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Hernndez Betancourt, Oscar; Ulloa Cuesta, Yaidimi; Ro Mndez, Douglas del; Carmen Galds, Mara del STAPHYLOCOCCUS AUREUS Y SU IDENTIFICACIN EN LOS LABORATORIOS MICROBIOLGICOS. REVISIN BIBLIOGRFICA Archivo Mdico de Camagey, vol. 9, nm. 1, 2005 Centro Provincial de Ciencias Mdicas de Camagey Camagey, Cuba
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Archivo Mdico de Camagey 2005; 9(1) ISSN 1025-0255

Instituto Superior de Ciencias Mdicas Carlos J. Finlay. Centro de Inmunologa y Productos Biolgicos CENIPBI

STAPHYLOCOCCUS

AUREUS

SU

IDENTIFICACIN

EN

LOS

LABORATORIOS MICROBIOLGICOS. REVISIN BIBLIOGRFICA

Dr. Oscar Hernndez Betancourt*; Lic. Yaidimi Ulloa Cuesta**; Dr. Douglas del Ro Mndez***; Tec. Mara del Carmen Galds****

* ** *** ****

Doctor en Ciencias Biolgicas e Investigador Auxiliar. Licenciada en Ciencias Farmacuticas. Doctor en Medicina Veterinaria. Tcnica en Microbiologa.

RESUMEN
Se realiz un compendio con ms de 30 publicaciones que abordan las nuevas investigaciones sobre los principales elementos que intervienen en el mecanismo de infeccin y los mtodos diagnsticos ms utilizados para la deteccin del Staphylococcus aureus por parte de los laboratorios microbiolgicos en el mundo y Cuba. Nuevas molculas que contribuyeron al proceso infectivo del ente se encuentran en fase de estudio, para algunas de ellas se describi su papel en el mecanismo. El mtodo ms difundido en nuestro pas es el ensayo de la coagulasa en tubo. Se decidi informar los mtodos ms utilizados en el diagnstico de esta entidad, incluyendo los ms recientes, an en fase de estudio y estandarizacin en algunos casos, as como brindar algunos de los elementos bsicos o factores que intervienen en el mecanismo de infeccin.

DeCS: STAPHYLOCCUS AUREUS; LABORATORIOS; MICROBIOLOGA

INTRODUCCIN
El Staphylococcus aureus es el causante de un gran nmero de infecciones graves como

infecciones por heridas, septicemias, endocarditis y osteomielitis. El correcto diagnstico de los grmenes causantes de infecciones en pacientes, tanto hospitalizados como ambulatorios es importante al abordar el tratamiento adecuado para su eliminacin. El cultivo de lquidos y secreciones corporales en los laboratorios microbiolgicos permite el aislamiento de varias especies patgenas entre las que se encuentran los S. aureus, la cual constituye la especie de mayor importancia clnica humana dentro del gnero1. Su crecimiento en medio slido est caracterizado por colonias circulares de bordes lisos, de color gris a amarillo dorado intenso. En ocasiones se encuentra presente en la microbiota normal, en cambio en otros pacientes puede ser el agente etiolgico de diversas enfermedades, fuera del hombre o animal, carecen de un hospedero significativo. En el primero, se encuentran principalmente en la nariz y las superficies cutneas y su transmisin generalmente es por contacto persona a persona.2,3La mayor incidencia de las infecciones se presentan en nios, principalmente neonatos y lactantes,4-6 as como en pacientes sometidos a intervenciones
7-10

quirrgicas,

incrementndose

el

nmero

de

infecciones

nosocomiales.

Se decide realizar un estudio que permita mencionar los mtodos que se utilizan en la actualidad para el diagnstico del S. aureus, y buscar la informacin necesaria para evaluar la eficiencia del mtodo tradicional (prueba de la coagulasa en tubo) empleado en nuestro pas, con la finalidad de mejorar la atencin al paciente en los laboratorios microbiolgicos de las entidades de la red hospitalaria de la regin Centro- Oriental de Cuba, con investigaciones que se llevan a cabo en el laboratorio.

DESARROLLO
Estafilocoagulasa y algunos factores que intervienen en el mecanismo de infeccin El S. aureus coagula el plasma descalcificado debido a la produccin de una enzima conocida por estafilocoagulasa que acta como un agente activo en la coagulacin capaz de convertir el fibringeno en fibrina. Existe una correlacin positiva entre la presencia de la misma y la virulencia del patgeno en humanos.11, 12 La enzima se encuentra presente en dos formas 3. Coagulasa libre: Es una protena extracelular, que se encuentra presente en los filtrados de cultivos, la misma reacciona con el factor reactivo de la coagulasa (FRC) presente en el

plasma, para formar una sustancia similar a la trombina (estafilotrombina), acta indirectamente en la conversin del fibringeno en fibrina.

Coagulasa ligada: La coagulasa ligada o factor de aglutinacin no est presente en filtrado de cultivos. Convierte el fibringeno en fibrina insoluble de forma directa sin intervencin de los factores plasmticos.

La funcin de la coagulasa in vivo no ha sido todava aclarada y an queda en el campo especulativo, aunque est bien esclarecido, que esta enzima est implicada en el desarrollo de los abscesos, mediante la formacin de una capa de fibrina alrededor de la lesin, lo que impide la localizacin y fagocitosis del agente patgeno. 2 Se identificaron otros factores que intervienen en la patogenesidad del mismo mediante el mecanismo de la coagulacin. La expresin de estos factores empleando las tcnicas de recombinacin gentica en microorganismos poco patgenos como Lactococcus lactis, permiti conocer que los mismos se encuentran directamente asociados a su patogenicidad.13,14 Entre los mas estudiados aparecen: Protena A de unin a la fibronectina (fnbA): tiene afinidad por el receptor de las inmunoglobulinas con lo que evita de modo eficaz la eliminacin inmunolgica mediada por anticuerpos, jugando un papel importante en las infecciones endovasculares, incrementa la adherencia del S. aureus a los ligandos especficos y por consiguiente la liberacin de toxinas que causan la patologa.15,16 Factor de unin celular A (clfA): Conocida como coagulasa ligada, se encuentra en la superficie externa de los S. aureus. El 95 % de las cepas contiene este factor, lo que permite diferenciarlos de otras especies del gnero. Este factor est estrechamente ligado a infecciones como la endocarditis.17-19 Factor de unin al fibringeno extracelular (Efb): Es secretado por el germen,se une a la cadena de fibringeno de forma divalente,20 esta protena, junto a otras, median la adherencia con las protenas del tejido hospedero como: fibrinogeno/fibrina, vitronectina, fibronectina, y el colgeno. Recientemente se identific un Efb que interfiere con las plaquetas,21 no obstante, debe sealarse que esta protena an no est bien caracterizada en los Staphylococcus provenientes de aislamientos clnicos.22 Otras: Protena de adhesin extracelular (Eap) y protena de unin a la protena de la matriz extracelular (Emp), estas protenas al igual que las otras median el proceso de adherencia, en el caso de la Eap (60KDa), se plantea que est estrechamente ligada a la internalizacin de la bacteria a la clula.21,23 Adems de la molculas antes mencionadas, los S. aureus producen un gran nmero de antgenos solubles, entre los que se encuentran otras enzimas como la catalasa, - lactamasa, y antgenos anclados a la membrana, que incluyen entre otras, toxinas como las enterotoxinas (ocho tipos), citotoxinas (cinco tipos), citoxinas exfoliativa (dos tipos) y la toxina de choque txico. Estos

metabolitos son la causa principal de las infecciones postquirrgicas de heridas, implantacin de marcapasos, sitios de desviaciones arteriovenosos externos para hemodilisis, sndrome del shock txico y en el envenenamiento por comidas 3. Ensayos realizados para la determinacin de la coagulasa A continuacin mencionaremos los mtodos mas empleados en los laboratorios microbiolgicos para el diagnstico del S. aureus. a) Prueba de la coagulasa en tubo Constituye la principal prueba que se realiza en los laboratorios microbiolgicos para la identificacin de este germen. Es capaz de detectar ambas coagulasas. Se realiza directamente de una colonia obtenida en la placa de aislamiento, pero es mejor utilizar un crecimiento de 18-24 h en medio lquido enriquecido como la infusin de cerebro-corazn (BHI). La determinacin se evidencia mediante la aparicin de un cogulo en el substrato empleado para la identificacin, que consiste en plasma animal o humano.2,11 b) Prueba de la coagulasa en lmina Se utiliza para determinar la coagulasa ligada. Constituye una forma rpida de identificacin del S. aureus, aunque es solo presuntiva, deben verificarse mediante la prueba en tubo todos aquellos cultivos que den resultados negativos o positivos tardos, ya que algunas cepas no producen factor de aglutinacin. No es recomendable realizar el ensayo de la coagulasa de S. aureus en lmina, pues a pesar de ser ms rpida y econmica, presenta los siguientes inconvenientes:24 - Entre un 10 y un 15 % de las cepas de S. aureus pueden dar un resultado falso negativo. - Las reacciones deben leerse rpidamente porque aparecen resultados falsos positivos si los tiempos de incubacin exceden los 10 s. - Las cepas en estudio no deben provenir de medios que contengan altas concentraciones de sal (agar-manitol salado) porque se presentan reacciones de autoaglutinacin. c) Ensayo de la termonucleasa (desoxiribonucleasa termoestable estafilocccica): El ensayo se realiz por primera vez en la dcada de lo 80. Shanholtzer y Peterson, probaron su factibilidad en la determinacin de cepas de S. aureus cuando lo compararon con otros tres mtodos en 189 aislamientos clnicos. Los autores no encontraron diferencias significativas entre este mtodo y el ensayo en tubo25. Este mtodo es simple, econmico y rpido y brinda resultados fciles de interpretar, est basado en una fosfodiesterasa con propiedades endo y exonucleasas capaces de cortar tanto el ADN como el ARN.26 Esta prueba no sustituye la prueba de la coagulasa en tubo, pero se recomienda que las reacciones de coagulasa 2+ (pequeos cogulos organizados) sean confirmadas por una prueba de termonucleasa antes de considerar S. aureus a los microorganismos investigados.27-29 d) Ensayo de aglutinacin en ltex: Existen varios juegos comercializados a base de ltex como soportes slidos, los cuales tambin surgieron en la dcada del 80 y muestran que son mtodos rpidos y prcticos para la

identificacin del S. Aureus.27, 28No obstante, se han observado falsos positivos en el uso de alguno de stos, lo que conlleva a la determinacin de otras caractersticas tpicas de la especie para diferenciarla29. Estudios recientes plantean que este mtodo presenta una alta sensibilidad y especificidad, y permite adems la deteccin de otras especies de estafilococos coagulasa positiva (S.intermedius y S. lycus)30 aunque no permite distinguir entre stas. e) Ensayos inmunoenzimticos (ELISA): Estos mtodos han revolucionado el diagnstico clnico y microbiolgico en los pases desarrollados, el mismo se basa en el reconocimiento inmunolgico de algunos antgenos o factores presentes en el agente patgeno. Los primeros ELISAS destinados al reconocimiento de antgenos especficos del S. aureus surgieron a principio de los aos 80. Varias son las molculas seleccionadas para tales fines, entre las que se encuentran: peptidoglicanos, cido teicoico, toxinas, lipasas, y polisacaridos capsulares31-33. El uso de algunas de estas molculas permiti diferenciar entre pacientes con endocarditis por S. aureus e individuos sanos (controles negativos)34. Aos ms tarde se disearon experimentos encaminados a estudiar y estandarizar un ELISA que emple anticuerpos monoclonales (AcMs) dirigidos a reconocer los ttulos de anticuerpos levantados contra la protena A de unin al fibringeno celular, extracelular (Efb), y al factor de unin o "clumping factor" (Clf) en suero de pacientes con septicemia18. Los estudios realizados con individuos sanos mostraron niveles variables de anticuerpos levantados contra los antgenos estudiados, no se observ correlacin entre los niveles de anticuerpos para Clf y Efb, aunque para este ltimo se evidenci su presencia en la fase tarda de la enfermedad. Se experiment la produccin in vivo de la protena A de unin a la fibronectina del S. aureus, as como se evidenci el posible papel diagnstico de los anticuerpos generados contra estas protenas. Matsuka et al.35, realizaron estudios que mostraron los diferentes grados de interaccin que presenta la protena A de unin a la fibronectina (recombinante), con el fibringeno, fibronectina y la fibrina. Recientemente se public una investigacin que demuestra el empleo de las enterotoxinas A y B para el montaje del ELISA,36 no obstante, los resultados obtenidos con estos mtodos inmunolgicos, no han sido conclusivos debido a la presencia de anticuerpos especficos para estas toxinas en la mayora de los sueros de pacientes normales. f) Identificacin mediante medios de cultivos: Tradicionalmente los Staphylococcus son identificados presuntivamente antes de tener una caracterizacin definitiva en medios de cultivos no especficos como el agar sangre. En 1994 se prob un nuevo mtodo para la identificacin del S. aureus, basado en la deteccin fluorognica de la coagulasa mediante la incorporacin en el medio de cultivo de substratos cromognicos para la fosfatasa alcalina y la B-galactosidasa 37. El RAPIDEC-Staph como se le denomin se evalu con 303 cepas de Staphylococcus. La comparacin con varios mtodos convencionales evidenci el reconocimiento del 100 % de las cepas S. Aureus, se observ que la especificidad y sensibilidad del mtodo vari en relacin de la especie a identificar. Recientemente Gaillot y et al.38 ensayaron

un mtodo cromognico altamente especfico para la identificacin de S. aureus basados en la formacin de colonias malvas posterior a las 18 h de incubacin. El mtodo presenta una excelente sensibilidad y especificidad, superiores a otros mtodos convencionales y permite el recobrado o aislamiento de muestras clnicas que no fueron detectadas en el medio agar sangre. Se mencionaron seis mtodos donde se expusieron algunas ventajas e inconvenientes que presentan estos. Un aspecto no analizado en la literatura revisada, fue el alto costo de estas tcnicas en el mercado internacional, que impide o dificulta la generalizacin de los mismos en pases subdesarrollados, estos tuvieron que valerse de las tcnicas ms simples pero no menos tiles, establecidas hace varias dcadas y que se mantienen vigentes por los buenos resultados que con ellas se obtienen. Los pases con recursos disponibles para las investigaciones destinadas al diagnstico del S. aureus, incorporan tcnicas de avanzadas descritas en esta revisin, donde los mejores resultados se lograron con medios de cultivos que incluyen substratos cromognicos, que permitieron obtener ndices de especificidad y sensibilidad elevados.

CONCLUSIONES
1. 2. La mayor incidencia del S. aureus, se present en infantes, fundamentalmente en neonatos y lactantes, as como en pacientes intervenidos quirrgicamente. La prueba de la coagulasa en tubo es la tcnica mas extendida y establecida en Cuba, mostr resultados que varan en cuanto a los ndices de positividad obtenidos, en dependencia del plasma empleado, lo cual gener nuevas investigaciones por parte de nuestro grupo. 3. Los ELISAS no se encentraron bien establecidos para el diagnstico in vitro de esta enfermedad. Pocos laboratorios emplearon la presencia de antgenos especficos del S. aureus para tales fines, por no existir una molcula que brinde una especificidad adecuada que permita obtener resultados altamente confiables y un sistema correctamente estandarizado. 4. Los mejores resultados obtenidos en el diagnstico de esta enfermedad se obtuvieron con los mtodos basados en medios de cultivos con substratos cromognicos incorporados, que mostraron altos ndices de especificidad y sensibilidad comparado con los restantes mtodos aqu mencionados para el diagnstico in vitro

ABSTRACT
A compendium of more than 30 publications which covered new investigations about main elements that intervened in the mechanisms of infection was performed, and diagnostic methods

more used for the detection Sthaphyloccus aureus in microbiologic labs in the world and Cuba. New molecules that contributed to the infective process are in the study phase, for some of them its role in the mechanism was described. The method more expanded in our country is the essay of coagulase in tube. It was decided to inform the methods most used in the diagnosis of this entity, including the most recent, even in study phase and standardization in some cases, as well as to give some of the basic elements or factors that participate in the infection mechanism.

DeCS: STAPHYLOCOCCUS AUREOUS; LABORATORIES; MICROBIOLOGY

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Dr. Oscar Hernndez Betancourt. Edificio 26 plantas, Piso 23, Apto 6. Plaza de la Revolucin. Camagey. oscar@finlay.cmw.sld.cu