UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA PLATA FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLOGICAS ASIGNATURA HEMATOLOGIA

Mtodos del laboratorio hematolgico

Docentes

Dr. Eduardo Gaddi Dra. Mara Elena Chiesa Dra. Ma. Alejandra Fernndez Alberti Bioq. Fernando Ventimiglia Bioq. Mariana Gonzlez Bioq. Federico Remes Lenicov

La Plata, 2011

Contenido
Instructivo para la obtencin de sangre perifrica por puncin venosa Descripcin de los anticoagulantes usados en hematologa Obtencin del frotis de sangre Coloracin del frotis de sangre segn May Grnwald-Giemsa Contadores automatizados Recuentos celulares en Cmara de Neubauer a) Recuento de glbulos blancos b) Recuento de plaquetas Determinacin de la frmula leucocitaria: recuento diferencial de leucocitos Hematocrito Determinacin de hemoglobina: mtodo de la cianmetahemoglobina Velocidad de sedimentacin globular Recuento de reticulocitos Grupos sanguneos ABO y Rh: pruebas de Coombs Determinacin de anticuerpos inmunes: titulacin de anticuerpos Hemostasia a) Tiempo de sangra b) Tiempo de coagulacin c) Retraccin del cogulo Determinacin del tiempo de tromboplastina parcial activada Determinacin del tiempo de protrombina o tiempo de Quick en una etapa Cuantificacin de hierro srico y TIBC Separacin electrofortica de hemoglobina Deteccin histoqumica de hemoglobina fetal: reaccin de Kleihauer-Betke Diagnstico de mononucleosis infecciosa Clulas LE y auto-anticuerpos Electroforesis de las protenas sricas en acetato de celulosa Citoqumica a) Reaccin de Pas (hidratos de carbono) b) Sudan Black B (lpidos) Determinacin de fibringeno 74 46 47 49 50 52 55 59 62 63 65 67 71 16 18 20 26 31 35 45 3 5 7 7 9 13

INSTRUCTIVO PARA LA OBTENCIN DE SANGRE PERIFRICA POR PUNCIN VENOSA A) EN ADULTOS 1. Durante la toma de muestra deben guardarse las ms estrictas normas de higiene. 2. El material descartable a usar se abrir slo al momento de su utilizacin y, una vez manipulado, no podr guardarse nuevamente an cuando se lo considere nuevo. 3. Una vez realizada la toma de muestra, descartar inmediatamente los materiales usados en recipientes para ese fin. 4. Los recipientes que contienen algodn y los de desecho deben estar perfectamente cerrados todo el tiempo y se abrirn solamente al momento de usar. 5. Al momento de hacer la extraccin colocarse los guantes desechables, los cuales se mantendrn puestos durante todo el procedimiento. 6. Antes de iniciar la toma de muestra, tener todo el material preparado pero sin abrir. 7. Elegir una vena bien visible en el antebrazo, localizndola visualmente y por palpacin. Colocar el lazo y volver a palpar la vena, indicarle al paciente que abra y cierre el puo para facilitar la extraccin. El lazo debe ser colocado de modo de producir una compresin del msculo no mayor a 1 mm. 8. Una vez identificada la vena, limpiar el rea circundante con algodn empapado en alcohol. Dejar secar perfectamente. 9. En este momento se romper el sello de garanta de la aguja, se la colocar en la jeringa sin tocar con los dedos, controlando el correcto funcionamiento del mbolo. 10. La aguja se insertar en la vena elegida con el bisel hacia arriba, dejando que la sangre fluya en la jeringa aspirando suavemente con el mbolo. La escala de la jeringa debe estar visible (hacia arriba). 11. Despus de la toma, se le indica al paciente que abra la mano, se retira el torniquete y luego la aguja, presionando el lugar de la puncin con un trozo de algodn seco. 12. La aguja se descartar en el contenedor destinado para ese fin. La sangre que est en la jeringa se descargar en los tubos o frascos que contienen los anticoagulantes correspondientes, evitando hacer espuma. 13. Rotular los tubos o frascos con los datos del paciente. 14. En el sitio de la puncin se pondr un apsito despus de controlar que no haya ms sangrado.

15. La persona que hace la extraccin deber quitarse los guantes al finalizar la toma de muestra y desecharlos inmediatamente. No deben ser reutilizados. 16. Si hay algn dato que haya interferido con el procedimiento, aclararlo en el registro de muestras. B) EN NIOS 1. En nios mayores de 6 meses, se recomienda hacer la extraccin del brazo como en adultos, pidindole a un adulto que colabore en mantener inmvil al nio, en particular el brazo. 2. En el caso de nios menores de 6 meses, se proceder a extraer la muestra del taln con una lanceta descartable. Antes de la extraccin conviene calentar el taln frotndolo entre las manos para favorecer la irrigacin de la zona. 3. Desinfectar con un trozo de algodn embebido en alcohol, dejar evaporar y punzar con la lanceta, en la zona del taln indicada en el dibujo adjunto. 4. Limpiar la primera gota y dejar gotear la sangre en el tubo con anticoagulante. 5. Secar la zona con un trozo de algodn seco y una vez que no haya sangrado, colocar una curita o apsito.

Las flechas indican los lugares de puncin

DESCRIPCIN DE HEMATOLOGA

LOS

ANTICOAGULANTES

USADOS

EN

Los anticoagulantes se utilizan para obtener plasma o muestras de sangre total para estudiar las caractersticas morfolgicas y realizar los recuentos celulares. Deben intentar que las clulas sanguneas a estudiar se encuentren en el estado ms parecido al fisiolgico, como cuando se encuentran circulando por el torrente sanguneo. Para ello los anticoagulantes no deben alterar la morfologa de los leucocitos ni el tamao eritrocitario, no producir hemlisis e impedir la agregacin plaquetaria, posibilitando al mismo tiempo el mximo perodo de conservacin de la muestra (generalmente no ms de 24 horas incluso refrigerada a 4 C). Los anticoagulantes ms utilizados son: EDTA (C10H16N2O8) o sal disdica, dipotsica o tripotsica del cido etilendiaminotetraactico, acta mediante un efecto quelante sobre el calcio (Ca ++), impidiendo el proceso de la coagulacin al fijarlo. Este anticoagulante se utiliza fundamentalmente para la realizacin de recuentos celulares, sobretodo en los autoanalizadores y permite adems la realizacin del hematocrito y del frotis sanguneo hasta dos horas despus de la extraccin de la muestra al mismo tiempo que impide la aglutinacin de las plaquetas. Las sales de potasio tienen la ventaja con respecto a la de sodio, por ser ms fcilmente solubles en sangre cuando las usamos a partir del producto slido, sin embargo , las tres sales afectan el tamao del eritrocito, especialmente despus del almacenamiento de la sangre anticoagulada por espacio de algunas horas. El International Council for Standardization in Hematology (ICSH) recomienda la sal dipotsica como anticoagulante para recolectar muestras sanguneas destinadas al recuento y caracterizacin del tamao celular y especialmente cuando los valores del hematocrito se requieren para la calibracin de los contadores automticos. El K2EDTA.2H2O posee un peso molecular relativo de 404,1g; 1g quela 100 mg de calcio inico y el pH para una solucin al 1% es de 4.8+/-1,0. La cantidad de EDTA dihidratado agregada a la sangre debe ser de 1.5-2.2 mg/ml. de sangre total. Esta cantidad es un compromiso entre la cantidad requerida para evitar la coagulacin y la cantidad a la cual se producen las alteraciones celulares. HEPARINA SDICA (o HEPARINA DE LITIO) es un anticoagulante fisiolgico que acta impidiendo que la protrombina se transforme en trombina. Estructuralmente es un mucopolisacrido cido. Los frotis realizados con muestras sanguneas anticoaguladas con heparina producen en las tinciones panpticas un color azulado y una pseudovacuolizacin celular por lo tanto no se lo recomienda para tal fin. La proporcin adecuada es de 15-20 UI (0.1-0.2 mg) de heparina por ml de sangre. CITRATO TRISDICO, C6H5O7Na3, acta impidiendo que el calcio se ionice, evitando as la coagulacin. Se utiliza para realizar las pruebas de hemostasia en una proporcin sangre: anticoagulante 9:1; as como para la velocidad de eritrosedimentacin en una proporcin sangre: anticoagulante 4:1. El citrato sdico se utiliza a una concentracin de 0.106 mol/l (31,3 g/L de C6H5O7Na3.2H2O).

ACD se emplea fundamentalmente en Bancos de Sangre para conservar las unidades de sangre y para estudios metablicos eritrocitarios por permitir una buena conservacin de los hemates. Se utiliza en una proporcin de un volumen de ACD por cada cuatro volmenes de sangre. La proporcin de la mezcla del anticoagulante es de: Acido Ctrico 0.9 g, Citrato disdico 2 g, Dextrosa 2 g, H2O destilada 120 ml.

OBTENCIN DEL FROTIS DE SANGRE Sobre un portaobjetos perfectamente limpio, se coloca en un extremo una gota pequea de sangre (1-2 mm) recin obtenida, ya se trate de puncin digital, o del taln (en pediatra) o de la ltima gota de sangre extrada con la jeringa y que se encuentra en la luz de la aguja. Evitar usar sangre con anticoagulantes porque altera la morfologa de las clulas. Por medio de otro portaobjetos de borde pulido y al cual se le ha quitado los ngulos (extensor), se realiza la extensin de la gota de sangre. Conservando un ngulo menor de 45 respecto al portaobjetos horizontal, el extensor se apoya delante de la gota de sangre y retrocediendo hasta tocarla, una vez que la misma se extiende a lo largo del borde de contacto por capilaridad, se avanza con firmeza y no muy rpidamente. As se obtiene una fina pelcula de sangre que representa integralmente a la gota de sangre que se extiende. Secar rpidamente el extendido al aire para evitar el deterioro de las clulas. Un extendido as obtenido poseer tres reas de diferente espesor y con distribucin tambin distinta de leucocitos: 1. Zona excesivamente gruesa: se encuentra en la regin inmediata al punto de partida de la extensin (cabeza). En ella hay siempre un aumento del nmero de linfocitos. 2. Zona excesivamente fina: corresponde al final de la extensin (cola) y en sta se observa un exceso de granulocitos y monocitos. 3. Zona ideal: regin central (cuerpo), en ella hay un reparto equilibrado de las clulas.

COLORACIN DEL FROTIS DE SANGRE SEGN MAY GRNWALDGIEMSA Fundamento Prcticamente todos los mtodos empleados para teir las clulas de la sangre se basan en el empleo de una mezcla de eosina y azul de metileno. Estos colorantes son muy sensibles a las variaciones de pH de las diferentes estructuras celulares, de modo que las que tienen carcter bsico fijan en mayor medida la eosina (colorante cido), mientras que las que poseen propiedades cidas fijan principalmente

el azul de metileno (colorante bsico). Esto explica que ciertas estructuras basfilas presentes en el ncleo (nuclolo) o en el citoplasma (ribosomas) se coloreen de azul, mientras que otros componentes acidfilos como la hemoglobina adquieren color rosado. De esta manera, la diferente afinidad de ciertas granulaciones citoplasmticas por dichos colorantes permite clasificar los leucocitos polimorfonucleares en: neutrfilos, en los que la granulacin especfica posee compuestos neutros que fijan ambos colorantes simultneamente, resultando en un color pardo; eosinfilos, en los que la granulacin especfica contiene sustancias de intenso carcter bsico que fijan fundamentalmente los colorantes cidos, dando un color rojo-naranja; y los basfilos, cuya granulacin especfica posee sustancias de carcter cido, que fijan colorantes bsicos dando un color azul oscuro. Reactivos Solucin May Grnwald: eosinato de azul de metileno en metanol. Solucin Giemsa: azul de metileno (clorhidrato de tetrametiltionina), su derivado oxidado en medio alcalino (el azur II), y eosina (tetrabromofluorescena).

Mtodo Cubrir el frotis de sangre seco con solucin May Grnwald. Dejar 3 minutos. A continuacin, agregar buffer fosfato pH 6.8 en proporcin igual a la de colorante. Homogeneizar soplando suavemente con una pipeta o moviendo el portaobjetos con un movimiento de vaivn. Dejar 5 minutos. Volcar y cubrir el preparado con una solucin de Giemsa, obtenida a razn de dos gotas del colorante por ml de agua. Dejar 10 minutos. Lavar con agua , limpiar la cara inferior del portaobjeto con un algodn y secar al aire.

MTODOS AUTOMATIZADOS: CONTADORES HEMATOLGICOS A) RECUENTO DE CLULAS POR MTODO AUTOMATIZADO La automatizacin ha contribuido de manera decisiva al aumento de la rapidez y la fiabilidad del recuento de las clulas sanguneas. Existen distintos tipos de instrumentos: los semiautomatizados que requieren algunos pasos previos, como por ejemplo diluciones de la muestra antes de ser procesada, y los aparatos totalmente automatizados que slo requieren que se les suministre la muestra obtenida en condiciones apropiadas (por ejemplo con el anticoagulante adecuado). Los sistemas de recuento celular por estos medios se basan en la medida del tamao u otras propiedades fsicas de las clulas suspendidas en medio lquido de acuerdo con uno de los dos principios siguientes: 1. Impedancia o resistencia elctrica. 2. Dispersin de luz o campo oscuro.

1. Mtodo de la impedancia o de la resistencia elctrica Es el ms empleado en los autoanalizadores hematolgicos. Se basa en la propiedad de las clulas sanguneas de no conducir la electricidad. La sangre total es diluida en una solucin de conductividad estable, las clulas sanguneas as diluidas se hacen pasar por un orificio de apertura con un rea prefijada. Por dentro y fuera del orificio se disponen electrodos que establecen una diferencia de potencial. Cuando una clula pasa a travs del orificio, se genera una resistencia entre ambos electrodos que se registra como un impulso. El nmero de impulsos se corresponde directamente con el recuento celular y como la amplitud del impulso es directamente proporcional al tamao de la clula, es posible determinar tambin el volumen celular. Este mtodo tiene algunas limitaciones. Como los impulsos elctricos que van a determinar el volumen celular se generan en el orificio de apertura del sistema, para cada poblacin celular que se quiera estudiar se deben seleccionar las condiciones para que sean analizadas sin error. Las condiciones ms importantes que deben tenerse en cuenta son: 1. La intensidad de corriente entre ambos electrodos: debe ser lo suficientemente sensible para detectar la resistencia que genera la partcula cuando atraviesa el orificio. Si es muy elevada puede daar las clulas y producir interferencias originadas por ruido electrotrmico. El dimetro del orificio de apertura: debe estar en relacin al tamao de las partculas que se analizan. Debe ser perfectamente permeable, por lo general poseen un monitor de visualizacin que permite observar su permeabilidad

2.

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durante el recuento. Es importante realizar peridicamente una limpieza de este orificio. 3. La concentracin de la suspensin analizada: debe ser la adecuada para evitar el error de coincidencia, es decir, que varias clulas atraviesen el orificio al mismo tiempo.

2. Mtodo de dispersin de luz Se analiza la dispersin de luz producida por las clulas desde dos dimensiones gracias a sensores ubicados en ngulos diferentes. Las clulas se hacen pasar individualmente a lo largo de una cmara de lectura sobre la que incide perpendicularmente un haz de luz que puede ser halgena o lser. Cada vez que una clula se interpone en el haz de luz se produce una sombra que, proyectada sobre un campo oscuro, ser analizada por los sensores. Estos sistemas permiten medir la concentracin y el volumen celulares. Si adems las clulas se someten a tinciones citoqumicas, se pueden determinar los diferentes tipos de leucocitos midiendo la intensidad de dicha reaccin. Causas de error en el recuento automatizado de clulas Con el empleo de mtodos automatizados se puede cometer grandes errores si se olvida el control peridico y el calibrado diario de los instrumentos. En general, el error debido al propio mtodo de recuento electrnico, cuando se realiza en ptimas condiciones, suele ser inferior al 1%, pero puede incrementarse por: 1. Errores de extraccin: a) Dilucin. b) Hemoconcentracin. c) Coagulacin parcial. d) Hemlisis. 2. Mala homogeneizacin por agitacin insuficiente de la sangre. 3. Uso de un diluyente incorrecto. 4. Presencia de partculas extraas en el diluyente. 5. Defectos en el sistema electrnico de recuento: a) Lisis incompleta de los eritrocitos en el orificio de leucocitos. b) Presencia de agregados celulares a nivel del orificio de recuento. c) Obstruccin de los capilares u orificios de recuento. d) Dilucin incorrecta de la muestra por el lquido diluyente. e) Presencia de microburbujas, que son contadas como clulas. f) Contaminacin por arrastre de un espcimen con el siguiente. g) Presencia de interferencias electrnicas y averas de los componentes electrnicos del instrumento.

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Valores de referencia Glbulos rojos: Edad Recin nacidos Nios (2-12 aos) Adultos jvenes (12-18 aos) Adultos (19-60 aos) Glbulos blancos: Adultos Recin nacidos Nios de 1 ao Nios de 4 a 7 aos Nios de 8 a 12 aos Plaquetas: Edad Adultos Intervalo de referencia 150x109/L 400x109/L 4.000 - 11.000 / mm3 10.000 - 25.000 / mm3 6.000 - 18.000 / mm3 6.000 - 15.000 / mm3 4.500 - 13.000 / mm3 Sexo ambos ambos mujeres hombres mujeres hombres Intervalo de referencia 4,7x1012/L - 6,3x1012/L 4,0x1012/L - 5,3x1012/L 4,1x1012/L - 5,1x1012/L 4,5x1012/L - 5,3x1012/L 4,1x1012/L - 5,2x1012/L 4,6x1012/L - 5,9x1012/L

B) DETERMINACIN DEL HEMATOCRITO El mtodo automtico de determinacin del hematocrito se basa en el clculo matemtico a partir del Volumen Corpuscular Medio (VCM) y el nmero de hemates. Hto = n de hemates x VCM Valores de referencia El valor de Hto vara con la edad y el sexo. Se indican los valores medios 2 DE. Edad y sexo Recin Nacidos Nios (hasta 10 aos) Mujeres (18-50 aos) Embarazadas Hombres (18-50 aos) Hematocrito % 54 10 38 5 42 5 39 5 45 5 Fraccin 0,54 0,1 0,38 0,05 0,42 0,05 0,39 0,05 0,45 0,05

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C) NDICES HEMATIMTRICOS Volumen Corpuscular Medio (VCM) VCM (fL) = Hto (fraccin) / N GR (x1012/L) Hemoglobina Corpuscular Media (HCM) HCM (pg) = Hb (g/L) / N GR (x1012/L) Concentracin de Hemoglobina Corpuscular Media (CHCM) CHCM (g/L) = Hb (g/L) / Hto (fraccin) Ancho de distribucin de glbulos rojos (RDW %)

Valores de referencia Se indican los intervalos de referencia para adultos. VCM (fL) 80 - 96 HCM (pg) 28 - 33 CHCM (g/L) 33 - 36 RDW% 15,8 2,9

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RECUENTO DE CLULAS EN CMARA DE NEUBAUER A) RECUENTO DE LEUCOCITOS 1) Agregar 20 l de sangre a un tubo de Kahn conteniendo 0,38 ml de solucin de Trk. Esta solucin contiene acido actico al 1 % en agua destilada y el agregado de una punta de esptula de azul de metileno. 2) Homogeneizar la mezcla. 3) Cargar las cmaras de recuento. La cmara puede ser cargada con un capilar o con una micropipeta, evitando que queden burbujas para que la misma quede cargada uniformemente. 4) Ubicar el reticulado de la cmara con bajo aumento, constatar la ausencia de burbujas y que la distribucin sea regular. 5) Aplicando mayor aumento se procede al recuento de los elementos presentes en los cuadrados angulares grandes (4) de la cmara. Las cuentas de los cuatro cuadrados no deben diferir entre s en ms del 20%. En caso contrario debe cargarse nuevamente la cmara.

Recuadro central

6) Clculo:

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m x 10 x d = N de leucocitos/ mm3 n Donde: m=nmero de leucocitos contados en n (4) cuadrados de 1 mm de superficie y d=dilucin utilizada. Si el valor obtenido (leucocitos/mm3 de sangre) es menor de 2500, se practica nuevamente el recuento empleando una dilucin 1:10. Si por el contrario el nmero resulta notablemente elevado se emplean diluciones 1:100 o 1:200.

B) RECUENTO DE PLAQUETAS 1) Obtener sangre por puncin venosa en anticoagulante EDTA (0,342 mol/L), en tubos plsticos. 2) Homogeinizar bien la muestra y tomar 100 l que se colocan en otro tubo plstico que contenga 1,9 ml de oxalato de amonio 1%. La solucin hipotnica de oxalato de amonio en agua destilada induce hemlisis. 3) Incubar 10-15 min. para permitir la hemlisis. 4) Cargar la cmara de Neubauer con el hemolizado y dejar que sedimenten las plaquetas en ambiente hmedo: se recomienda colocar la cmara dentro de una cpsula de Petri conteniendo un trozo de algodn humedecido. 5) Incubar 10-15 min en atmsfera hmeda. 6) Efectuar el recuento en microscopio en el reticulado central de la cmara (el que est dividido en 400 cuadrados pequeos comprendidos en 1 mm 2). Se eligen 5 de los cuadrados que se encuentran subdivididos en 16 cuadraditos, como se muestra a continuacin:

Recuadro central La superficie de este cuadrado central es de 1 mm 2 y la cmara tiene una profundidad de 0,1 mm. 7) Contar los 4 cuadrados de los extremos y el cuadrado central (por ende, sern 5 cuadrados con 16 cuadraditos c/u, o sea 80 cuadraditos).

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8) Clculo: Sumar las plaquetas contadas en los 5 cuadrados y multiplicar por 1000 para obtener el nmero de plaquetas por mm3. El factor 1000 surge del producto: 20 x 400 = 1000/mm3 80 x 0,1 mm3 Donde 20 es el factor de dilucin, 400 son los cuadraditos totales y 80 los cuadraditos contados. El volumen total del cuadrante es de 0,1 mm3. Observaciones Actualmente, en muchos laboratorios, los recuentos de plaquetas se realizan en forma automatizada en contadores hematolgicos o en contadores especficos, habindose logrado un alto nivel de precisin (incluso en trombocitopenias). El recuento manual suele efectuarse para la comprobacin de la cifra de plaquetas en trombocitopenias muy graves y en el caso de plaquetas gigantes en las que el recuento automtico no es fiable.

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DETERMINACIN DE LA FRMULA LEUCOCITARIA: RECUENTO DIFERENCIAL DE LEUCOCITOS La frmula leucocitaria es un recuento relativo de los distintos tipos leucocitarios. Su interpretacin siempre debe realizarse junto con la informacin proveniente del recuento absoluto. La determinacin de los diferentes tipos de leucocitos se realiza en un frotis coloreado por May Grnwald-Giemsa. Primero se observa a bajo aumento para tener una visin general del preparado. Luego, tras colocar una gota de aceite de inmersin, se observa la regin media del extendido con un aumento de 100X para comenzar el recuento. Para obtener un resultado confiable, es importante no clasificar y contar dos veces las mismas clulas. Para ello debe recorrerse el extendido siguiendo una trayectoria ordenada. Por ejemplo, dicha trayectoria se puede realizar comenzando en uno de los bordes, desplazndose 4 a 5 campos microscpicos de forma paralela a este e iniciando a continuacin una recorrida transversal hasta llegar al otro borde. All se comienza de nuevo, recorriendo 4 a 5 campos microscpicos paralelos al borde y otra incursin transversal hasta el borde opuesto. Se clasifican como mnimo 100 leucocitos. Tener en cuenta que esta trayectoria debe quedar contenida en la zona media del extendido, ya que la morfologa proporcin de los leucocitos puede verse afectada en las zonas de cola y cabeza del mismo. Valores de referencia No hay variacin de la frmula segn el sexo, pero s segn la edad. Frmula leucocitaria normal de un adulto Cayados Neutrfilos Eosinfilos Basfilos Linfocitos Monocitos 0-1% 55-70% 1-4% 0-1% 20-40% 4-8%

Nacimiento: 70% de neutrfilos. Primera semana: 50% de neutrofilos y 50% de linfocitos. Segunda semana: 65% de linfocitos y 25% de neutrfilos3-4 aos: 50% de linfocitos y 50% de neutrfilos. 10-12 aos: valores de referencia del adulto.

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Descripcin de cada uno de los elementos que componen una frmula normal 1. Neutrfilo: Ncleo lobulado ( 2-5 lbulos). Los lbulos estn unidos entre s por filamentos cromatnicos muy delgados. La cromatina es condensada. Es una clula terminal. Mide aproximadamente 12 m. El citoplasma es abundante y rosado, cubierto por una granulacin fina especfica de color pardo rojiza. 2. Neutrfilos en cayado: Slo se diferencia del anterior por su ncleo no lobulado en forma de C y, a veces de S . No hay una zona muy delgada de material nuclear que permita diferenciar dos lbulos. 3. Eosinfilo: Mide aproximadamente 13 m. El ncleo es segmentado, con predominio del bisegmentado en forma de anteojo. El citoplasma es abundante y est cubierto de granulaciones esfricas de mayor tamao que las del neutrfilo y que se colorean de anaranjado. 4. Basfilos: Mide aproximadamente 10 m. El ncleo est irregularmente lobulado. La cromatina es densa. La masa nuclear es voluminosa con relacin al citoplasma. Las granulaciones son groseras y muy irregulares en forma y tamao pudiendo quedar superpuestas al ncleo, cubrindolo parcialmente. 5. Linfocitos: Es una clula generalmente pequea (7 m), pero puede llegar hasta 12 m. La forma ms pequea posee slo un escaso anillo de citoplasma color celeste. Alrededor de un 10% de los linfocitos circulantes son clulas ms grandes y con citoplasma ms abundante. El ncleo por lo general es redondo, pero puede tener una escotadura. La cromatina es densa. 6. Monocito: Es el leucocito normal de mayor tamao (18-24 m). El ncleo presenta forma irregular y variada, la cromatina se esponjosa. La proporcin ncleo-citoplasma es aproximadamente semejante. El citoplasma se tie de celeste plomizo y no presenta granulaciones.

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HEMATOCRITO Definicin El hematocrito (Hto) es la relacin existente entre el volumen de eritrocitos y el volumen total de sangre, expresado como porcentaje. Est directamente relacionado con la concentracin de hemoglobina, por lo que su determinacin constituye el procedimiento ms simple para el diagnstico de anemia. As, un descenso del Hto es indicativo de anemia, mientras que el aumento lo es de poliglobulia. El mtodo de referencia para la determinacin del Hto es la centrifugacin de sangre total en tubo capilar (micromtodo). Es una tcnica sencilla, barata y accesible a laboratorios de baja complejidad. Aunque tambin puede emplearse un tubo de Wintrobe (macromtodo), este procedimiento no es tan recomendable debido a su mayor inexactitud e imprecisin. Ambos mtodos se basan en medir el empaquetamiento de la columna de eritrocitos cuando la sangre total con anticoagulante se somete a la accin de una fuerza centrfuga. Por ello, entre sus factores de error est el plasma que queda atrapado entre los eritrocitos empaquetados y el posible efecto de leucocitos y plaquetas en la lectura. En la actualidad, todos los autoanalizadores hematolgicos suministran, dentro del contexto del hemograma automatizado, un valor de Hto que resulta de un clculo electrnico a partir del Volumen Corpuscular Medio (obtenido por conductividad o campo oscuro) y la concentracin de eritrocitos. Obviamente este valor obtenido electrnicamente difiere del obtenido por centrifugacin en que no considera el efecto del plasma atrapado entre los eritrocitos ni el efecto de las restantes clulas sanguneas, por lo que es siempre algo inferior (0,2-0,3 %). Tanto el Hto obtenido por microcentrifugacin o por mtodos automatizados, son un buen parmetro del estado de la serie eritroide. El Hto refleja la concentracin y no la masa total de glbulos rojos. Por ejemplo, en un paciente en estado de shock acompaado de hemoconcentracin, el Hto. puede ser normal o alto, an cuando la masa eritrocitaria total disminuye por la prdida de sangre. Por lo tanto no es confiable como indicador de anemia poco despus de una hemorragia o una transfusin. Micromtodo (microhematocrito) Es una tcnica muy utilizada, por necesitar muy poca cantidad de sangre, ser muy sencilla y poder realizarse en gran nmero de muestras a la vez y en muy poco tiempo. Se utilizan tubos capilares de vidrio de 7 a 7,5 cm de longitud por 1 mm de dimetro interno. Heparinizados o no, dependiendo del tipo de muestra (sangre entera anticoagulada o sangre capilar). Si se utiliza sangre capilar, se desechar la primera gota despus de la puncin. Se llena el tubo capilar hasta tres cuartas partes de su capacidad con la sangre (aproximadamente 50 l). El llenado de los tubos se realiza por capilaridad, 19

favoreciendo el proceso inclinando el capilar hacia abajo a medida que se va llenando. Limpiar con papel o gasa el capilar y tapar el extremo limpio con plastilina o sellndolo a la llama del mechero. Una vez cerrados se colocan los capilares en la centrfuga con el extremo del capilar cerrado hacia fuera y de modo que quede perfectamente equilibrada. Se centrifugan durante cinco minutos a 12.000 rpm. Tan pronto se detiene la centrfuga se extraen los capilares y se procede a su lectura. Esta se puede realizar con los lectores de hematocrito, que nos darn el resultado directamente, o con una regla milimetrada, aplicando la siguiente regla de tres: A________________100 B________________ x donde: x: hematocrito (por ciento) A: longitud total de sangre en el capilar B: longitud de la parte corpuscular La determinacin del Hto debe realizarse por duplicado y la diferencia entre los dos valores obtenidos no debe ser nunca superior a 0,01. Causas de error Las fugas de muestra al no quedar bien sellado los capilares producen una disminucin en el valor, al perderse mayor proporcin de clulas que de plasma. El uso de anticoagulantes lquidos provoca un error por dilucin de la muestra En muestras capilares, no descartar la primer gota produce una mezcla con los lquidos tisulares que provoca hemodilucin. En muestras de sangre venosa, el lazo colocado durante un cierto tiempo produce hemoconcentracin. La lectura no inmediata de los capilares, provoca que el sedimento de hemates vaya tomando forma de bisel si el capilar permanece en posicin horizontal.

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DETERMINACIN DE HEMOGLOBINA: CIANMETAHEMOGLOBINA Fundamento

MTODO

DE

LA

Este mtodo tiene como fundamento la transformacin previa de la hemoglobina en cianmetahemoglobina (HiCN), que es muy estable y posee un color caracterstico cuya absorbancia a 540 nm puede ser cuantificada comparndola con la de varias soluciones de concentraciones conocidas de hemoglobina preparadas a partir del patrn de referencia (curva de calibracin). Los distintos compuestos de hemoglobina, excepto la sulfohemoglobina, que casi nunca es significativa, se transforman en HiCN segn el siguiente proceso: Hemoglobina + Ferricianuro potsico metahemoglobina Metahemoglobina + Cianuro potsico cianmetahemoglobina Materiales Espectrofotmetro o fotocolormetro: Estos instrumentos deben ser calibrados peridicamente mediante la solucin patrn de HiCN, preparada de acuerdo a las especificaciones del International Committee for Standardization in Haematology (ICSH) Tubos: 12 x 100 mm. Sangre venosa total: anticoagulada con EDTA-K3 (1,5 mg/ml) o con heparina (10 UI/ml). Puede emplearse sangre capilar. Pipetas volumtricas: de vidrio y de 5 ml. Pipetas automticas: de 20 l, debidamente calibradas. Reactivo de Cianmetahemoglobina (reactivo de Drabkin): Composicin (pH 7-7,4) Ferricianuro potsico [K3 Fe(CN) 6] Cianuro potsico [CNK] Fosfato monopotsico [KH2PO4] Detergente no inico* Agua destilada 200 mg 50 mg 140 mg 1 ml hasta 1000 ml

*Detergentes no inicos: Tritn X-100, Nonic 218, Nonidet/40, Quolac Nic 218. El detergente no inico facilita la solubilizacin de protenas insolubles y acelera la transformacin de la hemoglobina en HiCN, de forma que aquella se completa en 5 min. Este reactivo debe tener un color amarillo plido, ser completamente transparente y tener un pH entre 7 y 7,4. La lectura de absorbancia a 540 nm utilizando agua destilada como blanco debe ser igual a cero. Para su conservacin utilizar botellas de vidrio de borosilicato opacas y mantener a temperatura ambiente (el fro modifica el color del reactivo). 21

Patrn de referencia (solucin comercial): Es una solucin de HiCN cuya absorbancia corresponde a una determinada concentracin de hemoglobina. Todo patrn de referencia de HiCN debe cumplir las especificaciones del llamado patrn primario de HiCN (detalladas en el punto siguiente). Patrn primario de HiCN: Se suministra a centros o personas relacionadas con programas oficiales reconocidos para la estandarizacin y el control de calidad. Este patrn, es una solucin muy estable de cianmetahemoglobina cuyas propiedades y caractersticas fisicoqumicas han sido definidas por el ICSH en base al peso molecular (64,458) y el coeficiente de extincin (44,0) de la hemoglobina. Se suministra en ampollas cerradas al vaco que contienen 10 ml de una solucin de HiCN correspondiente a una concentracin exacta de hemoglobina que se indica siempre en la ampolla. El valor correspondiente en gramos de hemoglobina por litro se refiere al que tendra una muestra de sangre diluida y preparada convenientemente para realizar la lectura fotocolorimtrica correspondiente a la ampolla. As, si en el frasco se indica una concentracin de 572 mg/l, significa que dicha solucin patrn posee la misma absorbancia que la de una solucin de hemoglobina de 143 g/l, si la sangre total se ha diluido 250 veces. El patrn primario posee un espectro de absorcin caracterstico con un pico de mxima absorbancia (A) a 540 nm y una inflexin a 504 nm. La curva de longitud de onda versus Abs, desde =750 nm a =460 nm se observa en la Fig.1, donde tambin se incluye la curva del reactivo. El valor de la Abs a 540 nm debe variar entre 0,400 y 0,404, y a 504 nm entre 0,248 y 0,251, segn el lote y el instrumento de lectura utilizados. El cociente A540/A504 debe oscilar entre 1,60 y 1,62. Si alguno de estos parmetros se modifican, indica deterioro del patrn.

Tcnica Por un lado, se efectuar el espectro de absorcin de la solucin de HiCN y del reactivo de Drabkin en un rango de 400 a 700 nm (Fig.1). Por otro lado se determinar la concentracin de Hemoglobina de una muestra problema siguiendo los pasos detallados a continuacin: 1) Conectar el espectrofotmetro. 2) Homogeneizar bien la sangre mediante agitacin suave con un sistema automtico (rodillos/disco giratorio) durante un tiempo mnimo de 5 min o manualmente por inversin del tubo 20 veces. 3) Pipetear 5 ml de reactivo de Drabkin en un tubo de ensayo limpio. 4) Mediante la micropipeta aadir 20 l de sangre homogeneizada al tubo que contiene 5 ml de reactivo de Drabkin. Al realizar esta operacin es fundamental eliminar el exceso de sangre que pueda quedar en las paredes externas del capilar antes de introducirlo en el reactivo y procurar asimismo que no quede sangre adherida a las paredes internas de la pipeta. 5) Agitar el tubo con el fin de conseguir homogeneizar bien la mezcla sangre-reactivo y esperar un mnimo de 5 min para que se produzca la hemlisis total y se complete la transformacin de toda la hemoglobina en cianmetahemoglobina. 22

6) Leer la Abs de la solucin a 540 nm, utilizando agua destilada como blanco. 7) Para calcular la concentracin de hemoglobina es recomendable disponer de una curva de calibracin (ver ms adelante), de un Standard de Hb o de una solucin patrn de HiCN. Elaboracin de la curva de calibracin La grfica de calibracin tiene como finalidad calibrar el espectrofotmetro para una lectura determinada calculando la correccin existente entre los valores de Abs ledos en el aparato y los correspondientes valores de concentracin de hemoglobina. Para trazar este grfico se preparan 5 soluciones de concentracin de HiCN conocida y decreciente a partir del patrn de HiCN mediante diluciones sucesivas en reactivo de cianmetahemoglobina (vase tabla). Reactivo de Drabkin Volumen Dilucin Hb Tubo (modificado) final (ml) (g/l) (g/l)* (ml) 1 3,0 0 3 0 145 2 1,5 1,5 3 1:2 72 3 1,0 2,0 3 1:3 48 4 0,5 2,5 3 1:6 24 5 0 3,0 3 0 0 * El valor de esta concentracin depender del valor indicado en la ampolla del patrn de HiCN que se emplee en el Trabajo Prctico. Patrn de referencia de HiCN (ml) La concentracin de hemoglobina correspondiente a cada tubo se determina a partir del grado de dilucin y del valor indicado en la ampolla del patrn de HiCN. Una vez preparadas las soluciones patrn, se inicia la lectura a 540 nm del tubo que contiene slo reactivo (tubo 5) y se ajusta la Abs (100% de transmitancia). Luego, partiendo de la solucin de HiCN ms diluida (tubo 5) se leen las restantes soluciones patrn. Finalmente, la relacin entre los valores de Abs obtenidos y los correspondientes de concentracin de hemoglobina se representan en un grfico con los valores de Abs en las coordenadas y la concentracin de hemoglobina en las abscisas (Fig. 2).

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Causas de error en la determinacin de la concentracin de hemoglobina La determinacin de hemoglobina est sometida a posibles errores que deben ser tenidos en cuenta. Algunos de ellos obedecen a caractersticas peculiares del espcimen como la presencia de hiperlipemia o leucitocitosis intensa (>50 x 109/L). No obstante, la mayora de las veces los errores se deben a defectos tcnicos en la manipulacin y el anlisis del espcimen. Errores en la obtencin del espcimen de sangre: 1. Errores de extraccin 2. Empleo de anticoagulantes no recomendados 3. Coagulacin parcial de la sangre Errores de la dilucin: 1. Empleo de pipetas automticas descalibradas u otras pipetas sucias o hmedas 2. No eliminacin del exceso de sangre adherida a las paredes externas del capilar antes de introducirlo en el reactivo 3. Dilucin incompleta de la sangre en el reactivo Errores de la transformacin de la hemoglobina en HiCN: 1. Empleo de reactivo de Drabkin mal preparado o vencido 2. Lectura antes del tiempo necesario para la completa transformacin de la Hb en HiCN Errores de la determinacin: 1. Empleo de instrumentos no calibrados 2. Cubetas sucias o deterioradas 3. Soluciones turbias de HiCN Errores en la conservacin del reactivo: 1. Congelacin del reactivo, lo que produce transformacin de K3Fe(CN)6 en K4Fe(CN)6 y una oxidacin parcial de la Hb. 2. Conservacin del reactivo en botellas de polietileno: se pierden grupos CN con formacin exclusiva de metahemoglobina, en vez de HiCN, con lo que los valores de concentracin de Hb obtenidos son inferiores a los reales.

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Figura 1. Espectro de absorcin de la solucin de HiCN y del reactivo de Drabkin

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Figura 2. Curva de calibracin elaborada a partir de una solucin de cianmetahemoglobina de concentracin conocida.

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VELOCIDAD DE SEDIMENTACIN GLOBULAR Fundamento El test de velocidad de sedimentacin globular (VSG) mide la sedimentacin de eritrocitos en su plasma nativo. VSG es un test no especfico que puede ser utilizado para detectar un amplio rango de enfermedades y para monitorear el curso evolutivo de ciertas enfermedades crnicas como los procesos inflamatorios crnicos (artritis reumatoidea, polimialgia reumtica y tuberculosis) o la respuesta a la terapia, por ejemplo con citostticos (para enfermedad de Hodgkin, linfomas y mieloma mltiple). Sin embargo, en ocasiones, cuadros tan graves como neoplasias y la cirrosis pueden presentar una VSG normal. Constituye uno de los tests ms utilizados como screening en el laboratorio clnico. Se trata de un mtodo sencillo para realizar y que requiere equipamiento simple. El mecanismo por el cual se produce la eritrosedimentacin no est completamente dilucidado, pero parece obedecer a interacciones electrostticas entre la superficie de los GR y diversas protenas del plasma que favorecen (fibringeno y globulinas) o disminuyen (albmina) la agregabilidad de estas clulas. Desde el punto de vista fsico, este fenmeno depende de los siguientes factores: a. b. c. d. Tamao de los GR Diferencia de densidad entre los GR y el plasma Viscosidad del plasma. Temperatura.

Estos factores se hallan relacionados entre s a travs de la ley de Stokes si se considera al GR como una esfera suspendida en un medio infinito (relacin entre la resistencia R que encuentra una partcula esfrica de radio r al desplazarse en el seno de un fluido de viscosidad a una velocidad v: R = 6vr La sedimentacin ocurre en 3 etapas: 1) una etapa en que se produce la aglutinacin de los GR con formacin de agregados en forma de "pilas de monedas", 2) un perodo durante el cual los agregados de GR sedimentan a velocidad constante, y 3) una etapa final donde la velocidad de sedimentacin se enlentece al mismo tiempo que los GR se acumulan en el fondo del recipiente. La etapa ms importante es la primera o de aglutinacin, ya que de ella depender la velocidad de todo el proceso. As, cuanto ms pequeos sean los agregados, ms lentamente se producir la sedimentacin y viceversa. Dado que, como se mencion ms arriba, el test tambin est influenciado por la forma y el tamao de los GR, ste resulta poco confiable como un ndice de enfermedad en la anemia falciforme o cuando hay una marcada poiquilocitosis. La velocidad de sedimentacin se incrementa por las altas concentraciones de fibringeno y otras protenas de fase aguda e inmunoglobulinas. La albmina retarda la 27

VSG. El mecanismo por el cual el fibringeno y las globulinas facilitan la aglutinacin de GR no se conoce fehacientemente aunque se cree que actan disminuyendo la fuerza de repulsin que normalmente existe entre GR debido a su carga superficial o potencial zeta. El potencial zeta es producido por una intensa carga negativa a nivel de la superficie de los GR, lo que explica que estas clulas se mantengan separadas. La intensidad del potencial zeta depende en gran medida de la composicin proteica del plasma y especialmente de la relacin entre las concentraciones de albmina, globulinas y fibringeno. As, mientras la albmina tiende a aumentar el potencial zeta, las globulinas y sobre todo el fibringeno tienden a disminuirlo. Ello obedece a que tanto el fibringeno como las globulinas tienen un mayor peso molecular y una conformacin menos esfrica que la albmina, lo que aumenta la constante dielctrica del plasma y reduce el potencial zeta eritrocitario. La disminucin del potencial zeta de los GR tiene como consecuencia una mayor tendencia de stos a agregarse y formar las llamadas pilas de moneda. De acuerdo con este mecanismo, el valor normal de la VSG resulta del equilibrio entre las principales protenas plasmticas. Metodologa Existen dos mtodos comnmente utilizados para medir la VSG: el mtodo de Westergren y el mtodo de Wintrobe. Ambos mtodos poseen limitaciones. El mtodo de Westergren es menos sensible a pequeos aumentos de los factores que causan la sedimentacin de los GR y puede ser levemente menos confiable como un procedimiento de screening. El mtodo de Wintrobe, por el otro lado, puede dar lecturas bajas incorrectas cuando la VSG de Westergren es marcadamente elevada. Ambos mtodos son altamente sensitivos a la relacin entre el plasma y los GR en la muestra, y un bajo hematocrito causa un aumento no especfico de la VSG probablemente acelerando la agregacin y reduciendo las fuerzas de friccin entre los agregados en sedimentacin. Se trataron de aplicar factores de correccin para anemias, pero no resultaron confiables. Tradicionalmente, la VSG se ha determinado ms frecuentemente por el mtodo de Westergren que fue propuesto como mtodo de referencia por el International Council for Standarization in Hematology (ICSH). Durante los ltimos aos, han aparecido sistemas semiautomticos para medir la VSG que emplean soportes especiales y pipetas de material plstico desechable. Estos sistemas, aunque reproducen exactamente el mtodo de Westergren, se diferencian de ste por su carcter cerrado (recogida de los especmenes en tubos al vaco que incorporan una cantidad precisa de anticoagulante) y por el empleo de material complementario (bombas aspirativas) que aumentan la rapidez y precisin del llenado de las pipetas. 1. Mtodo de Westergren Es el mtodo de referencia para medir la VSG. Sin embargo, continua siendo un mtodo poco reproducible y sometido a diversas variables difciles de controlar, como es la necesidad de prediluir la sangre.

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Materiales Anticoagulante Citrato trisdico 109 mM en solucin acuosa. Si se utiliza citrato trisdico dihidratado (Na3C6H5O7.2H2O) preparar una solucin acuosa de 32,08 g/l. Tubo de sedimentacin Se utilizan tubos de vidrio especialmente diseados de una longitud de 300 + 1.5 mm y de un dimetro de 2.55 + 0.15 mm. El dimetro del tubo debe ser uniforme (+ 0.05 mm) todo a lo largo del tubo y ste debe poseer una escala graduada con exactitud en mm numerada de 200 mm en el fondo hasta 0 mm. Los tubos estandarizados que cumplen las especificaciones de ICSH deben ser aprobados por Comits de Estandarizacin en los diferentes pases. Los tubos deben ser cuidadosamente limpiados en acetona-agua. No se recomienda el uso de detergentes o dicromatos para la limpieza. Tubos plsticos descartables: Se fabrican tubos plsticos descartables segn las especificaciones, los cuales son provistos limpios y secos por el fabricante. Algunos plsticos resultan inadecuados pues unen GR siendo as ms susceptibles a los problemas de taponamiento. Otros tubos plsticos se manufacturan recubiertos de agentes que eliminan hongos o contienen componentes que interactuan con la sangre. Gradillas Las gradillas o dispositivos de sostn estn diseados para sostener los tubos en una posicin vertical inmvil. Un dispositivo de burbuja niveladora debe formar parte integral de la gradilla para asegurar que la posicin de los tubos sea vertical dentro de un lmite de 1. La misma debe estar construida de modo tal que no existan prdidas de sangre cuando el tubo est colocado en ella.

Tcnica 1) La sangre se obtiene por puncin venosa, evitando contaminacin con materiales utilizados para la higiene de la piel. La sangre se agrega en proporcin de 4 Vol de sangre a 1 Vol de solucin de citrato de sodio, por ejemplo 2 ml de sangre en 0,5 ml de anticoagulante. El test debe ser realizado dentro de las 2 hs si la sangre es mantenida a temperatura ambiente, o dentro de las 6 hs si es mantenida a 4C. 2) Si la sangre citratada se equilibra a temperatura ambiente, se mezcla por inversin repetidas veces, y se sumerge un tubo de Westergren en la muestra dejando que la sangre ascienda por capilaridad. El nivel de la sangre se ajusta a cero. 3) El tubo es colocado en la gradilla en posicin estrictamente vertical a temperatura ambiente (18-25C), sin exposicin a la luz del sol directa, libre de vibraciones y corrientes de aire, mantenindolo exactamente 60 min.

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4) Una vez transcurrido el tiempo, se lee la distancia entre la superficie del menisco de la columna eritrocitaria y la parte superior de la columna de sangre situada a nivel de la marca cero de la escala graduada. El valor de esta distancia, expresado en mm, corresponde al de la VSG durante la primera hora (mm/hora). Factores tcnicos capaces de modificar la VSG Causas de aumento Desviacin de verticalidad de la pipeta Incremento de la longitud y el dimetro de la pipeta Elevacin de la temperatura ambiente Dilucin de la sangre Causas de disminucin Reduccin del dimetro de la pipeta Utilizacin tarda de la sangre (especimen envejecido) Cambio de anticoagulante Valores de referencia EDAD (aos) Nios mayores y jvenes Hombres adultos Mujeres adultas 0-15 17-50 51-60 61-70 17-50 51-60 61-70 X + 2 DE 5 + 10 4+3 6+3 6+4 6+3 9+5 10 + 5 Lmite superior de la normalidad 15 10 12 14 12 19 20

Interpretacin de resultados Los valores de referencia de la VSG se expresan exclusivamente en mm/h y varan fundamentalmente con el sexo y en cierto grado tambin con la edad (ver valores de referencia), el ciclo menstrual, y las medicaciones (corticosteroides, contraconceptivos orales, etc.) La VSG no parece estar influenciada por las ingestas o por los ritmos circadianos. Las determinaciones de la VSG a la segunda hora o a las 24 hs, muy utilizadas anteriormente, han demostrado ser poco fiables y de escasa significacin clnica, por lo que no se recomienda su empleo. Existen numerosas patologas con alteraciones proteicas del plasma que cursan con modificaciones del valor de VSG. Se observan aumentos de VSG en un amplio espectro 30

de enfermedades principalmente relacionadas a las protenas de fase aguda, y tambin en el embarazo normal y el puerperio. Un 10% de los nios normales tambin presentan VSG aumentadas. La VSG es especialmente baja (0-1 mm) en la policitemia, anormalidades de GR (hemoglobinopatas, esferocitosis hereditaria, anemia falciforme, etc.), hipofibrinogenemia, defectos cardacos congestivos, y ocasionalmente sin causa aparente. Adems de estas condiciones que pueden tender a ocultar una alta VSG, es inusual obtener falsos negativos, por ende, un valor normal de VSG generalmente asegura que no existe enfermedad orgnica.

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RECUENTO DE RETICULOCITOS Los reticulocitos, eritrocitos inmaduros, existen en la sangre en una proporcin de cinco a diez por mil hemates. Su tamao es el de los dems hemates y se caracteriza por contener una pequea cantidad de ARN (ribosomas) formando un retculo granulofilamentoso observable al ser teido con colorantes llamados vitales como son el azul brillante de cresilo o el azul de metileno nuevo. La cantidad de ARN es tanto menor cuanto ms madura es la clula. El recuento de reticulocitos es la tcnica ms simple actualmente disponible para valorar la actividad eritropoytica de la mdula sea. Cuando una anemia se acompaa de un elevado nmero de reticulocitos circulantes (reticulocitosis) se considera regenerativa, mientras que cuando el nmero es normal o disminuido se denomina arregenerativa. En condiciones normales, los reticulocitos permanecen en la mdula durante 2-3 das y terminan su maduracin en 24 horas, aproximadamente, una vez ya en la sangre perifrica. El recuento de reticulocitos debe realizarse a partir de sangre total con anticoagulante (EDTA) y de ser posible, dentro de las 24 primeras horas de la extraccin cuando la sangre se conserva a temperatura ambiente. Si se mantiene a 4 C, el recuento puede realizarse hasta 48 horas despus de la extraccin. El recuento puede efectuarse por dos procedimientos: 1. Tincin vital y microscopio ptico. 2. Recuento automatizado. El mtodo manual adolece de muy escasa fiabilidad (coeficientes de variacin >20%), lo que limita su empleo para valorar la capacidad de respuesta medular frente a teraputicas agresivas, pero sobretodo a los errores de ndole subjetiva debidos al diferente criterio que cada observador tiene de lo que es un reticulocito.

1. Mtodo de la tincin vital (mtodo de referencia) Materiales Colorante: azul de metileno nuevo 1 g cada 100 ml de solucin citratada (1 vol de citrato de sodio 30 g/L y 4 vol de NaCl 9 g/L). Sangre total anticoagulada con EDTA Tcnica 1) Mediante una pipeta Pasteur se aaden a un tubo de hemlisis tres gotas de solucin colorante y tres gotas de sangre total bien homogeneizada. En caso de

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valores muy bajos de hematocrito debe colocarse doble cantidad de sangre total que de solucin colorante. 2) 3) 4) 5) La suspensin sangre/colorante se agita suavemente y se deja a temperatura ambiente durante cinco minutos. Transcurrido este tiempo, se toma una pequea gota de la suspensin y se extiende sobre un portaobjetos. Una vez seca se puede observar al microscopio con objetivo de inmersin (x1000). Es necesario realizar el recuento sobre un mnimo de 1000 eritrocitos. El recuento se efecta contando en donde los eritrocitos estn distribuidos homogneamente. Se cuentan tantos campos como sean necesarios para alcanzar la cifra de eritrocitos requerida, siendo 100-125 el nmero ptimo de hemates por campo de los cuales distinguimos cuales son reticulocitos para luego expresar el resultado como porcentaje, siendo el cien por ciento el nmero total de hemates contado.

Interpretacin de resultados El valor obtenido por la tcnica de referencia ser valido si se trata de una concentracin normal de eritrocitos en sangre total. Por ello, cuando disminuye el nmero de eritrocitos como suele suceder en la anemia, el valor porcentual debe corregirse segn el hematocrito empleando la siguiente frmula:
Hto del paciente Hto normal

Reticulocitos corregidos (%) = reticulocitos observados (%) x

(El hematocrito normal es el que le corresponde segn edad y sexo) En caso de anemia intensa, el nmero de reticulocitos circulantes suele ser superior al que corresponde al grado de regeneracin eritroblstica. Ello obedece a que la anemia se acompaa siempre de un estmulo eritropoytico compensador, que facilita una salida precoz de reticulocitos desde la mdula a la sangre perifrica, y un acortamiento de su perodo de maduracin intramedular, lo que supone un aumento del perodo de maduracin perifrica. Este fenmeno se caracteriza por la aparicin en el examen morfolgico de la extensin de sangre de eritrocitos grandes (macrocitos) y de tonalidad azulada (policromasia) Existe una relacin inversa, aproximadamente lineal, entre el hematocrito y el perodo de maduracin perifrica de los reticulocitos. De esta forma puede calcularse otra magnitud de inters clnico denominada ndice de produccin reticulocitaria (IPR) aplicando la frmula siguiente: IPR = Reticulocitos del paciente x Hto del paciente

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Perodo de maduracin en das x Hto normal Un IPR >3 indica aumento de actividad eritropoytica medular (anemia regenerativa), mientras que un IPR <2 indica escasa actividad eritropoytica (anemia arregenerativa) Relacin entre la respuesta reticulocitaria y el grado de anemia Hematocrito 0,45 0,40 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 Niveles de Hemoglobina (g/L) 150 133 117 110 83 66 50 Recuento de reticulocitos (%) 1 2 5 10 15 20 30 Recuento de reticulocitos 1 1,8 4 7 8,3 9 10 corregido (%) Tiempo de maduracin estimado 3 1 da 2 da das ndice de reticulocitos 1 2 5 5 7,5 10 10 Otra tcnica Utiliza como colorante el Azul Brillante de Cresilo en iguales proporciones a las indicadas en el mtodo de referencia. La mezcla sangre/colorante se incubar durante 15 minutos a 37 C. Luego de este tiempo se realizar el extendido y el recuento como se indic antes. 2. Recuento automatizado Estos equipos realizan un recuento muy fiable de reticulocitos a partir de sangre total. En los equipos semiautomticos la sangre es previamente incubada con el fluorocromo, mientras que en los totalmente automatizados no es necesaria esta incubacin previa y el anlisis se realiza directamente. El fundamento de estos autoanalizadores es la sustitucin del criterio morfolgico inherente al mtodo visual por el anlisis cuantitativo del contenido eritrocitario en ARN mediante citometra de flujo y luz lser. Para la tincin del ARN se emplean fluorocromos que pueden ser de dos tipos: naranja de tiazol o auramina. Valores de referencia Valor relativo (%) 3,2-6,0 (4-19 aos) 0,2-2,2 0,2- 2,5 0,5-2,8 Valor absoluto (x109 /L) 110-330 25-89 25-86 32-97

Recin nacido (sangre de cordn) Nios y adultos jvenes (4 a 19 aos) Adultos (20-50 aos) Mujeres Hombres

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Variaciones patolgicas Disminucin de la cifra de reticulocitos (reticulocitopenia) Aplasia medular Anemias carenciales intensas (megaloblstica y ferropnica) Anemias inflamatorias Aumento de la cifra de reticulocitos (reticulocitosis) Perodo neonatal Anemias hemolticas Anemias posthemorrgicas Anemias carenciales en fase de tratamiento Mieloptisis (infiltracin neoplsica en la mdula sea) Mielofibrosis idioptica

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GRUPOS SANGUNEOS ABO Y Rh: PRUEBAS DE COOMBS A) TIPIFICACION DE ANTIGENOS ABO EN HEMATIES: METODO EN TUBO POR SEDIMENTACION 1) Preparar una suspensin de hemates de grupo sanguneo desconocido, al 2% en salina fresca (vase ms abajo el apartado C) Preparacin de la suspensin globular al 2%). 2) Agregar una gota de la suspensin globular a igual volumen de suero anti-A, anti-B, anti-AB y plasma AB normal (poli o monoclonales) en tubos de Kahn. 3) Simultneamente controlar cada antisuero contra hemates A1, B y O al 2%. 4) Incubar 1 hora a temperatura ambiente o centrifugar 1 minuto a 1000 rpm. 5) Leer primero los controles y luego las muestras problema microscpica y macroscpicamente. 6) Evaluar segn los siguientes scores de lectura: +++ un gran aglutinato ++ varios aglutinatos grandes ++ muchos aglutinatos pequeos + pequeos aglutinatos, muy escasos, visibles a ojo desnudo + aglutinatos visibles pero solo microscpicamente aglutinatos conteniendo muy pocas clulas: tr trazas negativo

B) TIPIFICACION DE ANTICUERPOS ABO EN SUERO 1) Tomar una muestra de suero libre de hemates. 2) En tubos de Kahn, agregar una gota de suero a igual volumen de suspensin al 2%, de los siguientes hemates: a. hemates A conocidos b. hemates B conocidos c. hemates del propio individuo d. hemates O conocidos 3) Incubar 1 hora a temperatura ambiente o centrifugar 1 minuto a 1000 rpm. 4) Leer primero los controles y luego las muestras problema, microscpica y macroscpicamente.

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Interpretacin de resultados Glbulos rojos problema Anti A + + GR A + + Anti B + + GR B + + Anti AB + + + GR AB + + + Grupo ABO A B O AB Grupo ABO A B O AB

Suero problema

C) PREPARACIN DE LA SUSPENSIN GLOBULAR AL 2% 1) Separar los hemates del plasma y trasvasar una porcin de los mismos a un tubo de Kahn. 2) Llenar el tubo con solucin salina al 0,85% y centrifugar 1 min a 1000 rpm. 3) Eliminar el sobrenadante y repetir los lavados dos veces ms, teniendo la precaucin de resuspender perfectamente el culot globular antes de completar el agregado de solucin fisiolgica. 4) Tomar una gota del culot (50 l) y agregarle 0,5 ml de solucin fisiolgica. Se tendr as la suspensin al 2%. D) SUBAGRUPACION DEL GRUPO A: METODO EN PLACA 1) Colocar una cantidad de sangre total igual a de gota. 2) Agregar una gota de anti-A absorbido y mezclar bien con una varilla de punta fina. Tambin se puede utilizar un monoclonal anti-A1. 3) Al terminar de mezclar, disparar el cronmetro. 4) Rotar la placa en forma circular y observar la aparicin de aglutinacin dentro del minuto. E) TIPIFICACION DEL FACTOR D DEL SISTEMA Rh 1) Coloque 2 gotas de suero anti-D en un tubo de Kahn. 2) Adicione una gota pequea de suspensin de glbulos o en su defecto de sangre entera de la muestra.

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3) Agite para mezclar los reactivos y centrifugue durante 1 minuto a 1500 rpm. 4) Desprenda suavemente el culot globular y lea. La lectura se har microscpicamente con un visor y macroscpicamente. Reacciones Positiva: los hemates D (Rho) positivos permanecern aglutinados al querer desprender el culot globular. Negativa: los hemates Rh (rh) se suspendern nuevamente sin evidenciar aglutinacin. 5) Proceda de la misma manera con los tubos controles. Controles a. Prueba sobre la bondad del suero: sangre D positiva + antiD b. Prueba sobre la inespecificidad respecto de anti-D: sangre D negativa + anti-D c. Control de seudoaglutinacin: muestras de sangre + plasma de persona AB. F) PRUEBA PARA DETECTAR Du Nunca puede ser diagnosticada como negativa la sangre de un dador por ofrecer reacciones negativas frente a sueros antiD. Siempre debe descartarse la posibilidad de estar en presencia de un individuo Du. Para ello es necesario aplicar la prueba de Coombs. 1) Coloque dos gotas de suero anti D(Rho) en un tubo de Kahn. La deteccin de Du tambin se puede hacer con anticuerpo monoclonal anti-Du. 2) Agregue 1 gota de una suspensin sangunea al 2% en solucin salina. 3) Agite para mezclar los reactivos e incube durante 30 minutos a 37C. 4) Lave los hemates 3 veces con abundante cantidad de SF (ocupando casi todo el volumen del tubo). Centrifugue y elimine el sobrenadante. 5) Agregue 2 gotas del suero antiglobulina humana. 6) Agite para mezclar los reactivos y centrifugue inmediatamente durante 1 minuto a 1500 rpm, desprenda suavemente el culot globular y lea. La lectura se har macro y microscpicamente. Reacciones Positiva: los hemates Du (Rhou) positivos permanecern aglutinados luego de intentar desprender el culot globular. Negativa: los hemates Rh (rh) y Du (Rhou) negativos se resuspendern y no aglutinarn. Controles a. Prueba sobre la bondad del suero b. Prueba de su especificidad c. Prueba de seudoaglutinacin 38

Para el primer control positivo deben emplearse hemates Rh positivos de dador conocido OR1r (Cde/cde). Es aconsejable usar esos hemates y evitar emplear eritrocitos D (Rho) positivos con el antgeno E (rh) presente, dado que en tales hemates el factor D (Rho) es ms reactivo. El control negativo consiste en eliminar la posibilidad de estar utilizando un suero que contenga aglutininas inespecficas para el antgeno en cuestin (por ejemplo: anti-A y/o anti-B no absorbidos durante la preparacin del suero). Estos dos primeros controles sirven para demostrar que el suero a emplear es especfico y no posee ningn contaminante que pueda falsear los resultados. El tercer control es de seudoaglutinacin y para ello se reemplaza el suero antiD por suero de persona de grupo sanguneo AB, y se lo enfrenta con los hemates que estn siendo tipificados. G) COMPROBACIN DE LA PRESENCIA DE ANTICUERPOS INMUNES MEDIANTE LA PRUEBA DE COOMBS. G.1 Prueba de Coombs indirecta 1) Colocar en un tubo de Kahn 2 gotas de suero problema y 2 gotas de suspensin de hemates de grupo O Rh+ al 2%. Agitar suavemente 2 o 3 veces durante el perodo de incubacin de 1 hora a 37 C. Proceder de la misma manera con un tubo control que contiene 2 gotas de solucin fisiolgica y 2 gotas de suspensin de hemates O Rh+ al 2%. 2) Centrifugar, quitar el sobrenadante y lavar 3 veces con solucin fisiolgica, eliminando completamente el sobrenadante en el ltimo lavado. 3) Preparar otros controles siguiendo las indicaciones del apartado F). 4) Leer al microscopio antes del agregado del suero antiglobulina humana. 5) Agregar una gota de suero antiglobulina humana. Centrifugar 1 minuto a 1500 rpm. Leer microscpica y macroscpicamente. G.2 Prueba de Coombs directa 1) Colocar en un tubo de Kahn 2 gotas de suspensin al 2% de hemates problema. Preparar un tubo control que contenga 2 gotas de suspensin de hemates O Rh+ sensibilizados al 2%. 2) Preparar otros controles siguiendo las indicaciones del apartado F). 3) Leer al microscopio antes del agregado del suero antiglobulina humana. 4) Agregar una gota de suero antiglobulina humana. Centrifugar 1 minuto a 1500 rpm. Leer microscpica y macroscpicamente.

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Anti-A, Anti-B o Anti A,B

Monoclonal
Reactivos para la determinacin de grupos sanguneos ABO SIGNIFICACION CLINICA En el ao 1900 Landsteiner descubri que los glbulos rojos humanos podan ser clasificados en A, B, AB u O de acuerdo a la presencia (grupos A, B, o AB) o ausencia (grupo O) de antgenos altamente reactivos en su superficie. Tambin demostr que existen anticuerpos (aglutininas) para los anfgenos A y B y que el suero de un individuo no contiene anticuerpos para el antgeno presente en sus propios glbulos rojos pero s contra los que no posee. Actualmente se han identificado subgrupos de los grupos A y B con distinta especificidad. Todas estas observaciones revelaron la importancia de la compatibilidad ABO en la prctica transfusional. Por este motivo, la tipificacin de los grupos sanguneos ABO es la prueba fundamental sobre la que se basan los dems ensayos pretransfusionales. FUNDAMENTOS DEL METODO Los glbulos rojos del paciente se ponen en contacto con Reactivo Anti-A, Anti-B o Anti-A,B monoclonal. Si existen en la superficie de los eritrocitos los antgenos correspondientes, se producir una aglutinacin visible macroscpicamente. La ausencia de aglutinacin en todos los casos, implica grupo O. REACTIVOS PROVISTOS Anti-A, Anti-B o Anti-A,B monoclonal: reactivos preparados a partir de anticuerpos monoclonales secretados por lneas celulares de hibridomas de ratn. REACTIVOS NO PROVISTOS De acuerdo a la tcnica que se emplee pueden requerirse adicionalmente: - Solucin fisiolgica - Solucin fisiolgica tamponada con buffer fosfatos (PBS) - Solucin fisiolgica de baja fuerza inica (LISS) - Albmina Bovina 30% de Wiener lab. INSTRUCCIONES PARA SU USO Los Reactivos se proveen listos para usar. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Los Reactivos Provistos son estables en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Desechar el reactivo cuando se observe contaminacin del mismo. MUESTRA Glbulos rojos o sangre entera a) Recoleccin: la sangre debe ser obtenida aspticamente, con o sin anticoagulante. b) Aditivos: pueden emplearse como anticoagulantes: EDTA, heparina, ACD (cido ctrico, citrato, dextrosa) CPD (citrato, fosfato, dextrosa) o CPDA-1 (citrato, fosfato, dextrosa, adenina). Se recomienda el uso de Anticoagulante W de Wiener lab. c) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: las muestras deben conservarse en refrigerador (210oC). Si se utiliz heparina o EDTA, la tipificacin debe llevarse a cabo en 48 horas. Las muestras recogidas con ACD, CPD o CPDA-1 pueden ser ensayadas hasta los 35 das. Si se emplean cogulos, deber efectuarse la tipificacin dentro de los 7 das de obtenida la muestra. MATERIAL REQUERIDO (no provisto) - Centrfuga - Tubos de hemlisis - Placas - Palillos mezcladores descartables PRECAUCIONES Los reactivos son para uso diagnstico "in vitro". PROCEDIMIENTO En las siguientes tcnicas la suspensin de glbulos rojos a ensayar debe ser preparada con solucin fisiolgica, PBS o LISS. I- TECNICA EN PLACA Preparar una suspensin de glbulos rojos al 10%. Como alternativa puede emplearse una suspensin al 35-45% en plasma del mismo paciente o sangre entera.0 1) A una gota de Reactivo Anti-A, Anti-B o Anti-A,B monoclonal colocada en una placa limpia, agregar 1 gota de suspensin de glbulos rojos.

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2)

Mezclar el Reactivo y los glbulos con un palillo descartable cubriendo un rea circular de 2 cm de dimetro y balancear la placa continuamente durante 2 minutos. Observar aglutinacin visible microscpicamente hasta los 2 minutos. No debe emplearse microscopio.

II- TECNICA EN TUBO (por centrifugacin) 1) A una gota de Reactivo Anti-A, Anti-B o Anti-A,B monoclonal colocada en un tubo de hemlisis, agregar 1 gota de suspensin de glbulos rojos al 3-5%. III- TECNICA EN TUBO (por sedimentacin) 1) A una gota de Reactivo Anti-A, Anti-B o Anti-A,B monoclonal colocada en un tubo de hemlisis, agregar 1 gota de suspensin de glbulos rojos al 3-5%. 2) Mezclar e incubar durante 60 minutos a temperatura ambiente. 3) Agitar el tubo para despegar las clulas y examinar macroscpicamente la aglutinacin. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS La observacin de aglutinacin (con cualquiera de las tcnicas utilizadas) indica una reaccin positiva. Grupo sanguneo A B 0 AB Variants dbiles del grupo A como Ax Antisuero Anti-B + + -

Anti-A + + +/-

Anti-A,B + + + +

METODO DE CONTROL DE CALIDAD El control de calidad puede efectuarse ensayando glbulos rojos tipificados. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Reacciones dbiles pueden observarse en las siguientes situaciones: - Neonatos: los antgenos A y B no se encuentran totalmente expresados en el recin nacido. Por esta razn deben extremarse los cuidados, sobre todo en los prematuros. - Leucemias u otros desrdenes malignos. - Pacientes recientemente transfundidos con cantidades sustanciales de sangre de grupo no idntico. - Reacciones falsas positivas: se han observado problemas ocasionados en la tipificacin de los grupos sanguneos ABO debido a anticuerpos que reaccionan con drogas, colorantes, compuestos qumicos o con partculas de slica coloidal liberadas de vidrios de mala calidad. - Aglutininas fras: en presencia de aglutininas fras, el lavado de los glbulos rojos 4-6 veces con solucin fisiolgica, resulta generalmente suficiente para obtener clulas aptas para la tipificacin. En muy raras ocasiones se requiere un calentamiento a 37oC durante 10 minutos antes de los lavados mencionados. Como control, se coloca una gota de estas clulas con 2 gotas de solucin fisiolgica. No debe producirse aglutinacin. PRESENTACION Anti-A: frasco x 10 ml (Cd. 1443152). Anti-B: frasco x 10 ml (Cd. 1443154). Anti-AB: frasco x 10 ml (Cd. 1443153). BIBLIOGRAFIA - Moore, S. et al. Int. Symp. on Monoclonal Antibodies: Standardization of their Characterization and use. Pars, France, 1983. Develop. Biol. Standard 57:49-59. - Widman, F.K. Technical Manual. 9 th Edition, Washington, D.C. American Association of Blood Banks 1985. Chapter 8. 2) Mezclar y centrifugar 20 segundos a 3.500 rpm. 3) Agitar el tubo para despegar las clulas y examinar macroscpicamente la presencia o ausencia de aglutinacin.

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Anti-D (Rho)
monoclonal
Reactivo para la deteccin de antgeno D (Rho) SIGNIFICACION CLINICA Las observaciones de Levine y Stetson en 1939 y de Landsteiner y Wiener en 1940 establecieron las bases para el conocimiento actual de la importancia clnica de la deteccin en el laboratorio de los anticuerpos anti-D. Aproximadamente el 15% de los individuos de raza blanca y el 8% de los individuos de raza negra carecen del antgeno D y son fcilmente estimulados cuando reciben este antgeno, ya sea por transfusin o durante el parto, produciendo anti-D. Este anticuerpo es responsable de severas reacciones postransfusionales y de la enfermedad hemoltica del recin nacido. Existen muchos otros antgenos identificados dentro del sistema Rh. Sin embargo, es el antgeno D el que posee mayor importancia en la clnica despus del sistema ABO. FUNDAMENTOS DEL METODO Los glbulos rojos del paciente se ponen en contacto con suero anti-D (anti-Rho). Si existe en la superficie del eritrocito el antgeno correspondiente, se producir una aglutinacin visible macroscpicamente. REACTIVO PROVISTO Anti-D (Rho): solucin de anticuerpos monoclonales humanos. REACTIVOS NO PROVISTOS De acuerdo a la tcnica empleada puede requerirse adicionalmente: - Solucin fisiolgica. - Suero Anti-humano (poliespecfico) provisto separadamente por Wiener lab. INSTRUCCIONES PARA SU USO Anti-D (Rho): listo para usar. PRECAUCIONES El reactivo es para uso diagnstico "in vitro". ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO El Reactivo Provisto es estable en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Desechar el reactivo cuando se observe contaminacin del mismo. MUESTRA Glbulos rojos o sangre entera a) Recoleccin: obtener la sangre en forma asptica con o sin anticoagulantes. b) Aditivos: pueden emplearse como anticoagulantes: heparina, EDTA, ACD (cido ctrico, citrato, dextrosa), CPD (citrato, fosfato, dextrosa) o CPDA-1 (citrato, fosfato, dextrosa, adenina). c) Sustancias interferentes conocidas: los glbulos rojos recubiertos con inmunoglobulinas o fracciones del complemento pueden dar reacciones falsamente positivas. Cuando se sospecha esta situacin deber realizarse una Prueba de Antiglobulina Directa. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: las muestras deben conservarse en refrigerador (210oC). Si se utiliz heparina o EDTA, la tipificacin debe llevarse a cabo en 48 horas. Las muestras recogidas con ACD, CPD o CPDA-1 pueden ser ensayadas hasta los 35 das. Si se emplean cogulos, deber efectuarse la tipificacin dentro de los 7 das de obtenida la muestra. MATERIAL REQUERIDO (no provisto) Dependiendo de la tcnica que se emplee, podrn ser necesarios: - Centrfuga - Tubos de hemlisis - Placa de vidrio - Palillos mezcladores descartables PROCEDIMIENTO I- TECNICA EN PLACA Preparar una suspensin de glbulos rojos al 40-50% en plasma o suero autlogos, o solucin fisiolgica. Tambin puede emplearse sangre entera. 1) Colocar una gota de Anti-D (Rho) sobre una placa de vidrio limpia. 2) Agregar una gota de la suspensin de glbulos rojos a probar.

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3)

Mezclar el antisuero y los glbulos rojos con un palillo descartable en un rea de 2 cm de dimetro y balancear constantemente la placa durante 2 minutos. Observar macroscpicamente la presencia o ausencia de aglutinacin.

II- TECNICA EN TUBO Preparar una suspensin de glbulos rojos al 3-5% en plasma o suero autlogos, o en solucin fisiolgica. 1) Colocar una gota de Anti-D (Rho) en un tubo de hemlisis. 2) Agregar una gota de la suspensin de glbulos rojos a probar. 3) Mezclar y centrifugar 20 segundos a 3.500 rpm. 4) Agitar el tubo para despegar las clulas y examinar macroscpicamente la presencia o ausencia de aglutinacin. Las reacciones aparentemente negativas deben incubarse a 37 oC durante 15-30 minutos, luego centrifugar y volver a leer como se describi en 4). Las muestras que an en estas condiciones resulten negativas deben ser investigadas respecto al antgeno Du. III- PRUEBA ANTIGLOBULINA INDIRECTA PARA Du Preparar una suspensin al 3-5% de glbulos rojos en plasma o suero autlogos, o solucin fisiolgica. 1) Colocar una gota de Anti-D (Rho) en un tubo de hemlisis. 2) Agregar una gota de la suspensin de glbulos rojos a probar.

3)
4) 5) 6)

Mezclar e incubar a 37oC durante 15-30 minutos. Lavar las clulas 3-4 veces con solucin fisiolgica, descartando perfectamente el sobrenadante y resuspender las clulas luego de cada lavado. Agregar 2 gotas de Suero Anti-humano (poliespecfico) , mezclar, centrifugar 20 segundos a 3500 rpm. Agitar el tubo para despegar las clulas y examinar macroscpicamente.

INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS La observacin de aglutinacin (con cualquiera de las tcnicas empleadas) indica una reaccin positiva. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA. La prueba para tipificacin de antgeno D (Rho) de glbulos rojos sensibilizados debe realizarse solamente en medio salino. La determinacin del Du no puede efectuarse sobre glbulos rojos sensibilizados. Pueden obtenerse resultados ms rpidos y mejor visualizacin precalentando la placa a 45-50 oC. PRESENTACION Frasco x 10 ml (Cd. 1443155). BIBLIOGRAFIA - Landsteiner, K.; Wiener, A.S. - Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 43: 223, 1940. - Wiener, A.S.; Unger, L.J. - JAMA 169:696, 1959. - Widman, F.K. - Technical Manual - 9 th. Ed. Washington D.C., American Association of Blood Banks, Chapter 9, 1985. - Race , R.R. and Sanger, R. - Blood Groups in Man - 6 th Ed. Oxford Blackwell Scientific Publications, pg. 178, 1975.

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Suero Anti-humano
(poliespecfico)
Para realizar Pruebas Antiglobulina (Coombs) Directa o Indirecta SIGNIFICACION CLINICA Las experiencias descriptas por Coombs, Mourant y Race en 1945 establecieron que las Pruebas Antiglobulina Humana resultaban los mejores mtodos para detectar anticuerpos sensibilizantes pero no directamente aglutinantes. El ejemplo descripto originalmente haca referencia a antgenos del sistema Rh. Experiencias posteriores probaron el valor de estas pruebas en la deteccin de anticuerpos en casi todos los grupos sanguneos de importancia clnica, siendo empleadas actualmente en los siguientes casos: Prueba Antiglobulina Indirecta - Screening de suero de donantes y pacientes para anticuerpos. - Pruebas de compatibilidad previas a la transfusin. - Fenotipo de glbulos rojos. - Identificacin y titulacin de anticuerpos encontrados en suero o eluatos. Prueba Antiglobulina Directa - Diagnstico de laboratorio de anemia hemoltica y enfermedad hemoltica del recin nacido. - Investigacin de reacciones dudosas en una transfusin. - Investigacin de enfermedades autoinmunes que involucran la unin de inmunoglobulinas y/o fracciones del complemento a los glbulos rojos. FUNDAMENTOS DEL METODO El agregado de Suero Anti-humano (poliespecfico) a glbulos rojos que estn cubiertos de inmunoglobulinas y/o Fragmentos de complemento (C3b, C3bi, C3dg o C3d), produce una aglutinacin de los glbulos rojos visible macroscpicamente. REACTIVO PROVISTO Suero Anti-humano (poliespecfico): suero obtenido de conejos inmunizados con inmunoglobulina G purificada y C3. REACTIVOS NO PROVISTOS - Reactivos para la determinacin de grupos sanguneos. De acuerdo a la tcnica a emplear puede requerirse adicionalmente: - Solucin fisiolgica. - Solucin fisiolgica tamponada con buffer fosfato (PBS). - Solucin fisiolgica de baja fuerza inica (LISS). INSTRUCCIONES PARA SU USO Suero Anti-humano (poliespecfico): listo para usar. PRECAUCIONES El Reactivo Provisto es para uso diagnstico "in vitro". ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO El Reactivo Provisto es estable en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Desechar el reactivo si se observa contaminacin del mismo. MUESTRA Glbulos rojos a) Recoleccin: la sangre debe ser obtenida aspticamente, con o sin anticoagulante. b) Aditivos: pueden emplearse como anticoagulantes: EDTA, heparina, ACD (cido ctrico, citrato, dextrosa) CPD (citrato, fosfato, dextrosa) o CPDA-1 (citrato, fosfato, dextrosa, adenina). Se recomienda el uso de Anticoagulante W de Wiener lab. c) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: las muestras deben conservarse en refrigerador (210oC). Si se utiliz heparina o EDTA, la tipificacin debe llevarse a cabo en 48 horas. Las muestras recogidas con ACD, CPD o CPDA-1 pueden ser ensayadas hasta los 35 das. Si se emplean cogulos, deber efectuarse la tipificacin dentro de los 7 das de obtenida la muestra. Cuando se efectan pruebas antiglobulina directas, la sangre debe ser preferentemente fresca (menos de 24 horas de la extraccin).

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Si los glbulos provienen de cogulos, no deben ser refrigerados antes de las pruebas directas. MATERIAL REQUERIDO (no provisto) - Centrfuga - Bao de agua a 37oC - Tubos de hemlisis PROCEDIMIENTO I- PRUEBA ANTIGLOBULINA INDIRECTA (en solucin salina de fuerza inica normal). 1) En un tubo de hemlisis colocar 2 gotas del suero a probar. 2) Agregar 1 gota de suspensin de glbulos rojos a probar al 3% lavados 3 veces y resuspendidos en PBS.

3)
4)

5) 6) 7)

Mezclar e incubar a 37oC durante 30-60 minutos. Lavar los glbulos 3 veces con PBS teniendo la precaucin de descartar completamente el sobrenadante y resuspender el precipitado luego de cada lavado. Descartar completamente el sobrenadante luego del ltimo lavado. Agregar 2 gotas de Suero Anti-humano (poliespecfico) al botn de clulas. Mezclar perfectamente y centrifugar durante 15 segundos a 3.500 rpm. Resuspender las clulas por agitacin y observar macroscpicamente. Tener en cuenta que agitaciones demasiado vigorosas pueden desligar aglutinaciones dbiles. Los resultados negativos deben confirmarse por adicin de glbulos rojos sensibilizados con IgG dbiles.

II- PRUEBA ANTIGLOBULINA INDIRECTA (en solucin fisiolgica de baja fuerza inica). El empleo de esta solucin permite reducir el tiempo de incubacin a 15 minutos. Los glbulos rojos deben lavarse 2 veces con PBS y una vez con LISS. Finalmente preparar con esta solucin una suspensin de glbulos rojos al 3%. 1) Colocar en un tubo de hemlisis 1 gota de suero a probar. 2) Agregar 1 gota de glbulos rojos a probar al 3% en LISS. 3) Mezclar e incubar a 37C durante 15 minutos en bao de agua. Continuar como se indica en los pasos 4) a 7) de la tcnica I). III- PRUEBA ANTIGLOBULINA DIRECTA Se emplea para demostrar la absorcin in vivo de IgG y/o fracciones del complemento en la superficie de los glbulos rojos. 1) Preparar una suspensin de glbulos rojos a probar en PBS al 3%. 2) En un tubo de hemlisis colocar 1 gota de esta suspensin y continuar con los pasos 4) a 7) de la tcnica I). INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS La observacin de aglutinacin (con cualquiera de las tcnicas empleadas) indica una reaccin positiva. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Reacciones falsas positivas y falsas negativas pueden ocurrir por las siguientes causas: - Contaminacin qumica o bacteriana de la muestra u otros materiales empleados para la prueba. - Lavado inadecuado de las clulas. - Tiempo o temperatura de incubacin inadecuados. - Tiempo o velocidad de centrifugacin inadecuados. - Concentracin inadecuada de glbulos rojos. - Agitacin excesiva para despegar los glbulos rojos aglutinados. Recordar que los reactivos han sido estandarizados para detectar inmunoglobulinas humanas y fragmentos C3 unidos a los glbulos rojos. No son aptos para detectar anticuerpos de otro origen. PRESENTACION Frasco x 10 ml (Cd. 1443156). BIBLIOGRAFIA - Coombs, R.R.A.; Mourant., A.E. and Race, R.R. - Lancet, ii:15, 1945. - Coombs, R.R.A.; Mourant, A.E. and Race, R.R. - Brit. J. Exp. Path. 26:225, 1945. - Widman, F.K. - Technical Manual. 9th ed. Washington D.C. American Association of Blood Banks, pg. 376, 1985.

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DETERMINACIN ANTICUERPOS

DE

ANTICUERPOS

INMUNES:

TITULACIN

DE

Tcnica bsica de titulacin 1. Preparacin de diluciones madres. 1) Colocar en una gradilla 10 tubos de Kahn numerados del 1 al 10 (el nmero de tubos puede aumentarse o disminuirse si fuera necesario). 2) En los tubos 2 al 10, colocar 0,100 ml de solucin fisiolgica (SF). Colocar 0,300 ml de suero a titular en el tubo N1. 3) Tomar 0,100 ml de suero del tubo 1 y transvasarlo al tubo N2. 4) Homogeneizar la mezcla de suero y SF con la misma pipeta. Luego se toman 0,100 ml de la misma y se trasvasan al tubo de Kahn N3. Homogeneizar y repetir la operacin hasta completar las diluciones. 2. Titulacin 1) Se toman 10 tubos de Kahn, numerados del 1 al 10 y se disponen en una gradilla. Con una pipeta Pasteur para cada dilucin, colocar 2 gotas de las mismas en los correspondientes tubos. 2) Adicionar con pipeta Pasteur 2 gotas de suspensin de hemates al 2%. Agitar la mezcla. 3) Incubar a la temperatura apropiada, el tiempo requerido. 4) Simultneamente se llevan a cabo controles de autoaglutinacin y de especificidad del suero. 5) Leer los resultados macro y microscpicamente comenzando por los controles y luego por el tubo de mayor dilucin. El grado de aglutinacin se considerar segn los scores anteriormente indicados. El ttulo es la recproca de la dilucin ms alta donde se observa aglutinacin . Si en la ltima dilucin, con aglutinacin, el tipo de aglutinato es tr, el ttulo se determinar promediando dicha dilucin con la precedente. Por ejemplo, si en el tubo N 5 cuya dilucin es 1/16, el tipo de aglutinato es tr, el ttulo ser (16+8)/2=12. Controles a. Control de autoaglutinacin: consiste en enfrentar dos gotas de suspensin de hemates a usarse con dos gotas del suero del dador de hemates. b. Control de especificidad del suero: consiste en enfrentar dos gotas de hemates O con dos gotas del suero a titular.

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TIEMPO DE SANGRIA 1) METODO DE IVY Fundamento Esta prueba valora la capacidad hemosttica global in vivo y consiste en medir el tiempo transcurrido desde la realizacin de una pequea incisin cutnea hasta que cesa la hemorragia. La prueba mide el tiempo necesario para obtener un tapn hemosttico eficaz y, por ende, representa una valoracin global y simultnea de la funcin plaquetaria (nmero, adhesin, agregacin y degranulacin plaquetaria) y de la funcin vascular. Respecto al factor vascular, la prueba depende de la integridad de la pared vascular y de su capacidad constrictora. El mtodo original del corte en el lbulo de la oreja, introducido por Duke en 1910 es poco sensible y menos reproducible, por lo que no es aconsejable continuar utilizndolo hoy en da. En 1935, Ivy introdujo la aplicacin de un manguito de presin en el brazo y la prctica de la incisin en la cara anterior del antebrazo. Este mtodo, con la modificacin introducida por Borchgrevink, que sustituye la puncin con lanceta por un corte realizado con hoja de bistur, ha demostrado una alta sensibilidad. Por ltimo, la introduccin de plantillas o dispositivos automticos para la realizacin de la incisin ha venido a uniformar y aumentar la reproducibilidad. Materiales Dispositivos automticos para la realizacin de la incisin: Simplate y Simplate II (Organon Teknika) y Surgicutt (Ortho Diagnostics). Cronmetro. Tcnica 1) Es aconsejable colocar un esfigmomanmetro en el brazo del paciente y regular a 40 mm de Hg, mantenindo esta presin a lo largo de toda la prueba. 2) Se extrae el dispositivo automtico de su reservorio estril y se sita en la parte superior de la cara anterior del antebrazo (previamente desinfectada), en una zona sin vello y alejada de las venas superficiales, a unos 3 cm por debajo del pliegue del codo y paralelo al mismo. 3) Se presiona el disparador del dispositivo y al mismo tiempo poner en marcha el cronmetro (el corte tendr un largo y profundidad predeterminados: 1 cm x 1 mm). 4) La sangre que brota espontneamente se va secando cada 30 segundos, sin tocar la incisin, anotndose el tiempo que tarda en cesar la hemorragia, que ser el resultado de la prueba. Cuando el tiempo se alarga ms de 20 minutos puede detenerse la prueba aplicando una compresa con material hemosttico. Valores de referencia Hasta 6-8 minutos. Los tiempos superiores a 10 minutos son claramente patolgicos. 47

2) METODO DE DUKE Fundamento El mtodo original de Duke es, como dijimos antes, poco sensible y menos reproducible, pero se contina aplicando. Tcnica 1) Se practica una incisin de 2 mm de longitud en el lbulo de la oreja utilizando una lanceta con tope, descartable. 2) La sangre que brota espontneamente se va secando cada 30 segundos, sin tocar la incisin, anotndose el tiempo que tarda en cesar la hemorragia, que ser el resultado de la prueba. Valores de referencia Inferior a 5 minutos. Interpretacin de resultados La prueba se prolonga por reduccin del nmero de plaquetas o por alteraciones funcionales plaquetarias o plasmticas (enfermedad de von Willebrand) relacionadas con los procesos de adhesin, agregacin o degranulacin plaquetarias. Est alterado en trombocitopenias, trombopatas, trombastenias y dficit de fibringeno. Se observan tiempos prolongados en uremias, mielomas, macroglobulinemias y despus de la ingesta de cido acetilsaliclico. En la enfermedad de von Willebrand generalmente es alargado, pero si es normal no invalida el diagnstico de dicha enfermedad.

TIEMPO DE COAGULACION Fundamento El tiempo de coagulacin de sangre total es una de las pruebas llamadas globales y abarca la activacin intrnseca de la protrombina y el fibringeno. La sangre, al ser extrada sin mayor contaminacin con tromboplastina tisular, es capaz de coagular cuando se la deposita en un tubo de vidrio. El tiempo que tarda este proceso est en relacin con el sistema de procoagulantes e inhibidores fisiolgicos o adquiridos, que influyen en la formacin de dicho cogulo. Este tiempo de coagulacin in vitro reflejar mejor la eficacia del sistema in vivo, cuanto menos se modifique esta sangre (contacto con el vidrio, burbujas de aire, detergentes, etc.).

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Materiales Tubos de vidrio, perfectamente limpios. Bao a 37C. Cronmetro.

Procedimiento 1) Obtener 3 ml de sangre por puncin venosa, de primera intencin y con jeringa plstica. 2) Disparar el cronmetro en el instante en que la sangre venosa se introduce en la jeringa. 3) Desconectar la aguja y vaciar ordenadamente 1 ml de sangre en el primero de los tres tubos de vidrio perfectamente limpios, previamente colocados en gradilla de bao a 37C. 4) Inclinar el primer tubo cada 30 seg. por la misma cara hasta que la sangre se coagule (deja de escurrirse por las paredes del tubo). 5) De inmediato, inclinar el segundo tubo hasta que se coagule; luego, proceder de la misma forma con el tercer tubo. 6) Se toma como tiempo de coagulacin el valor obtenido en el tercer tubo. Valores de referencia 7-15 min a 37C. Interpretacin de resultados El rango normal debe establecerse en cada laboratorio, con un grupo suficiente de controles (20 como mnimo). Conviene repetir un paciente normal semanalmente, para determinar cualquier variabilidad de los valores previamente obtenidos. Se considera alargado un tiempo de coagulacin que difiere en ms de 2 min del lmite superior del rango normal, establecido en cada laboratorio (media + 2 SD). Se trata de un mtodo poco sensible, pues se prolonga slo en aquellos casos de dficit graves. Un tiempo de coagulacin normal no descarta la existencia de un trastorno de la coagulacin, pero un tiempo prolongado es siempre ndice de un defecto severo de la misma, que puede deberse a una deficiencia de cualquiera de los factores que intervienen en la formacin del cogulo de fibrina, con excepcin de una deficiencia pura de los factores VII y XIII; pero el mtodo es mucho ms sensible a los defectos de los factores que intervienen en la activacin por contacto y en la formacin del activador intrnseco de la protrombina.

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RETRACCION DEL COAGULO Fundamento La retraccin del cogulo depende de la actividad trombodinmica de las plaquetas, por lo que se require un nmero mnimo de plaquetas normales y adecuados niveles de Ca++. Tcnica 1) Los tres tubos utilizados para determinar el tiempo de coagulacin deben dejarse en bao a 37C durante por lo menos 3 hs. Al cabo de este tiempo, observaremos la mejor retraccin de los tres tubos, graduando de acuerdo a la magnitud de la retraccin por apreciacin visual del tamao del cogulo retrado y el suero libre en: a. Normal o completa b. Incompleta c. No retrae d. Hiperretrctil Interpretacin de resultados Esta prueba depende del nmero de plaquetas, su actividad funcional y de la concentracin de fibringeno, aunque no se relacione muy bien con el nmero de plaquetas (en ciertas condiciones da normal an con 30.000/mm3). Un aumento importante de fibringeno reducir la retraccin por efecto de volumen, mientras que lo opuesto ocurre en casos de hipofibrinogenemia. En la trombastenia de Glanzman (alteracin funcional) se observan retracciones incompletas o nulas.

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DETERMINACION DEL TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ACTIVADA (APTT)

APTTest
Reactivos para la determinacin del Tiempo de Tromboplastina Parcial Activada
SIGNIFICACION CLINICA El tiempo de tromboplastina parcial activada (APTT), es una prueba sensible a la deficiencia de factores procoagulantes del plasma as como a la presencia de ciertos inhibidotes de la coagulacin. Sirve para detectar anormalidades en la va intrnseca de la coagulacin, como son los factores necesarios para la formacin del activador intrnseco de la protrombina, o sea los factores VIII, IX, XI y XII. Tambin detecta deficiencias severas de los factores II, V, X y fibringeno, no siendo as con los trastornos plaquetarios, las deficiencias de los factores VII y XIII ni los problemas vasculares. La rapidez, sencillez y reproducibilidad de la prueba la hacen muy adecuada para el control de la teraputica anticoagulante por heparina. Tambin permite la identificacin rpida de hemoflicos en potencia, a fin de poder someterlos a tratamientos preventivos prequirrgicos y evitar problemas hemorrgicos. FUNDAMENTOS DEL METODO El ensayo se basa en la medida del tiempo que tarda en coagular un plasma descalcificado, colocado en un bao a 37oC y en presencia de un exceso de cefalina, activador y calcio. REACTIVOS PROVISTOS Reactivo APTT: viales conteniendo cefalina con tierra de diatomeas como activador particulado. Cloruro de Calcio: solucin de cloruro de calcio 0,025 mol/l. REACTIVOS NO PROVISTOS Agua bidestilada o desionizada. INSTRUCCIONES PARA SU USO Cloruro de Calcio: listo para usar. Reactivo APTT, preparacin: - Abrir un vial quitando el precinto metlico y retirando lentamente el tapn de goma para evitar prdidas del material. - Agregar el volumen de agua bidestilada o desionizada indicado en el envase. - Verificar que la temperatura del agua empleada no sea mayor a 37oC. - Tapar y agitar suavemente hasta obtener una suspensin homognea. Volver a homogeneizar cada vez que se emplee. PRECAUCIONES Los reactivos son para uso diagnstico "in vitro". ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Reactivos Provistos: estables en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. Reactivo APTT: una vez reconstituido es estable durante 14 das en refrigerador o 30 das congelado (-20 oC). El congelado y descongelado slo puede realizarse una vez. Por esto se recomienda dividirlo en porciones, de acuerdo a las necesidades de trabajo. MUESTRA Plasma a) Recoleccin: obtener sangre cuidadosamente (evitando estasis o trauma) y colocar en un tubo con anticoagulante en proporcin 9 + 1 exacta (ejemplo: 4,5 ml de sangre + 0,5 ml de Anticoagulante TP de Wiener lab.). Mezclar suavemente. Centrifugar y separar el plasma antes de los 30 minutos. Es recomendable efectuar la extraccin con jeringas plsticas. b) Aditivos: para obtener el plasma debe emplearse Anticoagulante TP de Wiener lab. o citrato de sodio 0,130 mol/l. c) Sustancias interferentes conocidas: - Las contaminaciones, visibles o no, son causa de tiempos falsamente prolongados. - No debe emplearse EDTA o heparina para obtener plasma. Referirse a la bibliografa de Young para los efectos de las drogas en el presente mtodo. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: el plasma debe mantenerse en refrigerador (2-10 oC) hasta el momento de efectuar la prueba. Este perodo no debe prolongarse ms de 4 horas. En caso de no poder procesarse en este lapso, el plasma debe congelarse a -20oC. Este procedimiento al igual que el descongelado debe realizarse con rapidez (sumergiendo en bao a 37 oC) previo a la determinacin. La muestra debe conservarse hasta el momento de su anlisis en tubos plsticos para minimizar los efectos de activacin por contacto que pueden ocurrir con los tubos de vidrio. MATERIAL REQUERIDO (no provisto) - Tubos de hemlisis. - Pipetas y micropipetas capaces de medir los volmenes indicados.

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- Bao de agua a 37oC. - Cronmetro. - Fuente luminosa, para la observacin del cogulo.

PROCEDIMIENTO Precalentar el Cloruro de Calcio antes de realizar la prueba en bao de agua a 37 oC. En un tubo de hemlisis colocar: Muestra (plasma desconocido o control) 100 ul Reactivo APTT (homogeneizado) 100 ul Mezclar e incubar de 3 a 5 minutos a 37oC, luego agregar: Cloruro de Calcio (a 37oC) 100 ul Disparar simultneamente un cronmetro. Agitar brevemente para homogeneizar el contenido, mantener en el bao unos 25 segundos. Luego sacar el tubo del bao, inclinar suavemente una vez por segundo y detener el cronmetro en el momento de la formacin del cogulo. Tomar nota del tiempo de coagulacin. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS Los resultados pueden expresarse de distinta forma: 1) Como tiempo de tromboplastina parcial activada en segundos. 2) Como relacin entre el tiempo obtenido con el desconocido y el de un plasma control. METODO DE CONTROL DE CALIDAD Plasma Control normal - patolgico. VALORES DE REFERENCIA El intervalo de valores observados en individuos normales oscila entre 33-48 segundos. Se considera fuera de lo normal valores que difieran en ms de 6 segundos de un plasma control. Es recomendable que cada laboratorio procese un plasma control con cada lote de reactivos empleado y que correlacione los valores obtenidos para los pacientes con el de dicho plasma, haciendo constar estos resultados en el informe. CURVA DE CALIBRACION Este mtodo es til como control de la respuesta a la heparina en pacientes tratados con este anticoagulante. La tcnica empleada es la siguiente: 1) Preparar una Solucin de Trabajo de heparina en solucin fisiolgica cuya concentracin sea 10 Unidades/ml. Debe emplearse la misma heparina que se suministra al paciente. 2) Preparar diluciones de esta Solucin de Trabajo utilizando un pool de plasmas frescos normales o Plasma Control normal como diluyente. Se debern obtener diluciones de 0,8; 0,6; 0,4; 0,2; y 0,1 Unidades/ml. 3) Determinar el tiempo de tromboplastina parcial para cada una de estas soluciones as como para el pool de plasmas y graficar en papel semilogartmico APTT vs. Concentracin de heparina. El valor obtenido para el paciente debe correlacionarse con los valores de la grfica, para obtener la concentracin actual de heparina circulante. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver Sustancias interferentes conocidas y Estabilidad e instrucciones de almacenamiento en MUESTRA. El mecanismo de la coagulacin involucra una serie de reacciones enzimticas que pueden ser influenciadas por toda condicin que afecte a los sistemas enzimticos en general, razn por la cual se deben observar las mismas precauciones metodolgicas. Debe tenerse en cuenta que variaciones en la relacin anticoagulante/muestra o en la concentracin de citrato utilizada afectan los tiempos de tromboplastina parcial activada, por lo que se recomienda controlar la dosis de anticoagulante empleada al tomar la muestra. PERFORMANCE Reproducibilidad: procesando replicados de las mismas muestras en un mismo da se obtuvieron los siguientes resultados: Nivel 45 seg 62 seg D.S. +1,1 seg +1,8 seg C.V. 2,5% 3,0%

PRESENTACION Equipo para 150 determinaciones (6 x 2,5 ml) (Cd. 1705002). BIBLIOGRAFIA - Bell, W.N.; Alton, H.G. - Nature 174:880 (1954). - Dacie, J.B.; Lewis, S.M. - Hematologa Prctica Ediciones Toray, 2 Edicin (1970). - Wintrobe, M.M. - Hematologa Clnica 3 Edicin Intermdica (1969). - Bragos, I; Rodrguez Pcora, S; Lorenzo, L; Capriotti, G. Evaluacin de un nuevo Reactivo de Tiempo Parcial de Tromboplastina Activada - 53 Triduo Bioqumico Cientfico Anual; Baha Blanca (1988). - Young, D.S. - "Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests", AACC Press, 3rd ed., 1990.

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DETERMINACION DEL TIEMPO DE PROTROMBINA O TIEMPO DE QUICK EN UNA ETAPA

Soluplastin
Tromboplastina clcica para la determinacin del Tiempo de Protrombina o Tiempo de Quick en una etapa

SIGNIFICACION CLINICA
El fenmeno de la coagulacin puede desencadenarse por una va extrnseca (lesin tisular) o por una va intrnseca contacto de la sangre con epitelios distintos del vascular normal). La determinacin del Tiempo de Protrombina o Tiempo de Quick es una prueba global para evaluar la coagulacin extrnseca, siendo sensible a: factor II o protrombina, factor V o proacelerina, factor VII o proconvertina y factor X o Stuart-Prower. Por lo tanto la determinacin se aplica a: - estudios de rutina en los anlisis prequirrgicos; - deteccin de alteraciones en los niveles de uno o ms factores involucrados en la va extrnseca; - control de la teraputica con anticoagulantes orales. FUNDAMENTOS DEL METODO Este ensayo se basa en la medida del tiempo que tarda en coagular un plasma descalcificado, colocado a 37 oC y en presencia de un exceso de tromboplastina tisular y calcio. El mtodo no detecta deficiencias de factores de la va intrnseca (VIII, IX, XI y XII). REACTIVO PROVISTO Soluplastin: viales conteniendo tromboplastina de cerebro de conejo, cloruro de calcio para una concentracin final de 0,0125 mol/l y cloruro de sodio para una concentracin final de 0,1 mol/l. REACTIVO NO PROVISTO Agua bidestilada o deionizada. INSTRUCCIONES PARA SU USO - Abrir un vial quitando el precinto metlico y retirando lentamente el tapn de goma para evitar prdidas del material. - Agregar el volumen de agua bidestilada o desionizada indicado en el envase. Verificar que la temperatura del agua empleada no sea mayor de 37oC. - Tapar y agitar suavemente hasta obtener una suspensin homognea. Volver a homogeneizar cada vez que se emplee. PRECAUCIONES El reactivo es para uso diagnstico "in vitro". ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Soluplastin provisto: estable en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. Soluplastin reconstituido: en refrigerador (2-10oC), es estable 5 das a partir del momento de su reconstitucin. MUESTRA Plasma a) Recoleccin: obtener sangre cuidadosamente (evitando estasis o trauma) y colocar en un tubo con anticoagulante en proporcin 9 + 1 exacta (ejemplo: 4,5 ml de sangre + 0,5 ml de anticoagulante). Si se emplea Anticoagulante TP de Wiener lab., se requerirn 7 gotas para 4,5 ml de sangre). Mezclar suavemente. Centrifugar y separar el plasma antes de los 30 minutos. b) Aditivos: para obtener el plasma se debe emplear Anticoagulante TP de Wiener lab. o citrato de sodio 0,130 mol/l. c) Sustancias interferentes conocidas: - las contaminaciones, visibles o no, son causa de tiempos falsamente prolongados; - la presencia de heparina o EDTA invalida los resultados; - hemlisis visibles dificultan la medicin foto-ptica de los resultados. Referirse a la bibliografa de Young para los efectos de las drogas en el presente mtodo. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: el plasma debe mantenerse en el refrigerador (2-10 oC) hasta el momento de efectuar el ensayo. En caso de no procesarse dentro de las 4 horas contadas desde la obtencin, la muestra se debe congelar (a -20 oC); de tal forma, puede conservarse durante un mes. Este ltimo procedimiento debe ser realizado con rapidez, al igual que el descongelamiento (sumergiendo en bao a 37oC) previo a la determinacin. MATERIAL REQUERIDO (no provisto) - Tubos de hemlisis.

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- Pipetas y micropipetas para medir los volmenes indicados. - Bao de agua a 37oC. - Cronmetro. - Fuente luminosa para la observacin del cogulo.

PROCEDIMIENTO 1- Colocar el plasma (desconocido o control) en bao de agua a 37oC durante 2-3 minutos (no ms de 10 minutos). 2- En un tubo de hemlisis, colocar 0,2 ml de Soluplastin reconstituido y preincubar a 37 oC durante 2-3 minutos (no ms de 10 minutos). 3- Pipetear 100 ul del plasma preincubado y agregar rpidamente al tubo conteniendo 0,2 ml de Soluplastin, disparando simultneamente el cronmetro. 4- Mantener el tubo dentro del bao y cerca de una fuente de luz. Previo al tiempo estimado de coagulacin, sacar el tubo del bao, inclinar suavemente una o dos veces por segundo y detener el cronmetro en el momento de la aparicin del cogulo. 5- Calcular el tiempo promedio de coagulacin de la determinacin por duplicado para cada plasma (desconocido o control). Si la diferencia entre los replicados de una misma muestra es mayor del 5%, se aconseja repetir el procedimiento desechando los valores anteriores. En caso de emplear un instrumento de medicin, deben seguirse las instrucciones del fabricante del mismo. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS Los resultados pueden expresarse de distintas formas: 1- Tiempo de Protrombina o Tiempo de Quick en segundos. 2- Porcentaje de Actividad Protrombnica respecto de un plasma normal (100% de actividad): para ello se debe trazar la curva de actividad protrombnica de un pool de plasmas frescos normales. Curva de calibracin En tubos de hemlisis, preparar 5 diluciones (cada una por duplicado) de un pool de por lo menos 3 plasmas normales o Plasma Control normal, segn: Diluciones Porcentaje de actividad (%) Pool plasmas normales (ml) Solucin fisiolgica 1:1 100 0,5 1:2 50 0,3 0,3 1:3 33,3 0,3 0,6 1:4 25 0,2 0,6 1:8 12,5 0,2 1,4

Determinar el Tiempo de Protrombina para cada dilucin, empleando el PROCEDIMIENTO descripto. En un papel milimetrado, graficar los resultados en un sistema de coordenadas. Colocar los Tiempos de Protrombina en segundos sobre el eje de las ordenadas y los Porcentajes de Actividad Protrombnica en el eje de las abscisas. Cada laboratorio debe trazar su propia curva de calibracin, correspondiente al lote de reactivos en uso. Repetir con cada nuevo lote de reactivos. 3- Razn Internacional Normatizada (R.I.N.) Para su clculo, deber emplearse la tabla de valores adjunta al equipo. METODO DE CONTROL DE CALIDAD Plasma Control normal - patolgico. VALORES DE REFERENCIA El rango de valores obtenidos en pacientes normales oscila entre: - Tiempo de Protrombina o Tiempo de Quick: 10 - 14 seg - Porcentaje de Actividad Protrombnica: 70 - 100% Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios intervalos o valores de referencia. Para pacientes bajo tratamiento con antivitaminas K se ha establecido un rango teraputico que se puede expresar como: - Porcentaje de Actividad Protrombnica: 25 - 35% R.I.N.: 2,4 - 2,5 LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA. Otras causas de resultados errneos son: - Extraccin defectuosa de sangre venosa. - Las variaciones en la relacin anticoagulante/muestra o en la concentracin de citrato utilizada afectan los Tiempos de Quick por lo que se recomienda controlar la dosis de anticoagulante empleada al tomar la muestra. - La preincubacin en el 2o paso del PROCEDIMIENTO no debe exceder los 10 minutos indicados como lmite mximo. Por otra parte, es conveniente que el reactivo reconstituido se retire del refrigerador inmediatamente antes de iniciar la prueba y vuelva a guardarse al finalizarla, ya que la exposicin por varias horas a temperatura ambiente en forma reiterada, deteriora el reactivo produciendo el alargamiento de los tiempos de protrombina. PERFORMANCE a) Reproducibilidad: procesando replicados de las mismas muestras en un mismo da, se obtuvieron los siguientes datos:

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X (n=20 11,5 seg 21,2 seg

D.S. +0,4 seg +0,6 seg

C.V. 3,5% 2,8%

b) Comparacin con mtodo de referencia: procesando distintas muestras con Soluplastin y con otro mtodo tomado como referencia, se observa:

Reactivo Soluplastin Referencia

X (n=60) 13,2 seg 12,8 seg

D.S. +0,3 seg +0,3 seg

C.V. 2,3% 2,3%

PRESENTACION - Equipo para 100 determinaciones (10 x 2 ml) (Cd. 1705001). - Equipo para 10 x 20 determinaciones (10 x 4 ml) (Cd. 1705005). - Equipo para 320 determinaciones (8 x 8 ml) (Cd. 1705003). BIBLIOGRAFIA - Quick, A.J. - Fisiologa y Patologa de la Hemostasis - Ed. El Ateneo, Buenos Aires (1952). - Araldi, H.T., et al. - Primer Reactivo Nacional Argentino de Referencia de Tromboplastina de Cerebro Humano Acta Bioqum. Cln. Latinoam. XVI/1:131 (1982). - Comit de Expertos de la O.M.S. en Patrones Biolgicos - Inf. N 28: Normalizacin de la Vigilancia del Tratamiento Anticoagulante (oral) - Serv. Inf. Tec. N 610:49-56 (1977). - Comit de Expertos de la O.M.S. en Patrones Biolgicos - Inf. N 31: Requerimientos para Tromboplastinas y Plasmas usados en la terapia anticoagulante oral - Serv. Inf. Tc. N 658:202-223 (1981). - Suer Casadevall, F. - Nuevas Normas Internacionales para la Expresin del Tiempo de Quick - Anlisis Clnicos X/40:240-245 (1985). - Young, D.S. - "Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests", AACC Press, 3rd ed., 1990.

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CUANTIFICACIN DE HIERRO SRICO Y CAPACIDAD TOTAL DE FIJACIN DE HIERRO (TIBC)

Fer-color Transferrina
Mtodo colorimtrico para la determinacin de la Capacidad Total de Fijacin de Hierro (Transferrina) del suero SIGNIFICACION CLINICA En el organismo humano, el hierro circula como Fe (III) unido a una protena transportadora especfica: la transferrina o siderofilina. Su funcin es captar el hierro de los sitios de absorcin (mucosa intestinal) o depsito (sistema retculo endotelial) y llevarlo a los rganos hematopoyticos donde es utilizado. En el individuo normal slo la tercera parte de la transferan se satura con hierro, estando el resto libre para unir y vehiculizar cualquier eventual aporte. La actividad fisiolgica de la transferrina se puede determinar eficazmente midiendo la capacidad total de fijacin de hierro (TIBC). La TIBC se encuentra aumentada en anemias post-hemorrgicas, y ferropnicas en general, en insuficiencias hepticas y fisiolgicamente en los ltimos meses del embarazo. Disminuye en cambio en la hemocromatosis, en ciertas anemias con disproteinemia (infecciosas, neoplsicas, nefropticas, etc.) en las hepatopatas crnicas, y en las grandes prdidas proteicas del sndrome nefrtico. FUNDAMENTOS DEL METODO La transferrina o protena transportadora especfica del hierro, se determina por su actividad fisiolgica de captar Fe (III) a pH mayor que 7,2 donde la transferrina se satura en presencia de Fe (III) en exceso. El remanente de Fe (III) no ligado se elimina totalmente por coprecipitacin con carbonato de magnesio. El hierro unido a la transferrina se libera y determina colorimtricamente segn la tcnica de Fer-color o Fer-color AA. La cantidad de Transferrina se expresa como los microgramos de Fe (III) con que est saturada. REACTIVOS PROVISTOS Solucin saturante: solucin estabilizada de Fe (III). Adsorbente: carbonato de magnesio granulado. REACTIVOS NO PROVISTOS - Fer-color o Fer-color AA provistos separadamente por Wiener lab. - Agua destilada. INSTRUCCIONES PARA SU USO Solucin saturante: lista para usar. Adsorbente: listo para usar. PRECAUCIONES Los reactivos son para uso diagnstico "in vitro". ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Los Reactivos Provistos son estables a temperatura ambiente hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. Adsorbente: el frasco debe volver a taparse inmediatamente despus de retirar las porciones necesarias para el momento. INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Ver el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA de Wiener lab. MUESTRA Ver el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA de Wiener lab. MATERIAL REQUERIDO (no provisto) - Ver el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA de Wiener lab. - Tubos de Kahn. CONDICIONES DE REACCION Ver el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA de Wiener lab. PROCEDIMIENTO a) Saturacin de la transferrina: en un tubo de Kahn colocar 500 ul de suero y 500 ul de Solucin saturante. Mezclar y dejar 5 minutos a 37oC. Con el dosificador provisto agregar el contenido de una medida al ras de Adsorbente.

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Tapar y agitar 5 minutos a temperatura ambiente. La agitacin deber ser vigorosa y en sentido longitudinal. Centrifugar 10-15 minutos a 3.000-4.000 r.p.m. hasta obtener sobrenadante lmpido o con la opalescencia propia del suero. b) Colorimetra: seguir el procedimiento indicado en el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA. ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINAL Ver el manual de instrucciones de Fer-color o Fercolor AA de Wiener lab. CALCULO DE LOS RESULTADOS Corregir las lecturas y efectuar los clculos de la misma manera que en la determinacin de hierro srico, multiplicando por dos el resultado final, por la dilucin del suero. Habitualmente se realiza la determinacin de hierro srico juntamente con la de transferrina. En ese caso se informan tres valores: Hierro Srico, Transferrina y Porcentaje de Saturacin de la Transferrina, que se calcula de la siguiente manera: Saturacin % = Hierro srico (ug/dl) Transferan (ug/dl) x 100

Si se desea efectuar simultneamente la determinacin de hierro srico para el clculo del Porcentaje de Saturacin, comenzar con la Saturacin de la Transferrina 30 minutos antes. VALORES DE REFERENCIA La literatura registra los siguientes rangos de valores para Transferrina y Saturacin de la Transferrina en personas normales: Transferrina (TIBC): 250-400 ug/dl. Saturacin de la Transferrina: 20-55%. Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver el manual de instrucciones de Fer-color o Fer-color AA de Wiener lab. La agitacin insuficiente producir valores falsamente aumentados de Transferrina. La concentracin de Fe (III) de la Solucin saturante es 10 veces mayor que la del Standard. Por lo tanto, no debe medirse este reactivo con la misma micropipeta que se utilice para el Standard y los Desconocidos. Caso contrario se introducen fuertes contaminaciones que invalidan los resultados. Adems, como la medida exacta de esta solucin no es crtica, puede usarse para tal fin una pipeta de 1 ml. PERFORMANCE Reproducibilidad: procesando replicados de las mismas muestras en un mismo da se obtuvieron los siguientes datos: Nivel 280 ug/dl 560 ug/dl D.S. +23,2 ug/dl +28,9 ug/dl C.V. 8,29% 5,16%

PRESENTACION Reactivos auxiliares para 25 determinaciones de la Capacidad Total de Fijacin de Hierro (Transferrina) (Cd. 1492002). BIBLIOGRAFIA - Dixon, K. - Ann. Clin. Biochem. 10/5:127 (1973). - I.C.S.H. - Am. J. Clin. Path. 56/4:543 (1971). - Zak, B.; Baginski, E.S.; Epstein, E. y Wiener, L.M.- Clin. Toxicol. 4/4:621 (1971). - Rojkn, M.; Olgun de Mariani, M.; Drappo, G. y Albarracn, A. - III Congreso Argentino de Bioqumica - Buenos Aires (1975). - Young, D.S. - "Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests", AACC Press, 3rd ed., 1990.

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Fer-color
Mtodo colorimtrico para la determinacin de hierro srico sin desproteinizacin SIGNIFICACIN CLINICA El hierro se encuentra en el organismo localizado en su mayor parte en el interior celular y particularmente en los eritrocitos, formando parte de la hemoglobina. La mioglobina, pigmento ms importante de las clulas musculares, contiene hierro en su grupo hemo, y una notable cantidad de este elemento se encuentra depositado en las clulas del sistema reticuloendotelial de hgado, bazo, mdula sea y parnquima heptico. Los niveles de hierro circulantes son relativamente bajos y dependen de numerosas variables (fluctuaciones diurnas, edad, sexo, hbitos alimenticios y actividad eritropoytica). La anemia por prdida de hierro representa uno de los trastornos orgnicos ms frecuentemente encontrados en la clnica mdica. Ocurre con frecuencia en mujeres, particularmente durante el embarazo debido a los requerimientos del feto. La otra causa ms comn de anemia ferropnica, es la prdida de sangre a travs del tracto gastrointestinal, a veces imperceptible, debida a hernia de hiato, lceras gstricas o duodenales, y carcinomas de estmago y colon. Por el contrario existen situaciones que conducen a hiperferremia. A veces se asocian a terapia transfusional, y otras veces a desrdenes caracterizados por una sntesis defectuosa de hemoglobina o fenmenos hemolticos. FUNDAMENTOS DEL METODO El hierro srico se libera de su unin con su protena transportadora especfica, la transferrina, en buffer succinato de pH 3,7 y en presencia de un reductor, el cido mercaptoactico. Posteriormente reacciona con el reactivo de color, piridil bis-fenil triazina sulfonato (PBTS) dando un complejo color magenta, que se mide a 560 nm. REACTIVOS PROVISTOS Reactivo PBTS: solucin estabilizada de piridil bis-fenil triazina sulfonato 50 mmol/l. Standard: solucin de iones Fe (III) equivalente a 100 ug/dl. Buffer succinato: solucin de succinato 0,25 mol/l para pH 3,7. Reductor: ampolla autorrompible conteniendo cido mercaptoactico al 70 %. REACTIVOS NO PROVISTOS Agua destilada. INSTRUCCIONES PARA SU USO Reactivo PBTS: listo para usar. Standard: listo para usar. Buffer/Reductor: transferir el contenido de la ampolla del Reductor al Buffer succinato, vertindolo directamente en el frasco de Buffer y mezclando por inversin. Anotar en el rtulo la fecha de preparacin. PRECAUCIONES Los reactivos son para uso diagnstico "in vitro". ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Reactivos Provistos: son estables a temperatura ambiente hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. Buffer/Reductor: en refrigerador (2-10oC) es estable durante un ao a partir de la fecha de su preparacin. Antes de usar llevar a 18-30oC. INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS Variaciones en las lecturas de Blancos de Reactivos y/o Standard, indican contaminaciones ocasionales (agua, material de vidrio, etc.). Un aumento en el valor de los Blancos indicar una contaminacin con hierro. MUESTRA Suero a) Recoleccin: debe usarse nicamente suero ya que los anticoagulantes interfieren en la reaccin. El paciente debe estar en ayunas y las extracciones deben practicarse siempre a la misma hora (preferentemente de maana) ya que las fluctuaciones fisiolgicas son significativas durante el da. b) Aditivos: no se requieren. c) Sustancias interferentes conocidas: no se observa interferencia por hemoglobina hasta 70 mg/dl, hiperlipemia, iones Cu hasta 200 ug/dl y bilirrubina hasta 400 mg/dl. Si bien hemlisis ligeras no interfieren con este mtodo, el International Committee for Standardization in Hematology (ICSH) recomienda el uso de suero libre de hemlisis. Referirse a la bibliografa de Young para los efectos de las drogas en el presente mtodo. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: el suero puede conservarse hasta una semana en refrigerador (2-10oC). MATERIAL REQUERIDO (no provisto) - Espectrofotmetro o fotocolormetro. - Micropipetas y pipetas para medir los volmenes indicados. - Tubos de fotocolormetro.

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LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO - Valores de Blanco aceptables: la determinacin de oligoelementos implica prevenir celosamente las posibles contaminaciones del agua y los reactivos. El Blanco de Reactivos, ejecutado de acuerdo al Manual de Instrucciones, no debe ser superior a 0,150 D.O. debiendo ser adems, despreciable la contribucin del agua en dicho Blanco. Para controlar esto ltimo, se recomienda leer un Blanco de Reactivos (2 ml de Buffer/Reductor + 0,5 ml de agua + 1 gota de PBTS) contra un Blanco de Buffer (2,5 ml de Buffer/Reductor + 1 gota de PBTS): la lectura del Blanco de Reactivos debe ser menor o igual que la del Blanco de Buffer. Caso contrario, reemplazar el agua destilada en uso por una de calidad comprobada (conductividad menor de 0,02 uOhms). Por otra parte, si la lectura del Blanco de Buffer es superior a 0,150 D.O. es indicio de contaminacin grosera de los reactivos, los cuales debern desecharse. Efectuar este control peridicamente. - Mezclado: los tubos pueden ser mezclados con la varilla o por agitacin suave. No invertir para evitar contaminaciones. - Limpieza del material: todo el material de laboratorio empleado debe estar libre de hierro, para lo cual debe ser sumergido durante 6 horas en HCl p.a. 10-15%, eliminando la acidez con numerosos lavados con agua libre de hierro. Secar el material preferentemente a no ms de 80C en cestillas de acero inoxidable o revestidos con plsticos. Todo el material debe ser empleado exclusivamente para la determinacin de hierro. PERFORMANCE a) Reproducibilidad: procesando la misma muestra en 10 das diferentes, se obtuvo un coeficiente de variacin del 4,2%, para un nivel de Fe srico de 129 ug/dl. b) Recuperacin: agregando cantidades conocidas de Fe (II) a alcuotas de un mismo suero, se recuper entre 90 y 103%. c) Linealidad: la reaccin es lineal hasta 500 ug/dl. PRESENTACION Equipo para 100 determinaciones (Cd. 1492001). BIBLIOGRAFIA - Dixon, K. - Ann. Clin. Biochem. 10/5:127 (1973). - I.C.S.H. - Am. J. Clin. Path. 56/4:543 (1971). - Zak, B.; Baginski, E.S.; Epstein, E. y Wiener, L.M.- Clin. Toxicol. 4/4:621 (1971). - Rojkn, M. L.; Olgun de Mariani, M. C.; Drappo, G. A. Y Albarracn, A. - III Congreso Argentino de Bioqumica Buenos Aires (1975). - Young, D.S. - "Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests", AACC Press, 3rd ed., 1990. CONDICIONES DE REACCION - Longitud de onda: 560 nm en espectrofotmetro o 540-560 nm en fotocolormetro con filtro verde. - Temperatura de reaccin: temperatura ambiente - Tiempo de reaccin: 10 minutos - Volumen de muestra: 500 ul - Volumen total de reaccin: 2,5 ml PROCEDIMIENTO En tres tubos de fotocolormetro marcados B (Blanco de Reactivos), S (Standard) y D (Desconocido) colocar: B Agua bidestilada Standard Suero Bfer/reductor 500 ul 2 ml S 500 ul 2 ml D 500 ul 2m

Mezclar. Leer la absorbancia del tubo D (Blanco de Suero BS) en espectrofotmetro a 560 nm o en fotocolormetro con filtro verde (540-560 nm) llevando a cero el aparato con agua. Agregar, manteniendo el frasco gotero en posicin vertical, 1 gota de Reactivo PBTS a cada tubo. Mezclar inmediatamente cada tubo y leer todos los tubos a 560 nm entre 6 y 20 minutos, llevando el aparato a cero con agua. ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINAL Los tubos deben ser ledos entre 6 y 20 minutos luego de completados los pasos del procedimiento. CALCULO DE LOS RESULTADOS Corregir las lecturas de S y D, restndoles los Blancos correspondientes: S - B = S corregida D - (B + BS) = D corregida Fe (ug/dl) = D corregida x f Donde: f = 100 ug/dl S corregida

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METODO DE CONTROL DE CALIDAD Standatrol S-E 2 niveles. VALORES DE REFERENCIA En un grupo de 20 mujeres y 20 varones sanos, con edades oscilando entre los 18 y 51 aos, se hall un rango de 60 a 160 ug/dl con los siguiente promedios: Varones: 114,6 ug/dl Mujeres: 103,3 ug/dl Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia.

SEPARACIN ELECTROFORTICA DE HEMOGLOBINA Fundamento Las diferentes hemoglobinas se separan por migrar a diferentes velocidades. En este medio la HbA migra hacia el nodo, mientras que la HbF (que en condiciones normales se encuentra en pequeas cantidades), queda en la HbA migrando juntas. La HbA 2 tiene una velocidad menor que la A. Materiales y reactivos Soporte: Acetato de celulosa gelatinizado, en medio alcalino (pH= 8,6). Las tiras deben conservarse en posicin vertical y en un recipiente tapado conteniendo metanol al 40%. Las tiras secas pierden las dimensiones y las caractersticas del gel. La superficie de las tiras que es penetrable a las protenas se reconoce porque es ms opaca luego de secarse entre dos tiras de papel de filtro. Solucin buffer: Tris........................ 14,1 g Glicina .................. 22,6 g H2O destilada......... 1000 ml Solucin colorante: Ponceau S: 0,5 g en 100 ml de cido tricloroactico 5% (dosis para 20 tiras) Solucin decolorante: cido actico 5%. Solucin deshidratante: Metanol puro. Solucin de transparentizacin: Metanol ......................... 85 ml cido actico ................ 14 ml Glicerol ........................... 1 ml Solucin disolvente: cido actico 80%

Tcnica

1) Sumergir las tiras en el buffer por lo menos 10 minutos. 2) Eliminar el exceso de lquido secando entre 2 papeles de filtro. 3) Extender las tiras sobre el puente de la cmara electrofortica. La superficie penetrable tiene que ir dirigida hacia arriba. La tira debe estar bien tiesa y plana. Operar rpidamente para evitar evaporaciones. 4) Sembrar las muestras con el hemolizado obtenido (ver ms adelante).

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5) Conectar la fuente de poder, realizar la corrida a un voltaje constante de 200 volts, durante 90 minutos. 6) Desconectar la corriente y retirar las tiras. 7) Colorear durante 5 minutos. 8) Decolorar con 3-4 baos de decolorante, hasta ver el fondo blanco de la tira. 9) Determinacin cuantitativa: Cortar las fracciones coloreadas e introducirlas en tubos de ensayo conteniendo la solucin disolvente y agitar. Leer a 520 nm si se us colorante Ponceau S. 10) Transparentizacin: Luego de decolorar las tiras se sumergen en metanol puro anhidro durante 30 segundos, a continuacin se las coloca en la solucin transparentadora durante 1 minuto como mnimo. Se colocan luego en una placa de vidrio, eliminando cuidadosamente las burbujas de aire y se calienta a la llama de un mechero durante unos minutos, hasta la transparencia completa. As se conserva para leer en densitometra. El siguiente cuadro muestra los resultados obtenidos en diferentes Hemoglobinopatas: TIPO Normal Polo negativo Anhidrasas Carbnicas Recin nacido Anhidrasas Carbnicas Drepanocitosis homocigota Anhidrasas HbA2 Hb S Carbnicas Drepanocitosis heterocigota Anhidrasas HbA2 Hb S Carbnicas Hemoglobinopata C homocigota Anhidrasas carbnicas Hemoglobinopata C heterocigota Anhidrasas Carbnicas -talasemia heterocigota HbC HbA HbC HbA HbF HbA HbA2 Polo positivo ACLARACIONES HbA 98% HbA HbA2 2% HbF 90% HbA 10% HbA2 2% HbS 98% HbA < 50% HbS > 50% HbA2 2% HbC 98% HbA2 2% HbC > 50% HbA < 50% HbA2 entre 4-8% Anhidrasas HbA2 HbA

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Carbnicas -talasemia homocigota Doble Heterocigota S/C HbA2 normal % de HbF y HbA, variable segn tipo de Th homocigota HbS 50% HbC 50%

Anhidrasas HbA2 Carbnicas

HbF HbA

Anhidrasas HbC HbS Carbnicas PREPARACIN DEL HEMOLIZADO Tcnica

1) Obtener 5 ml de sangre por puncin venosa, usando cualquier anticoagulante, aunque se recomienda la heparina. 2) Lavar tres veces con solucin fisiolgica, desechando los sobrenadantes. 3) Agregar un volumen de agua destilada igual al del paquete globular y 0,8 ml de tolueno (rompe los glbulos blancos), agitar vigorosamente durante 1 minuto. 4) Colocar en heladera (favorece la hemlisis), dejar 24 horas. 5) Centrifugar durante 10 minutos a 3000 rpm, recoger con pipeta Pasteur el infranadante y filtrar. 6) Se determina la concentracin de hemoglobina en el hemolizado obtenido, mediante el mtodo de la cianmetahemoglobina, se lleva la concentracin hasta los valores 7-8 g/dl de hemoglobina con agua destilada.

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DETECCIN HISTOQUMICA DE HEMOGLOBINA FETAL: REACCIN DE KLEIHAUER-BETKE Fundamento La hemoglobina fetal (HbF o 22) es cido y alcalirresistente. Por consiguiente, sometido un preparado fresco de sangre a una elucin cida ser arrastrada la hemoglobina A y retenida la hemoglobina fetal dentro de los eritrocitos, lo cual se reconoce por la coloracin de estos ltimos. Reactivos Alcohol etlico al 80% Buffer de cido ctrico, pH 3,4 Solucin A ................. 84 ml Solucin B.................. 16 ml o Solucin A: cido ctrico............................ 4,2 g Agua destilada......................... 100 ml o Solucin B: Citrato de sodio........................ 5,9 g Agua destilada......................... 100 ml Eritrosina o eosina al 0,1 % en agua. Tcnica 1) Extendidos de sangre secos de no ms de una hora de obtencin, se fijan durante 5 minutos en el alcohol etlico al 80%. 2) Lavado rpido con agua y secado. 3) Inmersin en una cpsula de Petri que contenga el buffer de citrato. Llevarlos a estufa a 37C un mnimo de 5 minutos, agitando cada dos minutos. Lavar rpidamente en agua comn y secar en posicin vertical. 4) Colorear en 3 a 5 minutos con la solucin de eritrosina o eosina. Lavar con agua y secar. Interpretacin de resultados Los hemates con hemoglobina fetal se colorean por la eritrosina o eosina. Los que contienen hemoglobina A han sido reducidos a sus membranas vacas y aparecen como sombras. El anlisis cuantitativo puede hacerse estableciendo el porcentaje de hemates coloreados e incoloros.

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DIAGNOSTICO DE MONONUCLEOSIS INFECCIOSA

Monoslide
Prueba de aglutinacin en placa, con neutralizacin segn Davidsohn, para el diagnstico de mononucleosis infecciosa

SIGNIFICACION CLINICA
La mononucleosis infecciosa es una enfermedad benigna producida por el virus de Epstein-Barr (EBV) que se caracteriza en su aspecto clnico por la aparicin de fiebre irregular durante una o dos semanas, dolor e hinchazn de los ganglios cervicales e irritacin farngea; con un cuadro hematolgico bastante caracterstico debido a la gran proliferacin de clulas linfoides atpicas. Paul y Bunnell observaron que el suero de estos pacientes generalmente contiene un alto ttulo de anticuerpos heterfilos, capaces de aglutinar glbulos rojos de carnero o de caballo. Estos anticuerpos no son privativos de la mononucleosis, ya que en el suero de individuos sanos pueden existir aglutininas anti-carnero con ttulos de 1/28 y hasta 1/56, observndose ttulos de 1/112 o ms en diversas infecciones y luego de estimulaciones antignicas como transfusiones sanguneas. Tales hechos indican que la evidencia de altos ttulos de anticuerpos heterfilos slo tiene valor presuntivo en el diagnstico de esta enfermedad. Davidsohn introdujo la adsorcin diferencial con extracto de rin de cobayo (capaz de adsorber los anticuerpos heterfilos no-mononucleosis infecciosa o anticuerpos de Forssman), aumentando as la sensibilidad y especificidad de la prueba y permitiendo confirmar los resultados de la Paul-Bunnell, que por su rapidez y practicidad sigui emplendose como prueba de screening o seleccin. No obstante, existe cierto porcentaje de pacientes (aproximadamente el 10%) con mononucleosis infecciosa que poseen bajos ttulos de anticuerpos heterfilos, razn por la cual los resultados de estas pruebas nicamente son considerados significativos, desde el punto de vista diagnstico, cuando se relacionan con los datos hematolgicos y las manifestaciones clnicas del paciente. FUNDAMENTOS DEL METODO Los anticuerpos heterfilos asociados a la mononucleosis infecciosa se detectan por su capacidad de aglutinar los eritrocitos de caballo, neutralizndose simultneamente los anticuerpos no asociados a mononucleosis (anticuerpos Forssman) con extracto de rin de cobayo. La aglutinacin se visualiza macroscpicamente. REACTIVOS PROVISTOS Reactivo: suspensin de eritrocitos de caballo y extracto de rin de cobayo. Control Positivo: dilucin de suero positivo, inactivado. Equivalente a 2-3 (+). Control Negativo: dilucin de suero negativo, inactivado. REACTIVO NO PROVISTO Solucin fisiolgica. INSTRUCCIONES PARA SU USO Reactivo: vaciar la pipeta del gotero y agitar vigorosamente antes de usar, verificando que no queden eritrocitos adheridos al fondo del frasco. Control Positivo: listo para usar. Control Negativo: listo para usar. PRECAUCIONES Los reactivos son para uso "in vitro". Los controles han sido examinados para HIV y HBV encontrndose no reactivos. No obstante, deben ser empleados como si se tratara de material infectivo. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Reactivo y Controles provistos: estables en refrigerador (2-10C) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. MUESTRA Suero a) Recoleccin: obtener suero de la manera usual. b) Aditivos: no se requieren. c) Sustancias interferentes conocidas: se ha descripto un inhibidor termolbil de la reaccin que produce resultados falsos negativos. Para eliminar esta interferencia es necesario inactivar el suero. Adems, la hemlisis tambin interfiere. Inactivacin: colocar el suero a 56C durante 15 minutos, inmediatamente antes de usar. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: el suero debe ser preferentemente fresco. En caso de no procesarse en el momento puede conservarse en refrigerador (2-10C) hasta 48 horas o en congelador durante 3 meses, a partir del momento de su recoleccin. MATERIAL REQUERIDO

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1- Provisto - Placa de vidrio 2- No provisto - Palillo o varilla de vidrio - Cronmetro - Material volumtrico adecuado para efectuar mediciones y diluciones de las muestras - Lmpara o fuente de luz horizontal PROCEDIMIENTO Llevar los reactivos y las muestras a temperatura ambiente antes de usar. I) PRUEBA CUALITATIVA Colocar una gota (50 ul) de Muestra inactivada en uno de los crculos de la placa limpia y seca. Agregar una gota (50 ul) de reactivo homogeneizado. Mezclar con palillo de madera hasta obtener una suspensin uniforme en toda la superficie del crculo. Inmediatamente, disparar un cronmetro y observar microscpicamente el resultado dentro de los dos minutos. Para una correcta visualizacin de los resultados, debe mantenerse la placa sobre un fondo negro y ligeramente por encima de un haz luminoso horizontal (ej.: lmpara de microscopa). II) PRUEBA CUANTITATIVA Los sueros positivos, segn la prueba anterior, pueden titularse efectuando diluciones seriadas: 1) Colocar en una serie de tubos 200 ul de solucin fisiolgica. 2) Agregar al primer tubo 200 ul de la Muestra inactivada y mezclar. Transferir 200 ul de esta dilucin al segundo tubo y mezclar, continuando de esta forma las diluciones hasta el ltimo tubo. Las diluciones as obtenidas equivalen a 1:2; 1:4; 1:8; 1:16, etc. 3) Tomar una gota de cada dilucin y ensayar segn I). INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS Negativo: suspensin homognea. Positivo: aglutinacin que aparece dentro de los dos minutos. Se califica de 1 a 4 (+). Un resultado positivo indica la presencia de anticuerpos heterfilos asociados a la mononucleosis infecciosa. Ttulo: se expresa como la inversa de la mxima dilucin a la que se produce aglutinacin visible macroscpicamente. METODO DE CONTROL DE CALIDAD Como punto de referencia de las reacciones positivas y negativas de Monoslide, es conveniente procesar simultneamente el Control Positivo y Control Negativo provistos, que se utilizan de la misma manera que la muestra. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA. PERFORMANCE Sensibilidad: en la tcnica original de Davidsohn se emplean eritrocitos frescos (nativos) que dan lugar a reacciones inespecficas, por lo que la hemaglutinacin slo se considera como reaccin positiva para mononucleosis infecciosa en diluciones mayores de 1/14. La sensibilidad de los eritrocitos estabilizados que provee Monoslide ha sido regulada para proporcionar igual reactividad con suero inactivado sin diluir. PRESENTACION Equipo para 100 determinaciones (Cd. 1593151). BIBLIOGRAFIA - Wintrobe, M. M. - "Hematologa Clnica" - Pg. 924 (Ed. 1969) - Intermdica. - Lee, C. L.; Davidsohn, I.; Slaby, R. - Am. J. Clin. Path. 49/1:3 (1968). - Lee, C. L.; Davidsohn, I.; Panczyszyn, O. - Am. J. Clin. Path. 49/1:12 (1968). - Sinay, H. S.; Schoen, I.; Miyahira, T. - Am. J. Clin. Path. 50/1:75 (1968). - Hoagland. R. J. - "Infectious mononucleosis" - Ed. 1967 - Grune-Stratton. - Marletta, J.; Cravero, J.; Fay, O.; Rey. J. - Paran (1977).

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CLULAS LE Y AUTO-ANTICUERPOS El lupus eritematoso sistmico es una enfermedad de base autoinmune, en la que estn afectados numerosos tejidos y rganos como articulaciones, piel, sistema nervioso, rin, corazn, pulmn, sangre, hgado, bazo y ojos. Fundamento Las clulas LE son polimorfonucleares que han fagocitado material nuclear alterado proveniente de la destruccin del ncleo de otros leucocitos por el llamado factor LE (factor nuclear). Este factor (IgG anti-ADN) se fija a la superficie del ncleo y determina alteraciones de la cromatina. El material nuclear alterado recubierto de anticuerpos y complemento es fagocitado por los polimorfonucleares neutrfilos.

Tcnica 1) Extraer 10 ml de sangre y dejarla coagular en un tubo de ensayo durante 2 horas a 37C. 2) Centrifugar 10 minutos a 3500 rpm. 3) Eliminar el suero y depositar el cogulo sobre un tamiz de malla fina (gasa). 4) Aplastar el cogulo contra el tamiz, recogiendo el producto resultante en un tubo de ensayo. 5) Llenar mediante una pipeta de Pasteur un tubo de Wintrobe, con el material obtenido de la destruccin del cogulo. 6) Centrifugar durante 20 minutos a 5000 rpm. 7) Eliminar el sobrenadante y recoger con una pipeta Pasteur los leucocitos situados en la interfase suero/hemates.

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8) Efectuar dos frotis con este material. 9) Teir con el mtodo de May Grunwald-Giemsa y observar mediante el objetivo de inmersin. Interpretacin de resultados La prueba es positiva cuando se observan leucocitos en cuyo citoplasma se hallan ncleos fagocitados de otras clulas con aspecto desestructurado y parcial o totalmente hialinizados. Esta prueba es especfica, pero no tiene gran sensibilidad por cuanto es negativa en el 30% de los pacientes de lupus. La corticoterapia, que a menudo se aplica prontamente a estos enfermos, inhibe la formacin de las clulas LE. Por lo tanto en la actualidad no tiene tanto valor diagnstico y es necesario utilizar otras pruebas. Tambin se puede observar la formacin de clulas LE en otras enfermedades autoinmunes y muchas veces difciles de distinguir clnicamente del lupus, como en colagenopatas y artritis reumatoidea. Por ello en la actualidad la determinacin clsica de las clulas LE ha sido desplazada por otras pruebas cada vez ms sensibles y especficas, entre las que se destacan los anticuerpos antinucleares (AAN o factores antinucleares FAN). Estos autoanticuerpos tienen especificidad frente a los cidos nucleicos y nucleoprotenas. Pueden ser detectados por distintos mtodos, como inmunofluorescencia indirecta (IFI), ELISA, inmunobloting., etc. El ms usado es la IFI, que se basa en dos reacciones secuenciales. En el primer paso el suero del paciente se pone en contacto con el sustrato antignico. Si los anticuerpos estn presentes en el suero del paciente, se unen al antgeno formando un complejo Ag-Ac. Si el suero no contiene Acs dirigidos contra ese Ag en particular, no se formar el complejo Ag-Ac y todos los componentes del suero sern eliminados en la etapa de lavado. En el segundo paso se agrega una anti globulina humana marcada con isotiocianato de fluorescena. Si el complejo Ag-Ac se form en el primer paso la anti marcada se unir al complejo dando una reaccin positiva verde amarillenta que se observa al microscopio. La IFI para ANA utiliza distintos sustratos pero el ms especfico son las improntas de la lnea celular Hep-2. En ellas se estudia el ttulo de positividad de la fluorescencia, como tambin el patrn microscpico de la misma. Los distintos patrones, homogneo, moteado, nucleolar, citoplasmtico, etc, se asocian a diferentes patologas autoinmunes. Los anticuerpos anti ADN tambin se pueden detectar por IFI, usando improntas con el hemoflagelado Crithidia lucillae como fuente de ADN nativo. Este microorganismo contiene una mitocondria gigante modificada, el kinetoplasto, el cual contiene una red concentrada de ADN doble cadena, ubicado entre el ncleo y el cuerpo basal en la insercin del flagelo.

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ELECTROFORESIS DE LAS PROTENAS SERICAS EN ACETATO DE CELULOSA El suero humano contiene numerosas protenas que cumplen diferentes funciones. La electroforesis es una tcnica simple para separarlas en fracciones (Fig. 1).

1Ac 1Ag 1At Lp

Alb AT3 Lp C1q, C1r, C1s, C3, C4, C5 C1Inh

Alfa1-antiquimotripsina Alfa1-glicoprotena cida Alfa1-antitripsina Alfalipoprotena Albmina Antitrombina III Betalipoprotena Componente del complemento C1q ... C5 Inhibidor de C1

Cer CRP FB Fibr Hpt Hpx IgA, IgD, IgE, IgG, IgM Pl PreA

Ceruloplasmina Protena C reactiva Factor B Fibringeno Haptoglobina Hemopexina Inmunoglobulinas A ... M Plasmingeno Prealbmina

Figura 1. Electroforesis de protenas plasmticas en acetato de celulosa: se observan cinco fracciones cada una compuesta por muchas protenas individuales. Las ms importantes se muestran en la figura. Se utiliza la electroforesis de zona en la cual se emplea un soporte inerte: acetato de celulosa o agarosa; las protenas que son anfteras adquieren una carga neta negativa en el buffer de pH 8,6 (barbital) que se usa en la corrida, por lo tanto migran hacia el nodo. El buffer empleado no desnaturaliza ni precipita a las protenas y su fuerza inica est entre 0,05 y 1,5 mol/l. A medida que aumenta la fuerza inica la migracin se hace ms lenta. El soporte que utilizamos en el trabajo prctico separa las molculas por su carga molecular neta y se obtiene un patrn de 5 bandas para un suero normal.

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La proporcin de las distintas fracciones proteicas vara en algunas enfermedades y adems se puede observar la aparicin de bandas diferentes de las normales como en el mieloma. Materiales y reactivos Tiras de acetato de celulosa Conservacin Las tiras de acetato de celulosa se conservan en un recipiente tapado en metanol 40%. Es importante no permitir que las tiras se sequen porque pierden las dimensiones y caractersticas del gel Reconocimiento de la superficie penetrable por las protenas Slo una cara es penetrable por las protenas y se reconoce fcilmente por que es ms opaca, despus de secarse entre dos hojas de papel de filtro. Las tiras tienen un ngulo achaflanado. La superficie penetrable puede reconocerse, por ejemplo, poniendo la tira con el ngulo achaflanado abajo y a la derecha.

Buffers N 1 Veronal sdico 0,04M (dietilbarbiturato de sodio 8,24 g/litro) pH=8,6. N 2 Veronal sdico 5,15 g + EDTA sal tetrasdica 2,60 g/litro. pH=8,6. Solucin colorante: Ponceau S: 0,5 g en 100 ml de cido tricloroactico 5% (dosis para 20 tiras). Deshidratante: Metanol puro. Solucin transparentizadora: 85 ml de metanol + 14 ml de cido actico + 1 ml de glicerol Solucin disolvente para cuantificar las fracciones proteicas: cido actico 80%.

Tcnica 1) Sumergir las tiras en el tampn por lo menos 10 minutos (como mximo una noche). 2) Eliminar el exceso de lquido entre dos hojas de papel de filtro. 3) Extender las tiras sobre el puente de la cmara electrofortica. La superficie penetrable tiene que estar dirigida hacia arriba; adems las tiras deben quedar bien planas. Conviene hacerlo rpidamente para evitar la evaporacin. 70

4) Condiciones de siembre y migracin: sobre puente de 8,5 cm para micro o semimicroelectoforesis. Voltaje fijo: 200 V en buffer n 1 o n 2. Microelectroforesis Microaplicacin de 0,5 l/5mm a 3 cm del borde catdico. Tiempo: 20 minutos (longitud de la migracin 25 mm) (error admitido sobre tiempo: -1+5 minutos) Semimicroelectroforesis Semimicroaplicacin de 1,5 l/9 mm a 2cm del borde catdico. Tiempo: 30 minutos (longitud de la migracin 35 mm) error admitido sobre tiempo: -1+8 min). 5) Coloracin: 5 minutos. 6) Decoloracin: con solucin decolorante cambiar 3-4 veces hasta que el fondo de la tira est blanco con agitacin. 7) Determinacin cuantitativa: Disolucin. Cortar las fracciones coloreadas e introducirlas en tubos de ensayo preparados en serie de 5. Agregar la solucin disolvente y agitar (para las fracciones obtenidas de tiras 2,5 x 17 cm usar 3 ml de solucin). Leer el colormetro a 520 nm para el colorante Ponceau S. Transparentizacin. Se sumergen las tiras decoloradas en metanol puro anhidro durante 30 segundos como mnimo, en cubeta seca, y a continuacin en la solucin transparentizadora durante 1 minuto como mnimo. Luego se colocan sobre una placa de vidrio, eliminando las burbujas de aire y se calienta preferentemente debajo de lmpara infrarroja o sobre un bao seco a 60C durante unos minutos, a unos 5-10 cm de distancia, hasta transparencia completa. Conviene hacerlo rpidamente para evitar que las tiras transparentizadas se sequen al aire. Luego se invierte la placa de vidrio sobre papel de filtro, dejando enfriar durante 20 minutos como mnimo. Se puede separar la tira de acetato de celulosa de la placa de vidrio conservndola en sobre de plstico o entre papeles pudindose efectuar despus la lectura en el densitmetro.

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Interpretacin de resultados Los perfiles que se obtienen en la densitometra son los siguientes:

Figura 2. Electroforesis de protenas sricas: correlacin clinicopatolgica.

Valores de referencia Protenas Valores relativos (%)* Albmina 52-65 1 2,5-5 7,0-13,0 2 8,0-14,0 12,0-22,0 * % del total de protenas Valores absolutos (g/dl) 3,2-5,6 0,1-0,4 0,4-1,2 0,5-1,1 0,5-1,6

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CITOQUMICA Las tcnicas citoqumicas tienen por objetivo detectar componentes celulares especficos (enzimas, lpidos, hidratos de carbono, depsitos de Fe, etc). En hematologa, la citoqumica consituy un complemento importante a la microscopa ptica convencional en el diagnstico de neoplasias y otros desrdenes hematolgicos. Sin embargo, hoy en da ha perdido relevancia por la difusin de la citometra de flujo. Las muestras utilizadas en hematologa son extendidos de suspensiones celulares: sangre perifrica, buffy coat (la banda rica en leucocitos provenientes de la centrifugacin de sangre entera) y aspirados de mdula sea o ganglios linfticos. En el TP se realizan dos tinciones que contribuyen en el diagnstico de las leucemias agudas. Consideraciones de bioseguridad Metanol, formaldehdo, cido peridico y la solucin de trabajo de Sudn Black son irritantes por inhalacin o al contacto con piel, mucosas u ojos. La fucsina bsica del Reactivo de Schiff es un carcingeno reconocido.

A) REACCIN DE PAS (cido peridico y Schiff) Fundamento El cido perydico oxida y rompe las uniones tipo glicol de la glucosa (o de sus derivados aminados). Esta oxidacin genera funciones aldehdo que quedan expuestas y pueden reaccionar con la base de Schiff, generando un compuesto coloreado. Reactivos Fijador: metanol Solucin de cido perydico al 1% Conservar a 4C hasta su uso. Reactivo de Schiff Conservar a 4C y proteger de la luz hasta su uso. Es una solucin de fucsina bsica pretratada con Na 2S2O5 (metabisulfito de sodio). Se incuba con carbn activado (para quitar el color) y se filtra antes de usar. Descartar si se torna rosa antes de usar. Contracolorante: azul de metileno al 1% Tcnica 1) Fijar con metanol 10 min. 2) Lavar con H2O de la canilla. 3) Agregar cido perydico 30 min. 73

4) Lavar con H2O de la canilla. 5) Cubrir toda la superficie con reactivo de Schiff 60 min. 6) Lavar bien con H2O de la canilla. 7) Cubrir con azul de metileno 5 min. 8) Lavar con H2O de la canilla y dejar secar. Interpretacin de resultados Todas las clulas que contienen glcidos insolubles (glucgeno, glicoprotenas, mucopolisacridos, etc) son positivas. El patrn de positividad est diseminado en todo el citoplasma. Sin embargo, en los blastos linfoides la positividad se expresa en forma de grnulos gruesos perinucleares sobre un fondo negativo. Este patrn se observa tambin en una fraccin de los eritroblastos presentes en la leucemia mieloide aguda tipo M6.

B) SUDAN BLACK B Fundamento El Sudn Black B es liposoluble y colorea intensamente fosfolpidos, lpidos neutros y esteroles. Reactivos Fijador: formol al 37 %. Solucin de Sudan Black B al 0,3% en etanol. Buffer Es una mezcla de fenol (16g en 30 ml de etanol) y Na 2HPO4.12H2O (300mg en 100 ml de agua destilada). Solucin de trabajo: mezcla de buffer y solucin de Sudn Black en proporcin 2 : 3 Conservar a 4C y proteger de la luz hasta su uso. Filtrar antes de usar. Contracolorante: Giemsa 1:10. Preparar en el momento. Tcnica 1)Fijar los preparados con vapores de formol durante 10 min. (en ambiente cerrado, por ejemplo caja de Petri).

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2)Lavar bien con H2O de la canilla. 3)Cubrir con solucin de trabajo 60 min. 4)Lavar con etanol 70% (2 lavados) durante 5 min. 5)Cubrir con Giemsa 1:10 10 min. 6)Lavar con H2O de la canilla y dejar secar. Interpretacin de resultados En los blastos provenientes de leucemias mielocticas y mielomonocticas, el citoplasma aparece cubierto de grnulos color negro. Las clulas monocitoides se tien de forma menos intensa y las linfoides y eritorides son negativas. El patrn de positividad es idntico al obtenido con la tincin de la mieloperoxidasa. Por lo tanto, permite diferenciar leucemias mieloides (positivas) de la

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DETERMINACIN DE FIBRINGENO

Fibringeno
Reactivo para la determinacin de fibringeno plasmtico

SIGNIFICACION CLINICA
El fibringeno es una glicoprotena que se halla presente en el plasma y en los grnulos plaquetarios . Es el factor de la coagulacin que se encuentra en mayor concentracin plasmtica (200-500 mg/dl). Cuando se produce un trauma o injuria vascular, la trombita formada escinde al fibringeno convirtindolo en monmeros de fibrina que polimerizan espontneamente y luego son estabilizados dando lugar a la malla insoluble de fibrina. Niveles bajos de fibringeno pueden encontrarse en desrdenes hereditarios tales como hipofibrinogenemia, afibrinogenemia, disfibrinogenemia, y tambin en otras circunstancias como enfermedad heptica, coagulacin intravascular diseminada, sndromes fibrinolticos, etc. Niveles elevados pueden encontrarse en diabetes, enfermedad inflamatoria, etc. Actualmente se ha reconocido que niveles altos de fibringeno aumentan el riesgo a padecer enfermedad cardiovascular. FUNDAMENTOS DEL METODO El ensayo se basa en el mtodo de Clauss, designado como procedimiento de referencia por el NCCLS (Nacional Committee for Clinical Laboratory Standards). Cuando un exceso de trombina se adiciona a un plasma diluido, el tiempo de coagulacin es inversamente proporcional a la concentracin de fibringeno plasmtico. El tiempo de coagulacin obtenido se compara posteriormente con una preparacin de fibringeno estandarizada. REACTIVOS PROVISTOS Trombina: viales conteniendo trombina liofilizada. Una vez reconstituida equivale aproximadamente a 100 Unidades NIH de trombina/ml. Buffer Imidazol: solucin de imidazol 0,05 M, pH 7,3. Plasma Referencia: vial conteniendo plasma liofilizado. Ver el valor de fibringeno asignado en el rtulo. REACTIVO NO PROVISTO Agua bidestilada o desionizada. INSTRUCCIONES PARA SU USO Trombina y Plasma Referencia: quitar el precinto metlico y abrir el vial retirando lentamente el tapn de goma para evitar prdidas del material. Agregar el volumen de agua bidestilada o desionizada indicado en el rtulo. Tapar, dejar reposar 30 minutos y luego mezclar suavemente (sin agitar) hasta obtener disolucin completa antes de su uso. Fechar. Se recomienda mantener el reactivo Trombina en el frasco original luego de su reconstitucin y durante su uso. Buffer Imidazol: listo para usar. Evitar su contaminacin. Mantener en su frasco original bien cerrado. PRECAUCIONES Los Reactivos son para uso diagnstico "in vitro". Este producto ha sido preparado a partir de plasmas humanos, los cuales han sido ensayados utilizando los mtodos bajo licencia de la FDA. No se ha encontrado reactividad para HBsAg, HCV y HIV. Pero dado que ningn mtodo de ensayo puede asegurar la ausencia absoluta de agentes infecciosos, los plasmas referencia, controles y muestras de pacientes deben manejarse como si se tratara de material potencialmente infeccioso. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Reactivos Provistos: son estables en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. Trombina reconstituida: estable 5 das refrigerada (2-10oC) o 30 das congelada (-20oC). Para descongelarla, hacerlo rpidamente a 37oC. No volver a congelar. Llevar a temperatura ambiente el reactivo antes de volver a usarlo. Evitar calentamientos prolongados. Plasma Referencia reconstituido: estable durante 8 horas refrigerado (2-10oC). MUESTRA Plasma a) Recoleccin: obtener sangre cuidadosamente, evitando estasis o espuma, y colocarla en un tubo con anticoagulante en proporcin 9 + 1 (ejemplo: 4,5 ml de sangre + 0,5 ml de anticoagulante). Mezclar suavemente. Centrifugar y separar el plasma antes de los 30 minutos. La extraccin se debe efectuar con jeringas plsticas. b) Aditivos: para obtener el plasma puede emplearse Anticoagulante TP de Wiener lab. o citrato de sodio 3,8% o 3,2%. No debe emplearse EDTA o heparina. c) Sustancias interferentes conocidas: - Las muestras ictricas, lipmicas o hemolizadas pueden dar resultados errneos. - Niveles elevados de productos de degradacin de fibringeno o fibrina pueden alargar los tiempos de coagulacin especialmente cuando los niveles de fibringeno son menores a 150 mg/dl.

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- Niveles teraputicos de heparina no interfieren con el ensayo, pero niveles elevados pueden conducir a resultados falsamente disminuidos. Referirse a la bibliografa de Young para los efectos de las drogas en el presente mtodo. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: la muestra debe conservarse hasta el momento de su anlisis en tubos plsticos para minimizar el efecto de activacin por contacto que puede ocurrir con los tubos de vidrio. El plasma debe mantenerse en refrigerador (2-10oC) hasta el momento de efectuarse la prueba. Este perodo no debe prolongarse ms de 4 horas. En caso de no poder procesarse en este lapso, el plasma debe congelarse a -20 oC. Este ltimo proceso debe realizarse con rapidez, al igual que el descongelamiento (sumergiendo en bao a 37 oC) previo a la determinacin. MATERIAL REQUERIDO 1- Provisto - Hoja de papel doble logartmico. 2- No provisto - Tubos de hemlisis. - Tubos plsticos para preparar las soluciones. - Pipetas y micropipetas para medir los volmenes indicados. - Bao de agua a 37oC. - Cronmetro. - Fuente luminosa para la observacin del cogulo. PROCEDIMIENTO I- CURVA DE CALIBRACION 1- Preparar diluciones del Plasma Referencia fibringeno 1:5, 1:10, 1:15, 1:20, 1:30, empleando 0,1 ml del Plasma Referencia reconstituido y 0,4; 0,9; 1,4; 1,9 y 2,9 ml de Buffer Imidazol respectivamente. El plasma diluido 1:10 representa el 100% del valor asignado en el envase. 2- Precalentar 0,2 ml de cada dilucin a 37oC durante 2 minutos. 3- Disparar el cronmetro con el agregado de 0,1 ml de Trombina reconstituida (no precalentar el reactivo de Trombina) a las diluciones preincubadas y registrar el tiempo de formacin del cogulo. 4- Calcular el tiempo promedio de coagulacin para cada dilucin, por duplicado. 5- Construir la curva de calibracin de fibringeno representando los tiempos de coagulacin en funcin de la concentracin de fibringeno, sobre el papel log-log. Unir a travs de una recta la mayora de los puntos representados. La recta final debe contener por lo menos 3 puntos consecutivos. Concentracin fibringeno* 1:5 0,8 0,2 ----mg/dl 1:10 0,9 0,1 ----mg/dl 1:15 1,4 0,1 ----mg/dl 1:20 1,9 0,1 ----mg/dl 1:30 2,9 0,1 ----mg/dl * concentracin de fibringeno indicada en el rtulo del Plasma Referencia Dilucin Bfer Plasma Ref. Factor dilucin x2= x1= x 0,67 = x 0,5 = x 0,33 =

El valor de fibringeno de cada dilucin de la curva se determina multiplicando la concentracin de fibringeno en el Plasma Referencia por el factor de dilucin. Por ejemplo, si en el Plasma Referencia se indica un nivel de fibringeno de 260 mg/dl, entonces las diluciones 1:5, 1:10, 1:15, 1:20 y 1:30 tienen 520, 260, 173, 130 y 87 mg/dl respectivamente. II- MUESTRAS DE PACIENTES Y CONTROLES 1- Preparar diluciones 1:10 de los plasmas de pacientes o plasmas controles en Buffer Imidazol. 2- Precalentar 0,2 ml de cada dilucin a 37oC durante 2 minutos. 3- Rpidamente adicionar 0,1 ml de Trombina y registrar el tiempo de formacin del cogulo. 4- Repetir la determinacin y promediar el resultado para cada muestra. CALCULO DE LOS RESULTADOS Conocido el tiempo de coagulacin del paciente o del control, ingresar este valor a la curva standard e interpolar el valor de fibringeno en cada caso. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS Si el tiempo de coagulacin para la muestra es demasiado corto (por ejemplo, menor a 7 segundos) diluir el plasma 1:20 con Buffer Imidazol y volver a ensayar. Multiplicar el resultado por 2. Si el tiempo de coagulacin para la muestra es demasiado largo (por ejemplo, mayor a 35 segundos) diluir el plasma 1:5 con Buffer Imidazol y volver a ensayar. Multiplicar el resultado por 0,5. METODO DE CONTROL DE CALIDAD Plasma Control normal/patolgico. VALORES DE REFERENCIA El intervalo de valores observados en pacientes normales oscila entre 200 - 400 mg/dl. En general se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios intervalos de referencia, dentro de su poblacin de pacientes.

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LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO - Se deber realizar una curva de calibracin nueva con cada cambio de lote de reactivo o cualquier cambio de instrumento. - Fallas en la reconstitucin de los reactivos pueden ser causa de resultados errneos. - Recoleccin de muestra: las muestras y sus diluciones debern colocarse en tubos de plstico o de vidrio siliconado. Es importante respetar la relacin de anticoagulante y sangre como tambin la concentracin de citrato utilizada. - Debe controlarse que el ensayo se realice a 37oC y que los tubos de trabajo estn absolutamente limpios. PERFORMANCE Reproducibilidad: procesando replicados de las mismas muestras en un mismo da se obtuvieron los siguientes resultados:

Nivel
12,1 seg 20,4 seg

D.S. +0,3 seg +0,6 seg

C.V. 2,7% 3,2%

PARAMETROS PARA ANALIZADORES AUTOMATICOS El reactivo Fibringeno se puede usar en forma manual y con mtodos de deteccin mecnicos y foto-pticos. Para instrumentos semiautomticos y automticos se recomienda seguir las instrucciones del aparato. PRESENTACION Equipo para 100 determinaciones (Cd. 1705006) conteniendo: - Trombina: 10 x 1 ml - Plasma Referencia: 1 x 1 ml - Buffer Imidazol: 2 x 60 ml BIBLIOGRAFIA - Clauss, A. - Acta Haematol. 17:237, 1957. - Koepke, J.A. - Am. J. Clin. Pathol. 63:984, 1975. - Collet, J.P. - Blood 82/8:2462, 1993. - Ernest, E. - Ann. Intern. Med. 118/12:956, 1993. - Young, D.S. - "Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests", AACC Press, 3rd ed., 1990.

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