El Manual de Laboratorio de la Organizacin

Mundial de la Salud para el examen del semen humano y de la interaccin entre el semen y el moco cervical, fue publicado por primera vez en 1980 en respuesta a una creciente necesidad de estandarizacin de los procedimientos para el examen de semen humano.

Objetivo General
Unificar criterios en la realizacin de los parmetros informados en el estudio del Semen Humano, siguiendo los lineamientos de la OMS.

Objetivos Especficos
1 Contribuir de manera eficiente con
la evaluacin del funcionamiento del espermatozoide aportando informacin fidedigna al clnico como apoyo al estudio de la subfertilidad masculina.
2 Aportar informacin necesaria sobre el plasma seminal.

Contenido
Captulo I: Conocimiento del aparato genital

masculino y formacin del lquido seminal (semen).

Captulo II: Tcnicas de Laboratorio:

-Procedimientos estndar -Procedimientos opcionales -Procedimientos de investigacin -Control de calidad

Introduccin
Qu es, para qu sirve y cmo se produce el semen? Estas son preguntas que han venido evolucionando a lo largo de la historia, y han encontrado respuestas que en la actualidad nos pudieran parecer cmicas

Antecedentes
Semen siempre relacionado a sexuidad Aristteles (348-322 a.C.), consider el hecho de ser

mujer como un defecto natural (misgino!) El esperma masculino es cocido a partir de la sangre y su equivalente en la mujer es la sangre menstrual, un licor que no ha sufrido dicha metamorfosis

Griegos
Primera mitad del Siglo III, Digenes Laercio:

Lquido que se forma en el cerebro y fluye a gotas.

Los mdicos consideraban que los testculos

femeninos lo producian y a travs de las trompas llegaban a la matriz y eyaculara durante el coito.

Edad Media.
La fabrica de los espermatozoides esta en la columna vertebral, por lo tanto los lomos son considerados la sede de la lujuria masculina; esta hiptesis quedo definida por la frase en latn que significa por la deshonestidad del deseo

Conocimiento del aparato genital masculino y de la formacin del lquido seminal como base para comprender las alteraciones que se puedan observar en el estudio del semen y establecer correlacin entre los diferentes parmetros que se evalan.

 Producen espermatozoides y las hormonas que

Testculos

regulan la vida sexual masculina. Ambas funciones estn controladas por un sistema hipotlamo-hipofisiario. Alcanzan su tamao adulto alrededor de los 16 aos (4 cm de longitud y un volumen de 15-25 mL) Se encuentran protegidos por el escroto, que es una bolsa de piel y tejido muscular. El 60% de su volumen est ocupado por los tbulos seminferos. Aportan el 5% del volumen del semen.

Tbulos seminferos
En

su interior se lleva a cabo Espermatognesis Clulas espermticas (espermatogonias) Clulas de Leyding Clulas de Sertoli Suponen el 60% del volumen testicular

la

CELULAS DE LEYDING
- Clulas polidricas dispuestas en grupos en los

intersticios entre los tbulos seminferos. - La disfuncin de las clulas de Leyding suele provocar una espermatognesis defectuosa (Probable infertilidad). - Responsables de producir la testosterona por influencia de LH.

Clulas de Sertoli
Revisten la membrana basal de los

tbulos

seminferos. Proporcionan a las clulas germinales el ambiente adecuado para su diferenciacin Fagocitan clulas germinales daadas y cuerpos residuales. Secretan protena fijadora de andrgenos.

Epiddimos
Conducto de 5-6 m de longitud, enrollado. Se almacenan y maduran los espermatozoides

antes de ser eyaculados. Contribuye con poco menos del 10% del volumen del semen Produce protenas esenciales para la motilidad En su porcin final forma el conducto deferente.

Epididimos
Juegan un papel crucial en la maduracin de os espermatozoides y en la adquisicin de su capacidad de movilidad progresiva y por lo tanto capacidad fecundante. Su marcador en plasma seminal es la Alfaglucosidasa neutra.

Conductos deferentes o Vasos deferentes

o Llevan los espermatozoides del epiddimo a la

vescula seminal.
o Almacenan los espermatozoides hasta antes de la

eyaculacin.

Vesculas seminales
Produce

una secrecin azucarada altamente viscosa (fructuosa) que proporciona energa a los espermatozoides. Alto contenido de flavinas (fluorescencia). pH neutro a ligeramente alcalino. Produccin del sustrato responsable de la coagulacin post-eyaculatoria. Contribuye con el mayor volumen del semen o lquido seminal (60-70%).

Prstata
Secreta un lquido lechoso estimulante de los

espermatozoides, con un alto contenido de cido ctrico (pH 6.5) Este lquido es rico en fosfatasa cida, responsable del proceso de licuefaccin del lquido seminal. Contribuye con aproximadamente el 20-30% del volumen total del semen.

Uretra
Transporta y expulsa al exterior tanto la orina (desde la

vejiga) como el semen (desde la prstata).

Reproduccin
Capacidad de los seres vivos para perpetuarse y dar lugar a otros individuos semejantes a ellos. Se inicia con la produccin de gametos: Mujer: vulos (ovognesis) Hombre: Espermatozoides (espermatognesis)

Espermatognesis
Proceso por el cual se forman los espermatozoides. Se lleva a cabo en los testculos, al interior de los

tbulos seminferos (donde se encuentran las clulas germinales o espermatogonias) Presenta regulacin hormonal. Es un proceso en que estn implicados procesos de mitosis y meiosis

CLULAS GERMINALES Espermatogonias

Final de la embriognesis existen 300,000

espermatogonias/gnada.
A la pubertad 600, 000 000 clulas/gnada Etapa de madurez sexual 100, 000,000de

espermatozoides/da
Ms de un trilln de espermatozoides en la vida

reproductiva

Primera etapa: Transformacin de Espermatogonias a Espermatocitos

Cada espermatogonia se divide en aproximadamente 24 horas y forma dos Espermatocitos primarios, despus el DNA de cada clula se replica en los 46 cromosomas y forma dos cromtides unidas por un centrmero
Inicia la meiosis, las cromtidas se separan, las clulasse dividen y se forman dos clulas hijas que son Espematocitos secundarios cada una con 23 cromosomas.

Segunda etapa: Formacin de Espermtidas

2 a 3 das despus deformado el espermatocito

secundario, ocurre una segunda divisin meitica

Cada clula da origen a dos nuevas clulas

denominadas Espermtidas, de las cuales cada una contiene 23

Tercera etapa: Transformacin de espermtidas a espermatozoides

1) Compactacin de la Cromatina Nuclear: Contiene la informacin gentica que se transmite va paterna.

2) Formacin del Acrosoma: Se realiza a partir del aparato de Golgi; es esencial para la penetracin del oocito 3) Formacin de la pieza media: es por eliminacin de citoplasma y re-arreglo de las mitocondrias.

ESPERMATOGNESIS
ESPERMATOGONIA ESPERMATOCITO PRIMARIO

ESPERMATOCITO SECUNDARIO
ESPERMATIDA ESPERMATOZOIDE

Parte I:Procedimientos
Estndar: se realizan de manera ordinaria y bajo

condiciones establecidas y controladas. Opcionales: Su realizacin se solicita y justifica segn los resultados obtenidos de los procedimientos estndar Investigacin: Se realizan a parejas con condiciones de infertilidad de causa idioptica por sospecha establecida por procedimientos estndar y/u opcionales

Procedimientos estndar
1.Recoleccin de la muestra 2.Examen macroscpico 3.Examen microscpico inicial 4.Movilidad espermtica 5.Vitalidad espermtica 6.Cuantificacin espermtica de rutina 7.Cuantificacin espermtica baja: criptozoospermia y sospecha de azoospermia 8.Cuando una evaluacin precisa del nmero bajo de espermatozoides no se requiere

9. Cuando una evaluacin precisa del nmero bajo de espermatozoides se requiere 10. Conteo de clulas diferentes a espermatozoides: clulas germinales inmaduras y leucocitos 11. Morfologa espermtica y mtodos de tincin

Procedimientos opcionales
1.

2.
3. 4. 5. 6.

ndice de defectos mltiples en los espermatozoides Inmunohistoqumicia: tincin para CD45 Interaccin entre el espermatozoide y el moco cervical Pruebas bioqumicas para evaluacin de la funcin de glndulas sexuales accesorias Anlisis seminal asistido por computadora (CASA) Pruebas para anticuerpos adheridos a los espermatozoides

Procedimientos de Investigacin
1.
2. 3. 4. 5.

6.

Especies oxgeno reactivas Pruebas de interaccin esperma humano-ovocito Pruebas de unin a la zona pellucida humana Valoracin de la reaccin acrosomal Prueba de penetracin del ovocito de hmster sin zona pellucida Valoracin de la cromatina espermtica

Parte II: Preparacin espermtica

Tcnicas de preparacin espermtica

Criopresevacin de espermatozoides

Parte III: Aseguramiento de la Calidad

Control de calidad en el labortorio de androloga
Naturaleza de los errores en el anlisis de semen

Error mnimo estadstico debido al muestreo

El programa de aseguramiento de la calidad

Manual de procedimientos de laboratorio

Control de calidad interno

 Procedimientos estadsticos para el anlisis y

presentacin de informes dentro y entre errores sistemticos tcnicos Control de calidad para porcentajes Evaluacin de Xbar y cartas S Procedimientos estadsticos para anlisis y reporte dentro de variables tcnicas Control de calidad externo y garanta de calidad Frecuencia y prioridad del control de calidad

1.Existe evidencia de que la calidad de las muestras de semen vara en funcin de cmo se produce la eyaculacin. Un eyaculado producido por masturbacin y recolectado en un recipiente en una habitacin cerca al laboratorio, pueden ser de mayor calidad que la recuperada de los condones sin espermicida usado durante el coito en el hogar o por coito interrupto.

2. El total de la muestra debe ser recolectada: La primera fraccin, rica en fluidos prostticos, contiene la mayor cantidad de espermatozoides, mientras que la fraccin posterior es rica en lquido proveniente, de vesculas seminales. Por lo tanto, la prdida de la primera parte induce un error de conteo muy alto.

3. La actividad de las glndulas sexuales debe ser considerada, pues la cantidad de lquidos ah producidos influye en el nmero total de espermatozoides eyaculados: concentracin espermtica multiplicado por el volumen del semen.

4.Tiempo transcurrido desde la actividad sexual ms reciente: En ausencia de la eyaculacin, los espermatozoides se acumulan en el epiddimo y luego de desbordamiento en la uretra se eliminan en la orina. La vitalidad espermtica y la cromatina se ven afectados por una mayor duracin de la abstinencia.

5. El tamao de los testculos, influye en el nmero total de espermatozoides por eyaculado y tambin afecta a la morfologa espermtica.

La gran variacin biolgica en la calidad del semen, se refleja en los muchos factores antes mencionados y hace imposible que la caracterizacin de la calidad del semen se pueda realizar con la evaluacin de una muestra nica

Por lo tanto, es til examinar dos o tres muestras para obtener datos de referencia.

Variacin en numero total de espermatozoides y concentracin de esperma en un periodo de 18 meses.

Actividades en funcin del tiempo

a) En los primeros 5 minutos: Colocar el recipiente con la muestra a 37 C hasta que se lleve a cabo la licuefaccin.

b) Entre los 30 y 60 minutos:

-Evaluar la licuefaccin, aspecto y pH -Realizar una preparacin hmeda para la evaluacin inicial microscpica, movilidad delos espermatozoides y determinacin de la dilucin necesaria para evaluar el nmero de espermatozoides. -Evaluar la vitalidad espermtica. -Hacer frotis de semen para evaluar la morfologa -Hacer diluciones de semen para evaluar la concentracin y nmero total de espermatozoides - Evaluar la presencia de clulas peroxidasa positivas. - centrifugar el semen para la realizacin de pruebas bioqumicas

c) Dentro de las tres horas: -Enviar las muestras al laboratorio de microbiologa (si es necesario).
d) Despus de 4 horas: - Fijacin, tincin y la evaluacin de frotis para la morfologa de los espermatozoides. e) Ms tarde el mismo da o en un da posterior si las muestras se congelan: - Analizar marcadores bioqumicos de glndula accesoria (si es necesario). -Realizacin de la prueba indirecta Immunobead (si es necesario).

La muestras deber ser recolectada: *En una habitacin privada cerca del laboratorio. *Despus de un periodo de abstinencia sexual y alcohlica de entre 2 y 7 das. *Deber ser completa, sin prdida de ninguna de las fracciones. *En un recipiente (proporcionado por el laboratorio) rotulado con los datos solicitados (nombre, fecha y hora de recoleccin).

*Deber ser obtenida por masturbacin y eyaculado en un recipiente de vidrio o plstico, libre de txicos para los espermatozoides. *El contenedor de la muestra debe mantenerse entre 20 C y 37 C, para evitar grandes cambios de temperatura. *Entregar la muestra al laboratorio, mximo una hora post-eyaculacin. *Informar al laboratorio si la muestra recolectada fue incompleta, en cuyo caso se deber repetir la recoleccin.

Confirmacin de la compatibilidad de los recipientes de recoleccin

Seleccionar varias muestras de semen con una concentracin de espermatozoides alto y buena motilidad (control). Colocar la mitad de cada muestra en el mismo nmero de recipientes (seleccionados al azar de un lote) que se desean probar. Evaluar la movilidad espermtica en intervalos de una hora durante 4 horas, a 37 C. Si no hay diferencias en cada evaluacin entre el control y la muestra (P> 0,05 segn lo juzgado por un t de student), los contenedores de prueba puede ser considerados no txicos para los espermatozoides y se podrn utilizar para la recoleccin de esperma.

Recoleccin de muestra para reproduccin asistida y estudio microbiolgico

-El paciente debe de orinar. -Lavarse las manos y el pene con jabn, para reducir el riesgo de contaminacin de la muestra con organismos comensales de la piel. -Enjuagar con abundante agua -Secar las manos y el pene con una toalla desechable. -Eyacular en un recipiente estril.

Recoleccin de la muestra en casa

Se podr realizar solo en circunstancias excepcionales, como una

incapacidad demostrada para producir una muestra por masturbacin en la clnica o la falta de instalaciones adecuadas cerca del laboratorio. Entregar instrucciones escritas al paciente, haciendo hincapi en que la muestra debe ser completa y deber entregarla dentro de 1 hora de recogida. Entregar al paciente un recipiente previamente pesado y etiquetado con los datos pertinentes. Durante el transporte al laboratorio, la muestra debe mantenerse entre 20 C y 37 C.

Recoleccin de la muestra con condn

-Una muestra puede ser recogida en un condn durante las relaciones sexuales slo en circunstancias excepcionales, tales como la incapacidad demostrada para producir un muestra por masturbacin. - Slo los condones especiales de carcter no txico, diseados para la recogida de semen debe ser utilizados. - En el informe se debe de registrar la forma de recoleccin.

Examen Macroscpico inicial

1.
2. 3.

4.
5.

Licuefaccin Viscosidad Aspecto Volumen pH

 Inmediatamente despus de la eyaculacin en el recipiente de

recoleccin, el semen es normalmente una masa coagulada semislida. Dentro de unos minutos a temperatura ambiente, el semen por lo general comienza a licuarse (se vuelven ms fluido), momento en el que se convierte en una mezcla heterognea fluida con algunos grumos. Como sigue la licuefaccin, el semen se convierte en ms homogneo y muy acuoso, y en las etapas final slo pequeas reas se siguen observando como cogulo. Generalmente licua en un plazo de 15 minutos aunque rara vez puede tardar hasta 60 minutos o ms. Si la licuefaccin no se produce dentro de los 60 minutos, esto deber quedar registrado. Comnmente algunas muestras pueden contener grnulos gelatinosos que no se lican, stos no parecen tener ningn significancia clnica. La presencia de filamentos de moco, sin embargo, pueden interferir en el anlisis del semen

Licuefaccin tarda
De vez en cuando las muestras no pueden licuarse, lo que dificulta la evaluacin del semen, en estos casos un tratamiento adicional es necesario. 1. Algunas muestras pueden ser inducidas a licuarse mediante la adicin de un volumen igual de medio fisiolgico (por ejemplo, solucin salina de tampn fosfato de Dulbecco) seguido por pipeteo repetido. 2. Pasar la muestra suavemente a travs de una jeringa con aguja despuntada de calibre 18 (0,84 mm de dimetro interior) o 19 (0,69 mm de dimetro interior) repitiendo el procedimiento 6 a 10 veces. 3. Digestin con bromelina, enzima proteoltica (CE 3.4.22.32),

Estos procedimientos pueden afectar la bioqumica del plasma seminal y la movilidad y morfologa de los espermatozoides. En caso de diluir con medio fisiolgico, considerar el factor de dilucin al realizar los clculos finales.

 Despus de la licuefaccin, la viscosidad de la muestra

se puede estimar aspirando suavemente con una pipeta de plstico desechable de gran calibre (aproximadamente 1,5 mm de dimetro) permitiendo que el esperma caiga por gravedad y observar la formacin de cualquier filamento Una muestra normal sale de la pipeta en pequeas gotas; si la viscosidad es anormal, la gota forma un hilo de ms de 2 cm de largo. Tambin puede ser evaluada mediante la introduccin de una varilla de vidrio en la muestra y observando la longitud del hilo que se forma tras la retirada de la varilla. Debe registrarse como anormal cuando el hilo formado es superior a los 2 cm.

- Es importante no confundir una falta de

licuefaccin con una muestra de viscosidad aumentada; una alta viscosidad puede ser reconocida por las propiedades elsticas de la muestra. Los mtodos para reducir viscosidad son las mismas que las utilizadas para las muestras con licuefaccin tarda. - Una alta viscosidad puede interferir con la determinacin de la movilidad y la concentracin espermticas, as como la aglutinacin por anticuerpos y la cuantificacin de indicadores bioqumicos

 Una muestra de semen normal tiene un aspecto

homogneo, de color gris opalescente. Puede aparecer menos opaco si la concentracin de espermatozoides es muy bajo.
El color tambin puede ser diferente, es decir, rojo-

marrn cuando los glbulos rojos estn presentes (haemospermia), o amarilla en un paciente con ictericia o si ingiere ciertas vitaminas o drogas.

El volumen del eyaculado es aportado principalmente por las vesculas seminales y la prstata y epiddimos. La medicin precisa del volumen es fundamental en cualquier evaluacin de semen, porque es un factor determinante en el nmero total de espermatozoides y las clulas diferentes a espermatozoides. El volumen se mide mejor por diferencia en peso de la muestra en el recipiente en el que se recolecta, por lo que se debe de entregar al paciente un recipiente previamente pesado.
Calcular el volumen del peso de la muestra, suponiendo que la densidad de esperma es 1 g / ml (Densidad del semen vara entre 1,043 y 1,102 g / ml)

 El pH refleja el equilibrio entre los valores de pH de las diferentes secreciones de las glndula sexuales accesoria, principalmente la secrecin alcalina de vesiculares seminales y la secrecin cida prosttica.
El pH debe ser medido despus de la licuefaccin en un tiempo

uniforme, preferentemente despus de 30 minutos, pero en cualquier caso dentro de 1 hora posterior a la eyaculacin, ya que es influido por la prdida de CO2 que se produce despus de la eyaculacin.

Utilizar papel pH en un rango de 6.0 a 10.0

Mezclar bien la muestra de semen; aplicar una gota de semen uniformemente sobre el papel pH. Comparar con la tabla de color antes de 30 segundos

La precisin del papel de pH debe cotejarse con los estndares conocidos.

Estudio microscpica inicial

Se recomienda el microscopio de contraste de fases para

preparaciones sin teir. El primer examen microscpico de la muestra es a 100 aumentos, es decir, una combinacin de una lente de objetivo de A-10 con un lente ocular A-10 . Esto proporciona una visin general de la muestra, para observar: presencia de moco, aglutinacin de espermatozoides, clulas redondas (Leucocitos y las clulas germinales inmaduras), clulas epiteliales, y cabezas y colas aisladas de espermatozoides. A continuacin la preparacin debe revisarse a A-200 o A-400 para la evaluacin de la movilidad y determinacin de la dilucin requerida para la cuantificacin precisa del nmero de espermatozoides.

Homogenizacin y muestreo representativo

La naturaleza del eyaculado dificulta un muestreo representativo

si la muestra no se mezcla bien, el anlisis de dos alcuotas por separado puede mostrar marcadas diferencias en la movilidad, la vitalidad, la concentracin y la morfologa.
del semen para su anlisis., por lo que

 Antes de tomar una alcuota de semen para su

evaluacin, mezclar bien la muestra en su recipiente original, evitando la formacin de burbujas Esto se puede lograr por aspiracin de la muestra 10 veces con una pipeta de plstico desechable de aproximadamente 1.5 mm de dimetro (estril cuando sea necesario). No mezclar en vrtex a alta velocidad ya que se podran daar los espermatozoides.

Realizacin de una preparacin hmeda

Esta preparacin se debe de realizar por duplicado 1. Mezclar bien la muestra de semen y tomar la alcuota inmediatamente despus de homogeneizarla, para evitar que los espermatozoides se precipiten. 2. Mezclar nuevamente la muestra antes de realizar la segunda preparacin. 3. El volumen de semen y las dimensiones del cubreobjetos deben estandarizarse, de manera que los anlisis se llevan a cabo en una preparacin de profundidad fija de unos 20 mm que permite a los espermatozoides desplazarse libremente. 4. Colocar 10 ml de muestra en un portaobjetos de vidrio y cubrirlo con un cubreobjetos, de 22 mm 22 mm para lograr una cmara de aprox. 20 mm de profundidad. El peso del cubreobjetos extiende el volumen de muestra para lograr esta profundidad 5. Evitar la formacin y la captura de burbujas de aire . 6. Evaluar las dos preparaciones hmeda recin hechas tan pronto como la muestra se haya estabilizado

Consideraciones importantes: -Una profundidad de la preparacin de menos de 20 mm limita el movimiento de rotacin de los espermatozoides -Si la cmara es demasiado profunda, ser difcil de evaluar ya que los espermatozoides se movern dentro y fuera del campo de observacin. - Si el nmero de espermatozoides por campo visual vara considerablemente, significa que la muestra no esta bien homogeneizada por lo que deber repetirse el procedimiento - La falta de homogeneidad tambin puede resultar de la consistencia anormal, licuefaccin incompleta y la agregacin y aglutinacin de los espermatozoides.

En las preparaciones hmedas se evala:

Nmero aproximado de espermatozoides por campo

(A-200 A-400), para determinar la dilucin que se ha de realizar a la muestra para la cuantificacin de espermatozoides. Movilidad Agregacin de espermatozoides

Puede ser: a) Inespecfica: Es la adherencia de los espermatozoides inmviles entre s o de espermatozoides mviles a las hebras de moco, clulas no espermticas o residuos. b) Especfica: Es la adherencia de los espermatozoides mviles entre s (aglutinacin).

Agregacin inespecfica de espermatozoides sobre clulas, desechos y espermatozoides

Aglutinacin especfica
Se refiere a los espermatozoides mviles que se adhieren entre s, cabeza a cabeza, cola a cola o en forma mixta. La movilidad es a menudo muy importante, con un movimiento frentico, pero a veces los espermatozoides estn tan aglutinados que su movimiento es limitado. La aglutinacin se evala segn las partes involucradas y el nmero de espermatozoides aglutinados: Grado 1: Menos de 10 espermatozoides aglutinados, muchos libres

Grado 2: 10 a 50 espermatozoides aglutinados

Grado 3: Ms de 50 espermatozoides aglutinados, algunos espermatozoides siguen siendo libres Grado 4: Todos los espermatozoides estn aglutinados y se observan aglutinantes interconectados

Grado de aglutinacin Moderado Aislado

Partes involucradas

Cabeza-cabeza

Partes involucradas

Cola-cola

Punta de la cola-punta de la cola

Combinado

Maraa

Diagrama esquemtico de diferentes extensiones de aglutinacin de esperma.

Bruto

Alto

Aglutinacin tipo cabeza-cabeza (H-H). Contraste de fases 400x.

Aglutinacin tipo cola-cola (T-T). Contraste de fases 400x.

Pseudoaglutinacin. Contraste de fases 400x.

Aglutinacin provocada en espermatozoides humanos incubados con antisueros de conejo, previamente inmunizados con espermatozoides humanos. Contraste de fases 400x.

Aglutinacin

 La presencia de aglutinacin no es suficiente evidencia

para deducir una causa inmunolgica de infertilidad, pero es sugestivo de la presencia de anticuerpos antiespermticos; se requieren exmenes adicionales
La aglutinacin severa puede afectar la evaluacin de

la movilidad y el recuento de espermatozoides.

Su correcta evaluacin es trascendente, pues la movilidad espermtica progresiva est relacionada con la taza de embarazo. Los mtodos de evaluacin de la movilidad espermtica puede ser:

a)Anlisis asistido por computadora (Computer-aidede sperm analysis, CASA)

b)Mtodo manual

Debe ser evaluada lo antes posible despus de la licuefaccin de la muestra, de preferencia a los 30 minutos, pero en cualquier caso dentro de 1 hora despus de la eyaculacin, para limitar los efectos nocivos de la deshidratacin, el pH o los cambios de temperatura.

Mtodo Manual
1.) Homogeneizar la muestra 2.) Tomar una alcuota de semen inmediatamente despus de la mezcla, para evitar que los espermatozoides precipiten nuevamente. 3) Volver a mezclar la muestra de semen antes de tomar otra alcuota para realizar el estudio duplicado. Para cada repeticin, realizar una preparacin hmeda de aproximadamente 20 mm de profundidad. 4) Espere a que la muestra se estabilice (al menos 60 segundos). 5)Examinar la preparacin con la ptica de contraste de fase a A-200 A-400 Evaluar 200 espermatozoides en cada una de las dos preparaciones registrando el porcentaje de las diferentes categoras mviles. Comparar los valores duplicados para comprobar si estn aceptablemente cerca. En caso afirmativo, proceder con los clculos, y si no, preparar nuevas muestras.

CLASIFICACIN
Un sistema simple de clasificacin de la movilidad que se recomienda, es el que distingue a los espermatozoides con movilidad progresiva o no progresiva, de los que son inmviles.

Motilidad progresiva (MP): espermatozoides que se mueven activamente, ya sea de forma lineal o en un crculo grande, independientemente de la velocidad. Motilidad no progresiva (NP): todos los otros patrones de movilidad con una ausencia de progresin, por ejemplo, nadando en pequeos crculos, la fuerza flagelar apenas desplazando la cabeza, o cuando slo un latido flagelar se puede observar. Inmviles (IM): sin movimiento.

La evaluacin de la movilidad se debe efectuar de manera sistemtica para evitar contar dos veces el mismo espermatozoide, para lo cual se recomienda el uso de una retcula en el ocular y seguir de manera sistemtica la eleccin del campo en el que se efecta la evaluacin. Se deben evaluar al menos 5 campos

Una retcula ocular facilita el conteo de espermatozoides mvil e inmvil.

Seleccin sistemtica de campos para la evaluacin de espermatozoides en movimiento, al menos 5 mm del borde hacia el lmite del cubreobjetos.

Diferencias aceptables entre dos porcentajes dados para un promedio, determinado de cuentas duplicadas de 200 espermatozoides

Diferencias aceptables entre recuentos duplicados de porcentaje en funcin del porcentaje promedio y el numero de espermatozoides evaluados.

Lmite inferior de referencia

El lmite de referencia inferior de la movilidad total (PR + NP) es de 40% (40% ms)
El lmite de referencia inferior de la movilidad progresiva (PR) es del 32 % (32% ms)

Ejemplos de trabajo en la estimacin de la movilidad

Progresiva, 30% y 50%, no progresivo, 5% y 15%, inmviles, 65% y 35%

La categora ms comn es inmvil, con un promedio de 50% y una diferencia del 30%. De la tabla , se ve que con un promedio de 50%, una diferencia de hasta el 10% se espera que ocurra por casualidad. A medida que la diferencia observada excede de esto, los resultados son descartados y se debe repetir el procedimiento.

b) Progresiva, el 37% y 28%, no progresiva, el 3% y 6%; inmviles 60% y 66%. La categora ms comn es inmvil, con un promedio de 63% y diferencia del 6%. De la tabla , se ve que para un promedio de 63%, una diferencia de hasta el 10% se espera que ocurra por casualidad. A medida que la diferencia observada es menos que esto, los resultados son aceptados y report los valores medios: MP 32%, MNP 4%, 63% de IN.

El nmero total de espermatozoides por eyaculado y la concentracin de espermatozoides, estn relacionados con las tasas de embarazo y son predictores de la concepcin.
El nmero de espermatozoides en el eyaculado se calcula a partir de su concentracin y el volumen.

Para eyaculados normales, sin problemas de obstruccin y tiempos de abstinencia cortos, el nmero total de espermatozoides en el eyaculado se correlaciona con el volumen testicular y por lo tanto es una medida de la capacidad de los testculos para producir espermatozoides y la permeabilidad de los conductos. La concentracin de espermatozoides en el semen, est correlacionado con las tasas de embarazo, y es influido por el volumen de las secreciones de las vesculas seminales y la prstata, por lo que no es una medida especfica de la funcin testicular.

Los trminos "nmero total de espermatozoides" y concentracin de espermatozoides" no son sinnimos. La concentracin de espermatozoides se refiere al nmero de espermatozoides por unidad de volumen de semen y es una funcin del nmero de espermatozoides eyaculados y el volumen de fluidos glandulares. Y el nmero total de espermatozoides se refiere a la catidad de espermatozoides en el eyaculado completo y se obtiene multiplicando la concentracin de espermatozoides por el volumen del semen.

 La

generalizacin de que el numero de espermatozoides refleja la capacidad de produccion testicular de espermatozoides no es valida para los siguientes casos:
A) Produccin d electro eyaculados en varones con

enfermedad de medula espinal. B) Deficiencia andrognica. C) Muestras recolectadas despus de abstinencia prolongada. D) Eyaculacin retrograda.

Determinacin del numero de espermatozoides.

Realizar el estudio con una muestra BIEN MEZCLADA despus de haberse licuado. Realizar una preparacin en fresco para evaluar la dilucin que se ha de realizar. 2. Cargar la cmara de conteo y permitir que los espermatozoides se estabilicen; utilizar cmara hmeda (realizar por duplicado).
1.

3. Realizar la evaluacin de las muestras dentro de

10-15 minutos despus de la estabilizacin de los espermatozoides dentro de la cmara hmeda. 4. Contar por lo menos 200 espermatozoides en ambas preparaciones. 5. Comparar los dos conteos para evaluar si se pueden promediar. Si es as, proceder con los clculos, si no, repetir las diluciones de nuevo. 6. Calcular la concentracin de espermatozoides por ml. 7. Calcular el nmero total de espermatozoides por eyaculado.

Tipos de cmara de conteo

Se recomienda el uso del hemocitmetro de 100 mm de profundidad. En este manual se proporcionan los factores de dilucin para la Cmara de Neubauer mejorada. Otro tipo de cmaras requieren factores de dilucin diferentes. Existen cmaras desechables, pero antes de utilizarlas se requiere verificar sus dimensiones , comparando los resultados con el mtodo del hemocitmetro de Neubauer mejorada comparando la precisin con un programa de control de calidad externo. Las cmaras de mucha profundidad no se pueden utilizar para muestras con bajas concentraciones de espermatozoides

Cuidados de la cmara de conteo

Limpiar la cmara del hemocitmetro y cubreobjetos

con agua y secar bien con tejidos suaves despus de su uso, ya que cualquier residuo seco puede adherirse. Frotar la superficie de la rejilla para eliminar los espermatozoides residuales de la muestra anterior.
Remoje cmaras y cubreobjetos reutilizables toda la

noche en desinfectante para evitar la contaminacin con agentes potencialmente infecciosos en el semen.

Hemocitmetro de Neubauer mejorado

Cuenta con dos cmaras de conteo separadas con un patrn de lneas en cuadrcula dibujadas en la superficie del vidrio de 3 mm x 3 mm. Se utiliza con un cubreobjetos especial de un espesor de 0.44 mm, que cubre las retculas y se apoya en pilares de vidrio de 0.1 mm. Cada rea de conteo se divide en nueve rejillas de 1mm 1mm.

Hemocitmetro Neubauer mejorado

Croquis de la zona que muestra nueve rejillas en una cmara del hemocitmetro. La rejilla central (nmero 5) de 25 cuadros grandes. Micrografa de una parte de una cmara llena

Espermatozoides contados en los recuadros de las rejillas

La lnea central de las 3 lneas define la frontera del recuadro. Todos los espermatozoides dentro del recuadro central son contabilizados, incluyendo los que sus cabezas se encuentran en las dos lneas interiores, pero no los que sus cabezas se encuentran en las dos lneas exteriores.

Uso de la retcula del hemocitmetro

Contar solamente espermatozoides enteros (con cabeza y cola).La cuenta est determinada por la ubicacin de su cabeza; la orientacin de la cola no es importante. El lmite de un cuadrado es indicado por la lnea media de las tres, por lo que un espermatozoide se cuenta si la mayor parte de su cabeza se encuentra entre las dos lneas internas. Para evitar el contar dos veces el mismo espermatozoide, se debern contar aquellas cabezas que estn sobre la lnea superior o izquierda del cuadro.

Si hay muchas cabezas sin cola(cabeza de alfiler), su presencia debe ser registrada en el informe. Si se considera necesario, se determinara su concentracin de la misma manera que para los espermatozoides.

Diluiyente
1. Disolver 50 g de bicarbonato de sodio (NaHCO3) y 10 ml de formalina al 35% (v / v) en 1000 ml de agua destilada. 2. Si lo desea, aadir 5 ml de violeta de genciana (solucin saturada > 4 mg / ml), ndice de color 42.555, para resaltar las cabezas. 3. Almacenar a 4 C. Si se forman cristales en la solucin, filtrar con papel de 0,45 mm antes de su uso.

Determinacin de la dilucin requerida

A partir de la preparacin hmeda utilizada para la evaluacin de la movilidad, se estima el nmero de espermatozoides por campo (A-200 A-400)

Si se observan espermatozoides, contarlos para determinar la dilucin necesaria segn la siguiente tabla . Si no se observan espermatozoides, examinar otra preparacin en fresco.
Si no se observan espermatozoides, centrifugar la muestra.

Diluciones de semen requeridas, como realizarlas, que cmaras utilizar y las reas potenciales a evaluar

*Pipetas para el recuento de glbulos blancos y pipetas

que dependen de desplazamiento de aire no son lo suficientemente precisas para hacer diluciones volumtricas de semen viscoso; se deben de utilizar pipetas de desplazamiento positivo. *El volumen pipeteado de muestra, no debe ser menor de 50 ml, para evitar errores asociados con volmenes pequeos. *Si hay muy pocos espermatozoides por campo de visin a la dilucin recomendada, preparar otro ms baja. Si hay demasiados espermatozoides superpuestos por campo de visin a la dilucin recomendada, preparar otra ms alta. Nota 4: Si una dilucin 1 + 19 (1:20) es inadecuada, usar una 1 + 49 (1:50).

Preparacin de diluciones y cargado de la cmara

1.Respirar sobre la superficie de la cmara para empaarla. 2.Asegure el cubreobjetos sobre las cmaras presionando firmemente sobre los pilares. Iridiscencia (mltiples anillos de Newton) entre el cristal de las dos superficies confirma la posicin correcta del cubreobjetos. 3.Utilice una pipeta de desplazamiento positivo para depositar la cantidad ade-cuada de la dilucin (determinarla para cada cmara, generalmente son 10 ml). 4.Mezclar la muestra de semen.

5.Medir el volumen adecuado de semen inmediatamente despus de la mezcla, lo que permite que no haya tiempo suficiente para que los espermatozoides se precipiten. 6. Limpie el semen de la parte exterior de la punta de la pipeta, cuidando de no tocar la apertura de la punta. 7. Dispensar el semen en el diluyente y enjuagar la punta de la pipeta aspirando 4-5 veces. 8. Repetir los pasos anteriores para preparar el duplicado. 9. Mezclar la primera dilucin con el vrtex durante 10 segundos con velocidad mxima . 10. Aspirar el volumen necesario de la dilucin (generalmente 10 ml) y cargar la cmara: toque la punta de la pipeta con cuidado contra la ranura del borde inferior de la cmaras .

11. Presione el mbolo de la pipeta lentamente, permitiendo que la cmara se llene por capilaridad. El cubreobjetos no debe moverse durante el llenado, y la cmara no debe ser llenada en exceso o quedar espacios sin rellenar (cuando el aire ocupa parte del rea de la cmara)
12. Mezclar la segunda dilucin, como antes, e inmediatamente tome una alcuota de 10 ml y cargue la segunda cmara del hemocitmetro siguiendo los mismos pasos 13. Dejar reposar la cmara en posicin completamente horizontal por lo menos durante 4 minutos a temperatura ambiente y en una cmara hmeda (papel de filtro saturado con agua en una cubierta de caja Petri) para evitar que se seque. Las clulas inmovilizadas se sedimentos en la retcula durante este tiempo

Evaluacin del nmero de espermatozoides

El nmero de espermatozoides deben ser evaluados en las dos cmaras del hemocitmetro. Si los dos valores concuerdan, las alcuotas tomadas de la muestra pueden considerarse representativas (lo que indica que la muestra se mezclo adecuadamente) 1. Examine el hemocitmetro con ptica de contraste de fases A-200 o A-400 2. Contar por lo menos 200 espermatozoides en cada repeticin, a fin de lograr un error aceptablemente bajo debido al muestreo (ver tabla y grfica) 3. En primer lugar evaluar la rejilla central (No. 5) de 25 cuadros grandes, fila por fila.

4. Continuar contando hasta al menos 200 espermatozoides y una fila completa (de cinco grandes plazas) haya sido examinada. El conteo debe ser realizado por filas completas, no detenerse en medio de una fila. Si 200 espermatozoides no se han observado en las cinco filas de la parrilla central, seguir contando en las filas de las dos redes adyacentes (los nmeros 4 y 6 en la figura). No utilizar las filas de los cuadros 1,2,3,7,8 y 9 5. Anote el nmero de filas evaluado para llegar a un mnimo de 200 espermatozoides. Este mismo nmero de filas se contar a partir de la otra cmara del hemocitmetro

6. Realice el recuento de espermatozoides y filas con la ayuda de un contador de laboratorio. 7. Cambie a la segunda cmara del hemocitmetro y realizar el conteo duplicado; contar el mismo nmero de filas (el mismo volumen) como el primer conteo, incluso si esto resulta en menos de 200 espermatozoides. 8. Calcular la suma y la diferencia de los dos nmeros.

9. Determinar la aceptabilidad de la diferencia de la tabla o la grfica, (Se obtiene la diferencia mxima entre la cuenta de que se espera ocurra en el 95% de las muestras, debido a un error solamente de muestreo). Si la diferencia es aceptable, calcular la concentracin. Si la diferencia es demasiado alto, preparar dos diluciones nueva como se describe en y repetir las cuentas. Informe la concentracin espermtica promedio a dos cifras significativas. Calcular el nmero total de espermatozoides por eyaculado.

Diferencias aceptables entre conteos duplicados como una funcin del nmero total de espermatozoides

Diferencias aceptables entre dos cuentas duplicadas para una suma dada

Calculo de la concentracin de espermatozoides en semen

La concentracin de espermatozoides es igual al nmero (N) de espermatozoides contados dividido por el volumen en el que se encontraron, es decir, el volumen del total (n) de filas examinadas para los conteos duplicados(20 nl cada uno para las redes 4, 5 y 6), multiplicado por la dilucin C = (N/n) (1/20) factor de dilucin. Donde: C = Concentracin de Espermatozoides N = Nmero de espermatozoides contados n = Nmero de filas examinadas Factor de dilucin: 2 (1:2), 5(1:5), 20 (1:20), 50 (1:50)

Ejemplos de trabajo en el recuento de espermatozoides

1) Con una dilucin 1:20 (1 + 19), en la primera preparacin se contaron 201 espermatozoides en siete filas, mientras que en la segunda preparacin se contaron 245 espermatozoides en el mismo nmero de filas (7). La suma de los valores (201 + 245) es 446 en 14 filas y la diferencia (245 hasta 201) es de 44. De la tabla , se ve que es superior a la diferencia esperada por azar (41), entonces se debe repetir todo el procedimiento.

2) Con una dilucin 1:20

(1 + 19), en la primera preparacin se contaron 220 espermatozoides en cuatro filas, mientras que en el segundo conteo fueron 218 espermatozoides en cuatro filas. La suma de los valores (220 + 218) es de 438 en 8 filas y la diferencia (220-218) 2. De la tabla , se puede notar que la diferencia obtenida es inferior a la que se encuentra por azar (41), por lo que los valores son aceptados. Por lo tanto, la concentracin de espermatozoides por nl en la muestra es: C = (N / n) 1/20 x 20, es decir (438 / 8) 1.0 = 54.75 espermatozoides / nl, 55 106/ml de semen.

Criterios de referencia para la concentracin de espermatozoides

El lmite de referencia inferior para la concentracin de espermatozoides es de 15 106 espermatozoides por ml O sea, 15 106 de espermatozoides/ml ms

Calculo del numero total de espermatozoides en la eyaculacin

Se recomienda calcular y reportar el nmero total de espermatozoides por eyaculado, ya que este parmetro proporciona una medida de la capacidad de los testculos para producir espermatozoides y la permeabilidad de los conductos del aparato genital masculino. Esto se calcula multiplicando la concentracin de espermatozoides por el volumen total del eyaculado . Lmite de referencia inferior para el nmero total de espermatozoides: 39 106 espermatozoides por eyaculado O sea: 39 106 espermatozoides / eyaculado ms

Nmeros bajos de espermatozoides: Criptozoospermia y supuesta azoospermia

Si no se observan espermatozoides en el duplicado de preparaciones hmedas, se puede sospechar de azoospermia. Aunque se ha sugerido que la definicin debe cambiar, azoospermia sigue siendo una descripcin de la eyaculacin en lugar de una declaracin de su origen o una base para el diagnstico y terapia. En general se acepta que el trmino azoospermia slo puede utilizarse si no se encuentran espermatozoides en el sedimento de una muestra centrifugada .

Sin embargo, hay que tener en cuenta que: - El que los espermatozoides se observen en el sedimento depende de la centrifugacin: tiempo y velocidad y de la cantidad de sedimento que se examina. - La centrifugacin a 3 000g durante 15 minutos no agrupa a todos los espermatozoides de una muestra. - Despus de la centrifugacin, la movilidad se puede perder y la concentracin se pudo haber subestimado.

Cuando una evaluacin precisa de un bajo nmero de espermatozoides no es requerida

Si el nmero de espermatozoides por campo en la preparacin hmeda inicial es bajo (cero a 4 por campo 400x o cero a 16 por 200x), existen varias opciones. 1) No se toman nuevas medidas: Si el nmero de espermatozoides por campo de A-400 es menor a 4 (es decir, aproximadamente 1 106/ml), es suficiente para la mayora de propsitos clnicos reportar una concentracin de espermatozoides como menor a 2 106/ml, con una nota de la existencia o no de espermatozoides mviles observados.

2.Examen de las muestras centrifugadas para detectar espermatozoides Cuando no se observan espermatozoides en ninguna de las preparaciones hmedas, la muestra puede ser centrifugada para determinar si algn espermatozoide est presente en una muestra ms grande.

 Mezclar bien la muestra de semen

Tomar una alcuota de 1 ml de semen y centrifugar a

3 000 g durante 15 min. Decantar la mayor parte del sobrenadante y resuspender el sedimento de espermatozoides en el resto, aproximadamente, 50 l de plasma seminal. Coloque 10 l del semen resuspendido en dos portaobjetos y cubrirlos con cubreobjetos de 22 mm x 22 mm. Se obtendrn dos preparaciones hmedas de aproximadamente 20 m de profundidad

 Examinar las lminas con microscopio de contraste de

fase con 200x o 250x de magnificacin.

Examinar completamente el cubreobjetos,

sistemticamente, campo por campo. Comience en una esquina y explore a lo largo del eje x en el lado opuesto y luego mueva un campo a lo largo del eje y, explore de nuevo a lo largo de toda la anchura. Contine explorando en zig-zag para hacer una bsqueda completa y sistemtica de toda la alcuota Mantener la observacin de la preparacin al cambiar los campos.

 Con un objetivo 20x y un ocular 10x, apertura de

20 mm, el campo microscpico tiene un dimetro de aproximadamente 1 000 m . As pues, ser aproximadamente de 484 campos por cubreobjetos de 22 mm 22 mm a examinar.
La presencia de espermatozoides en cualquiera de los

replicados indica criptozoospermia.

La ausencia de espermatozoides en cualquiera de los

dos replicados sugiere azoospermia.

Examen de las muestras no centrifugadas para la deteccin de espermatozoides mviles

Cuando se buscan espermatozoides mviles (por

ejemplo, en una muestra de semen despus de vasectoma), se debe evitar diluir la muestra en el fijador y centrifugar a alta velocidad los espermatozoides. En este caso, se puede evaluar slo una alcuota de la muestra sin diluir. Mezclar bien la muestra de semen. Tomar una alcuota de 40 l de semen y cubrir con un cubreobjetos de 24 mm x 50 mm. Esto crear una preparacin hmeda de 33 m de profundidad

 Examinar la lmina con ptica de contraste de fase con

magnificacin de 200x o 250x.

Examinar completamente el cubreobjetos,

sistemticamente, campo por campo. Comience en una esquina y explore a lo largo del eje x en el lado opuesto y luego mueva un campo a lo largo del eje y, explore de nuevo a lo largo de toda la anchura. Contine en zig-zag para hacer una bsqueda completa y sistemtica de toda la alcuota. Mantener la observacin de la preparacin al cambiar los campos.

Con un objetivo de 20x y ocular de 10x, habr aproximadamente 1 200 campos (24 x 50) por cubreobjetos de 24 mm x 50 mm para ser examinados.

Nota: Este procedimiento puede durar hasta 10 min, ya que la muestra tendr un fondo elevado.

Evaluar aproximadamente 1200 campos de alto poder de 200x de magnificacin, para un cubreobjetos de 24 mm x 50 mm, y aproximadamente 484 campos de alto poder de 200x de magnificacin, para un cubreobjetos de 22 mm x 22 mm.

Evaluacin del numero bajo de espermatozoides con la cmara de Neubauer

Para reducir los errores de muestreo, se tiene que contar un nmero crtico de espermatozoides, preferiblemente, un total de 400 (200 espermatozoides por rplica).

Seguir el mismo procedimiento ya conocido para la cuantificacin de espermatozoides y tener en consideracin lo siguiente:

Clculo de concentraciones bajas de espermatozoides en el semen

La concentracin de espermatozoides en el semen es su nmero (N) dividido entre el volumen en el que se encontraron, es decir, el volumen total (n) de los cuadrados examinados por duplicado (el volumen de un cuadrado grande es de 100 nl), multiplicado por el factor de dilucin. Es decir: C = (N/n) x (1/100) x factor de dilucin

Para una dilucin 1+1 (1:2), la concentracin es: C = (N/n) x (1/100) x 2 espermatozoides por nl Si el nmero de espermatozoides es muy bajo, se pueden contar las dos cmaras.

Hemocitmetro Neubauer mejorado

Croquis de la zona que muestra nueve rejillas en la cmara del hemocitmetro.

Valora la capacidad de la membrana plasmtica para regular el flujo de agua e iones y tiene una relacin significativa con los resultados de inseminacin intrauterina (IIU) y la fertilizacin in vitro (FIV). Es usada para diferenciar entre casos de necrozoospermia o de espermatozoides inmviles como el sndrome de Kartagener y cilios inmviles

El porcentaje de espermatozoides vivos, se determina segn la evaluacin de la integridad de la membrana de las clulas. Se puede determinar a todas las muestras, pero es especialmente importante para las muestras con menos de un 40% de espermatozoides progresivamente mviles. Este examen puede proporcionar un control sobre la evaluacin de la movilidad, ya que el porcentaje de clulas muertasno debe ser superior al porcentaje de espermatozoides inmviles. El porcentaje de clulas viables normalmente es superior al de las clulas mviles.

Mtodos empleados
Tincin con Eosina Y Tincin con Eosina-Nigrosina

Hinchamiento con solucin hipo-osmtica

Prueba con Eosina Y

Esta prueba utiliza la tcnica de tincin con eosina Y para aumentar el contraste entre las cabezas de los espermatozoides muertos y los intactos. No se puede guardar para leer con posterioridad.

Es un mtodo sencillo y rpido, pero las preparaciones hmedas no se puede almacenar para control de calidad. Preparacin de los reactivos 1. NaCl, 0,9% (w/v): disolver 0,9 g de NaCl en 100 ml de agua destilada 2. Eosina Y, 0,5% (w/v): disolver 0,5 g de eosina Y (ndice de color 45.380) en 100 ml de NaCl al 0.9%

Procedimiento
1. Mezclar la muestra de semen. 2. Tomar una alcuota de 5 ml de semen y mezclar con 5 ml de solucin de eosina Y en un portaobjetos y mezclar con la punta de la pipeta, de manera circular (Realizar por duplicado) 3. Cubrir con un portaobjetos de 22 mm por 22 mm y reposar 30 segundos. 5. Examinar ambas preparaciones, de preferencia con la ptica de contraste de fase negativa fcil a A-200 o A- 400

6. Realice el recuento de clulas teidas (muertos) y sin teir (vital). 7. Evaluar 200 espermatozoides en cada preparacin. 8. Calcular la media y la diferencia de los dos porcentajes de clulas vitales y muertas. 9. Determinar la aceptabilidad de la diferencia de la tabla o la figura correspondientes 10. Si la diferencia entre los porcentajes es aceptableinformar el promedio de los dos porcentajes. Si la diferencia es demasiado alta, repetir el procedimiento. 11. Reporte el porcentaje promedio de espermatozoides vitales al nmero entero ms cercano

El nmero total de espermatozoides con la membrana intacta en el eyaculado es de importancia biolgica. Se obtiene multiplicando el nmero total de espermatozoides en el eyaculado por el porcentaje de los que tienen la membrana intacta (vitales)

Prueba con Eosina-Nigrosina

Este mtodo es sencillo y rpido, se prepara una laminilla que puede leerse con posterioridad

Tcnica con Eosina-Nigrosina

1) Eosina Y: Disolver 0.67 de Eosina Y y 0.9 g de NaCl 2) 3)

4) 5)
6)

7)

en 100 ml de agua destilada Eosina nigrosina: Adicionar 10 g de Nigrosina en 100 ml de solucin de Eosina Y Homogenizar la muestra Mezclar 50 ml de muestra y 50 ml de colorante en una placa de porcelana Realizar por duplicado Realizar una extensin y leer a A-1000 Calcular la media y el promedio de las clulas vitales (incoloras) y determinar la aceptabilidad

Solucin hipo-osmtica
Disolver 0.735 g de Citrato de Sodio dihidratado y 1.351 g de D-fructuosa en 100 ml de agua destilada.
Congelar alcuotas de 1 ml

Representacin esquemtica de los principales cambios morfolgicos de espermatozoides humanos sometidos a stress hipo-osmtico.

(a) Sin cambios. (b) (g) Varios tipos de cambios de cola. * La inflamacin en la cola esta indicada por el rea gris.

en parejas sometidas a un proceso de fertilizacin

in vitro (FIV), la taza de fertilizacin fue del 7.6 % en el grupo que tena menos de 4% de formas normales, a diferencia del 63% cundo la morfologa normal fue superior a 14 %

Mtodo
1. Preparacin de un frotis en portaobjetos .
2. Secado al aire, fijacin y tincin 3. Examen de la diapositiva con la ptica A1000 con aceite de inmersin . 40. La evaluacin de 200 espermatozoides por duplicado para el porcentaje de formas normales y anormales .

50. La comparacin de los valores duplicados para ver si estn aceptablemente cerca: si es as, proceder con los clculos, si no volver a leer las diapositivas.

Espermatozoide normal
Definir un espermatozoide morfolgicamente normal presenta dificultades, pero la observacin de espermatozoides obetenidos del aparato reproductor femenino, sobre todo en moco cervical de origen postcoital y de la superficie de la zona pelcida, han ayudado a definir la imagen de un espermatozoide con potencial de fertilizacin (morfolgicamente normales).

La relacin entre el porcentaje de formas normales y las tazas de embarazo (in vivo e in vitro), ha sido til para establecer la importancia de la determinacin de la morfologa bajo criterios estrictos como una forma til para el pronstico de la fertilidad.

Los criterios estrictos de Kruger, provee el mejor valor pronstico dentro de los programas de fertilizacin in vitro (FIV), debido a que representa una prueba global de la funcin espermtica.

Espermatozoides morfolgicamente normales

A,B:
A C

espermatozoides tincin de Shorr recuperados de la zona pelcida in vitro. C: Espermatozoides tincin de Papanicolaou recuperados de moco endocervical despus del coito

Preparacin del frotis de semen

La adicin de un fijador al lquido seminal, no permite la visualizacin adecuada de los espermatozoides, ya que se oscurecen por desnaturalizacin de las protenas seminales. Para el anlisis morfolgico, se deben preparar frotis y dejar secar al aire antes de la fijacin y la tincin.

Sin embargo, este procedimiento est asociado con: - Cambios en las dimensiones de los espermatozoides: los espermatozoides secados, fijados y teidos se visualizan ms pequeos que los espermatozoides vivos - Expansin de las cabezas de los espermatozoides inmaduros. - Prdida de la gota citoplasmtica (citoplasma residual de espermatogonias), pues son osmticamente sensibles

La evaluacin debe hacerse por duplicado, para minimizar las diferencias debidas a la preparacin de la laminilla: 1. Mezclar bien la muestra. 20. Tomar la alcuota de inmediato, antes de que los espermatozoides sedimenten nuevamente (5-10 ml, dependiendo de la concentracin de spermatozoides). 3. Mezclar nuevamente antes de la preparacin de la segunda laminilla. 4. Seleccionar el mtodo de realizacin del frotis, segn la viscosidad de la muestra.

Mtodos de manchado de semen para la morfologa de los espermatozoides

A: Mtodo de plumaje para el semen sin diluir.
B: Mtodo de pipeta para muestras lavadas.

Preparando un frotado de semen normal

Muestras con baja concentracin de espermatozoides

Si la concentracin de espermatozoides es menos de 2 106/ml), se concentra la muestra: 1. Centrifugar la muestra a 600 g durante 10 minutos. 2. Eliminar la mayor parte del sobrenadante. 3. Resuspender el precipitado en el resto del sobrenadante mediante pipeteo suave. 4. Obtener una concentracin de espermatozoides aproximadamente de 50 106/ml. 5. Tratar como una muestra normal. Nota: La centrifugacin puede afectar a la morfologa de los espermatozoides, por lo que su uso debe ser registrado.

6.Comparar los porcentajes de formas normales de las dos evaluaciones independientes. 7. Calcular la media y la diferencia de los dos porcentajes de formas normales. 8. Determinar la aceptabilidad de la diferencia de la tabla o la figura. 9. Si la diferencia entre los porcentajes es aceptable, informar el promedio. 10. Si la diferencia es demasiado alta, repetir la evaluacin en las mismas laminillas. 11. Informe sobre el porcentaje medio de formas normales de la unidad ms prxima.

Mtodos de tincin
Se recomiendan cualquiera de las siguientes tinciones 1. Papanicolaou 2. Shorr 3. Diff-Quik Con las tres tcnicas de tincin, la regin del acrosoma, se tie de color azul plido y la regin del post-crosoma de azul oscuro. La pieza intermedia puede mostrar algunas manchas de color rojo y la cola se tie de color azul o rojo. La gota citoplasmtica(exceso de residuos citoplasma), normalmente se encuentra detrs de la cabeza y alrededor de la pieza intermedia, se tie de color rosa o rojo (Papanicolaou) o naranja rojizo-(Shorr)

Mtodos rpidos de tincin

No son recomendables, pues no permiten observar los detalles de los espermatozoides como son descritos en este manual.

Examen de la preparacin teida y clasificacin segn la morfologa

Leer a A1000 con aceite de inmersin. La evaluacin de la morfologa presenta una serie de dificultades relacionadas con la falta de objetividad y la variacin en la interpretacin, lo que lo hace difcil de estandarizar. El mtodo que aqu se recomienda es clasificarlos como normal o anormal, con opcin a describir la zona en donde se encuentra la anormalidad (cabeza, cuello, pieza media y cola) Todas las formas lmite debe considerarse anormal.

No es necesario distinguir todas las variaciones en el tamao y forma de la cabeza o de la pieza intermedia y varios defectos de la pieza principal de la cola. La evaluacin morfolgica se debe realizar en cada espermatozoide evaluable. Se debe realizar en varias reas seleccionadas sistemticamente de la preparacin, para evitar sesgo en la seleccin de los espermatozoides.

Evaluacin de la Morfologa
1. Examinar el portaobjetos con ptica de campo claro A-1000 con aceite de inmersin. 2. Evaluar todos los espermatozoides en cada campo, pasando de un campo microscpico a otro. 3. Evaluar al menos 200 espermatozoides en cada preparacin, a fin de lograr un error aceptablemente bajoy debido solo al muestreo. 4.Realizar el recuento de espermatozoides normales y anormales con la ayuda de un contador de laboratorio 5. Repetir la evaluacin de al menos 200 espermatozoides, de preferencia en una laminilla duplicada, pero alternativamente en la misma.

Espermatozoide normal
Es aquel que tiene cabeza, cuello y pieza medias y cola NORMALES

Clasificacin de un espermatozoide anormal

Pueden hacerse notar la siguiente clasificacin de defectos A) Defectos de cabeza B) Defectos de cuello y pieza media C)Defectos de la pieza principal de la cola

Otras anormalidades
Exceso residual de citoplasma Colas sueltas (Cabeza de alfiler)

Cabeza sueltas

Dibujos esquemticos de algunas formas anormales de espermatozoides humanos

Evaluacin de la morfologa
Las siguientes microfotografas de espermatozoides fueron evaluadas con la aplicacin estricta de los criterios establecidos para morfologa. La evaluacin fue realizada por un observador nico, experto: Dr. Thinus Kruger

Anlisis de Semen

Espermatozoides

clasificados como NORMALES

Evaluacin de la morfologa de espermatozoides

Anlisis de Semen
1)Cabeza anormal Pieza media, gruesa Pieza principal(cola), doble Clasificacin general, ANORMAL 2)Cabeza anormal Pieza media, gruesa Pieza principal(cola), doble Clasificacin general, ANORMAL 15)Cabeza anormal Otro comentario: Piriforme Pieza media, gruesa, Exceso de citoplasma residual Pieza principal(cola), doble Comentario: Citoplasma anormal (Mayor a 1/3 de la cabeza Clasificacin general, ANORMAL

Evaluacin de la morfologa de espermatozoides

La mejor correlacin entre las anomalas morfolgicas y la infertilidad se produce cuando se halla una anomala nica y en un amplio porcentaje de espermatozoides.

 ndice de teratozoospermia (TZI)

Total de defectos____________ Nmero de espermatozoides con defecto

ndice de deformidad de los Espermatozoides

_________Total de defectos_______ Nmero de espermatozoides contados.

(SDI)

ndice de teratozoospermia.
Comprendido entre 1 y 3
Criterio de referencia: Menor a 1.6 Si es mayor a 1.6 esta asociado con menores tazas de

embarazo.

Elementos celulares diferentes a espermatozoides

La eyaculacin contiene clulas que no son espermatozoides, algunos de los cuales puede ser clnicamente relevantes. Estas incluyen : a) clulas epiteliales del tracto genitourinario b) leucocitos c) clulas germinales inmaduras

Estas dos ltimas son denominadas como clulas redondas. Se pueden identificar mediante el examen de un frotis teido y su concentracin se puede estimar en referencia a la concentracin de espermatozoides

A) Clulas epiteliales uretrales B) Leucocitos

Leucocitos.
Estn presentes en la mayora de los eyaculados. Su concentracin no debe ser mayor a 1 x 106 / ml. Su aumento se conoce como leucocitospermia y es

indicativo de infeccin.

Clulas de la Espermatognesis (clulas redondas)

Espermtides
Espermatocitos

primarios Espermatocitos secundarios Espermatogonias.

C) y D)Clulas de la Espermatognesis

Conteo de clulas redondas.

1) Contar el nmero de clulas redondas y leucocitos por 100 espermatozoides (A-1000)en la misma preparacin utilizada para evaluar la morfologa 2) Calcular el nmero de clulas redondas y leucocitos utilizando la siguiente expresin

C = ( N x S ) / 100
C = Tipo de clula (redondas y leucocitos) N = cantidad de tipo celular contado en el mismo nmero de campos que 100 espermatozoides. S = Recuento de espermatozoides en millones/ml

Si no se observan clulas redondas en el total del portaobjetos reportar como:

menos de 3 700 clulas / ml Este criterio no aplica para muestras con aparente azospermia ni hipospermis severa

ESTERILIDAD E INFERTILDAD
Esterilidad masculina: Incapacidad para que el

esperma fertilice el vulo.

Esterilidad femenina: Incapacidad para concebir

mediante el coito.
Infertilidad: Incapacidad de concebir despus de

un ao de relacione sexuales regulares, sin medidas anticonceptivas y con la misma pareja.

ESTERILIDAD E INFERTILDAD
Esterilidad masculina: Incapacidad para que el

esperma fertilice el vulo.

Esterilidad femenina: Incapacidad para concebir

mediante el coito.
Infertilidad: Incapacidad de concebir despus de

un ao de relacione sexuales regulares, sin medidas anticonceptivas y con la misma pareja.

ESTERILIDAD E INFERTILDAD
Esterilidad masculina: Incapacidad para que el

esperma fertilice el vulo.

Esterilidad femenina: Incapacidad para concebir

mediante el coito.
Infertilidad: Incapacidad de concebir despus de

un ao de relacione sexuales regulares, sin medidas anticonceptivas y con la misma pareja.

ESTERILIDAD E INFERTILDAD
Esterilidad masculina: Incapacidad para que el

esperma fertilice el vulo.

Esterilidad femenina: Incapacidad para concebir

mediante el coito.
Infertilidad: Incapacidad de concebir despus de

un ao de relacione sexuales regulares, sin medidas anticonceptivas y con la misma pareja.

Falla en la Espermatognesis
Las anomalas en la funcin testicular se pueden agrupar en: a) Defectos de desarrollo y estructurales b) Defectos adquiridos c) Anomalas asociadas con enfermedades sistmicas o neurolgicas y resistencia a andrgenos.

Defectos de desarrollo y estructurales

Mutaciones del receptor: Defectos en la formacin

de testosterona Sndrome de Klinefelter: Presencia de un cromosoma X adicional (47, XXY 46XY/47XXY) Sndrome del varn XX. Ocasiona hialinizacin de los tbulos seminferos y azospermia Sndrome de los cilios inmviles: Los espermatozoides presentan mala movilidad o son carentes de ella. Defectos congnitos de aumento de los niveles de estgenos: uso de digitlicos.

Defectos adquiridos
Orquitis vrica: causa adquirida mas frecuente,

ocasionada por el virus de la parotiditis, ecovirus, virus de la coriomeningitis linfoctica y grupo de Arbovirus B. La padecen hasta una cuarta parte de los adultos afectados; puede ser unilateral. Traumatismo: Pudiendo ser mecnico o trmico Radiacin: Por afectacin de las clulas de Leyding, lo que ocasiona alteraciones en la produccin de testosterona.

Defectos adquiridos
Frmacos y drogas: Pueden causar

infraandrogenizacin e infertilidad:
Inhibicin de la sntesis o biodisponibilidad de

testoterona: espironolactona, ciproterona, ketoconazol, etanol, fenitona, carbamazepina, quimiotrapia, marihuana, herona y metadona Bloqueo de la accin perifrica de los andrgenos: ciproterona, cimetidina, ranitidina, omeprazol Aumento de los niveles de estrgenos: digitlicos

Defectos adquiridos
Toxinas ambientales: El plomo inhibe la respuesta a LH.

Dibromocloropropano, etilenglicol, cadmio, compuestos organoclorados y tabaco actan como estrgenos o antiandrgenos. Trastornos autoinmunes: Anticuerpos circulantes contra la membrana basal de los testculos Enfermedades granulomatosas: lepra lepromatosa

Defectos adquiridos
Infeccin por Micoplasma: factor femenino asociado

con infertilidad femenina Varicocele: Masa de venas dilatadas y tortuosas que se forman en el escroto. Aumento de la temperatura con la consecuente disminucin de la concentracin espermtica (Menos 5 millones/mL) Hiperplasia prosttica: Obstruccin del flujo uretral por aumento de la prstata Tumores estromales: de las Clulas de Leyding y Sertoli Orquiepididimitis por infeccin Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis y Escherichia coli

Anomalas asociadas con enfermedades sistmicas o neurolgicas y resistencia a andrgenos. Insuficiencia renal: Disminucin de la lbido e impotencia, deterioro de la espermatognesis (destruccinde clulas germinales y falta de produccin de testosterona) Drepanocitosis: Atrofia testicular y de la maduracin testicular de la espermatognesis Enfermedades crnicas: malnutricin proteocalrica, Hodgkin, fibrsis qustica, enfermedad pulmonar crnica y amiloidosis, por falla en las clulas de Leyding Tirotoxicosis: Disminucin en el recuento espermtico y volumen del semen

Anomalas asociadas con enfermedades sistmicas o neurolgicas y resistencia a andrgenos.

Enfermedades inmunolgicas: SIDA, por disminucin

de la testosterona biodisponible
Enfermedad febril aguda: Disminucin de la

concenetracin de espermatozoides
Stress

Los productos de secrecin de las glndulas accesorias pueden ser medidas para evaluar su funcionamiento. Las infecciones pueden causar disminucin en la secresin de estos marcadores, llegndose a observar un dao irreversible en el eepitelio secretor, de tal forma que aun despus del tratmiento los valores permanecen. Puede no presentarse alteracin aun despus de un proceso infeccioso

Capacidad secretora de prstata

Zinc Fosfatasas cidas prostticas Ac. Ctrico Gamma glutamil transpeptidasa

Capacidad secretora de vesculas seminales

Fructuosa Prostaglandinas

Capacidad secretora de epididimos

L- carnitina Glucosidasa neutra Glicerofosfocolina (GPC)

Valores de referencia
La cantidad total de cualquiera de las secresiones de las glndulas accesoiara en el eyaculado, se obtiene multiplicando su concentracin por el volumen total del eyaculado.

Zinc: Mayor o igual a 2.4 mmol/eyaculado Fructuosa: Mayor o igual a 13 mmol/eyaculado

Glucosidasa neutra: Mayor o igual a 20 mU/eyaculado

Zinc
Un equipo para medicin de zinc en suero, con un principio espectrofotomtrico, puede ser adaptado para semen. El siguiente es el principio del mtodo propuesto por Johnsen & Eliasson en 1987. 2-(5-bromo-2-pyridylazo)-5-(N-propil-Nsulfopropiamino)-fenol (5-Br-PAPS), se enlaza al zinc formando un complejo que produce un cambio en la coloracin, el cual presenta un mximo de absorbancia a 540 nm. 5-Br-PAPS + Zn2+ 5-Br-PAPSZn

FRUCTUOSA
La fructuosa forma un complejo coloreado con indol por aplicacin de calor y a pH bajo, el cual presenta un mximo de absorvancia a 470 nm. Existen equipo comerciales para la estimacin de fructuosa seminal. Alternativamente se pueden preparar los siguientes reactivos:

 1. Agente desproteinizante 1(63 mol/l ZnSO4): Disolver

1.8 g de ZnSO4.7H2O en 100 ml de agua destilada.

2. Agente desproteinizante 2 (1 mol/l NaOH): Disolver

0.4 g de NaOH en 100 ml de agua destilada

3. Reacitvo de color (indol 2 mol/l en benzoato 16

mol/l): disolver 200 mg of cido benzoico en 90 ml of agua destilada en bao mara a60 C. Dissolve 25 mg de indol y aforar a 100 ml; almacenar a 4 C.

 4. Estndar de Fructosa 2.24 mmol/l: disolver 40 mg

of D-fructosa en 100 ml de agua destilada. Almacenar a 4C o congelar alcuotas.

5. Curva estndar. Realizar diluciones del estndar de

2.24 mmol/l tandard para prepara concentraciones de 1.12, 0.56, 0.28 and 0.14 mmol/l.
6. Se sugiere preparar un pool de semen para control

de calidad interno

 4. Estndar de Fructosa 2.24 mmol/l: disolver 40 mg

of D-fructose en 100 ml de agua destilada. Almacenar a 4 C o congelar alcuotas 5. curve estandard : Diluir el estndar para preparar concentraciones seriadas de 1.12, 0.56, 0.28 y 0.14 mmol/l. 6. Congelar alcuotas para control de calidad interno

Procedimiento
1. Centrifugar la muestra de semen remanente depus

de su anlisis por 10 minutos a 1 000g, decantar y almacenar el plasma seminal libre de espermatozoides a -20 C hasta su anlisis. Se puede formar un pool con otras muestras para ser utilizado en control de calidad interno. 2. Homogenizar el plasma seminal en vortex.

 3. Preparar diluciones del plasma adicionando 50 ml de

agua destilada en dos tubos de 5 ml y adicionar 5 ml de plasma seminal con pipeta de desplazamiento positivo.

4. Desproteinizacin: A los 55 ml de muestra diluida,

adicionar 12.5 ml de 63 mol/l ZnSO4 12.5 ml de 0.1 mol/l NaOH y mezclar. Reposar 15 min a temperatura ambiente y centrifugar a 8 000 g por 5 minutos.

5. Transferir 50 ml del sobrenadante de cada duplicado a los

tubos de trabajo. Incluir duplicados de blanco y de cada estndar.

 6. Adicionar 50 ml de indol a cada tubo 7. Adiconal 0.5 ml de cido clorhdrico concentrado

(32% v/v) (HCl) a cada tubo. Cubrir con papel parafilm y mezclar cuidadosamente.
8. Incubar por 20 min a 50C en bao mara y enfriar

en bao de hielo por 15 minutos.

9. Leer a 470 nm utilizando el blanco de agua..

a glucosidasa neutra
El plasma seminal contiene una a-glucosidasa neutra producida por epididimo y isoenzma cida producida por prstata, la cual es necesario inactivarla para poder evaluar la funcin del epididimo; esto se hace con dodecil sulfato de sodio.

Principio del mtodo

La a-glucosidasa convierte el sustrato de glucopiransido sLa inttico en p-nitrofenol, el cual por la adicin de abicarbonato de sodio se convierte en un coplejo amarillo, el cual presenta un mximo de absorbancia a 405 nm El equipo de reactivos se encuentra comercialmente disponible

Marcadores bioqumicos y su correlacin con hormonas de fertilidad y la calidad del semen

Varios marcadores bioqumicos son secretados por las glndulas accesorias en el sistema reproductor masculino y pueden ser utilizados como predictores diagnsticos para los desrdenes en el sistema reproductor masculino.

En un estudio realizado en 500 pacientes Sudaneses (150 oligosprmicos, 100 astenozoosprmicos, 100 teratozoospermia), se encontr: a) Alfa glucosidasa neutra y cido ctrico significativamente reducidos en pacientes azosprmicos y oligosprmicos b) B) Zinc, reducido en todos los pacientes infrtiles c) Fructuosa, normal

Se observ una correlacin negativa entre la alfa-glucosidasa neutra y FSH y LH en pacientes azoosprmicos y con prolactina en pacientes oligosprmicos

Las determinaciones realizadas a la muestra de un paciente, es necesario compararlas con valores de referencia para tomar decisiones sobre su diagnstico o manejo. Estos valores han sido determinados considerando condiciones ptimas y controladas y aplicacin de herramientas estadsticas. Las muestras fueron de varones sanos con paternidad dentro de 12 meses despus de interrumpir el uso de mtodos anticonceptivos.

Las caractersticas del semen son altamente variables, tanto intra como inter individuos, y no son el nico determinante de la fertilidad de la pareja. Los parmetros del semen que se encuentran dentro del intervalo de referencia del 95% no son garanta de fertilidad. Las caractersticas del semen de un hombre tienen que ser interpretadas en conjunto con la informacin clnica.

Pruebas funcionales espermtica

Permiten obtener una idea acerca de la capacidad fecundante del espermatozoide. Entre las que evalan la capacidad de transporte estn: a)Prueba de interaccin moco-semen in vivo (prueba poscoital) b) Interaccin moco-semen in vitro ( prueba de Kremer, de Miller-Kurzrok) c) La que emplea moco-semen cruzados.

Pruebas que miden la habilidad fertilizante

a)Evaluacin con lectinas de las modificaciones de las
glicoprotenas espermticas durante la capacitacin b)Prueba de hinchazn hipoosmtica para valorar la funcionalidad de la membrana plasmtica c)Evaluacin acrosomal ,por tinciones diferenciales, anticuerpos monoclonales, inmunofluorescencia o microscopia electrnica. d)Ensayo de unin a la zona pelcida en hemizona ,para comparar los espermatozoides del paciente con controles. e)Penetracin de oocitos de hmster a los que se ha removido la zona pelcida

Muchos Centros Reproductivos prefieren en la actualidad, basarse en la morfologa espermtica segn criterio de Kruger y realizar pruebas de reaccin acrosmica inducida y ensayos de estrs oxidativo, debido a que ofrecen ms simplicidad y mayor valor predictivo en los resultados de la fecundacin

La Medicina es el bello arte de llevar salud a travs de la ciencia, sin perder el lado humano

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