonista que se liga a um receptor acoplado protena G heterotrmerica. A subunidade da protena G, ativa a fosfolipase C (FLC),

uma enzima presente na membrana plasmtica que promove a formao de

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dois segundos mensageiros: o trifosfato de inositol (IP 3) e o diacilglicerol (DAG), atravs da clivagem do inositol difosfato (PIP 2) (Figura 1). O IP3 tem uma funo especfica de ligar-se a receptores presentes no RS o que resultar no extravasamento de Ca2+ para o citosol atravs dos receptores de rianodina (WEBB, 2003). Isso acarreta na contrao muscular e alterao da fora contrtil (REMBOLD, 1992). O DAG juntamente com o Ca2+ por sua vez responsvel pela ativao da protena quinase C (PKC) que proporciona diversas aes dependendo do msculo liso (Figura 1) (WEBB, 2003). Ao aumentar a [Ca2+]i do MLV, por qualquer que seja a via de sinalizao, inicia-se a contrao muscular. O passo primordial para contrao a ligao de quatro ons de Ca 2+ com protena calmodulina (peso molecular de 16.700 kDa), que representa cerca de 1% de todas as protenas celulares (BERNE et al., 2004). O complexo formado entre o Ca+ e a calmodulina estimula a quinase C dependente de calmodulina que atua fosforilando e assim ativando a enzima quinase de cadeia leve de miosina (Figura 1) (MLCK). A MLCK, ento, expe seu stio cataltico e fosforila o aminocido Ser19 da cadeia leve regulatria da miosina (rMCL). Ademais, a MLCK promove a ativao da ATPase da miosina necessria para energizar a miosina, resultando no deslizamento entre os filamentos finos e grossos e

desenvolvendo assim, o ciclos das pontes cruzadas, a gerao de fora e encurtamento no MLV (Figura 1) (REMBOLD, 1992). Alm da contrao dependente de Ca 2+ h outra forma de contrao do MLV em que necessrio um aumento da sensibilizao do aparato contrtil ao Ca2+, ou seja, aumenta-se a afinidade dos filamentos grossos e finos para uma dada [Ca2+]. Esta sensibilizao o estgio em que uma contrao maior produzida por uma dada [Ca2+]i (SOMYLO e SOMYLO, 1994), podendo a mesma ser positiva ou negativa dependendo da via estimulada (KIZUB et al., 2010). Por exemplo, a sensibilizao ser maior quando um pequeno aumento da [Ca 2+] i produz uma mxima fosforilao da rMCL (REMBOLD, 1992). A fosforilao da rMCL, alm de ser regulada pela MLCK, tambm sofre interferncia de uma fosfatase denominada de fosfatase da cadeia leve

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de miosina (MCLP) (Figura 1), que responsvel pela retirada do fosfato de alta energia que mantm o MLV no seu estgio contrado (ITO et al., 2004). Destarte, afirma-se que o balano entre a MLCK e a MCLP so imperativos para o estado de fosforilao da rMCL. A MCLP apresenta trs subunidades, uma subunidade cataltica com peso de 38 kDa (PP1c) e duas regulatrias uma com peso de 110kDa, chamada de miosina fosfatase subunidade alvo 1 (MYPT1) e outra de 20 kDa a pequena subunidade regulatria M20 (WEBB, 2003 e ITO et al., 2004). Quando se tem a fosforilao da MCLP inibi-se sua atividade enzimtica, o que provoca a manuteno do estado contrado do msculo (WEBB, 2003). Algumas hipteses so estudadas para a atuao da MCLP e a sensibilizao dos miofilamentos. Uma delas a ativao da protena monomrica G (Rho) dependente de Rho-quinase (RhoK) (Figura 2). Estes mecanismos promovem a fosforilazao da CPI-17 (substrato da RhoK) que por sua vez, se liga a subunidade PP1c da MCLP o que prolonga a contrao e a fora do msculo liso (KIMURA, et. al., 1996). A MCLP a principal protena inibitria responsvel pelo

relaxamento da musculatura lisa vascular. A inativao desta protena gera como conseqncia a manuteno do acoplamento entre os filamentos de miosina e actina (KIZUB et al. 2010), o que pode acontecer atravs da ao da RhoK e a PCK.

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Figura 2 Representao da ativao da protena monomrica G. Rho A (prot ena monomrica G) ROCK (Rho-quinase).Adaptado de: Webb, 2003.

Quanto ao relaxamento do MLV h uma perda de fora contrtil e o retorno do msculo s condies basais. Para tanto, fundamental a reduo da [Ca2+]i e a retirada do fosfato de alta energia da rMLC. Para que este ltimo evento acontea precisa-se da ativao da MCLP (SOMLYO e SOMLYO, 2000) (Figura 3). A diminuio da [Ca2+]i resultado da combinao de alguns fatores como: inativao das correntes de Ca 2+, ativao da bomba Ca2+ATPase do RS, efluxo de Ca 2+ para o meio extracelular pela bomba de Ca2+ presente na membrana celular e por fim, pelo trocador de sdio e Ca 2+ (SPERELAKIS, 1993). Com isso, afirma-se que o relaxamento vascular pode ser promovido por inibio dos VOCCs por voltagem que provocam hiperpolarizao da membrana ou atravs de agentes farmacolgicos que promovem o aumento de adenosina monofosfato cclico (AMPc) e guanosina monofosfato cclico (GMPc), ou ainda reduzir a sensibilidade do aparato contrtil ao on Ca2+

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(REMBOLD, 1992). No mais, como descrito por Mcfadzean e Gibson (2002), substncias como: neurotransmissores ou hormnios que provoquem

hiperpolarizao da membrana da clula muscular lisa fechando os canais para Ca2+, promovem dilatao vascular.

Figura 3 Representao esquemtica do relaxamento do MLV. VOCC (canal de Ca 2+ operados por voltagem) ROCC (canal de Ca operados por recept or) Ca,Mg-A TPase (bomba + 2+ de clcio) Na / Ca (troc ador sdio-clcio). MLC (cadeia leve de miosina) Adaptado de: Webb, 2003.

2+

Atravs do GMPc o relaxamento no msculo liso acontece por abertura de canais para K+ o que leva a hiperpolarizao celular e posteriormente a reduo do influxo de Ca2+ (ROBERTSON et al., 1993). Pode atuar, tambm, ativando a bomba de Ca 2+-ATPase no RS (SERCA) ou aumentando a atividade do trocador Na 2+ /Ca2+ presente na membrana citoplasmtica, tendo como consequncia a diminuio do Ca2+ intracelular (REMBOLD, 1992; BERNE et al., 2004). Alm do mais, o GMPc capaz de reduzir a concentrao de IP 3 por inibir a FLC. Quando se trata do acrscimo do AMPc sugere-se que o relaxamento do MLV tambm dado pela reduo da [Ca2+] i por atuao nos

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canais de Ca2+. Alm disso, h estudos que mostram a atuao do AMPc nos canais de K + ativados por Ca2+ ou ATP e/ou pela fosforilao da MLCK (REMBOLD, 1992). O endotlio vascular e os canais de potssio so essenciais, essenciais no s para a manuteno do tnus, mas tambm para o relaxamento vascular. O primeiro encontra-se na luz do vaso sanguneo e apresenta-se como uma camada de clulas delgadas e atuante no funcionamento vascular, sendo fonte de uma srie de substncias capazes de promover relaxamento e contrao do MLV. Desta forma, o endotlio atua como agente protetor contra desenvolvimento de leses nos vasos sanguneos (CARVALHO et al., 2001). Como relatado por KATZUNG (2003) o endotlio sintetiza xido ntrico (NO), prostaciclinas (PGI2 ) e o fator hiperpolarizante derivado do endotlio (FHDE), como II e agentes vasodilatadores, e A2 como as

endotelinas,

angiotensina

tromboxano

substncias

vasoconstritoras. Fisiologicamente, h o equilbrio entre essas substncias sendo os efeitos dilatadores mais operantes que os contraturantes, mantendo a homeostasia vascular (FLTOU e VANHOUTTE, 2006). O NO um radical livre gasoso, inorgnico e altamente difusvel, alm de ser um potente vasodilatador. formado a partir da L-arginina atravs da atuao de uma famlia de vrias isoformas de NO sintetase, o que resulta na formao da L-citrulina e NO. Atua como vasorelaxante por ativar a guanilil ciclase que resulta no aumento do GMPc que atuar inibindo a MLCK. O NO tem outra funo que a de inibir a agregao de neutrfilos ao endotlio. As PGI2 derivada da sntese dos eicosanides tm propriedades especficas, pois apresenta-se como vasodilatadoras e inibidoras da agregao plaquetria (CARVALHO et al., 2001 e STANKEVICIUS, 2003). O relaxamento dado pelas PGI2 dependente dos receptores expressos nas clulas musculares lisas que provocam. Aps sua ativao, o aumento de AMPc ativa os canais de potssio levando hiperpolarizao celular, reduzindo a [Ca2+] i diminuindo, por conseguinte, a afinidade entre os filamentos de actina e miosina (CARVALHO et al., 2001; STANKEVICIUS et al., 2003). O mesmo fato leva a vasodilatao atravs do FHDE, estando mais

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envolvido na promoo do relaxamento nos vasos de maiores resistncias do que nas grandes artrias (CARVALHO et al., 2001). As endotelinas exercem vrias aes no organismo, atravs de diversos receptores nos tecidos, destacam-se nos vasos sanguneos, corao, rins, pulmes e sistema nervoso central. Causam uma vasoconstrio dose dependente e aes inotrpicas e cronotrpicas positivas. Apresentam tambm, ao sobre os rins inibindo a excreo de sdio e gua e provocam vasocontrio no msculo liso traqueal e brnquico. Esto envolvidas na proliferao e na hipertrofia das clulas vasculares (FLTOU e VANHOUTTE, 2006). Apresentam-se sobre diferentes isoformas endotelina 1, 2 e 3, sendo a primeira o mais potente vasoconstritor (CARVALHO et al., 2001). A angiotensina II outra substncia que promove contrao do MLV. Atua, principalmente em seus receptores AT1 que encontram-se ligado protena G que ativa a FLC aumentando a concentrao de DAG e IP3 elevando a [Ca2+]i e por fim, tendo a contrao vascular. Pelo exposto, nota-se que o entendimento da fisiologia cardiovascular importante para compreenso dos avanos das pesquisas cientficas que visam ao tratamento de distrbios orgnicos como a Hipertenso Arterial Sistmica (HAS), utilizando-se, principalmente, das plantas medicinais e seus efeitos

cardioprotetores.

1.4.4 Msculo liso vascular e canais de potssio

Os canais para potssio so estruturas tetramricas que contm seis unidades transmembranas, conforme descrito por KO e colaboradores (2008). Desempenha diversos papis como: liberao de neurotransmissores,

hormnios e excitabilidade celular e na reatividade do MLV, estando diretamente relacionados com os mecanismos que envolvem estmulos vasoconstritores e vasorrelaxantes alm do prprio tnus vascular (GHATTA,

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et al., 2006). Nos vasos, existem quatro tipos de canais de potssio, sendo classificados em dependente e no dependente de voltagem. Na primeira categoria so includos os canais de potssio dependente de voltagem e os canais ativados por Ca 2+, e na segunda os canais sensveis a ATP e os retificadores de potssio. Os canais ativados por voltagem (Kv) so responsveis pelo efluxo de potssio em reposta a despolarizao da clula muscular lisa, retornando o potencial ao seu repouso, esto diretamente relacionados com a manuteno do tnus do vaso. Vrias substncias so utilizadas para o bloqueio destes canais, dentre os quais destaca-se, a 4-aminopiridina (4-AP). Quando isso acontece tem-se a manuteno da despolarizao do MLV (STANDEN e QUALE, 1998; KO et al., 2008). O segundo tipo de canais de potssio ativados por alteraes no potencial de repouso so os ativados por Ca 2+ (KCA ) os que mais predominam no MLV. Conforme exposto por Ghatta e colaboradores (2006) foram os primeiros canais de potssio a serem estudados, devido a sua influncia sobre o tnus vascular. So ativados pela [Ca2+]i e pela despolarizao, sendo responsveis pela manuteno do potencial de membrana em vasos de pequeno calibre. Por terem grande atuao no sistema cardiovascular, diversas substncias que so utilizadas para fins teraputicos apresentam ao direta sobre esses canais, tanto provocando sua abertura ou seu fechamento (GHATTA et al., 2006). Uma das principais substncias utilizadas para o bloqueio destes canais o tetraetilamnio (TEA) (KO et al., 2008). Os canais sensveis a ATP (KATP) se apresentam como uma forma de complexos octamricos e foram os primeiros a serem estudados no sistema cardiovascular, estando relacionados com diversas patologias, como por exemplo, HAS, diabetes e angina. Alguns bloqueadores so utilizados com finalidade teraputica, dentre os quais destaca-se a glibenclamida (GLY) que atua nesses canais de potssio resultando na despolarizao das clulas que, como, por exemplo no pncreas, leva ativao das clulas pancretica e

liberao de insulina pelas mesmas. Como exposto por Nelson (1990) este canais no MLV so fundamentais j que quando so ativados provocam a

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hiperpolarizao celular, inibindo a entrada de clcio provenientes do meio extracelular. Por fim, os canais de potssio retificadores (K IR) que no MLV h evidncias que eles so responsveis pela manuteno do potencial de membrana e pelo tnus em vasos de pequenos calibres (PARK et al., 2007a,b). Pelo exposto, percebe-se a importncia desses canais na manuteno do funcionamento ideal dos vasos sanguneos.

1.4.5 Atividade cardiovascular de terpenos

So poucos os dados na literatura que relatam os possveis efeitos hipotensores e/ou anti-hipertensivos dos OEs (ou de seus respectivos constituintes) e menos ainda, no que diz respeito aos seus mecanismos de ao no sistema cardiovascular. Esses estudos podem vir a corroborar com o uso das plantas aromticas, na medicina popular, para o tratamento de diversas patologias, inclusive da hipertenso arterial sistmica, cuja prevalncia alta em nossa sociedade. Na literatura internacional, existem alguns relatos a cerca dos efeitos cardiovasculares de OEs de algumas plantas aromticas abundantes na regio do Norte-Nordeste do Brasil com largo uso na medicina popular. So os OEs presentes no Croton nepetaefolius Baill. (Euphorbiaceae) (marmeleiro vermelho), Mentha x villosa Huds. (Labiatae) (menta rasteira), Alpinia zerumbet Burt e Smith (Zingiberaceae) (sin: Alpinia speciosa Schum) (colnia), Croton zehntneri Pax et Hoffm (Euphorbiaceae) (canela de cunh), Ocimum gratissimum L (Labiatae) (alfavaca) e a Aniba canelilla Mez (Lauraceae) [Syn. A. Elliptica A.C. SM., Cryptocarya canelilla Kunth] (casca-preciosa). Foi mostrado que a administrao intravenosa (i.v.) do OECn, OEMv, OEAz, OECz, OEOg e OEAc induz reduo dose-dependentes da PAM e da freqncia cardaca (FC) em ratos normotensos (LAHLOU et al., 1996a, 1999, 2001, 2002c,d, 2004c, 2005; de SIQUEIRA et al., 2006a,b) ou hipertensos, DOCA-sal (LAHLOU et al., 1996b, 2000, 2002a, 2003; INTERAMINENSE et al., 2005), acordados. Efeitos similares foram observados aps o tratamento i.v. com os principais constituintes desses OEs tais como 1,8-cineol (LAHLOU et al., 2002b), o

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metil-eugenol (LAHLOU et al., 2004a), o eugenol (LAHLOU et al., 2004b), o xido de piperitenone (LAHLOU et al., 2001, 2002a; GUEDES et al., 2002), o anetol (de SIQUEIRA et al., 2006a), o estragol (de Siqueira et al., 2006a), 4 terpineol (LAHLOU et al., 2002c, 2003) e o 1-nitro-2-feniletano (de SIQUEIRA et al., 2010; INTERAMINENSE et al., 2010), sugerindo que os efeitos cardiovasculares do OECn, OEMv, OEAz, OEAc, OECz e OEOg podem ser parcialmente atribudos as aes do(s) seu(s) respectivo(s) principal(ais) constituinte(s). Um conjunto de argumentos decorrentes de experimentos realizados tanto in vivo quanto in vitro sugere que o efeito hipotensor desses OEs assim como de seus principais constituintes resulta, em grande parte, de seus efeitos vasodilatadores diretos sobre a musculatura lisa vascular (LAHLOU et al., 1999, 2000, 2001, 2002a,b,c,d, 2003, 2004a,b,c, 2005; de SIQUEIRA et al., 2006a; INTERAMINENSE et al., 2007; MAGALHES et al., 2008; PINTO et al., 2009). Entretanto, o mecanismo envolvido na mediao da hipotenso e bradicardia induzidas pelo OECz (i.v.) em ratos normotensos difere daquele dos demais OEs estudados at hoje. De fato, estudos recentes mostraram que a hipotenso induzida pelo OECz assim como seus principais constituintes, anetol e estragol, so principalmente de origem reflexa (reflexo vago-vagal) atravs da estimulao dos receptores vaniloides (TPRV1) localizados nas fibras sensoriais vagais (de SIQUEIRA et al., 2006b). Aps sua injeo intra-arterial, o OECz foi ainda capaz de provocar uma hipotenso reflexa de origem espinhal, como foi mostrado por capsaicina (de SIQUEIRA et al., 2006b).

Tambm foi demonstrado que a injeo i.v. do 1-nitro-2-feniletano induziu uma queda de PAM e FC, bifsica: o primeiro componente (fase 1) rpido e foi caracterizado como um reflexo vago-vagal, o segundo componente (fase 2) ocorre mais tardio e parece ser decorrente de uma ao direta desse constituinte na musculatura lisa vascular. A fase 1 induzida pelo o 1-nitro-2feniletano est ausente aps injeo direta no ventrculo esquerdo,

completamente abolida pela bivagotomia ou o pr -tratamento perineural com a capsaicina, mas permaneceu inalterada pelo o pr-tratamento com o antagonista dos receptores vanilides TPRV1, capsazepina ou com o antagonista dos receptores serotoninrgicos 5-HT3, ondansetron. Em ratos normotensos acordados, a hipotenso e bradicardia (fase 1) induzida pelo 1nitro-2-feniletano foi completamente abolida pelo pr-tratamento com

metilatropina. Em preparaes articas oriundas de ratos normotensos, 1-nitro2-feniletano induziu um relaxamento, dependente da concentrao da

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contrao induzida por fenilefrina (FE) (de SIQUEIRA et al., 2010). Estes dados sugerem que o reflexo vago-vagal induzido pelo 1-nitro-2-feniletano iniciado nas aferncias vagais pulmonares e no nas cardacas. O mecanismo de transduo deste reflexo ainda no est definido, e parece no envolver a ativao dos receptores vanilides nem os receptores serotoninrgicos 5-HT3 localizados nos nervos vagais sensoriais. A fase 2 da resposta hipotensora do 1-nitro-2-feniletano parece esta mediada, pelo menos em parte, atravs de um mecanismo vasodilatador perifrico (de SIQUEIRA et al., 2010). Efeitos similares do 1-nitro-2-feniletano foram tambm observados em ratos

espontaneamente hipertensos (SHRs) segundo o mesmo mecanismo de ao daquele mencionado acima em ratos normotensos (INTERAMINENSE et al., 2010).
Quando se faz meno ao OE que extrado do OEAr pouco se sabe sobre seus efeitos biolgicos e/ou farmacolgicos e principalmente no sistema cardiovascular. Quimicamente este leo apresenta um teor muito elevado de um monoterpeno alcolico, j citado, que o linalol. No OEAr a porcentagem de linalol varia entre 74 a 96% de todo o leo, este variao acontece, como os demais OEs, em conseqncia a localidade em que encontrada planta matrix, alm da forma da coleta (ALCNTARA, YAMAGUCHI E JUNIOR-VEIGA,2010).

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1.5 Atividade Biolgica e Farmacolgica do Linalol

O linalol um constituinte encontrado alm da Aniba rosaeodora (conhecida popularmente como pau rosa) em diversas plantas presentes nas regies Norte e Nordeste do Brasil tais como: Piper crassinervium , Croton cajucara Benth e Hyssopus officinalis L. var. decumbens. O linalol um monoterpeno de extrema importncia para as indstrias de cosmticos e alimentcios, j que utilizado, como fixador de fragrncias (BAKKALI, et al., 2008). Quimicamente, o linalol, (3,7-Dimethyl-1,6-octadien-3-ol) apresentase como um monoterpeno alcolico tercirio de cadeia aberta (Figura 4) com frmula molecular C 10H18O. Possui peso molecular 154,3 com densidade 0,86 g/ml (SIGMA ALDRICH, 2003), tendo ponto de ebulio de aproximadamente 198 a 199C.

Figura 4 - Estrutura qumica do linalol. Monot erpeno alcolico tercirio de cadeia abert a e suas unidades isoprenicas Fonte: Usta et al., 2009.

Diversos estudos demonstraram que linalol um constituinte que medeia em parte a atividade antiinflamatria e antinociceptiva (BIGHETI, et al., 1999; HIRUMA-LIMA et al., 2000; PEANA et al., 2003; PEANA et al., 2004a; e BATISTA et al., 2010). Conforme descrito por Peana e colaboradores (2003 e

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2004a) a administrao do linalol induz e feito antinociceptivo e antiinflamatrio em diferentes modelos experimentais, inibindo o edema de pata pela carragenina e reduzindo a dor induzida por diferentes estmulos tais como contores, em resposta ao cido actico, placa quente e injeo de formalina. Seu efeito antinociceptivo parece envolver a transmisso glutamatrgica, dopaminrgica e opiide sem excluir a participao dos canais de potssio sensveis a ATP (PEANA et al., 2004b) nem a participao dos receptores da adenosina A1 e A2 (PEANA et al., 2006a) neste efeito. Foi mostrado que a reduo da liberao/produo do NO , em parte, responsvel pelo mecanismo molecular da atividade antinociceptiva do linalol (PEANA et al., 2006b). Este monoterpeno, quando administrado tanto por via perifrica quanto central, tambm foi responsvel pela antinocicepo em camundongos, por inibir a dor causada por glutamato, mostrando que h envolvimento dos receptores glutaminrgico, nesta ao (BATISTA et al., 2008). O linalol tambm j teve seu efeito testado na dor neuroptica causada por ligadura do nervo perifrico. Seu efeito foi de reduzir, temporariamente, a dor mecnica quando administrado por sete dias consecutivos (BERLIOCCHI et al., 2009). Apresenta tambm, efeito anestsico local inibindo neurnios do sistema nervoso central e sensorial (NARUSUYE et al., 2005). O OEAr produz diminuio na excitabilidade neuronal evidenciada pela reduo da amplitude de potencial de ao provavelmente dada pelo seu maior constituinte, o linalol, em preparao de nervo isolado de rato (de ALMEIDA et al., 2009). Afirmao confirmada por Leal-Cardoso e colaboradores (2010) em que o linalol agiu no sistema sensorial somtico bloqueando canais de sdio dependente de voltagem em nervo citico de ratos apresentando com isso, atividades anestsicas locais. O mesmo foi observado em nervos citico de rs (ZALACHORAS, et al., 2010). Re e colaboradores (2000) relataram o efeito do linalol na juno neuromuscular do diafragma. Segundo esta pesquisa o composto em questo atua reduzindo a eficcia do impulso nervoso na liberao de acetilcolina, tendo atuao no neurnio pr-sinptico, o que sugere a atuao do linalol sobre os canais dependentes de voltagens como sdio e/ou potssio na juno neuromuscular. Outros efeitos tambm foram listados para o linalol tais como: antileishmaniose (ROSA et al., 2003) e anti-microbiano, podendo ser utilizado no combate aos microorganismos causadores de infeces hospitalares, principalmente em pacientes imunocomprometidos, destacando-se neste grupo os portadores de HIV e transplantados (ALVIANO, et al., 2005). Dependendo da dose o linalol, apresenta efeitos anticonvulsivantes por ser agonista de receptores ionotrpicos de NMDA (BRUM et al., 2001).

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Alm destas propriedades apresenta aes hipnticas e hipotrmicas. Alm disso, o linalol apresentou aes sedativas, quando inalado por cerca de 1h, sem trazer comprometimento nas funes motoras de camundongos (LINCK et al., 2009). Este mesmo efeito foi evidenciado em ratos pela potencializao de tempo de sono induzido pelo pentobarbital (de ALMEIDA et al., 2009). No que se refere a toxicidade do linalol sua dose letal baixa, quando comparada a outros constituintes dos OEs, tornando-se, por este motivo, alvo de estudos para futuramente possuir aplicabilidade teraputica. As pesquisas dos efeitos txicos das substncias esto relacionadas com via de administrao, tempo, durao e frequncia da dose, o que foi demonstrado por Venncio (2006). O linalol apresentou baixa toxicidade aguda em vrios modelos experimentais e com diferentes vias de administrao (BICKERS et al., 2003) o que justifica o interesse deste constituinte em diversas reas da cincia bsica. Estudos em humanos comprovaram que a estimulao olfatria pela inalao do ch de jasmim, rico em linalol induz uma bradicardia e tem efeito sedativo sendo este constituinte responsvel por tal ao (KUDORA et al., 2005). A estimulao olfatria com o linalol em ratos anestesiados reduz a presso arterial via ativao dos receptores histaminrgicos H 3 centrais (TANIDA et al., 2006). Sabendo-se das diversas aes biolgicas do linalol, pouco se explorou sobre seus efeitos no sistema cardiovascular e menos ainda no MLV por isso a necessidade de estud-lo. Sobretudo do ponto de vista de seus mecanismos de ao sobre o MLV, abrindo espao para descoberta de novas substncias farmacologicamente ativas.

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2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral:


Estudar os efeitos cardiovasculares do linalol em ratos normotensos.

2.2 Objetivos Especficos:

Estudar os efeitos do linalol sobre a presso arterial mdia e a freqncia cardaca de ratos anestesiados; Averiguar oefeito do linalol sobre a contratilidade de preparaes de aorta isolada; Verificar a influncia do dos canais de potssio na mediao dos efeitos vasculares do linalol; Analisar a influncia do Ca2+ extracelular sobre o efeito do linalol na contratilidade vascular;

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3 MATERIAS E METDOS

3.1 Animais

Foram utilizados ratos Wistar machos, adultos normotensos provenientes do Biotrio da Universidade Federal do Cear (UFC), situado no Campus do PICI. Os ratos possuam pesos entre 250 e 350 g, foram mantidos sob condies de temperatura constante (22 2 C) com ciclo claro escuro padro (12 horas claro/12 horas escuro), gua e alimento ad libitum. Os experimentos foram realizados conforme o Guide for the Care and Use of Laboratory Animals , publicado pelo US National Institute of Health (NIH publicaes 85-23, revisado em 1996) em anlise pelo Comisso de tica para Uso de Animais da Universidade Estadual do Cear (CEUA UECE), sob o n do processo: 10244898 1.

3.2 Extrao do Linalol

O linalol que ser utilizado neste estudo foi isolado a partir do OEAr atravs de tcnicas cromatogrficas pela equipe do Prof. Dr. Jos Guilherme Soares Maia (Faculdade de Engenharia Qumica e de Alimentos, Universidade Federal do Par, Belm, PA). O grau de pureza do linalol de 99,5%.

3.3 Solues e Drogas

Para os experimentos in vitro o linalol (forma levgira) foi dissolvido em soluo de Krebs Henseleit (KB) e Tween 80 (0,5%) e homogeneizado imediatamente antes do uso. As outras substncias tais como fenilefirna (FE), Acetilcolina (ACh), dimetilsulfxido (DMSO), cido etileno glicol-bis ( -amino ter) N,N,N,N,-tetraactico (EGTA), 4-AP e TEA (Sigma Chemical Co.) foram dissolvidos em gua destilada ou em DMSO conforme as recomendaes da prpria indstria. O meio de perfuso que

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foi usado foi a soluo de KB, contendo em mM: NaCl 118,4; KCl 4,75; KH2PO4 1,18; NaHCO3 25; MgSO4 1,18; CaCl2 1.9 e glicose 5. Solues de meio de perfuso sem Ca2+ foram preparadas omitindo a adio do CaCl2 na soluo de KB com ou sem adio de EGTA 1mM. A soluo nutritiva foi mantida aereda com carbognio, temperatura de 37C e o pH ajustado para 7,4 atravs de HCl 1M ou NaOH 1M. A adio de linalol ou das outras substncias foi realizadas de forma direta no banho onde os volumes especficos foram calculados a fim de atingir as concentraes finais desejadas nas cmaras de banho para rgos isolados.

3.4 Experimento in vivo

3.4.1 Cateterizao dos animais


Os ratos foram anestesiados com injeo intraperitoneal de pentobarbital (50mg/kg, i.p.) Em seguida, dois cateteres heparinizados (125 Ul/ml em salina isotnica), foram implantados a aorta abdominal (para registro da PA e da FC), e na veia cava inferior (para administrao de drogas), atravs da artria e veia femoral esquerda, respectivamente; ambos 1 cm abaixo da artria renal, como descrito previamente (LAHLOU et al., 1990). Posteriormente, os animais alojados em gaiolas individuais receberam uma injeo intramuscular de penicilina (24000 Ul). Todos os experimentos de registro cardiovascular foram realizados 48 horas aps o procedimento cirrgico.

3.4.2 Sistema de Registro

No momento do experimento, o cateter arterial foi conectado a um transdutor de presso fisiolgica (MLT844, ADInstruments) acoplado a um polgrafo digital PowerLab (PowerLab 8/30, modelo ML870, ADInstruments, Bella Vista, NSW, Austrlia) ligado a um amplificador de sinal (Octal Bridge Amplifier, modelo ML228). A PAM foi calculada como diastlica +[(sistlica-diastlica)/3]. A FC assim como a PAM foram obtidas atravs do uso do Software Chart TM v5.5.4 com o sinal obtido do transutor.

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3.4.3 Protocolos experimentais

Para delinear as respostas cardiovasculares ao linalol foi utilizado o seguinte protocolo. Ratos foram anestesiados com pentobarbitl sdico (50mg/kg, i.p.), suplementado sempre que necessrio (15mg/kg). O animal encontrava-se em posio supina respirando espontaneamente atravs de um traquestomo. Antes de cada experimento, foi permitida a estabilizao da PAM e FC por um perodo de 15 a 20 min. Dessa forma, foram identificados os valores basais desses parmetros. As suas eventuais alteraes desses parmetros foram monitoradas por um perodo de 10 min ps-injeo. O linalol foi injetado manualmente em bolus no volume de 0,1 ml, seguido de injeo de 0,2 ml de soluo salina. Cada animal recebeu uma srie crescente de doses (1,5,10 e 20 mg/kg, n=6) atravs do cateter intravenoso e o curso temporal das alteraes de PAM e FC foi registrado, Um procedimento similiar foi realizado em outro grupo de ratos (n=7) que foram submetidos, 15 min antes, a uma bivagotomia realizada ao nvel cervical.

3.5 Experimentos In vitro

3.5.1 Registro da atividade contrtil em aorta isolada

Os animais foram sacrificados por cmara de CO 2, seguida por pesagem e dissecao. Este ltimo ocorreu mediante a inciso ventral e abertura da caixa torcica por exciso do esterno e de parte das costelas foi possvel a visualizao e retirada dos rgos intratorcicos para o acesso aorta torcica que ser transferida para uma placa de Petri com soluo nutritiva de KB, para porvindoura remoo do tecido adiposo e do tecido conectivo aderido. Aps a limpeza, a aorta foi seccionada em anis (4 a 5 mm de comprimento). Em seguida foi suspensas em banhos para rgo isolado (5 ml), contendo o meio de perfuso a 37 C (pH = 7,4), aerado continuamente com soluo

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carbognica, 95% O 2 e 5% CO 2. As preparaes de aorta foram contradas com uma tenso passiva de 1 g. Esta tenso foi registrada atravs de um transdutor de fora isomtrico atravs de fixadores de ao inoxidvel ligados a um fio de algodo e a outra extremidade a uma base fixa.

Os sinais eltricos captados pelo transdutor foram decodificados e digitalizados pelos hardwares PowerLab - Data Acquisition Systemse Quad Bridge Amp (ADInstruments). Os registros dos protocolos de contrao da musculatura lisa foram obtidos atravs do software LabChart 7 (ADInstruments) para anlise posterior (Figura 05).

Figura 5 Sistema de registro das contraes mecnicas. Foto: LAFAMULI- Laboratrio de Farmacologia do Msculo Liso- UFC, 2010.

Aps a montagem, as preparaes foram submetidas a um perodo de estabilizao (cerca de 60 minutos) tempo necessrio para adaptao da preparao s novas condies. Ao trmino deste perodo foi considerado que a preparao atingiu seu novo tnus basal.

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3.5.2 Protocolos experimentais

Para todos os experimentos, descritos a seguir, existiram preparaes controles e experimentais que foram submetidas aos mesmos protocolos e condies. Os experimentos foram iniciados com uma contrao controle induzida pela adio de 60mM de cloreto de potssio (K60) ao banho com o intuito de averiguar a viabilidade do tecido. Quando duas contraes controles, sucessivas, mostraram amplitudes similares, a preparao foi considerada vivel para o experimento. Para avaliar a integridade do endotlio, cada preparao foi pr-contrada por FE (0,1 M) e quando a amplitude da contrao estava estvel a preparao foi exposta Ach na concentrao de 1M. O endotlio foi considerado intacto se a ACh administrada fosse capaz de induzir um relaxamento da musculatura lisa da aorta maior que 50% da contrao, preexistente. Para avaliar se a atividade vasorrelaxante do linalol foi dependente do endotlio, os experimentos foram realizados em anis sem endotlio, que foi removido mecanicamente, imediatamente aps disseco, por uma suave frico do lmen da aorta com um fio de ao inoxidvel. A ausncia do efeito vasorrelaxante induzido pela ACh foi tomada como uma evidncia de que a preparao foi efetivamente desnudada do endotlio. Srie 1: Nesta srie, os efeitos relaxantes de concentraes crescentes do linalol (1-5000 M) sobre a contrao mantida por K+ (80 mM) ou FE (0,1 M) foram estudadas (figuras 6, 7 e 8), em preparaes de aorta com ou sem endotlio mantidas em com Ca2+ nos experimentos realizados com o K + e com endotlio quando o agente contraturante foi a FE. O efeito do veculo tambm foi analisado. O linalol e veculo foram adicionados de forma cumulativa.

Figura 6 Representao esquemtica do efeito relax ante do linalol em contra es sustentadas por K80 com endotlio.

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Figura 7 Representao esquemtica do efeito relax ante do linalol em contra es sustentadas por K80 sem endotlio.

Figura 8 Representao esquemtica do efeito relax ante do linalol em contra es sustentadas por FE (0,1 M) com endotlio.

Srie 2: Aps verificar a responsividade do tecido pela induo de uma contrao por K60, a preparao de anis de aorta foi mantida em uma soluo de KB sem CaCl2 e com quelante de Ca2+ (EGTA 1mM). Em seguida, a preparao foi lavada com soluo de KB sem Ca2+ e depois foi acrescentado ao banho, K60 e realizada uma curva concentrao-efeito ao Ca2+ pela adio de concentraes crescentes e cumulativas de CaCl2 (0,1; 0,3; 1; 3; 10 e 20 mM). Esta curva foi tomada como controle. A preparao ento foi novamente lavada com KB com Ca2+ e EGTA (1 m M) e uma nova curva concentrao-efeito para o Ca2 + foi realizada, porm na presena de 100, 300 ou 1000 de linalol. As curvas concentrao-efeito obtidas em presena

de linalol foram quantificadas e comparadas com a curva controle, ou seja, sem a presena do constituinte em estudo (figura 9).

Figura 9 Representao esquemtica do efeito do linalol sobre as contraes de CaCl 2 na 2+ presena de K60 sem Ca .

Srie 3: Nesta serie, o papel dos canais de potssio na mediao dos efeitos vasorrelaxantes do linalol foi investigado. Para isso, os efeitos relaxantes do linalol (1-5000 M) foram estudados em preparaes incubados 30 min precedentes

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adio do linalol com um dos seguintes inibidores dos canais de potssio : TEA (5 mM) (figura 10) e 4 AP (3 m M) (figura 11). As mudanas no tnus vascular foram expressas como porcentagem da contrao induzida por FE.

Figura 10 Representao esquemtica do efeito do linalol sobre a cont rao sustent ada induzida por FE na presen a de bloqueadores de canais de potssias (TEA 5mM).

Figura 11 Representao esquemtica do efeito do linalol sobre a cont rao sustent ada induzida por FE na presen a de bloqueadores de canais de potssias (4-AP 3mM)..

3.6 Anlise Estatstica

Todos os resultados foram expressos como mdia erro padro da mdia (EPM, n = 3-6 por grupo). O valor da EC 50 (mdia geomtrica 95% intervalo de confiana), definido como a concentrao do linalol (M) requerida para produzir 50% da reduo da resposta mxima da contrao induzida por K+ (ou FE), foi utilizado para avaliar a sensibilidade vascular para este monoterpeno. A significncia (P < 0,05) dos resultados foi determinada pelo uso de testes t de Student (pareado ou no pareado) e anlise de varincia a uma via (concentraes ou grupos) ou duas vias (tratamento x doses ou tratamento x concentraes), seguida pelo teste de contraste (Dunnett or Holm-Sidak) quando apropriado. Os dados foram analisados atravs do programa Sigma Plot 10 e o Sigma Stat 3,5.

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4. RESULTADOS

4.1 Experimentos in vivo

Estudo dos efeitos cardiovasculares do linalol em ratos anestesiados: influncia da vagotomia bilateral

Em ambos os grupos, intactos e bivagotomizados, os nveis basais da PAM e FC, antes das injees de qualquer uma das doses do linalol, permaneceram estveis durante todo o perodo do registro (P > 0,05; ANOVA uma via). Portanto, os valores mdios da PAM e da FC basais em ratos anestesiados foram 108,2 6,2 mmHg e 368 15 batimentos/min (bpm), respectivamente (n = 13 ratos). Em ratos intactos, injees intravenosas de doses crescentes do linalol (1, 5, 10 e 20 mg/kg) induziram uma hipotenso e bradicardia (fase 2) dose-dependentes (P < 0,01; ANOVA a uma via) que se tornaram significativas (P < 0,01, teste t de Student pareado) partir de 1 (Figura 12) e 5 (Figura 13) mg/kg, respectivamente. Apenas nas doses de 10 (Figura 14) e 20 mg/kg (Figura 15), as respostas hipotensoras e

bradicardizantes do LIN foram bifsicas (Figura. 16). O primeiro componente (fase 1) foi rpido com um tempo de latncia oscilando entre 1,4-2,7 segundos, j o segundo componente (fase 2) ocorre mais tardiamente com um tempo de latncia oscilando entre 4,8-11,1 segundos. A tabela 1 mostra os valores mdios do tempo de latncia, em segundos, para a induo dos efeitos hipotensores e bradicardizantes (fases 1 e 2) do linalol nas doses estudadas em ratos intactos ou submetidos bivagotomia cervical. Vale salientar que em ratos intactos, o tempo de latncia da fase 2 para hipotenso e bradicardia similar quele registrado em ratos bivagotomizados (6,1-13,3 segundos).

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Na dose de 10 mg/kg, a PAM e FC permaneceram

significativamente (P < 0,05, teste de Dunnett) reduzidos a 1 (37,37 4,65 e 16,55 3,63%, respectivamente), 3 (-31,23 6,17 e -16,18 3,21%, respectivamente) e 5 (-16,20 4,72 e -12,79 2,96%, respectivamente) min aps da administrao. J na dose de 20 mg/kg, a PAM e FC permaneceram significativamente (P < 0,05, teste de Dunnett) reduzidos a 1 (-59,11 3,34 e 31,36 3,01%, respectivamente), 3 (-49,04 9,08 e -30,54 4,06%, respectivamente), 5 (-35,91 10,05 e -30,78 8,38%, respectivamente) e 10 (18,62 5,81 e -15,31 2,16%, respectivamente) min aps da administrao. Em ratos bivagotomizados, injees intravenosas de doses

crescentes do linalol (1, 5, 10 e 20 mg/kg) induziram uma hipotenso e bradicardia (fase 2) dose-dependentes (P < 0.01, ANOVA a uma via) que se tornam significativas tambm nas doses de 1 (Figura 12) e 5 (Figura 13) mg/kg, respectivamente. Entretanto, a fase 1, para hipotenso e bradicardia, induzidas pelo linalol nas doses de 10 (Figura 14) e 20 mg/kg (Figura 15) foi complemente abolida (P < 0,01, teste t de Student pareado) em ratos bivagotomizados. Isto no foi verificado para a fase 2.

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Figura 12: Mudanas mximas da presso arterial media (PAM) e da freqncia cardaca (FC) induzidas pela administrao int ravenosa do linalol (1 mg/kg) em rat os anestesiados antes ou depois da bivagotomia. Os dados (media EPM) foram expressos em porcentagem dos valores basais (n = 6-7 ratos por grupo). *P < 0, 05 pelo o teste t de Student pareado vs. os valores basais.

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Figura 13: Mudanas mximas da presso arterial media (PAM) e da freqncia cardaca (FC) induzidas pela administrao int ravenosa do linalol (5 mg/kg) em rat os anestesiados antes ou depois da bivagotomia. Os dados (media EPM) foram expressos em porcentagem dos valores basais (n = 6-7 ratos por grupo). *P < 0, 05 pelo o teste t de Student pareado vs. os valores basais.

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Figura 14: Mudanas mximas da presso arterial media (PAM) e da freqncia cardaca (FC) induzidas pela administrao intravenosa do linalol (10 mg/kg) em ratos anestesiados antes ou depois da bivagotomia. A fase 1 da hipotenso e bradicardia do linalol foi # completamente abolida ( P < 0,01, teste t de Student pareado) pela bivagotomia. Os dados (media EPM) foram expressos em porcentagem dos valores basais (n = 6-7 ratos por grupo). *P < 0,05, **P < 0,01 pelo o teste t de Student pareado vs. os valores basais.

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Figura 15: Mudanas mximas da presso arterial media (PAM) e da freqncia cardaca (FC) induzidas pela administrao intravenosa do linalol (20 mg/kg) em ratos anestesiados antes ou depois da bivagotomia. A fase 1 da hipotenso e bradicardia do linalol foi # completamente abolida ( P < 0,01, teste t de Student pareado) pela bivagotomia. Os dados (media EPM) foram expressos em porcentagem dos valores basais (n = 6-7 ratos por grupo). *P < 0,05, **P < 0,01 pelo o teste t de Student pareado vs. os valor es basais.

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Doses do LIN 1 (mg/kg, i.v.) Ratos intactos Fase 1 Hipotenso Bradicardia Fase 2 Hipotenso Bradicardia Ratos submetidos bivagotomia Fase 1 Hipotenso Bradicardia Fase 2 Hipotenso Bradicardia 7,50 0,38 6,14 0,28 9,43 0,35 7,64 0,40 11,07 0,43 8,57 0,48 13,29 0,31 10,71 0,61 AUSENTE AUSENTE AUSENTE AUSENTE AUSENTE AUSENTE AUSENTE AUSENTE 5,87 0,15 4,83 0,16 8,46 0,60 6,21 0,57 10,18 0,50 7,28 0,33 11,13 0,47 7,41 0,49 AUSENTE AUSENTE AUSENTE AUSENTE 2,75 0,10 2,06 0,21 1,82 0,06 1,36 0,49 5 10 20

Tabela III: Valores mdios do tempo de latncia (em segundos) para a induo dos efeitos hipotensores e bradicardizantes (fases 1 e 2) pelo linalol (LIN) intravenoso (i. v.) nas doses estudadas, em ratos intactos ou submetidos bivagotomia cervical. Os dados foram expressos em media EPM. (n = 6-7 ratos por grupo).

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Figura 16: Traado representativo mostrando as alteraes bifsicas na presso arterial mdia (A: PAM) e na freqncia cardaca (B: FC) induzidas pela administrao intravenosa de linalol (10mg/Kg) em ratos anestesiados. A seta indica o momento da injeo. B.p.m (batimentos por minutos.

4.2. Experimentos in vitro

Efeito relaxante do linalol sobre a contrao sustentada e induzida por potssio em anis de artria aorta isolada de ratos.

Esta srie experimental teve como finalidade estudar o efeito do linalol sobre o acoplamento eletromecnico. Nas preparaes com o endotlio intacto, o linalol (1- 5000 M, n=6) relaxou completamente a contrao induzida

60
e sustentada por K80 de maneira dependente de concentrao, um efeito que tornou significante a parir da concentrao de 100 M, (p<0,001 ANOVA, seguido de Holm-Sidak n=6) quando comparada com o controle (CTRL). O veculo utilizado para dissolver o monoterpeno foi utilizado como controle, nestas sries experimentais, em que o mesmo volume de solvente foi acrescentado ao banho substituindo o linalol. A concentrao capaz de

reverter 50% da contrao induzida por K80 (EC 50) nas preparaes com endotlio foi de 334,9 17,9 M (figuras 17 ). Todos os dados expressos foram comparados com o controle (n=3). Os efeitos da exposio ao composto foram reversveis em todas as preparaes aps uma hora de lavagem com KB.

120

100

% C o n trao K (80m M )

*
80

60

40

20 E N D + (n = 6 ) 0 C TR L EN D + ( n =3)

-2 0 1 10 100 1000 10000

L in a lo l ( M )

Figura 17: Efeito do linalol (1- 5000 M) na reverso da cont rao induzida e mantida por K (80mM) em aorta isolada de ratos com E ND. Os c rculos cheios represent am o grupo experimental (n = 6) e os crculos vaz ados o grupo controle (n = 3). Os resultados foram expressos em % da resposta mxima da contrao mdia % EPM%. n= nmero de experimentos. O s mbolo * representa significncia estatstica para p < 0,05 em relao ao + controle (A NOVA, Holm-Sidak). O eixo y representa a % da contrao do K 80 mM e o eixo x representa as concentraes aplicadas de linalol.

61
Em relao aos experimentos realizados sem a presena do endotlio vascular, percebe-se que o relaxamento produzido pelo linalol foi significante a partir da concentrao 300 M (p<0,001 ANOVA, n=7 ). Com EC 50 de 388,4 27,0 M. Controle (n=4; figura 12). Com isso, afirma-se que no houve diferenas significativas entre as EC50 das preparaes com e sem endotlio (figura 13).

120 100

% C o n trao K (80m M )

80 60 40 20 0 -2 0 -4 0 1 10 100 E N D - (n = 7 ) C T R L E N D - (n = 4 )

1000

10000

L in a lo l ( M )

Figura 18: Efeito do linalol (1- 5000 M) na reverso da cont rao induzida e mantida por K (80mM) em aorta isolada de ratos sem E ND. Os quadrados cheios representam o grupo experimental (n = 7) e os quadrados vazados o grupo controle (n = 4). Os resultados foram expressos em % da resposta mxima da contrao mdia % EPM%. n= nmero de experimentos. O s mbolo * representa significncia estatstica para p < 0,05 em relao ao + controle (A NOVA, Holm-Sidak). O eixo y representa a % da contrao do K 80 mM e o eixo x representa as concentraes aplicadas de linalol.

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120

100

% C o n trao K (80m M )

* *
80

60

40 E N D + (n = 6 ) 20 C TR L EN D + ( n =3) E N D - (n = 7 ) C T R L E N D - (n = 4 ) 0

-2 0 1 10 100 1000 10000

L in a lo l ( M )

Figura 19: Efeito do linalol (1- 5000 M) na reverso da cont rao induzida e mantida por K (80mM) em aorta is olada de ratos com e sem E ND. Os crculos cheios representam o grupo experimental (n = 6) e os crculos vazados o grupo c ontrole (n = 3). J os quadrados cheios representam o grupo experimental (n = 7) e os quadrados vazados o grupo controle (n = 4). Os resultados foram expressos em % da resposta mxima da c ontrao mdia % EPM%. n= nmero de experiment os. O smbolo * representa significncia estatstica para p < 0,05 em + relao ao controle (A NOVA, Holm-Sidak). O eixo y represent a a % da contra o do K 80 mM e o eixo x represent a as concentraes aplicadas de linalol.

Efeito relaxante do linalol sobre a contrao sustentada de fenilefrina em artria isoloda de ratos.

O linalol tambm foi capaz de reverter contrao produzida por fenilefrina (0,1 M). Este constituinte foi adicionado de forma cumulativa sobre o plat da contrao de fenilefrina (1 -5000 M) (figura 13). O relaxamento obtido M (p<0,05; two way ANOVA seguido de Holm-Sidak (n=4).

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120

100

% C o n trao F E (0,1 M )

80

*
60

40

E N D + (n = 4 ) C T R L E N D + (n = 3 )

20

-2 0 0 ,1 1 10 100 1000 10000

L in a lo l ( M )

Figura 20: Efeito do linalol (1- 5000 M ) na reverso da contrao induzida e mantida por FE (0,1 M) em aorta isolada de ratos com endotlio. Os c rculos cheios represent am o grupo experimental (n = 4) e os crculos vaz ados o grupo controle (n = 3). Os resultados foram expressos em % da resposta mxima da contrao mdia % EPM%. n= nmero de experimentos. O s mbolo * representa significncia estatstica para p < 0,05 em relao ao controle ( ANO VA seguido de Holm-Sidak). O eixo y representa a % da contrao do FE 0,1 M e o eixo x representa as concentraes aplicadas de linalol.

Efeito Inibitrio do Linalol na Contrao Induzida por CaCl 2 na Presena de K60 em soluo 0Ca2+ .

A fim de avaliar o efeito do LIN sobre os VOCCs, contraes foram induzidas por influxo de Ca2+ em aorta isolada despolarizada por soluo K60. Inicialmente, segmentos de aorta com endotlio intacto foram incubados em uma soluo KB sem Ca2+ (0Ca2+) e, em seguida, concentraes cumulativas e crescentes de CaCl2 (0,1 20 mM) foram adicionadas ao banho para promover uma contrao. Logo depois, as preparaes de aorta foram submetidas novamente

64
a uma curva concentrao-efeito de CaCl2, porm em presena do linalol (100, 300 ou 1000 M) adicionado previamente. A contrao evocada por CaCl2 (0,120 mM) foi dependente de concentrao e se tornou significante a partir da concentrao de 0,5 mM (P < 0,05, ANOVA a uma via seguido de Dunnett) Sua amplitude mxima foi alcanada na concentrao de 20 mM. Em presena de 100 M (n = 3) de linalol,a tenso mxima alcanada por 20 mM de CaCl2 foi reduzida de forma no significativa (P > 0,05, ANOVA a duas vias seguido de Holm -Sidak) para 81,71 10,59 % do seu controle (1,48 0,23 g). A contrao se tornou significante a partir da concentrao de 1 mM (P < 0,05, ANOVA a uma via seguido de Dunnett; (figura 21) . Entretanto, as concentraes de 300 e 1000 M de linalol foram capazes de reduzir de forma estatisticamente significante (p < 0,05, ANOVA a duas vias seguido de Holm-Sidak) a amplitude mxima da curva de CaCl2. Em preparaes expostas a 300 M (n = 5) de linalol, a contrao foi reduzida para 78,38 3,64% do controle (1,54 0,07 g) e tornou-se significativa a partir da concentrao de 3 mM (P < 0,05, ANOVA on ranks seguida de Dunnett; (figura 22). concentrao de 1000 M (n = 5) de linalol induziu uma reduo para 34,37 8,29% do controle (1,45 0,07 g) (figura 23). Nestas condies, somente as concentraes de 10 e 20 mM de CaCl2 induziram uma contrao estatisticamente significante (P < 0,05, ANOVA a uma via seguido de Dunnett) em relao primeira concentrao 0,1 mM.

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Figura 21: Efeit o do Linalol (100 M) sobre a contrao induzida pelo CaCl2 (0,1 -20mM) em anis isolados de aorta de ratos mantidos em meio sem Ca2+. Os resultados foram expressos em % da resposta mxima EPM%. O smbolo * primeiro efeito significante para a curva controle (CNTL) e para a curva obtida na pres ena de LIN (P < 0,05, ANOVA a uma via seguido de Dunnett).

Figura 22: Efeit o do linalol (300 M) sobre a contrao induzida pelo CaCl 2 (0,1- 20 mM) em anis isolados de aorta mantidos em meio sem Ca 2+. Os resultados foram expressos em % da resposta mxima EPM. O smbolo *indica o primeiro efeit o significante: (P < 0,05, ANOVA a uma via seguido de Dunnett). O linalol desloca para direita a curva concent rao-cont rao

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induzida pelo CaCl 2 (# P < 0,05, ANOVA a duas vias em relao ao controle).

Figura 23: Efeit o do linalol (1000 M) sobre a contrao induzida pelo CaCl 2 (0,1- 20 mM) em anis isolados de aorta mantidos em meio sem Ca 2+. Os resultados foram expressos em % da resposta mxima EPM. O smbolo *indica o primeiro efeit o significante: (P < 0,05, ANOVA a uma via seguido de Dunnett). O LIN desloca para direita a curva concentrao -contrao induzida pelo CaCl 2 (# P < 0,05, ANOVA a duas vias em relao ao controle).

Efeito relaxante do linalol sobre a contrao sustentada de fenilefrina na presena de bloqueadores de canais de potssio em artria aorta isoloda de ratos.

Esta srie experimental teve como finalidade verificar a se a ao do linalol sobre os canais de potssio. Foi analisado o efeito do linalol sobre as contraes induzidas por fenilefrina (0,1 M) na presena de dois bloqueadores de canais de potssio TEA (5mM) e 4 AP (3mM). Ao se adicionar ao linalol de forma cumulativa observa-se que o mesmo induz relaxamento cuja EC50 foram de 593 42,0 M e de 1407 47,0 M na presena de TEA (5mM) (figuras (25) e 4AP (3mM) (figura 24e 25), respectivamente. Ao analisar os dados em presena de 4AP observou-se que houve diferena estatisticamente significante a partir da concentrao de 300 M (p<0,05; two way ANOVA seguido de Holm-Sidak), quando comparado ao controle.

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120

*
100

% C o n trao P H E 0,1 M

80

60

40

4 A p 3 m M (n = 6 ) C R T L (n = 4 )

20

-2 0 0 ,1 1 10 100 1000 10000

L in a lo l ( M )

Figura 24:. E feito do linalol (1- 5000 M ) na reverso da cont rao induzida e mantida por FE (0,1 M) em aorta isolada de ratos com endotlio na presena de 4AP (3mM). Os c rculos cheios representam o grupo experimental (n = 6) e os crculos vaz ados o grupo controle (n = 4). Os resultados foram expressos em % da resposta mxima da contrao mdia % EPM%. n= nmero de experimentos. O smbolo * representa significncia estatstica para p < 0,05 em relao ao controle (t wo way ANOVA seguido de Holm-Sidak). O eixo y representa a % da contrao de FE (0, 1 M) e o eixo x repres enta as concentraes aplicadas de linalol.

J em relao ao relaxamento do linalol na presena do TEA, verificou-se que no existiu diferena estatisticamente significante, quando comparada ao controle (P< 0,05, ANOVA on Ranks seguido de Dunns).

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120

% C o n trao d e p h e 0,1 m M

100

80

60

40

T E A 5 m M (n = 6 ) C R T L (n = 3 )

20

-2 0 0 ,1 1 10 100 1000 10000

L in a lo l ( M )

Figura 25: Efeito do linalol (1- 5000 M ) na reverso da contrao induzida e mantida por FE (0,1 M) em aorta is olada de ratos com endotlio na presena de TEA (5mM ). Os c rculos cheios representam o grupo experimental (n = 6) e os crculos vaz ados o grupo controle (n = 3). Os resultados foram expressos em % da resposta mxima da contrao mdia % EPM%. n= nmero de experimentos. No houve diferena significativa entre os dois grupos em estudo(p >0,05; two way ANOVA seguido de Holm-Sidak). O eixo y representa a % da contrao de FE (0,1 M) e o eixo x representa as concent raes aplicadas de linalol.

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5. DISCUSSO

Apesar do grande interesse em estudar os leos essenciais e seus constituintes, pouco mencionado, na literatura internacional, a respeito das aes do linalol sobre o sistema cardiovascular. Portanto, o presente estudo se constitui em uma contribuio literatura, tornando-se assim, relevante. Os valores mdios da PAM e FC basais em ratos anestesiados, normotensos foram da mesma ordem de grandeza daqueles previamente relatados para a mesma preparao (LAHLOU e al., 2005; de SIQUEIRA e al.,2006b; 2010). Neste estudo, a administrao i.v. de linalol nas doses de 10 e 20mg/kg induziram dois perodos de hipotenso e bradicardia. Inicialmente, uma bradicardia rpida (tempo de latncia de 1-2 segundos) ocorreu coincidindo (um tempo de incio de 2-3 segundos) com uma hipotenso arterial (fase 1), seguida de uma diminuio tardia na presso sangunea, associada a uma segunda bradicardia (fase 2). Todos estes efeitos, assim como os efeitos in vitro so parcialmente reversveis, excluindo a possibilidade de estarem relacionados a um efeito txico do linalol. Ao nosso conhecimento, a primeira vez que tais efeitos cardiovasculares resultantes com a administrao i.v. do linalol foram relatados em ratos normotensos. A fase 1, mas no a fase 2 para hipotenso e bradicardia induzidas pelo linalol nas doses de 10 e 20 mg/kg foi complemente abolida pela bivagotomia. Em ratos acordados pr-tratados com a metilatropina (um antagonista colinrgico perifrico), foi mostrado que esta fase 1 para bradicardia foi complemente abolida, enquanto a hipotenso inicial no s foi abolida, mas revertida em efeito pressor (dados no mostrados). Contudo, estes resultados levam a sugerir que a fase 1 caracterizada como um reflexo vago-vagal como foi observado recentemente com o 1 -nitro-2-feniletano, o principal constituinte do OEAc, em ratos normotensos (de SIQUEIRA et al., 2010) ou hipertensos (INTERAMINENSE, et al., 2010). Esta hiptese parece estar corroborada por resultados preliminares (n = 2) que mostram que a fase 1, mas no a fase 2 para hipotenso e bradicardia induzidas pelo LIN (10 mg/kg, i.v.), foi completamente abolida pelo pr-tratamento perineural de

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ambos nervos vagos com a capsaicina, um procedimento eficaz para dessensibilizar seletivamente as fibras sensoriais do tipo C de origem cardaca ou pulmonar projetando para o ncleo do trato solitrio (JANSC e SUCH, 1983; SCHELEGLE et al., 2000). O nico estudo em humanos mostrou que a estimulao olfatria pela inalao do ch de jasmin induz uma bradicardia e tem um efeito sedativo sobre o sistema nervoso autnomo, e que o linalol, um dos seus componentes, seria em parte responsvel por este efeito (KURODA et al., 2005). muito provvel que a fase 2 para hipotenso induzida pelo linalol seja decorrente de uma ao direta deste monoterpeno na musculatura lisa vascular, como foi observado recentemente com o 1-nitro-2-feniletano em ratos normotensos (de SIQUEIRA e al. 2010) ou hipertensos (INTERAMINENSE et al., 2010). Portanto, ns partimos para estudar os efeitos vasorrelaxantes do linaol em anis de aorta, assim como os possveis mecanismos envolvidos nestes efeitos. Confirma-se ento, juntamente com os dados encontrados in vivo que o linalol apresentou efeito miorelaxante, acrescentando mais um efeito proporcionado pelo linalol nos sistemas biolgicos. O fator primordial deste estudo em aorta isolada de rato que este monoterpeno alcolico apresenta variadas vias de aes, muitas ainda a serem investigadas. Nossos resultados mostram que o linalol apresentou efeito relaxante sobre o acoplamento eletromecnico e farmacomecnico, ou seja, apresentou efeito antiespasmdico indepentende do agente contraturante (K80 ou FE 0,1M). Em relao ao acoplamento eletromecnico sabe-se que ao se despolarizar a membrana, por exemplo, por aumentar a concentrao de potssio no meio extracelular promove-se uma desporalizao da membrana celular e conseqentemente abertura dos VOCCs o que aumentar a [Ca2+]i, resultando assim, na contrao do MLV (REMBOLD, 1992; WEBB 2003). O linalol apresentou efeito relaxante nas contraes evocadas por K80 na presena e ausncia de endotlio com IC50s

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Foi avaliada, tambm, a participao do endotlio vascular, no que concerne o acoplamento eletromecnico, e verificou-se que o linalol, como outros terpenos (PEIXOTO-NEVES et al., 2010), aparentemente, incapaz de liberar fatores relaxantes derivados do endotlio como o NO ou FHDE (CARVALHO et al., 2001), visto que no houve diferena estatstica entre o relaxamento de preparaes com o endotlio intacto e aquelas com endotlio removido. Sobre o acoplamento farmacomecncio o linalol foi capaz de relaxar a contrao induzida e mantida por FE (0,1 M), na presena do endotlio. A FE um agonista 1 -adrenrgico, que provoca a contrao vascular por ativar os ROCCs, (acoplamento farmacomecnico) (REMBOLD, 1992; WEBB 2003; SOMLYO; SOMLYO, 1968). A IC 50, nesta srie experimental foi de 695,3 linalol tem potncia maior em relaxar preparaes pr-contradas com K+ (IC 50 = 334,9 17,9), o que indica a atuao preferencial sobre VOCCs mais possivelmente os canais de Ca2+ do tipo L comumente encontrados no MLV (KNOT et al., 1996). Nossos dados corroboram com aqueles obtidos por Baccelli e colaboradores (2010). Estes autores avaliaram o efeito relaxante de diversos terpenos no MLV, inclusive do LIN sobre a contrao induzida e mantida por KCl. O linalol mostrou IC 50 de 281M. Foi sugerida outra via de investigao para avaliar se a ao do linalol seria via VOCCs que a utilizao de brio para bloquear estes tipos de canais. sabido que o brio um on que tem preferncia de atravessar a membrana prioritariamente pelos VOCCs (MURRAY & KOTLIKOFF, 1991). Outros terpenos atuam utilizando os VOCCs para produzir efeitos relaxantes em MLV como, por exemplo, o cido kaurenico (TIRAPELLI et al. , 2004). Alm disso, o linalol pode atuar para induzir seu relaxamento atravs dos canais de K+ que, quando esto abertos, provocam, geralmente, um efluxo deste on, gerando hiperpolarizao e relaxamento do MLV (KO, et al., 2008). Por estes motivos, os canais de K+ tambm foram avaliados nesta pesquisa. Estes canais so estruturas presentes na membrana da clula muscular lisa do vaso e importante para diversas funes fisiolgicas como:

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manuteno do tnus vascular, para regulao do potencial transmembrana (NELSON e QUAYLE, 1995), dimetro dos vasos, resistncia vascular, fluxo sanguneo e na presso arterial (STANDEN e QUAYLE, 1998). J foram identificados no MLV quatro tipos de canais seletivos para on potssio: os canais ativados por voltagem, ativados por Ca2+, sensveis a ATP e os retificadores (STANDEN e QUAYLE, 1998). A classificao destes canais aconteceu em consequncia existncia de uma regio que apresenta aminocidos distintos que ficou conhecida como regio P (BIGGIN, ROOSILD e CHOE, 2000). Alguns agentes tm ao bloqueadora destes canais como: TEA, 4AP, Glibenclamida, iberotoxina dentre outros (KO, et al., 2008), estes bloqueadores podem apresentar especificidades diferentes a determinados tipos de canais. O TEA, por exemplo, apresenta-se como inibidor no seletivo para os canais de potssio em altas concentraes, mas em baixas concentraes tem uma especificidade maior para canais de potssio ativados por Ca2+ (KO et al., 2008). Efeito este comprovado por COOK (1989 apud NIU. 2008) que afirma que o TEA age como bloqueador no seletivo de canais de potssio na concentrao de 10mM. J o 4 AP um bloqueador seletivo de canais de K+ dependente de voltagem, tendo suas aes conhecidas em variados tipos de msculos lisos (SATAKE, SHIBATA, SHIBATA,1996). Nossos dados apontam que LIN na presena do 4-AP substncia que tem ao seletiva nos canais de potssio ativados por voltagem, apresenta efeitos relaxantes reduzidos. Neste estudo, o monoterpeno apresentou uma potencia reduzida na presena do 4-AP j que existiu um deslocamento da curva para direita apresentando uma IC50 de 1047,0 47,0 M. Este desvio da curva para a direita refora a idia que os canais K + tem ao no relaxamento vascular e que so provavelmente, uma dos alvos utilizados pelo linalol para provocar um efeito antiespasmdico. Aps a verificao do bloqueio parcial pelo relaxamento

proporcionado pelo 4 AP, foi analisado o efeito do TEA e sua influncia na ao do linalol. Hipotetiza-se que este bloqueador no foi capaz de alterar seu desempenho de relaxamento do componente em estudo j que sua IC 50 foi de

73
593,0 42,0M. O que nos leva a indagar que o linalol tem outras fontes para relaxar o MLV. Nesta pesquisa nos propusemos a elucidar se o lianlol apresenta efeitos sobre o sistema cardiovascular e isto foi constatado. O linalol atuou reduzindo a FC e PAM. A reduo PAM aconteceu, em parte pela ao do mesmo no MLV. Ressalta-se que o linalol teve seu efeito restringido pela presena do 4AP, preconizando que ele pode atuar promovendo relaxamento, em parte, via canais de K+ ativados por voltagem. Contudo, muito falta para elucidar os mecanismos de ao do efeito relaxante do linalol em anis articos. Experimentos futuros averiguando o papel dos receptores de IP 3 do RS, assim como alterao na sensibilidade do aparato contrtil ao Ca 2+ na mediao do efeito vasorrelaxante do linalol so necessrios Mediante ao breve relato, observou-se que o linalol um constituinte derivado dos OEs encontrados em algumas das espcies de plantas presentes nas regies Norte e Nordeste do Brasil, mostrou apresentou efeitos sobre o sistema cardiovascular de ratos normotensos. Efeitos estes, hipotensores e relaxantes, por isso, a investigao ainda deve ser continuada, j que se abre espao para descoberta de novas substncias antihipertensivas. Isso autenticam o que foi descrito por Shimono et al., (2010) que substncias derivadas de plantas aromticas tem ao antihipertensiva, incluindo o linalol e inalao, efeito que foi intensificado quando este dois constituintes foram associados. Por via oral, o linalol apresentou o mesmo efeito antihipertensivo em ratos (ANJOS et al., 2008). Desta forma, percebe-se a necessidade de pesquisar osmecanismos de ao deste monoterpeno em diferentes modelos experimentais, justificando a continuao desta pesquisa.

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6. CONCLUSO

O linalol apresenta ao sobre o sistema cardiovascular de ratos normotensos; A injeo i.v. de linalol induziu dois perodos de hipotenso e bradicardia. Inicialmente, uma bradicardia rpida (tempo de latncia de 1-2 segundos) ocorreu coincidindo (um tempo de incio de 2-3 segundos) com uma hipotenso arterial (fase 1), seguida de uma diminuio tardia na presso sangunea, associada a uma segunda bradicardia (fase 2). A fase 1 foi abolida pela bivag otomia sugerindo que esta mediada pelo um reflexo vago-vagal. J a hipotenso da fase 2 parece ser devida a uma ao vasodilatadora do linalol sobre o MLV uma vez que este monoterpeno relaxou a contrao induzida por K + de maneira concentrao-dependente, um efeito independente da presena de endotlio vascular funcional. Baseado sobre o valor da IC50 do linalol no relaxamento da contrao induzida pela FE, o linalol parece atuar preferencialmente no acoplamento eletromecnico do que farmacomecnico. Os resultados apontam para uma ao vasodilatadora do linalol mediada parcialmente por inibio do efluxo de clcio pelo VOCCs e ROCCs, e parcialmente mediada por abertura de canais de potssio dependente de voltagem. Entretanto, experimentos futuros averiguando o papel dos receptores de IP 3 do RS, assim como alterao na sensibilidade do aparato contrtil ao Ca2+ na mediao do efeito vasorrelaxante do linalol, entre outros possveis mecanismos, so necessrios.

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REFRENCIAS BIBLIOGRFICAS

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