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Escola Secundria do Lumiar

ndice
Introduo ..................................................................................................................................... 2 Dna Fingerprinting......................................................................................................................... 2 Introduo terica..................................................................................................................... 2 Objectivo ................................................................................................................................... 3 Material ..................................................................................................................................... 3 Procedimento ............................................................................................................................ 3 Resultados/Concluso ............................................................................................................... 3 Clonagem de genes ....................................................................................................................... 4 Introduo terica..................................................................................................................... 4 Objectivo ................................................................................................................................... 5 Material ..................................................................................................................................... 5 Procedimento ............................................................................................................................ 5 Resultados/Concluso ............................................................................................................... 6 Concluso/Crtica .......................................................................................................................... 7 Bibliografia .................................................................................................................................... 7

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Introduo
O objectivo da visita de estudo Universidade Lusfona no passado dia 25 de Janeiro foi o de aprofundar os nossos conhecimentos em relao Gentica e em relao Biologia Molecular e para o fazermos realizmos duas experiencias: Clonagem de genes e tcnica de fingerprinting

Dna Fingerprinting
Introduo terica
O cido Desoxirribonucleico um cido nucleico que contm toda a informao gentica de cada indivduo, nomeadamente de todos os seres celulares e de grande parte dos vrus. Este cido consiste numa molcula formada por duas cadeias antiparaledas (em forma de dupla hlice) ligadas entre si por ligaes de hidrognio entre as bases azotadas e constitudo por unidades alternadas de desoxirribonucletidos, os quais, por sua vez, so constitudos por um acar (a desoxirribose), um grupo fosfato e a referida base azotada ; esta base pode ser uma purina (Adenina e Guanina) ou uma pirimidina (Timina e Citosina). A Adenina est ligada com a Timina por 2 ligaes de hidrognio e a Guanina com a Citosina com 3 ligaes de hidrognio. Na tcnica de DNA fingerprinting (impresso digital do DNA), a partir da anlise do DNA de um organismo este pode ser identificado ao nvel do individuo. Esta tcnica muito utilizada na investigao criminal para identificar criminosos a partir de resduos de DNA (pele, sangue, esperma, cabelos, etc.) ou em testes de paternidade para identificar os pais (me e pai). 2

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Objectivo
Na experiencia efectuada o nosso objectivo principal foi o de descobrir a qual dos suspeitos coincidia uma amostra de Dna da cena do crime, descobrindo assim o culpado.

Material
Micropipetas 20l 10l de soluo de DNA 10l de mix-reao: ECO RI; PST 1 Gel Agarose Tampo- 50ml Proveta Erlenmeyer Vareta de vidro Microondas Balana digital Sistema formador de gis Pente para o sistema de gis Tina de electroforese. Equipamento de eletroforese em gel

Procedimento
Inicimos a experiencia, com o DNA que pretendamos analisar j pronto a ser utilizado; Com a micropipeta colocmos o DNA proveniente da soluo j preparada em diversos recipientes; Preparmos o gel de agarose; Colocmos o gel na tina de eletroforese e pipetmosse o DNA proveniente de cada recipiente em cada um dos marcadores presentes no gel. Ligmos a tina electroforese a 70 volt durante 1h 30min. Aps a 1h 30min observmos o gel luz ultravioleta.

Resultados/Concluso
Ao finalizarmos a experiencia foi-nos possvel constatar que um dos padres obtidos coincidia com o padro obtido atravs da amostra de DNA inicial.Ao realizarmos esta experiencia podemos concluir que a tcnica de DNA finger printinging pode ser muito til na comparao de duas amostras de DNA. 3

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Clonagem de genes
Introduo terica
Um gene um segmento de DNA que contm informao necessria para sintetizar uma determinada protena.

O DNA total de um organismo pode ser fragmentado em pequenos pedaos e introduzido em organismos hospedeiros. Estes, ao dividirem-se vo multiplicar tambm as molculas de DNA neles introduzidas, dando origem a um grande nmero de cpias (clones) , este processo denomina-se por clonagem de genes. A clonagem de genes realiza-se na sua maioria, em microorganismos pois estes tm uma elevada taxa de crescimento, so seres unicelulares, so de fcil manipulao, tm vrios vectores de clonagem e estirpes hospedeiras modificadas com vrias marcas de seleco.

As bactrias funcionam como hospedeiras pois possuem a informao gentica organizada em cromossomas circulares, os nucleides, e em molculas muito pequenas, os plasmdeos, que funcionam como cromossomas independentes. So os plasmdeos que vo funcionar como transportadores do DNA para a bactria (vectores de clonagem).

A transcrio de genes bacterianos muito simples, esta s necessita de RNA polimerase que possui um factor sigma especifico para cada tipo de regio promotora. A regio reguladora nos promotores denomina-se por genes operadores que controlaram a transcrio de genes no metabolismo de fontes alternativas de carbono e de azoto como por exemplo dos operes Lac, Trp e Ara. Existem vrias formas de regulao pr-transcripcional . No opero Ara a transcrio impedida na ausncia da arabinose atravs de um loop do DNA promovido por 2 molculas de repressor AraC . E na presena de arabinose, o repressor altera a sua conformao, permitindo a transcrio dos restantes genes do opero. As bactrias possuem sistemas de proteco/restrio de sequncias de DNA especificas. Existem vrias enzimas que reconhecem diferentes sequncias no DNA e que produzem 2 tipos de extremidades aps a restrio: Extremidades coesivas e cegas/rombas.
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Objectivo
Utilizar o mecanismo de reproduo das bactrias para criar cpias do seu prprio DNA mas tambm, cpias de um determinado DNA que se pretenda clonar.

Material
Bico de Busen Caixas de Petri lcool Etlico Soluo LB Arabinose Ampicila Colonia de bactrias em caixa de Petri Caixa de gelo Micro-recipientes Anas de plstico e anas de metal Vareta de vidro Pipeta graduada Suporte flutuador Soluo de DNA Banho Maria

Procedimento
Acendemos o Bico de Bunsen e deixmo-lo arder de modo a que o local de trabalho em redor da chama ficasse esterilizado.
Colocmos lcool no papel absorvente e desinfectmos a bancada com movimentos rectilneos de modo a no passar com o papel duas vezes no mesmo local. Utilizmos duas solues de cloreto de clcio em dois tubos diferentes e marcmos um tubo com um + e outro com um -, um dos quais iria ser utilizado como controlo para a experiencia Esterilizmos a ana de metal , levando-a chama. Retirmos com a ana de metal as bactrias da placa de petri , e colocmo-las em ambos os tubos;

De seguida foi adicionmos uma amostra de DNA do qual pretendia-mos clonar ao tubo marcado com um + Deixmos ambos os recipientes em gelo durante aproximadamente 10 minutos

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Colocmos os dois tubos em banho-maria a 42C durante 90 seg provocando assim um choque trmico em ambas as preparaes o que levou dilatao da membrana celular e permitiu a entrada do DNA na bactria.
Colocmos os dois tubos em gelo durante 2min. . Retirmos os tubos do banho-maria. Dividimos em trs pores equivalentes o contedo do tubo com o sinal (+), e com a pipeta de pasteur colocmos as trs pores nos trs diferentes meios de cultura e assinalamos as placas com o sinal de (+). De seguida repetimos a aco, com o tubo com o sinal(-) mas pusemos em dois meio de cultura LB e LB+ampicilina. Realizmos a esterilizao por flangeamento da vareta de vidro de modo a caber na placa. De seguida com a pipeta espalhmos uniformemente o contedo pela placa de sinal mais (+) de modo a tapar com contedo a placa toda. Repetimos a aco para as placas de sinal menos (-).

Desligmos a botija de gs; Deixmos as bactrias a recuperar na preparao LB a 37C (temperatura ideal) Passadas 24 horas , retirmos as placas e visualizmos com luz ultravioleta as mesmas.

Resultados/Concluso
Ao passarem 24 horas, nas duas placas de Petri marcadas com + foi possvel observar

que a presena da arabinose numa das preparaes apenas serviu para que as bactrias tivessem um aspecto florescente quando sujeitas a luz UV, ao estarem sujeitas ao DNA, adquiriram a capacidade de sobreviver a ampicilina o que lhes permitiu sobreviver noite e comear a desenvolver uma colnia no LB, esta colnia era, toda ela, composta por bactrias que continham o DNA que se pretendia clonar. Nas placas de Petri marcadas com - podemos verificar que, a placa que continha ampicilina no estava sujeita presena de qualquer tipo de bactrias, uma vez que ao no
estarem sujeitas ao DNA no conseguiram sobreviver aos efeitos do antibitico Na placa que continha uma soluo de LB podemos verificar vrios tipos de colnias de bactrias, isto deveu-se ao facto de com a ausncia de qualquer antibitico no s a

colnia de controlo se ter desenvolvido na preparao mas tambm outro tipo de bactrias que no faziam parte da experiencia. Ao analisarmos estes resultados podemos concluir que as bactrias tm a capacidade de replicar DNA que nelas seja inserido, mas para ocorrer este fenmeno as bactrias sujeitas a esta experiencia devero ser controladas e dever haver um antibitico que seleccione o tipo de bactrias que desejamos clonar.
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Concluso/Crtica
Mesmo no tendo podendo analisar os nossos resultados na experiencia Clonagem de genes, podemos analisar as amostras disponibilizadas pelo professor da Universidade Lusfona. Na minha opinio esta visita de estudo foi muito proveitosa, porque podemos lidar com as tecnologias modernas utilizadas nas cincias tecnolgicas, coisa que seria impossvel na nossa escola.

Bibliografia
http://www.knoow.net/ciencterravida/biologia/acidodesoxirribonucleico.htm http://www.todabiologia.com/genetica/genes.htm http://www.ufpe.br/biolmol/aula5_clonagem1.htm