METODOLOGIAS UTILIZADAS EN LA DETERMINACION DE LA PIGMENTACION Y PIGMENTOS EN TEJIDOS PELLETS

Por: Emilio Castro C.M.Sc. Csar Seplveda S. Bq. Fundacin Chile

26.1. INTRODUCCIN
El color de la carne de los salmnidos andromos se debe a la absorcin y fijacin de pigmentos carotenoides oxigenados en su carne. Entre ellos, el pigmento llamado astaxantina es el que se encuentra en mayor abundancia en el salmn silvestre, mientras que en las especies cultivadas es posible encontrar una mayor variedad como resultado de la inclusin de una gama de ingredientes y fuentes de pigmentacin en las dietas artificiales. Es as que en especies cultivadas se encuentran bsicamente astaxantina y cantaxantina y en concentraciones tisulares mucho menores, adenorrubina, zeaxantina, luteina y otros. Figura 26.1. Estructura de algunos carotenoides (Torrisen, O. J.; Hardy R. W. y Shearer D. K., 1989)

26.2. LOS PIGMENTOS Y LA PIGMENTACIN DE SALMNIDOS

26.2.1 Propiedades qumicas
Los pigmentos presentes en los salmnidos: i. Pertenecen a los carotenoides al igual que los carotenos. Sin embargo, se diferencian de stos por contener oxgeno en su molcula y consecuentemente presentar una mayor polaridad. Corresponden a derivados terpnicos caracterizados por poseer una cadena aliftica que presenta, un sistema de dobles enlaces conjugados,

ii.

iii.

iv.

grupos metlicos insertados y grupos hidroxlicos y cetnicos que les permiten diferenciarse de otros carotenoides. La presencia de los dobles enlaces les confieren las siguientes propiedades: a. Presentan una gran capacidad de absorvancia entre los 400 y 500 nm del espectro electromagntico y de absorber energa luminosa. b. Tienen la posibilidad de formar esterioisomeros cis y trans y por lo tanto, de poder reorganizarse molecularmente formando innumerables derivados con diferentes valores pigmentantes. Son solubles en aceites y presentan una adecuada solubilidad en acetona, dimetil sulfxido, metanol, etc, dado su carcter polar.

26.2.2 Isomera
a) Geomtrica

Los esteroismeros trans y cis de los pigmentos carotenoides de los salmnidos presentan diferentes valores pigmentantes. Se ha asignado un 100% de biodisponibilidad para la forma trans y cero para la forma cis (Medina, J.C. 1992).

b) Optica

La molcula de astaxantina tiene 2 tomos de carbono asimtricos equivalentes en las posiciones 3 y 3', pudiendo formar 3 ismeros pticos diferentes: (3R, 3'R), (3R, 3'S)= (3S, 3'S). Los ismeros pticos tienen propiedades qumicas iguales y coinciden en la mayora de las propiedades fsicas, diferencindose en su rotacin especfica, es decir, la direccin en que desvan el plano de la luz polarizada.

Se cree que slo los enantimeros (3R, 3'R) y (3S, 3'S) de la astaxantina son producidos naturalmente (Schiedt, K. et al, 1991). Se ha demostrado que la astaxantina sinttica corresponde a una mezcla racmica en la siguiente proporcin: (3R, 3'R): (3R, 3'S): (3S, 3'S) = 25:50:25 (Vecchi and Muller, 1979; Storebakken et al., 1985). Existen evidencias experimentales que el 100% de la astaxantina de la Phaffia rhodozyma corresponde a la forma (3R, 3'R).

26.3. ANLISIS Y EVALUACIN DE LOS PIGMENTOS Y PIGMENTACIN DE LOS

SALMNIDOS

La evaluacin del color de la carne de los salmones se puede realizar por medio de mtodos de anlisis sensorial con panelistas entrenados en tests descriptivos o comparativos, a travs de la comparacin del color de muestras de peces con colores estandarizados, por medio del anlisis instrumental basado en la luz refractada de muestras de peces, o por el anlisis cuantitativo de los pigmentos por HPLC.

26.3.1 Tabla de colores

El mtodo ms utilizado hasta la fecha por la industria salmonera chilena es la evaluacin por medio de Tabla de Colores que corresponde a una comparacin visual de esta tabla con la muestra respectiva. Esta tabla fue desarrollada especialmente para salmn Atlntico pigmentado con astaxantina y se usa tanto para filetes como para secciones de salmn. La utilizacin de dicha tabla dobiera efectuarse bajo condiciones especficas de luminosidad, lugar de evaluacin en el pez y de contraste. Su principal limitante es que se trata de un mtodo subjetivo, que depende de la apreciacin visual del observador y no cuantitativo. Este mtodo se recomienda para evaluar el nivel de pigmentacin en muestras de 10 a 15 peces y no en peces individuales. Las publicaciones de Torrisen sealan que el mtodo presenta una alta correlacin (R2 = 0.99) con la concentracin de pigmentos determinados a nivel tisular en una poblacin. a) Descripcin Compara visualmente el color de la carne del pez con colores estandarizados en una tabla: secciones (18) y filetes (1118). b) Limitaciones

Constituye un mtodo subjetivo. Obliga a disponer de una tabla de colores. Fue desarrollado especialmente para salmn atlntico pigmentado con astaxantina.

26.3.2 Colorimetra por reflactancia

Este otro mtodo basado en la luz refractada se considera ms objetivo y preciso que el anterior, dado su carcter instrumental. En l se utiliza un colormetro de refractancia, el cual entrega informacin basada en un sistema de valores definido para este efecto por la Comisin Internacional de Iluminacin (CIE) Los valores entregados se basan en un espacio cromtico en coordenadas rectangulares (L*a*b) junto con otro en coordenadas cilndricas (L*H*C), dichos valores representan a la luminosidad o claridad, el tono y la cromaticidad respecto a los colores componentes rojo, amarillo y azul. Diversos

investigadores han trabajado en tratar de definir la correlacin de estos valores con el grado de pigmentacin y con la Tabla de Colores, describiendo distintas correlaciones. El anlisis instrumental mediante colorimetra de refractancia presenta las siguientes limitaciones y ventajas: a) Limitaciones

Evala solo la coloracin superficial. No cuantifica el contenido de carotenoides. La presencia de grasa intramuscular, sequedad o pelcula brillante pueden alterar las lecturas.

b) Ventajas

Comprende una metodologa sencilla. No requiere de preparacin previa de la muestra. Elimina la subjetividad de la lectura. Puede utilizarse en interiores como en exteriores. Tiene estndares de referencia. Evita el tedio del analista. Por pequeas que sean las diferencias, estas son registradas por el instrumento dado su alta resolucin.

26.3.3 Anlisis por cromatografa de alta resolucin

Un logro particularmente importante a partir de 1975 en el anlisis qumico instrumental lo constituy el uso comn de la cromatografa lquida de alta resolucin en la industria de alimentos. La cromatografa permite separar, aislar e identificar los componentes de una mezcla de compuestos qumicos en la medida que son solubles o reaccionan con algn compuesto. Los pigmentos carotenoides de los salmnidos tienen propiedades de este tipo que hacen aplicable este mtodo. Cabe sealar que la cromatografa lquida de alta resolucin conocida como HPLC, difiere slo en detalles de la clsica. El procedimiento general de un anlisis cualquiera dentro de la cromatografa lquida incluye tres etapas fundamentales: a) Preparacin de estndares y curva de calibracin En nuestro caso particular, dado que comercialmente no existen estndares tanto para astaxantina como para cantaxantina, es necesario hacer una

preparacin de los estndares a partir de los productos comerciales Carophyll Pink (astaxantina 8%) y Carophyll Red (Cantaxantina 10%) y una calibracin espectrofotomtrica para conocer su concentracin real (Gross, 1992) Las etapas de esta calibracin son:

Pesar muestra de Carophyll Pink o Carophyll Red. Disolver la muestra en agua destilada tibia hasta lograr una suspensin homognea. Dejar enfriar a temperatura ambiente y aforar a volumen conocido. Dejar reposando por una hora a lo menos (o toda la noche) para que decante el almidn que recubre a los pigmentos. Tomar una alicuota de cada suspensin. Diluir con n-hexano y leer la absorbancia de las soluciones a 470 nm con n-hexano como blanco. El coeficiente de extincin para la astaxantina es de 1,910 (Gross, 1992) y para la cantaxantina es de 2,200 (Gross, 1992)

Una vez completa la etapa de calibracin se calcula la concentracin real de cada pigmento y se preparan las concentraciones adecuadas y diluidas en una mezcla metanol/agua para inyectar en el cromatgrafo. El rango aconsejable de estudio deber ser entre 0.1 a 4.0 g/ml. b) Preparacin de las muestras (i) Harinas de pescado y/o pellets Este procedimiento es vlido para muestras de pellet o harina de pescado que contengan Carophyll (Red o Pink), con Phaffia rhodozyma o la levadura simplemente (Sedmark y cols., 1990). En sntesis considera las siguientes etapas:

Moler en molino si la muestra es pellet. Pesar exactamente la muestra de la harina o Phaffia. Hidratar, en el caso de la phaffia, para facilitar su disgregacin. Agregar el dimetilsulfxido previamente calentado. Agitar vigorosamente, incubar en calor y centrifugar. Tomar una alicuota del sobrenadante y diluir en volumen conocido con mezcla MeOH/H2O. Volver a centrifugar e inyectar en el cromatgrafo del sobrenadante.

(ii) Tejido muscular de salmn o trucha

Este mtodo tambin es posible de utilizar sobre muestras de harina de krill (y otros crustceos), paprika y otros vegetales en polvo. En general, la metodologa se resume en los siguientes pasos:

Moler y homogenizar la muestra de tejido en un picadora de cocina cuando sea pertinente. Pesar en un tubo exactamente la muestra. Extraer con pequeos volmenes de acetona por agitacin vigorosa en un vrtex o por ultrasonido (hacer tantas extracciones como sea necesario). El sobrenadante llevarlo a un segundo tubo donde se juntan los extractos. Llevar a volumen conocido una mezcla de MeOH/H2O. Centrifugar e inyectar el sobrenadante directamente en el cromatgrafo.

La fase de extraccin puede ser optimizada utilizando un sistema de extraccin en fase slida acoplada a vaco. (iii) La determinacin cromatogrfica considera las siguientes condiciones generales
Fase mvil: Fase estacionaria: Vol. inyeccin: Temperatura: Detector: mezcla MeOH/H2O columna C-8 4 250 mm 20 l ambiente isible, 470 nm

La tcnica cromotogrfica anteriormente descrita utiliza una fase mvil relativamente polar constituida por una gradiente de metanol y una fase estacionaria apolar consistente en una columna en fase inversa C8. No se describen limitaciones para ella, si las siguientes ventajas: 1. Eluye el -caroteno en un tiempo razonable, separndolo de los oxicarotenoides del salmn. 2. Permite separar los ismeros cis y trans tanto de la astaxantina como cantaxantina. Otros investigadores han propuesto otras modalidades cromatogrficas algo distintas con el fin de evaluar otros aspectos de la pigmentacin de los salmnidos. Es as como:

Vecchi M. y Muller R.K. (1979) desarrollaron un mtodo HPLC diferente a los modos de separacin normal y reversa. Esta tcnica permite separar los ismeros configuracionales de la astaxantina previo a sus

esterificacin con cido campanico y posterior separacin de los correspondientes disteres en una columna de nitrilo (CN) por HPLC. Makoa et al. (1985) por su parte propusieron un mtodo HPLC que permite la separacin directa de los carotenoides diasteromricos de la astaxantina utilizando la columna Sumipax OA 2000 chiral.

Estos mtodos presentan las siguientes limitaciones: no se recomiendan como tcnicas de rutina ya que, en el primer caso, los pasos adicionales que involucra la preparacin de los esteres del cido campnico pueden afectar su exactitud y, en el segundo caso, el tiempo del anlisis es demasiado largo (90 minutos).

26.4. CONSIDERACIONES FINALES

La importancia que tiene la pigmentacin de los salmnidos tanto por su costo como por ser un factor clave de comercializacin determina la imperiosa necesidad de conocer la concentracin de los pigmentos carotenoides presentes en las distintas fuentes de pigmentacin, alimentos balanceados y tejidos de los peces. Las metodologas analticas utilizadas para este propsito presentan diversas limitaciones y desventajas. Sin embargo, el desarrollo reciente de tcnicas cromatogrficas de, alta resolucin, velocidad, sensitividad, reproducibilidad y operacin, nos permite ofrecer actualmente mtodos vlidos de evaluacin y certificacin de pigmentacin para la Industria Salmonera.

26.5. BIBLIOGRAFA
Buchwald, M. y Jencks, W.P. Optical properties of astaxanthin and aggregates. Biochemistry Vol. 7, No2, February 1968. Fisher, C. and Kocis, J.A. Separation of Paprika pigments by HPLC. J. Agric. Food Chem. 35:5759, 1987 Gross, R.W. Comunicacin personal, 1992. Lambertsen, G. and Braekkan, O.R. Method of analysis of astaxanthin and its occurrence in some marine products. J.Sci. Fd. Agric. 22: 99102, febrero 1971. Sedmak, J.J., Weerasinghe, D.K. and Jolly, S.O. Extraction and quantitation of astaxanthin from Phaffia rhodozyma. Biotechnology Techiques Vol. 4(2): 107112, 1990.

Aislamiento y propiedades qumicas de la hemoglobina

Antecedentes

La hemoglobina es una protena conjugada, cuyo peso molecular es de 64,458 la cual contiene cuatro grupos hem y globina. Esta ltima consiste en dos pares ( y ) de cadenas polipeptdicas. Las diversas cadenas se mantienen unidas por accin de fuerzas no colanetes, formando una protena globulas tridimensional. Es probable que en estas fuerzas intervengan puentes de hidrgeno, uniones salinas e interacciones hidrfobas. La hemoglobina puede considerarse como una enzima que tienen al oxgeno como uno de sus sustratos. Su reaccin con el oxgenos e acompaa de la modificacin estructural. (Wintrobe 1969) La hemoglobina es un tetrmero compuesto por dos cadenas de cada tipo de bloina alfa de 141 y beta de 146 aminocidos. La cadena alfa interacta con la cadena beta. La funcin de la hemoglobina est relacionada con su afinidad por el oxgeno. La hemoglobina desoxigenada, que se denomina desoxihemoglobina, tiene una afinidad ms bien baja por el oxgeno debido a que los enlaces entrecruzados de los pares de iones de las subunidades de hemoglobina estabilizan las estructuras de las cadenas individuales de modo que la protena se resite a la fijacin al oxgeno. A medida que el oxgeno se fija a la hemoglobina ocurre un cambio de conformacin significativo que desorganiza los enlaces entrecruzados entre las subunidades e inbremetna en esta forma la afinidad de la protena por el oxgeno. Cuando el oxgeno se fija a un sitio de hemo dentro de cada dmero alfa-beta, una subunidad alfa-beta de la hemoglobina gira unos 15 con respecto al otro par alfa-beta. En la desoxihemoglobina, el hierro est ligeramente fuera del plano del anillo y los seis electrones del orbital del hierro estn acomodados como cuatro electrones desapareados y un par de electrones acomodndose los cinco ligandos. Cuando se fija el oxgeno la estructura del hierro cambia y en enlace hierro-histidina se hace ms corto, los cuatro enlaces a los tomos

de nitrgeno son estirados y el hierro se mueve alrededor acercndose al plano. Una vez que el oxgeno se fija a un hemo, la desorganizacin de los pares inicos lleva a un cambio en la estructura cuaternaria, que hace los dems sitios hemo ms afines al oxgeno. El hem, que constituye alrededor del 4% del peso de la molcula, es un complejo metlico consistente en un tomo de hierro situado en el centro de una estructura porfirnica. El hem confiere a la hemoglobina su color rojo caracterstico. El contenido de hierro en la hemoglobina es de 0.3466%. el hierro tiene una valencia de coordinacin de seis. El hierro tiene una valencia de coordinacin de seis. De ellas, cuatro estn en un plano y unen al hierro con los tomos de nitrgeno de los anillos pirrlicos del hemo, pero se cree que las dos valencias restantes, estn unidas a grupos imadizlicos de dos residuos histidnicos de la globina. La combinacin de la hemoglobina con el oxgeno entraa el desplazamiento del imidazol y conduce a un enlace hierrooxgeno. (Wintrobe 1969) La metahemoglobina se forma cuando la hemoglobina es oxidada a una velocidad que excede a la capacidad enzimtica normal de reducir la hemoglobina. Ciertos individuos con dao en la capacidad enzimtica para reducir la hemoglobina pueden ser susceptible a cambios oxidativos leves. Existen numerosos agentes que pueden ser responsables de la oxidacin. Los mas frecuentes son:

Anilina Benzocaina Cloratos Cloroquina Dapsona Agua contaminada con nitratos Nitratos Nitritos Nitrofenol Fenazopiridina Primaquina Nitroprusiato de sodio

4-dimetilamino fenol

El hierro contenido en el grupo hem es susceptible a la oxidacin qumica, cambia su valencia de forma ferrosa a frrica. A pesar de que la oxidacin espontnea de la Hb ocurre ininterrumpidamente, el organismo cuenta con mecanismos que le permiten mantener los niveles de metaHb por debajo de 2%. El principal sistema reductor de la metaHeb es la metahemoglobina reductasa NADH dependiente o diaforasa A, el dinucletido de adenina niacina proviene de la gliclisis aerbica. La enzima cataliza ms del 95% de la metaHb producida en el organismo, el resto es catalizado por la metahemoglobina reductasa NADPH dependiente. El ciclo de las pentosas suministra el NADPH que acta como cofactor del sistema, su disminucin limita la actividad de la enzima. (Martnez y Velsquez 1998)

Varios compuestos oxidantes provocan la conversin de HbFe a metaHb Fe y reducen as la oxigenacin hstica por 2 mecanismos:

La metaHb no puede transportar oxgeno (O2) ni dixido de carbono (CO2), por lo tanto su presencia reduce la capacidad transportadora de la sangre. La presencia de Fe3+ cambia la configuracin tetramrica del grupo hemo y reduce la liberacin de O2 a los tejidos, pues la HbFe3+ tiene mayor afinidad por el O2 ; desplaza la curva de disociacin de la Hb a la izquierda.

En presencia de hipoxia, secundaria a la metaHb, los eritrocitos se encuentran incapacitados de obtener energa de la gliclisis aerobia, del ciclo de Krebbs y de la cadena respiratoria. La produccin de NADPH por el ciclo de las pentosas suple este dficit. El azul de metileno acta como un importante cofactor del ciclo de las pentosas. (Martnez y Velsquez 1998)

Con independencia de otros factores agudos producidos por el agente oxidante (hipotensin y taquicardia, en el caso de los nitritos) las manifestaciones clnicas en los pacientes con metahemoglobinemia dependen de la magnitud de la metaHb y la susceptibilidad del paciente a la hipoxia. La cianosis puede aparecer en pacientes asintomticos,

dada la pigmentacin oscura de la metaHb. La cianosis de los labios y las mucosas requieren de niveles de metaHb superiores al 10 %. La aparicin de otros sntomas y su correlacin con los niveles de metaHb depende de la presencia de enfermedades de base. En personas sanas, valores de metaHb por debajo del 30 % no producen sntomas o provocan manifestaciones mnimas como fatiga y cefalea, entre 30 y 50 % producen depresin moderada del sistema nervioso central (SNC) y el aparato cardiovascular, entre 50 y 70% aparece estupor, bradicardia, depresin respiratoria, convulsiones, arritmias cardacas y acidosis metablica y niveles por encima del 70 %, por lo general, no son compatibles con la vida. (Martnez y Velsquez 1998)

La carboxihemoglobina es la unin de hemoglobina y monxido de carbono que tiene una afinidad mucho ms alta con la hemoglobina que la que tiene el oxgeno (210 veces mayor ). Este se adhiere a la hemoglobina formando un nuevo compuesto: la carboxihemoglobina. Las grandes cantidades de monxido de carbono en la sangre ocasionan intoxicacin por esta misma sustancia, es decir, las cantidades excesivas de carboxihemoglobina en la sangre impiden el transporte de oxgeno, tomando su lugar en los glbulos rojos. Las reacciones txicas que ocasiona la inhalacin de xido de carbono se deben en forma exclusiva a la anoxia de los tejidos, pero esto genera alteraciones texturales como edema, pequeas hemorragias e infiltracin perivascular con necrosis focal. Este gas puede ocasionar daos permantentes en el corazn y el sistema nervioso central. Si la carboxihemoglobina se detecta oportunamente, puede ser efectivo tratarla con 100% de oxgeno para intentar reemplazar el monxido de carbono por oxgeno. (Wintrobe 1969)

La sulfohemoglobina es un compuesto que se forma por la reaccin de la hemoglobina con sulfuros inorgnicos solubles y perxido de hidrgeno. Se cree que la formacin de sufohamoglobina entraa la introduccin de un tomo de azufre algo lbil en la molcula de hemoblobina y tambin un cambio en el modo de enlace entre la globina y el hem. A diferencia de la carboxihemoglobina y la metahoemoglobina, la sulfohemoglobina no puede convertirse en hemoglobina sin que la molcula escinda en sus grupos constituyentes. Por consiguiente, el

tratamiento slo consiste en evitar el agente causal. Se observo que la sulfohemoglobinemia sobreviene por lo comn a raz del consumo crnico de acetanilida o a la feacetina. (Wintrobe 1969)

Justificaciones

Para extraer la hemoglobina es necesario separar el plasma de la sangre de los glbulos rojos. Al centrifugar los 50mL de sangre se separan los eritrocitos del suero que tiene protenas y otros compuestos disueltos. Sin embargo, si este proceso se realizara sin un anticoagulante los eritrocitos precipitaran coagulndose y dificultando la extraccin de la hemoglobina de ellos. Luego del decantado se lava con una solucin de NaCl al 1.2% para luego de centrifugarlos otra vez y separar bien de los glbulos rojos todos los solutos del plasma. Cuando el sobrenadante est claro quiere decir que ya se han eliminado todos los solutos separando los eritrocitos. En el lavado se mezcla cuidadosamente para que no se coagulen los glbulos rojos.

El tolueno es un compuesto orgnico no polar en el que los lpidos de la membrana celular de los eritrocitos son solubles. Con la agitacin en el baln de extraccin se promueve la lisis de los glbulos rojos al mezclarse el tolueno con las membranas celulares, liberando de esta manera la hemoglobina.

Para que se separen bien los compuestos no polares de los compuestos polares se deja reposar una hora. La hemoglobina es soluble en agua, por lo que queda en solucin en la fase acuosa. La capa acuosa se vuelve a centrifugar para eliminar los compuestos polares del plasma que hayan quedado.

La solucin clara que queda de la centrifugacin es la oxihemoglobina que se diluye para realizar todas las pruebas cuantitativas y de absorbancia de manera que quede una concentracin adecuada para que ocurran las reacciones y se pueda leer la absorbancia. Se diluye con agua destilada para que no haya

interferencia en los resultados. Se prepara un tubo con 4mL de la solucin para poder tener un patrn de referencia con el cual se pueden comparar las pruebas.

Para la preparacin de deoxihemoglobina, se usa el reactivo de Stockes que consiste en sulfato de hierro heptahidratado y cido tartrico con hidrxido de amonio. El protn derivado del cido tartrico se une a lugares especficos de la molcula de hemoglobina donde hayan grupos amino libres disminuyendo as la afinidad de la molcula de hemoglobina por el oxgeno. De esta manera la oxihemoglobina pierde sus molculas de oxgeno y da lugar a la deoxihemoglobina.

La metahemoglobina se produce por la reaccin de la hemoglobina en presencia de ciertos agentes qumicos u orgnicos. El ferricianato de potasio oxida al hierro de la oxihemoglobina cambiando su valencia de +2 a +3. As ya no tiene la misma afinidad que tena por el oxgeno por lo que ste se libera y al inclinar el tubo se observan las burbujitas.

La nitrosilhemoglobina se forma por la reaccin de la oxihemoglobina con xido ntrico, producido in vitro con el nitrito de sodio y el cido ascrbico.

Los espectros de absorcin son importantes para la determinacin de una cantidad mayor de una de metahemoglobina, carboxihemoglobina o nitrosilhemoglobina ya que de esta forma se puede saber si hay ms de lo que debe haber en la sangre y confirmar una metahemoglobulemia por ejemplo. Todas las lecturas de espectros se realizan desde 450 a 600nm para determinar las diferentes absorbancias dependiendo del grupo del que se trate, si todas las molculas de oxihemoglobina reaccionan o si es una mezcla y para determinar si haba contaminaciones.

Los blancos de cada lectura dependen del tratamiento que se le ha dado a la muestra. Para que la absorbancia de los reactivos no afecten los resultados.

Bibliografa

Wintrobe, M. HEMATOLOGA CLNICA. 3ed. Editorial Intermdica. Argentina (1969) 976p.p.

INTOXICACIN POR SUSTANCIAS METAHEMOGLOBINIZANTES. ESTUDIO RETROSPECTIVO DE 39 PACIENTES Dr. Jess Martnez Cabrera y Dr. Ral Velzquez Ogando Revista Cubana Med 1998 37(2) paginas 77-82 Centro Nacional de Toxicologa