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MTODOS DE CULTIVO E QUANTIFICAO DO CRESCIMENTO MICROBIANO

METABOLISMO:

catabolismo: liberao de energia anabolismo: requerimento de energia

macronutrientes incluem: C, N, P, S, K, Ca, Mg, Fe micronutrientes incluem: elementos trao, fatores de crescimento

REQUERIMENTOS DE ENERGIA POR MICRORGANISMOS

componentes celulares: parede, membrana, ... sntese de enzimas, c. nuclicos, polissacardeos, fosfolipdeos reparos e manuteno da clula crescimento e multiplicao

acumulao de nutrientes e excreo de produtos indesejveis motilidade

OPES METABLICAS PARA OBTENO DE ENERGIA

(Madigan et al., Fig. 2.8)

Fontes de carbono:

Autotrficos: fixam carbono do CO2 A maioria dos fototrficos so autotrficos: fotoautotrficos Produo primria uso de uma fonte de energia qumica ou luz para produzir nova matria orgnica a partir do CO2 Heteretrficos: obtm carbono de compostos carbonados orgnicos pr-existentes.

procariontes podem ser: quimioautotrficos, quimioheterotrficos, fotoautotrficos e fotoheterotrficos.


Os
Os eucariontes podem quimioheterotrficos. ser: fotoautotrficos e

MEIO DE CULTURA
MEIO DE CULTURA: material nutriente preparado no laboratrio para o crescimento de microrganismos in vitro. CULTURA: microrganismos que crescem e se multiplicam no meio de cultura.
INOCULAO contaminao proposital de um meio de cultura, ou seja, a transferncia de um determinado nmero de microrganismos para um meio de cultura a fim de que estes se desenvolvam e permitam a sua identificao. TCNICAS DE SEMEADURA maneiras como a inoculao das bactrias realizada em diferentes meios

CLASSIFICAO DOS MEIOS DE CULTURA

Quanto a composio
Quanto ao estado fsico Quanto a finalidade e caractersticas

CLASSIFICAO DOS MEIOS DE CULTURA Quanto a composio

NATURAIS

So aqueles encontrados na natureza, de origem vegetal (p.ex.: pedao de batata, de abbora) ou animal (p.ex.: gema de ovo, pedao de carne)

ARTIFICIAIS

So aqueles fabricados em laboratrio, constitudo de substncias qumicas. Podem ser DEFINIDOS ou INDEFINIDOS (complexos)

CLASSIFICAO DOS MEIOS DE CULTURA Quanto ao Estado Fsico

LQUIDO

Desprovidos de gar caldo

SLIDO

Contem de 1,5% a 2,5% de gar

SEMI-SLIDO

Contem at 1,0% de gar

CLASSIFICAO DOS MEIOS DE CULTURA Quanto finalidade e caractersticas

Simples S possui os nutrientes bsicos para o crescimento das bactrias em geral. Enriquecido ou Diferencial Alm dos nutrientes bsicos possui elementos nutritivos a mais, como fatores promotores de crescimento (sangue...), mas no especfico. De enriquecimento ou Seletivo suplementado com nutrientes especficos para o microrganismo que se deseja pesquisar. Alm disso, possui nutrientes agentes inibidores de determinados microganismos, mas no permite o isolamento da bactria, pois um meio lquido. Por exemplo: aminocidos (lisina Salmonella)

CLASSIFICAO DOS MEIOS DE CULTURA Quanto finalidade e caractersticas

Seletivo Possui agentes inibidores de determinados microrganismos. Permite a identificao e isolamento da bactria, pois um meio slido (permite a visualizao de UFCs). Por exemplo: Agar EMB inibe Gram+ Diferencial Permite a diferenciao de diferentes microrganismos. Por exemplo: a diferenciao de bactrias fermentadoras e no fermentadoras da lactose no Agar EMB. Indicadores Possuem agentes que indicam determinadas reaes no meio, para a determinao do metabolismo das bactrias. Por exemplo: ferro no meio pode indicar a produo de H2S pelo enegrecimento do meio (sulfeto ferroso) *** geralmente o agente um indicador de pH

CLASSIFICAO DOS MEIOS DE CULTURA Quanto finalidade e caractersticas

Quanto finalidade de estoque Meios onde so estocadas culturas puras para posterior utilizao. Geralmente so meios semislidos

Fonte: http://www.ebah.com.br/content/ABAAAe57YAG/tipos-meios-culturamicrobiologia

COMPOSIO g/L: Casena cida Hidrolisada: 0.50 Extrato de Levedura: 0.50 Protease Peptona: 0.50 Dextrose: 0.50 Amido Solvel: 0.50 Fosfato Dipotssico: 0.30 Sulfato de Magnsio: 0.024 Piruvato de Sdio: 0.30 pH FINAL: 7.2 0.2 APARNCIA DO P: Cor amarelo, homogneo e p livre circulante. COLORAO: Cor amarelo. TRANSPARNCIA: Soluo clara.

Culture Media
defined: made from purified chemicals e.g., glucose-mineral salts broth complex (undefined): exact chemical composition not known e.g., YE (yeast extract) agar

agar polysaccharide derived from algae forms a gel at temperatures of interest, including 37C not many microorganisms can degrade it widely used as solidifying agent in microbial media

(Madigan et al.)

aseptic transfer:
inoculating loop microbial culture

(Madigan et al., Fig. 5.3)

liquid

solid

(Madigan et al., Fig. 5.4)

streak plate:

confluent growth

single isolated colonies

(Madigan et al., Fig. 5.4)

MTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO

QUANTIFICAO DIRETA:

CONTAGEM EM PLACAS FILTRAO MTODO DO NMERO MAIS PROVVEL CONTAGEM DIRETA AO MICROSCPIO

QUANTIFICAO INDIRETA: - TURBIDIMETRIA - ATIVIDADE METABLICA - PESO SECO

MTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO


QUANTIFICAO DIRETA:

(1) CONTAGEM EM PLACAS


- tcnica mais utilizada na determinao do tamanho da populao bacteriana; VANTAGEM: qualificao de clulas viveis DESVANTAGEM: tempo (24 h para o aparecimento das colnias)

Contagem em placas e diluio seriada


Clculo:
n de colnias na placa x ndice de diluio da amostra = n de bactrias/mL -DILUIO SERIADA -MTODO DE ESPALHAMENTO EM PLACA

Adaptado de Madigan et al. (2003).

viable count:

(Madigan et al., Fig. 6.9)

only those cells that are viable and able to grow and form colonies under the provided conditions are counted results reported as colony forming units/mL (CFU/mL)

Contador de Colnias

MTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO

QUANTIFICAO DIRETA:

(2) FILTRAO
- < n de bactrias = pode ser utilizado o mtodo de filtrao para a sua contagem. - concentrao de bactrias sobre a superfcie de uma membrana de filtro de poros muito pequenos aps a passagem de um volume de 100 mL de gua.

- filtro posteriormente transferido para uma placa de petri contendo meio slido.

A membrana filtrante foi colocada sobre o meio de cultura e a placa foi incubada.

Clulas bacterianas na superfcie da membrana (poros)

CONTAGEM DE BACTRIAS PELO MTODO DE FILTRAO

MTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO

QUANTIFICAO DIRETA:

(3) O MTODO DO NMERO MAIS PROVVEL (NMP)


- utilizado para microrganismos que no crescem bem em meio slido.

A) diluio a partir de um alto volume de inculo (ex. 10 mL) B) diluio a partir de um mdio volume de inculo (ex. 1 mL) c) diluio a partir de um baixo volume de inculo (ex. 0,1 mL) d) contagem do n de tubos positivos e) estimativa do n de clulas/mL de bactrias

10 mL de inculo

6 tubos positivos (com


crescimento bacteriano)

1 mL de inculo

3 tubos positivos

0,1 mL de inculo

1 tubos positivos

Figura 9. Mtodo do nmero mais provvel (NMP)

6 Tabela de combinaes (NMP)

6-3-1 3 ndice de NMP/100 mL = 110 Inferior = 40 Superior = 300 1

Confiabilidade de 95%

Mtodo do nmero mais provvel (NMP)

MTODO DO NMERO MAIS PROVVEL PARA ESTIMATIVA DE CRESCIMENTO

CONTAGEM EM PLACA E DILUIES SERIADAS

METODOLOGIA UTILIZADA PARA A CONTAGEM DE COLNIAS EM PLACA

POUR-PLATE

ESPALHAMENTO EM PLACA

MTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO

QUANTIFICAO DIRETA:

(4) CONTAGEM DIRETA AO MICROSCPIO


- um volume conhecido de suspenso bacteriana colocado em uma rea definida da lmina de microscpio. - a amostra pode ser corada ou analisada a fresco. - utilizam cmaras de contagem

DESVANTAGENS: - no separa clulas mortas e vivas - pode haver erros de contagem - difcil contagem para bactrias mveis

Adaptado de Madigan et al. (2003)

Utilizao da cmara de contagem Petroff-Hausser.

direct microscopic count:


Petroff-Hauser counting chamber

(Madigan et al., Fig. 6.9)

requires at least 106 cells/mL counts all cells (a total count) without special stains, cannot distinguish between live and dead cells

CMARA DE NEUBAUER ou HEMACITMETRO

CMARA DE NEUBAUER ou HEMACITMETRO

CONTAGEM DIRETA AO MICROSCPIO

CMARA DE NEUBAUER

Ao microscpio aumento de 400X Ao microscpio aumento de 100X

Colorao com azul de metileno para evidenciar clulas viveis de leveduras clulas azuis esto mortas; clulas sem colorao so clulas vivas

Cmara de Sedgwick-Rafter reticulada

Cmara de Mac Master

MTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO

QUANTIFICAO INDIRETA:

(1) TURBIDIMETRIA
- monitoramento do crescimento bacteriano atravs da turbidez - espectrofotmetro (660 nm)

(2) ATIVIDADE METABLICA

- quantidade de um certo produto (como cido ou CO2) diretamente proporcional ao nmero de clulas bacterianas.

Fonte de luz

Filtro

Amostra contendo clulas microbianas

Detector sensvel luz

Leitura dos resultados em absorbncia ou transmitncia no espectrofotmetro

DETERMINAO DE CRESCIMENTO MICROBIANO PORTURBIDIMETRIA

A quantidade de luz que atravessa o detector inversamente proporcional ao n. de bactrias.


Quanto > o n. de bactrias < a quantidade de luz que transmitida

Figura 11. Determinao do n de bactrias por turbidimetria.

MTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO

QUANTIFICAO INDIRETA:

(3) PESO SECO


- principalmente para fungos filamentosos a) fungo removido do meio por filtrao b) seco em dessecador c) posterior pesagem.

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