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ARTIGO

MTODOS IMUNOQUMICOS PARA ANLISE DE RESDUOS DE PESTICIDAS: UMA REVISO


Summary
IMMUNOCHEMICAL METHODS FOR ANALYSIS OF PESTICIDE RESIDUES: A REVIEW. Immunoassay techniques provide simple, powerful and inexpensive methods for analysis of environmental contaminants, including pesticides. In this paper, special attention is given for the concepts related to the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) formats used as basic methods for the development of commercially available kits for pesticide analysis. A list of main commercial kits for detection of some prioritary pesticides is given in order to help anlysts. Others formats, such as flow-injection immunoassay analysis (FIIA), immunoassay chromatography and immunosensors are also cited as emerging and complementary techniques. Keywords: immunoassays, EIA, ELISA, pesticides analysis Gilvanda Silva Nunes Universidade Federal do Maranho Ncleo de Anlise de Resduos de Pesticidas (NARP), Departamento de Tecnologia Qumica, Centro de Cincias Exatas e Tecnologia Correspondncia: Av. Portugueses, s/n 65080-040. So Lus. MA E-mail: vandasn@terra.com.br

Introduo
Devido grande difuso do uso dos pesticidas para controle de pragas na agricultura, existe hoje uma grande preocupao com relao contaminao ambiental e tambm presena de resduos destes compostos nos alimentos. Esta preocupao tem levado a inmeros estudos visando ao desenvolvimento de tcnicas e de metodologias analticas para a anlise rpida dos resduos de pesticidas. Mtodos uni ou multiresduos envolvendo a cromatografia a gs (GC) e a cromatografia a lquido de alta eficincia (HPLC) tm sido usados durante anos para a determinao de pesticidas (1). Em geral, tais mtodos apresentam elevada sensibilidade e comprovada confiabilidade, atravs dos estudos de validao. Contudo, existem alguns fatores que so considerados fortes inconvenientes para a utilizao destes mtodos, a saber: o alto custo das anlises; a necessidade de demorado treinamento de pessoal; o tratamento das amostras que, na maioria das vezes, no to simples, sobretudo para matrizes complexas como de alimentos, e o uso de solventes orgnicos, que acabam por resultar em um problema ambiental, pela produo de grandes volumes de resduos qumicos txicos. Por essas razes, tm-se verificado uma crescente demanda por mtodos mais rpidos e econmicos, principalmente para os casos de monitoramentos de resduos em alimentos e no ambiente, cujos resultados se constituem, em muitos casos, ponto de partida para tomadas de decises oficiais. Entre esses mtodos, destacam-se aqueles que envolvem as tcnicas bioanalticas, como os imunoensaios e os biosensores, que representam, em alguns casos, uma alternativa aos mtodos tradicionais. At algum tempo atrs, os imunoensaios tinham seu maior xito no campo da qumica clnica (2-4). Em meados da dcada de 70, foi desenvolvido o primeiro ensaio biolgico para pesticidas (aldrin e dieldrin), baseado na marcao radioativa, que coincidiu
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com o surgimento dos imunoensaios radioativos (do ingls, radioimmunoassay, RIA) (5). A partir da, e mais precisamente no incio dos anos 80, comeou-se a discutir as possibilidades que estes tipos de mtodos analticos poderiam oferecer na deteco de contaminantes, em especial de pesticidas, tanto em amostras ambientais como de alimentos (6-9). Comeou-se a utilizar, ento, a marcao enzimtica, que engloba os ensaios imunoenzimticos ou imunoensaios (do ingls, enzymatic immunoassays, EIA ), que proporcionam menores riscos e apresentam sensibilidades similares (6,8-12). Avanos nas tcnicas imunoqumicas, como o desenvolvimento de anticorpos altamente seletivos, o surgimento de novos formatos de ensaios e a harmonizao nos protocolos de validao, tm possibilitado o uso cada vez mais crescente dos EIAs para a determinao de traos de pesticidas em diferentes matrizes (13,14). Tais avanos so sentidos quando se verifica que algumas agncias regulamentadoras, como a EPA (US Environmental Protection Agency), que antes eram reticentes quanto a essas tcnicas, j aceitam diversos imunoensaios como mtodos oficiais de separao de amostras positivas (screening methods), que sero ento destinadas a posteriores anlises empregando tcnicas convencionais. Algumas agncias j admitem, inclusive, a adoo de alguns desses mtodos para fins quantitativos (15). Os mtodos imunoqumicos envolvem o uso de anticorpos, que so os componentes-chave de todos os imunoensaios, sendo caracterizados por stios de reconhecimento especficos, presentes nas suas estruturas, que possibilitam interaes altamente especficas com os antgenos. A gerao de anticorpos para molculas pequenas, como o caso dos pesticidas, extremamente difcil, porque estas no so hbeis na produo de respostas imunolgicas. Esta , certamente, a principal razo pela qual os mtodos imunoqumicos foram primeiramente
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introduzidos para trabalhos no campo clnico (16). Por outro lado, tm-se observado, nas duas ltimas dcadas, grandes progressos no desenvolvimento racional dos anticorpos para molculas mais simples (17). Problemas de reatividade cruzada (do ingls, cross reactivity, CR), que a capacidade que alguns compostos tm de responder positivamente ao EIA, desde que possuam estruturas similares do analito, tm sido verificados e minimizados pelas alteraes dos formatos dos ensaios (18). Alm dessa caracterstica intrnseca do ensaio , podem-se tambm encontrar outras caractersticas prprias da matriz, que podem interferir com a tcnica, comumente denominadas efeito matriz. Como os imunoensaios so formados por uma reao in vitro , as condies do meio, tais como pH, fora inica, temperatura, tempo de reao, entre outras, afetaro de forma significativa a eficincia destes. Este trabalho tem por objetivos: i ) apresentar, abreviadamente, as etapas para desenvolvimento de um EIA para anlise de pesticidas; ii ) discutir os principais avanos no desenvolvimento de imunoensaios para determinao de pesticidas, e algumas das suas aplicaes em estudos de monitoramentos ambientais e de alimentos; iii) mostrar alguns problemas relacionados com o efeito de matriz e reatividades cruzadas, na aplicao dos EIAs para determinao de pesticidas de diferentes classes, e iv) apresentar algumas tcnicas hifenadas, como aquelas utilizando EIA/cromatografia e EIA/FIA.

Haptenos Herbicidas alaclor 2,4-D atrazina cianazina captan dicamba glifosato metalaclor, alaclor, acetoclor paraquat picloram bensulfuron metlico ciclohexanediona fluoroxipir, triclopir metosulam trifluralina Inseticidas adicarb azadiractin carbofuran etofenproxi fenitrotion fenoxicarb benzofenilureia-flufenoxiron organofosforados esfenvalerato cloronicotinil-imidaclopride Fosalone Fungicidas tiabendazol tiram

Sensibilidade do imunoensaio 10 ppb 100 ppb* 100 ppb 0,3 ppb 0,5 ppb 1 ppb 10 ppb 1 ppm 0,06-0,4 ppb 0,1 ppb 10 ppb 0,002 ppb 0,1 ppb 10 ppb 0,1 ppb 1 ppb 0,03 ppb 0,5 ppb 0,3 ppb 1 ppb 0,3 ppb 0,5 ppb IC50 = 2,4 ppb 0,1 ppb 0,1 nM 3 ppb IC50 = 17,3 ppb IC50 = 35 ppb 20 ppb 9 ppb 30 ppb

Referncias

32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62

Desenvolvimento de um EIA para Pesticida


O desenvolvimento de um imunoensaio para anlise de um pesticida (em geral, de baixo peso molecular) compreende quatro fases bem diferenciadas, esquematizadas na Figura 1. Durante a seleo do analito, a estrutura qumica do composto, a sua estabilidade e os diferentes produtos de degradao, caso existam, so fatores que tero de ser considerados. Uma grande parte dos pesticidas d origem a produtos de degradao, sob determinadas condies do meio (pH, temperatura, etc.); estes, por sua vez, podem ou no interferir com o imunoensaio. O desenvolvimento de um EIA requer, como j mencionado, a produo de anticorpos para o analito. Uma vez que as molculas dos pesticidas so pequenas, estas devero ser

Quando a sensibilidade no apresentada como IC50, trata-se do limite de deteco.

Tabela 1. Alguns imunoensaios do tipo ELISA desenvolvidos a partir de anticorpos policlonais para anlise de pesticidas

Figura 1. Etapas bsicas para desenvolvimento de um imunoensaio

acopladas a molculas maiores, em geral protenas. Contudo, nem sempre o analito apresenta grupamentos qumicos capazes de possibilitar este acoplamento, e por isso devem ser sintetizados os haptenos, que nada mais so do que molculas mimticas do analito, contendo grupamentos como carboxila (-COOH), amino (-NH2), hidroxila (-OH) ou sulfidrila (-SH) (19-21). Os haptenos esto, ento, aptos a se ligar covalentemente s molculas de protenas [em geral, albuminas proveninetes de soro bovino (BSA), de soro humano (HSA), de ovo de galinha (OVA), da
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Haptenos Herbicidas 2,4-D atrazina Isoproturon paraquat metalaclor, alaclor paraquat picloram terbutilazina ciclohexanediona diclobenil e prod. Degradao imazetapir terbutrina Inseticidas azinfos metlico propoxur carbaril carbofuran clorotalonil ditiofosfato-azinfos metlico etofenproxi flucitrinato imazalil organofosforados Fungicidas tiabendazol

Sensibilidade do imunoensaio 0,1 ppb 0,1 ppb 1 nM 20 ppb 1 ng 0,06-0,4 ppb 0,1 ppb 10 ppb IC50 = 0,13 ppb 4 ppb 0,02 ppb 3-30 ppb IC50 = 0,13 ppb IC50 = abaixo de nM IC50 = 6,5 nM 0,1 ppb IC50 = 0,74 ppb 10 ppb IC50 = 6 nM 10 ppb 300 ppb 0,1 ppb 1 ppb 0,05 ppb

Referncias

63 64 65 66 67 40 41 42 68 44 69 70 68 71 72 73 72,74,75,76 55 77 78 51 79 80 55 73

, os anticorpos so gerados por diferentes clones de clulas (30). Os anticorpos policlonais so os mais fceis de se produzir; por outro lado, a biotecnologia possibilitou a produo de anticorpos monoclonais, a partir da fuso de clulas B nicas com clulas tumorais (31). Nas duas ltimas dcadas, diversos ensaios imunolgicos foram desenvolvidos para anlise de diferentes grupos de pesticidas, alguns apresentando excelentes limites de deteco, tanto com anticorpos policlonais (Tabela 1), quanto com monoclonais (Tabela 2). Dependendo do formato do EIA, que define, entre outras coisas, a sua seletividade, este pode ser usado somente como tcnica de screening ou como um mtodo quantitativo. A interao especfica do anticorpo com o seu analito quantificvel, graas utilizao de marcadores. Os diferentes tipos de marcadores incluem os radioistopos (31), as enzimas (31), a fluorescncia (81), a fosforescncia (81,82), a quimioluminescncia (31,81) e a bioluminescncia (83). Os mtodos mais utilizados utilizam enzimas e substratos colorimtricos, como aqueles utilizados pela primeira vez por Miles e Hayes (83), e posteriormente aplicados a ensaios imunolgicos (18). Os marcadores enzimticos mais empregados so a peroxidase (horseradish peroxidase, HRP) e a fosfatase alcalina (alkaline phosphatase, AP) (84,85), que apresentam uma srie de requisitos indispensveis (elevada pureza, alta atividade especfica, substrato estvel, facilmente conjugvel, etc.) (86).

Formatos de Imunoensaios
Nos formatos de EIAs mais simples e mais usuais o anticorpo pode ser acoplado ao antgeno em placas de poliestireno irradiadas ou em tubos contendo partculas magnticas (87). Como se tratam de ensaios conduzidos em suportes slidos, estes so denominados ELISA (do ingls, Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). Os fabricantes mais conhecidos dessas placas so as empresas Millipore, ImmunoSystem e Quantix. Alguns formatos tambm admitem a unio covalente dos anticorpos em partculas magnticas de 1m, que funcionam tambm como suportes slidos. A Ohmicron Systems a empresa que possui tradio na fabricao das partculas magnticas. Os EIAs podem ser de dois tipos: a) heterogneos, nos quais, durante o ensaio, ocorre separao dos reagentes unidos dos no-unidos, e b) homogneos, nos quais essa etapa de separao suprimida. Os ensaios heterogneos tm sido os mais utilizados em anlises de pesticidas, e compreendem dois tipos: os ensaios no-competitivos, tambm chamados sandwich, e os ensaios competitivos (14). A diferena do formato de ELISA tipo sandwich que neste o sinal gerado inversamente proporcional concentrao do analito (21,86). O EIA competitivo envolve a medida dos stios no-ocupados, a partir do uso de uma concentrao limite do anticorpo. A Figura 2 apresenta um esquema dos EIAs heterogneos, tanto com anticorpos (Figura 2A) quanto com antgenos (Figura 2B) imobilizados. Na Figura 2A, as molculas do analito presentes
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Quando a sensibilidade no apresentada como IC50, trata-se do limite de deteco.

Tabela 2. Alguns imunoensaios do tipo ELISA desenvolvidos a partir de anticorpos monoclonais para anlise de pesticidas

tiroglobulina (TG) ou da hemocianina (KLH)], dando origem aos imunoconjugados (20-22). Estes ltimos so utilizados para induzir a produo de anticorpos em cobaias, que podem ser camundongos, ratos, coelhos, e at animais de grande porte, como sunos, eqinos e caprinos (23-29). Os anticorpos gerados durante uma reao imunolgica podem unir-se a uma rea especfica da molcula do antgeno, chamada eptopo. Se o antgeno muito grande, uma populao heterognea de diferentes anticorpos pode ser formada durante a imunizao. Cada grupo de clulas B geneticamente idnticas (clones) e estimuladas produz seu anticorpo caracterstico, porm todos os anticorpos produzidos pelo mesmo clone so idnticos. Uma vez que no se podem separar os anticorpos de clones diferentes, o anti-soro resultante , por natureza, policlonal, isto
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anticorpos marcados so adicionados livres ao meio de reao. Esta configurao s pode ser conduzida quando o analito possui pelo menos dois stios de ligao, sendo, portanto, no-apropriado para pesticidas cujas molculas so muito pequenas (14).

Kits comerciais para anlise de pesticidas


A maioria dos EIAs comerciais para pesticidas (Kits de anlises) apresentam a configurao competitiva indicada na Figura 2A. O traador consiste no analito marcado, que adicionado ao sistema. Como j comentado, embora os marcadores fluorescentes e quimiluminescentes sejam altamente sensveis, os marcadores base de enzimas, como a HRP e a AP , tm sido os preferidos para aplicaes analticas. O antgeno marcado, na maioria das aplicaes, possui a denominao imunoconjugado. A Tabela 3 apresenta alguns dos kits de imunoensaios para anlise de pesticidas. A grande vantagem da sua utilizao, alm da rapidez e da sensibilidade, a possibilidade de se efetuar medidas in situ com uma grande quantidade de amostras, em um mesmo dia. Contudo, apesar dessas vantagens, a aceitao da aplicao desses mtodos rpidos em monitoramentos depende de vrios fatores, incluindo a demonstrao da qualidade dos dados analticos que leva em considerao parmetros como repetibilidade e reprodutibilidade, e da sua validao, mediante comparao de resultados com aqueles obtidos com o uso de tcnicas convencionais. Uma reviso crtica sobre o desenvolvimento e a aplicao desses kits comerciais para anlise de pesticidas foi apresentada por Gabaldn et al. (88).

Figura 2. Alguns tipos de imunoensaios. (A) EIA competitivo anticorpos imobilizados (concentrao conhecida do anticorpo) e adio dos analitos (ou antgenos) e dos analitos marcados soluo; (B) EIA competitivo antgenos imobilizados e adio dos analitos e dos anticorpos (concentrao conhecida) soluo; (C) EIA no-competitivo anticorpos imobilizados no-marcados e adio dos analitos e de um excesso de anticorpos marcados. (Reproduo permitida, com modificaes, da ref. 14)

Imunoensaios por Grupos de Pesticidas: desenvolvimento e aplicaes

a) Herbicidas
Os herbicidas so o grupo de pesticidas mais utilizado em todo o mundo (cerca de 65% do montante total) e, por essa razo, resduos desses compostos tm sido frequentemente encontrados no ambiente (89). So, portanto, esses compostos que lideram na lista dos EIAs desenvolvidos; os herbicidas do grupo das triazinas tm sido os mais estudados (34,35,64,65,9097), seguido do grupo das acetanilidas (32,40,98-100). Avanos nas tcnicas de produo dos anticorpos tm permitido a obteno e a purificao de anticorpos monoclonais altamente seletivos para deteco das s-triazinas. Bruun et al (91) sintetizaram e caracterizaram sete haptenos, a partir dos herbicidas atrazina, deisopropilatrazina hidroxiatrazina, simazina, hidroxisimazina, cianazina e terbutilazina, para obteno dos correspondentes anticorpos. Estudos de reatividade cruzada foram tambm conduzidos. Entre os herbicidas pertencentes ao grupo das acetanilidas, os mais estudados so o alaclor, o metolaclor e o acetoclor, que
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na amostra e as molculas marcadas do analito competem pelos stios de ligao com o anticorpo no suporte slido. Aps uma etapa de lavagem, na qual so removidas as molculas livres (que no se uniram ao anticorpo) tanto do analitos quanto do analito marcado, a concentrao do antgeno ligado medida por um traador. No ELISA competitivo indireto, os antgenos so imobilizados no suporte slido e os anticorpos marcados so adicionados ao meio, junto com os analitos a serem determinados. Na Figura 2B, as molculas imobilizadas do analito competem, com as molculas do analito provenientes da amostra, pelos anticorpos no-marcados. A concentrao dos anticorpos unidos s molculas imobilizadas do analito determinada pela adio de anticorpos marcados, que podem reconhecer especificamente os anticorpos (14). EIAs no-competitivos so representados na Figura 2C. Eles so baseados na medida dos stios de ligao no-ocupados, atravs da adio de um excesso conhecido do anticorpo. Anticorpos no-marcados so imobilizados, enquanto que os
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Composto detectado Acetanilidas Acetochlor alachlor aldicarb atrazina (triazinas) benomyl (MBC) captan carbaryl carbendazim carbendazim/benomil carbendazim/MBC cianazina ciclodienos clordane clorpirifos 2,4-D DDT fenitrotion fluometuron fluridona glifosato imidaclopride isoproturon metalaxil metolaclor metopreno paraquat paration paration/paration metlico triazinas trifluralina triclopir herbicidas urea piretroides sintticos

Fabricante EnviroLogix (P) Millipore (P) Baker (T), Millipore (P, T), Quantix (P) Baker (T), Millipore (P, T), EnviroLogix (P) Baker (T), Millipore (P, T), R-Biopharm (P), EnviroLogix (P) Quantix (P), EnviroLogix (P) Baker (T) Baker (T) Baker (T) Millipore (T), EnviroLogix (P) Millipore (P) EnviroLogix (P) EnviroLogix (P) Millipore (T) Baker (T), EnviroLogix (P) Baker (T), Millipore (P, T) Millipore (P), EnviroLogix (P) Millipore (P, T) EnviroLogix (P) EnviroLogix (P) EnviroLogix (T) EnviroLogix (P) Millipore (P), EnviroLogix (P) EnviroLogix (P) Baker (P), Quantix (P) EnviroLogix (P) Baker (T), Millipore (P), EnviroLogix (P) EnviroLogix (P) Millipore (P), EnviroLogix (P) EnviroLogix (P) Quantix (P) Baker (T) Millipore (P) EnviroLogix (P) EnviroLogix (P) EnviroLogix (P) EnviroLogix (P)

placas de poliestireno, e apresentam elevadas sensibilidade (IC50 variando de 0,75 a 2500 ppb e limites de deteco na faixa de 0,05 a 1,3 ppb) e reprodutibilidade (coeficientes de variao das curvas dose-resposta variando, geralmente, entre 5,7 e 17,8%). As empresas Ohmicron, Millipore e Quantix so as principais fabricantes dos kits de EIAs para metolaclor e alaclor (Tabela 3). O herbicida 2,4-D pertence ao grupo dos compostos clorofenoxi e tem sua aplicao no somente na agriculatura, mas tambm em nvel domstico, na preservao de jardins de casas, clubes e locais de recreao (101). Nos mamferos, quando assimilado, esse composto totalmente excretado via urina sem maiores biotransformaes (102, 103), o que permite a sua dosagem direta em estudos epidemiolgicos (104-107). Alguns EIAs bastante sensveis foram empregados para dosagem de 2,4D na urina, e o nico tratamento da amostra consistiu no ajuste do pH com o prprio tampo do ensaio (33,102,108). O ensaio extremamente fcil e, em alguns casos, foi possvel identificar uma contaminao em trabalhadores rurais, no s do 2,4-D como tambm do seu principal produto de degradao, o (4cloro-2-metilfenoxil)-cido actico (MCPA), mediante a anlise de urina e de smen, diretamente correlacionada com o tempo de exposio do trabalhador ao agrotxico (109). Muitas das vezes a prpria matriz trata de realizar a degradao do pesticida, como o caso do herbicida diclobenil que, no ambiente, rapidamente transformado em 2,6diclorobenzamida (BAM), atravs de uma combinao de processos biticos e no-biolgicos, em geral no hidrosolo. Deste modo, torna-se impossvel a determinao direta do compostopai sem grandes perdas na recuperao. Bruun et al. (110) desenvolveram um EIA altamente seletivo (reatividades cruzadas variando entre < 0,0002 e 10,8 %) e sensvel (IC50 de 0,2 ppb) para dosagem indireta do herbicida na forma de BAM. Trifluralina, um importante herbicida seletivo pr-emergente que apresenta elevada capacidade de ser absorvido pelo solo, tambm tem sido determinado por um ELISA empregando um anticorpo monoclonal, com limite de deteco de 0,1 ppb (111)

b) Inseticidas
Organoclorados (OCs)
Embora a sua utilizao tenha sido proibida em todo o mundo, diversos estudos visando ao monitoramento de resduos de OCs ainda vm sendo conduzidos, devido elevada persistncia desses compostos e de seus produtos de degradao no ambiente. Entre os OCs de maior ocorrncia, destaca-se o 1,1,1-tricloro2,2-bis(4-clorofenil)etano, mais conhecido como DDT. Diversos problemas endcrinos e neurolgicos em humanos tm sido relacionados com a contaminao desse composto e do seu principal metablito, o 1,1-dicloro-2,2-bis(4-clorofenil)etileno (DDE) (112). Poucos EIAs foram desenvolvidos para OCs, devido s dificuldades durante a preparao dos haptenos. Recentemente,
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screening para inseticidas


anticolinesterases

screening para inseticida


organoclorados inseticidas piretrides

P = kit em placa; T = kit em tubo Tabela 3. Alguns kits de imunoensaios comerciais para anlise de pesticidas

j possuem protocolos validados, sendo que, desde 1995, alguns kits de EIAs so considerados mtodos oficiais para screening de amostras de gua (100). Tais mtodos so baseados em um ELISA competitivo, desenvolvido em um formato que utiliza
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Figura 3. Efeito do teor do metanol no tampo PBST sobre a conformao das curvas concentrao-resposta do ELISA desenvolvido para anlise do inseticida carbaril

Anfossi et al. (112) desenvolveram um EIA no-competitivo baseado no mtodo original descrito por Eremenko et al. (113) para a determinao do DDT. Este mtodo baseia-se na separao entre os complexos analito-anticorpo e os anticorpos livres por meio de uma fase cromatogrfica. Brevemente, um excesso do anticorpo (monoclonal) especfico inicialmente misturado ao analito para formar o complexo, e a remoo dos anticorpos que no se uniram ao analito feita mediante o uso de uma coluna de bioafinidade, na qual um analito anlogo encontra-se imobilizado. O complexo passar pela coluna, sem ser fixado a esta, podendo ento ser detectado. No obstante sua simplicidade, o mtodo mostrou-se bastante sensvel (limite de deteco de 8 ng.L-1), tendo sido observada maiores reatividades cruzadas com seus anlogos p,p-DDD e p,p-DDE (RCs de 90 e 75%, respectivamente). Um outro imunoensaio foi desenvolvido para DDT, mas com deteco por quimiluminescncia (114), tendo sido depois aplicado na anlise de amostras ambientais e de alimentos (115).

quantificao dos inibidores de colinesterases, a maioria deles baseados em anticorpos monoclonais (55,71-76,78,116-119). Protocolos mais antigos e menos sensveis empregavam anticorpos policlonais (48,50,53,55,56). Contudo, recentemente foam desenvolvidos tambm anticorpos policlonais que possibilitaram o projeto de ELISAs altamente seletivos e sensveis para anlise de OPs (120,121). Algumas aplicaes em estudos ambientais tm sido relatadas (122-125). A aplicao direta dos imunoensaios em amostras reais algumas vezes difcil, pois, dependendo da natureza da amostra, um forte efeito de matriz pode ser observado. Ns desenvolvemos um estudo de validao do protocolo de um EIA para o inseticida carbaril, atravs da comparao dos resultados obtidos mediante um mtodo cromatogrfico oficial (119). Para a comparao dos resultados, o mesmo extrato metanlico, contendo uma quantidade conhecida do inseticida, foi analisado pelas duas tcnicas, sendo que, para a aplicao do EIA, foi necessria uma diluio do extrato com o prprio tampo do ensaio (PBST). A Figura 3 mostra que o anticorpo policlonal utilizado no estudo resistiu a um teor mximo de 10 % de metanol na amostra analisada. Uma excelente correlao foi encontrada entre os dois mtodos. Este mesmo EIA foi aplicado posteriormente para anlise direta em sucos de frutos (118), e o tratamento da amostra consistiu de uma simples diluio do suco em PBST, seguida de um prvio ajuste do pH para um valor prximo ao do tampo do ensaio. A Figura 4 apresenta uma comparao entre os resultados obtidos com amostras de sucos de limo tratadas e no-tratadas.

iretrides Triazinas Piretrides riazinas e P


Samsonova et al. (94) desenvolveram anticorpos mono e policlonais para determinao de inseticidas piretrides e triazinas. Elevadas sensibilidades foram encontradas para os mtodos desenvolvidos com tais anticorpos; contudo, a tcnica de deteco (quimiluminescncia) no se mostrou muito simples. Watanabe et al. (126) desenvolveram e validaram um ELISA relativamente sensvel (IC50 ~ 22,5 ppb) para anlise do inseticida piretride permetrina, tendo sido determinadas as reatividades cruzadas para seus compostos anlogos (transpermetrina, fenotrina, resmetrina, bioresmetrina, cipermetrina, deltametrina, esfenvalerato, fenvalerato e fluvalinato). Menor reatividade cruzada (0,004 %) foi verificada para fluvalinato, e maior (30,2 %) para trans-permetrina.

N-Methylcarbamatos (NMCs) e Organofosforados (OP (OPs) s)


Esses inseticidas foram primeiramente introduzidos como uma alternativa aos OCs, por apresentarem persistncia no ambiente e potencial de bioacumulao relativamente baixos, alm de um espectro de atuao bastante amplo (116,117). Os princpios ativos pertencentes a essas classes de inseticidas so inibidores da enzima acetilcolinesterase, que participa nos processos de transmisso de impulsos nervosos. Devido atual intensa aplicao desses compostos, sua monitorizao de fundamental importncia, sobretudo para a garantia de vida nos ecossistemas. Diversos EIAs tm sido desenvolvidos para deteco e
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Outros inseticidas
Para determinao especfica do inseticida sistmico imidaclopride, foi desenvolvido um ELISA bastante sensvel (IC50 = 6,2 nM) baseado em anticorpos monoclonais (127,128). O inseticida regulador de crescimento dos insetos fenoxicarb pode ser determinado pelos ELISAs competitivos baseados em anticorpos policlonais (129); este imunoensaio foi aplicado a anlises rpidas em plantaes de ma pulverizadas com o pesticida (130).
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(134); projetos de ensaios multiresiduais; o surgimento de diversos mtodos envolvendo cromatografia por imunoafinidade (133); o desenvolvimento de imunoensaios hifenados com FIA (Flow Injection Analysis) (135, 136) e a Cromatografia por Bioafinidade (117). Uma grande ateno tem sido devotada aos kits de imunoensaios para deteco/quantificao de resduos de pesticidas, principalmente os de ltima gerao, cuja polaridade varia de mediana a alta, e que tm sido freqentemente encontrados nos ambientes aquticos, na biota e tambm nos alimentos. Na maioria dos casos, em menos de uma hora de anlise pode-se ter uma resposta, sendo que a grande vantagem do uso desses kits, alm da rapidez, a possibilidade de se analisarem inmeras amostras ao mesmo tempo. Imunossensores automatizados e, na maioria dos casos, operando em FIA, tm sido tambm desenvolvidos para anlise de pesticidas, e uma nova categoria de sistemas analticos foi descrita pela primeira vez em 1992, dando origem aos sistemas de imunoanlises por injeo em fluxo (do ingls, Flow-Injection Immunoanalysis Systems, FIIA) (137). Em geral, os biossensores dispensam o tratamento da amostra, principalmente se esta for lquida ou pastosa, sendo ainda muito mais rpidos e sensveis que os mtodos convencionais. Contudo, o desenvolvimento de imunossensores em fluxo no tem sido uma tarefa fcil, e vrias pesquisas tm sido conduzidas visando ao melhoramento dos sistemas em FIIA (138-141).
Figura 4. Efeito do pH e da diluio com tampo PBST, sobre o imunoensaio ELISA aplicado anlise de carbaril em sucos de limo. (A) suco com pH natural (~2,08); (B) suco com pH ajustado a 7,5 com gotas de NaOH 2mol.L-1

Concluses
Entre os mtodos analticos para deteco e quantificao de pesticidas, os imunoensaios tm merecido destaque, pois combinam caractersticas altamente satisfatrias para a sua utilizao em programas de monitoramento, tais como simplicidade operacional e elevadas sensibilidade e rapidez. Este artigo apresenta alguns dos avanos atuais no desenvolvimento de imunoensaios para anlise de pesticidas, dando nfase aos mtodos imunoqumicos baseados na marcao enzimtica (ELISAs). Tcnicas de preparo online de amostras, denominadas, por sua eficincia ecolgica, como environmentally friendly analytical techniques, que empregam a microextrao em fase slida (SPME) e a extrao por soro em barra magntica (SBSE), podem vir a solucionar problemas de seletividade, de sensibilidade e de efeitos de matriz, em formatos para os quais foram desenvolvidos anticorpos ainda no totalmente seletivos. Certamente, pesquisas futuras estaro voltadas para essa direo, e tambm para o aperfeioamento das tcnicas de acoplamente covalente das enzimas fase slida, no desenvolvimento especfico da cromatografia por bioafinidade.

Um teste rpido foi desenvolvido para diflubenzuron, um inseticida do grupo dos compostos fenilurias (131).

c) F ungicidas Fungicidas
De todas as classes de pesticidas, os fungicidas tm sido menos estudados, com relao ao desenvolvimento de imunoensaios. Em geral, muito difcil sintetizar os haptenos para as suas molculas, mas alguns kits de anlise rpida pdem ser encontrados no mercado, j tendo sido aplicados para no monitoramento de resduos do fungicida procimidona em amostras vegetais (132).

Principais Avanos no Campo dos EIAs para Anlise de Pesticidas


Os avanos mais recentes na rea dos mtodos imunoqumicos incluem: o desenvolvimento de novos formatos de ensaios (14,133), inclusive envolvendo deteco por tcnicas altamente sofisticadas, como o caso da polarizao fluorescente
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Agradecimentos
A autora agradece o apoio do CNPq (Conselho Nacional de desenvolvimento Cientfico-Tecnolgico) pelo suporte financeiro.
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