Identificacin de los sitios de unin a cobre de lacasa fngica

Identificacin de los sitios de unin a cobre de lacasa fngica.

Rivera Jocelyn

INTRODUCCIN Lacasas ( EC 1.10.3.2) son metaloenzimas que pertenecen a la familia de las multicobre oxidasas (MCO). Catalizan la oxidacin de un amplio espectro de compuestos fenlicos y aminas molecular aromticas como utilizando aceptor de el oxgeno

de vida. Estas enzimas estn siendo cada vez ms evaluadas para una variedad de aplicaciones biotecnolgicas, debido a su amplia gama de sustrato. La utilizacin de sistemas mediador-lacasa son una alternativa promisoria para procesos biotecnolgicos con aplicaciones ambientales5, entre ellos, el blanqueo de la pulpa de papel, decoloracin de colorantes textiles y oxidacin de hidrocarburos polinucleoaromticos 6. La identificacin y caracterizacin de las especies y de cepas de hongos productores es importante, hoy en da las herramientas bioinformticas son de gran ayuda para poder predecir si ciertas especies son viables de utilizar en un sistema de produccin lo que ahorrara significativamente tiempo y recursos. En el presente trabajo se realiz la comparacin de las secuencias de aminocidos de diferentes basidiomicetos a fin de determinar las secuencias conservadas de la enzima lacasa. RESULTADOS Y DISCUSIN Motivos conservados Los basidiomicetos utilizados tambin se denominan como hongos de la podredumbre blanca (white rot fungi) en los que se ha descrito a la lacasa como un componente importante en su sistema enzimtico 7.

electrones,

reducindolo a agua. Esta gran versatilidad funcional se debe en parte al hecho de que lacasas poseen baja especificidad de sustrato y exhiben una amplia gama de potenciales redox 1. Todas las lacasas son glicoprotenas extracelulares que poseen cuatro tomos de cobre en su estado de oxidacin que les confieren una coloracin azul 2. Este proceso redox esta mediado por centros que contienen cuatro tomos de cobre en su estado de oxidacin. Estos tomos se clasifican como T1, T2 o T3 3. Incluye un tipo-1 (T1) de cobre (Cu1), y un tipo-2 (T2) y dos iones de cobre tipo 3-(T3) (Cu2 and Cu3) 1. Los hongos filamentosos son particularmente importantes debido a su relativa facilidad de manejo, costos reducidos, variedad y los niveles de las actividades enzimticas que son capaces de producir. Sin duda, esto se deriva de su diversidad metablica inherente que se refleja en su capacidad para crecer en una amplia gama de sustratos y condiciones en su entorno natural . En los hongos, las lacasas llevan a cabo una variedad de funciones fisiolgicas durante su ciclo
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Las 13 secuencias utilizadas muestras longitudes similares, que van de 510 a 590 aminocidos. Se identificaron cuatro regiones conservadas en las secuencias al usar MEME suit (Imagen 1A), esto coincide ya que las lacasas se distinguen por la presencia de cuatro secuencias de consenso, L1L4, que poseen una longitud de entre 8 y 25 residuos de aminocidos y se distribuyen a lo largo de la cadena polipeptdica . Dentro de estas regiones, se encuentran los restos de A partir de los alineamientos se obtuvo el rbol filogentico al emplear el mtodo de Mxima probabilidad (Maximum Likelihood) y se evalu la fiabilidad del rbol por el mtodo de bootstrap (Figura 2). aminocidos que sirven como ligandos para los tomos de cobre, que son crticos para mantener el plegamiento conformacional de la enzima
9,10 8

Anlisis filogentico Al realizar el alineamiento de las secuencias, se gener una matriz de similitud de las secuencias de aminocidos (datos no mostrados) en la que los dos hongos del genero Phanerochaete mostraron un porcentaje de similitud bajo (34%) en comparacin con las dems especies (de 58% a 90%).

en la tabla 1 se realiza una comparacin de las secuencias consenso obtenidas mediante MEME suit y las reportadas , se puede observar que son muy similares, salvo la secuencia del sitio de unin a cobre L4 que nicamente se nota ligeramente desplazada.
1

Tabla 1. Comparacin de las secuencias de los cuatro motivos para la unin a cobre en la enzima lacasa.
Sitio de unin L1 HWHGFFQKGTNWADGPAFINQCPI GTFWYHSHLSTQYCDGLRG[PA][FL]VVYD L2 GTFWYHSHLSTQYCDGLRGPF HPFHLHGH[TA]F[AS]VVRSAGS[TS][ETV]Y L3 HPFHLHGH DNVTIRFRT[DN]NPGPWFLHCHID[FW]HL L4 GPWFLHCHIDFHLEAGFAVVF
1 1 1

Motivo

IHWHGFFQ[HKN]GTNWADG[PT]A[FG][VI][NT]QCPI
1

Figura 2. rbol filogentico basado en el alineamiento de las secuencias de lacasa.

Los resultados obtenidos en el rbol filogenticos coinciden con lo reportado previamente en estudios filogeneticos, discriminados por una donde los hongos se cierto residuos incluye de a dividen en varios grandes grupos o subfamilias aminocidos, agrupacin

Hasta el momento se han reportado las estructuras cristalizadas de algunas lacasas en PDB, en este caso se utiliz la estructura tridimensional de Trametes trogii (Figura 1B), en la que se realiz la identificacin de los motivos y la interaccin de ellos con los tomos de cobre (Figura 1C y D).

Phanerochaete que se caracteriza por tener cadenas carboxilo terminal largas y en otro grupo estn incluidos Trametes que se caracterizan por cadenas carboxilo terminal cortas11.

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Figura 2. Motivos a partir de las secuencias de aminocidos lacasa. (A) los cuatro motivos T1-T4 se identificaron en las trece secuencias al utilizar la herramienta bioinformtica MEME suit, los motivos se ubican en zonas similares a lo largo de la cadena de aminocidos. Estructura tridimensional de lacasa de T. trogii elaborado con PyMol con base en los datos de PDB, (B) estructura de la lacasa con los cuatro cobres unidos (esferas color naranja). (C) se representan los motivos dentro de toda la estructura de la lacasa, (D) solo se resaltan los cuatro motivos de unin a cobre.

CONCLUSIONES Se identificaron cuatro motivos en las trece secuencias de aminocidos de la enzima lacasa, tales secuencias consenso mostraron corresponder a los sitios de unin a cobre. El porcentaje de similitud entre las secuencias es de superior a 58% con excepcin del genero Phanerochaete con 34%.
METODOLOGA Identificacin de motivos A partir de la secuencia de aminocidos de Trametes versicolor (gi 4218524), se realiz un anlisis en BLAST y con base en los resultados, desde la base de datos del NCBI GenBank, se obtuvieron las secuencias diversos basidiomicetos: Lenzites gibbosa (gi 348609402), Coriolopsis caperata (gi 445065172), Trametes gibbosa (gi 300433291), Stropharia aeruginosa (gi 380750098), Leucoagaricus gongylophorus (gi 409151715), Dichomitus squalens LYAD421 SS1 (gi 395334871), Polyporus ciliatus (gi 9957145),

Phanerochaete flavidoalba (gi 148888431), Phanerochaete chrysosporium (gi 28416421), tremellosa (gi 109287624). La bsqueda de motivos se realiz se MEME suit introduciendo las secuencias de aminocidos. Posteriormente con las secuencias obtenidas con MEME suit se identificaron los motivos tridimensionalmente con PyMol usando como referencia la estructura cristalizada de lacasa de Trametes trogii disponible en la base de datos Protein Data Bank (PDB). Anlisis filogentico El alineamiento mltiple se realiz en UGENE con MUSCLE usando los parmetros predeterminados, los alineamientos obtenidos se ajustaron manualmente, adems se obtuvo la matriz de similitud. Basados en los alineamientos generados, los rboles filogenticos se construyeron con MEGA 5.0 a travs del mtodo de mxima parsimonia, la significancia estadstica se evalu con bootstraping de 500 repeticiones. Coriolopsis rigida (gi 255918284), Phlebia brevispora (gi 402478663) y Phlebia

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REFERENCIAS 7. 1. Giardina, P. et al. Laccases: a never-ending story. Cellular and molecular life sciences: CMLS 67, 36985 (2010). Han, M.-J., Choi, H.-T. & Song, H.-G. Degradation of phenanthrene by Trametes versicolor and its laccase. Journal of microbiology (Seoul, Korea) 42, 948 (2004). Quintanar, L. et al. Shall We Dance? How A Multicopper Oxidase Chooses Its Electron Transfer Partner An Introduction to Multicopper Oxidases. 40, 445452 (2007). MacCabe, a P., Orejas, M., Tamayo, E. N., Villanueva, a & Ramn, D. Improving extracellular production of food-use enzymes from Aspergillus nidulans. Journal of biotechnology 96, 4354 (2002). Camarero, S. & Ibarra, D. Lignin-Derived Compounds as Efficient Laccase Mediators for Decolorization of Different Types of Recalcitrant Dyes. 71, 17751784 (2005). Hidalgo-lara, M. E. PRODUCCIN DE LA ENZIMA LACASA POR EL HONGO Cladosporium cladosporioides EN PRESENCIA DE FENANTRENO. 58 (2005). 8. Tapia-tussell, R. et al. New laccaseproducing fungi isolates with biotechnological potential in dye decolorization. 10, 1013410142 (2011). Bertrand, T. et al. Crystal structure of a four-copper laccase complexed with an arylamine: insights into substrate recognition and correlation with kinetics. Biochemistry 41, 732533 (2002). Courty, P. E. et al. Phylogenetic analysis, genomic organization, and expression analysis of multi-copper oxidases in the ectomycorrhizal basidiomycete Laccaria bicolor. The New phytologist 182, 73650 (2009). Czares-Garca, S. V., VzquezGarcidueas, M. S. & Vzquez-Marrufo, G. Structural and phylogenetic analysis of laccases from trichoderma: a bioinformatic approach. PloS one 8, e55295 (2013). Mkel, M. R. The white-rot fungi Phlebia radiata and Dichomitus squalens in woodbased cultures: expression of laccases , lignin peroxidases , and oxalate decarboxylase. 2, (2009).

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