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INTRODUO

O espectrmetro NIR ("Near Infrared Reflectance ") ou NIT ( "Near Infrared Transmitance" ) um equipamento de alta preciso que efetua anlises de alimentos e outras amostras orgnicas (e algumas inorgnicas)atravs do princpio de emisso de radiao eletromagntica.A energia radiante do infravermelho (IV) empregada para caracterizar substncias orgnicas.O espectrmetro NIR se baseia na aplicao da matemtica qumica analtica (quimiometria) . A tcnica uma integrao da espectroscopia, estatstica e computao de dados. O uso da espectroscopia de reflectncia no infravermelho prximo (NIRS) recente, sendo os primeiros relatos de 1939, na Pensilvnia. Comercialmente foi utilizada em 1985. Em 1988 o mtodo foi aceito oficialmente. Segundo VAN KEMPEM & JACKSON (1996), para entender-se o fundamento do NIR, necessrio o conhecimento da base fsica das cores.A energia luminosa luz branca composta de todas as cores do espectro do arco-ris.Quando essa luz incide sobre um objeto, certas cores so absorvidas e outras refletidas ou transmitidas.A luz refletida pode ser captada pelos olhos.Por exemplo, quando a luz incide sobre uma folha verde so absorvidos o vermelho e o azul.As cores refletidas so interpretadas pelos nossos sentidos visuais como verde. Ainda, segundo VAN KEMPEM &JACKSON (1996), a base fsica de absoro de luz relacionada natureza das ligaes moleculares que, por sua vez, so definidas pelos vnculos entre tomos dentro de molcula. Entretanto, essas ligaes no so conexes estticas e sim vibram o tempo todo, provocando estiramento e compresso das molculas, resultando em um movimento de onda dos tomos, com freqncia especfica dependente dos elementos envolvidos. A energia luminosa consiste em ftons que traam um percurso a uma velocidade fixa.Nesse percurso os ftons exibem um movimento de onda, que caracterstico para cada cor de luz e expresso como freqncia (nmero de ondas percorridas por segundo) ou como comprimento de onda (a distncia percorrida por uma onda completa). Quando iluminamos um determinado objeto com uma luz monocromtica podem ocorrer dois fenmenos: a luz refletida quando a freqncia (cor)da luz no igual freqncia de vibrao do enlace molecular ou, a luz absorvida e sua energia usada para intensificar a vibrao das ligaes moleculares (os objetos tornam-se mais quentes) quando a freqncia (cor)de luz igual freqncia de vibrao. Os alimentos so compostos principalmente de matria orgnica e uma menor frao inorgnica. As ligaes moleculares mais comuns nos alimentos so entre hidrognio, carbono, oxignio, enxofre, fsforo e nitrognio.A freqncia da vibrao entre estas molculas implica em uma determinada absoro de luz na regio infravermelha, isto , na regio que se estende alm do vermelho no arco-ris (no visvel para humanos), uma vez que seu comprimento de onda est acima de 700 nm.

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Os compostos orgnicos presentes nos alimentos absorvem energia eletromagntica na regio do IV. Em suas absores vibracionais, as ligaes covalentes se comportam como se fossem elsticas.O espectro no IV das molculas orgnicas tem sido comparado sua impresso digital (VOGE, 1992) O NIR se baseia no fato de que as ligaes covalentes das substncias orgnicas absorvem essa energia, usando-se essa absoro para estimar o nmero e tipo de ligaes moleculares nas amostras.Em outras palavras, o princpio mecnico seria o de iluminar uma amostra com luz de comprimento de onda especfico e conhecido da regio do infravermelho prximo.A absoro de luz ento medida por diferenas entre a quantidade de luz emitida pelo NIR e a quantidade de luz refletida pela amostra (VAN KEMPEM &JACKSON, 1996), relao atravs da qual pode-se predizer a sua composio qumica, desde que as leituras obtidas possam ser instantnea, efetivamente comparadas e ajustadas na matriz de um banco de dados armazenados que calibra o software de logstica do equipamento. Essa reviso tem por objetivos apresentar alguns aspectos relacionados aos princpios da espectroscopia de infravermelho prximo e suas aplicaes na nutrio animal, tendo como principais referncias os trabalhos de SHENK e WESTERHAUS (1994), GARRIDO et al.(1996) e GIVENS et al.(1997). Princpios do infravermelho prximo O espectro infravermelho foi descoberto em 1800 por Herschel.O pesquisador verificou que algumas cores de luz conduziam calor em ondas mais longas do que todas as luzes visveis e se apresentavam invisveis aos olhos humanos, denominando-os raio infravermelho (GIVENS et al., 1997). A parte do espectro eletromagntico visvel ao olho humano se estende de 400 a 730 nm, enquanto que o espectro eletromagntico do infravermelho (IV)vai de 2500 a 600000 nm. A regio intermediria entre o IV e o espectro visvel denominada de infravermelho prximo. Existem diferenas bsicas no comportamento da emisso de luz nas diferentes regies do infravermelho. Enquanto que o infravermelho prximo (NIR)caracteriza-se por uma combinao de harmnicas (ondas curtas com 700 -1400 nm) e bandas de vibraes (1400 -2500 nm, iguais as ocorrentes no infravermelho mdio)o infravermelho mdio se caracteriza por uma propagao de luz como vibraes fundamentais (2500 -50000 nm), enquanto que o infravermelho distante apresenta ondas muito longas (50000 -1000000 nm) propagando-se como rotaes. A molcula pode absorver radiao quando as vibraes entre as suas ligaes moleculares ocorrem na freqncia da onda de radiao, sendo que a freqncia caracterizada matematicamente como sendo:f =1/comprimento de onda. Norris (1965), citado por GIVENS et al.(1997), observou que compostos com grupos qumicos similares tinham bandas de absoro caractersticas do IV. Por exemplo, aldedos, cetonas, cidos orgnicos e seus esteres, anidridos e sais, os quais possuem um grupo funcional carbonila (>C =O) tem a banda de absoro em torno de 6000 nm. A natureza da estrutura qumica ligada carbonila influencia e determina o exato comprimento de onda absorvida . Quando uma amostra irradiada, a luz absorvida seletivamente de acordo com freqncia especfica de vibrao das molculas presentes e d origem a um espectro. O espectro infravermelho mdio de alimentos consiste em agrupar bandas de absoro a partir dos quais os compostos orgnicos podem ser identificados, mas so menos utilizados para anlises quantitativas devido ao baixo sinal e ao alto sinal de rudo dos instrumentos.J os instrumentos de infravermelho prximos apresentam um baixo sinal de rudos e interferentes, sendo mais adequado para medir quantitativamente os nutrientes. O NIRS apresenta como desvantagem funcional a baixa sensibilidade para muitas bandas sobrepostas, impossibilitando anlises estruturais e micro anlises.A sensibilidade limita-se a 0, 15%para a maioria dos constituintes dos alimentos. Por outro lado, a regio do NIR apresenta como vantagem a anlise quantitativa para constituintes em maior quantidade.Devido ao baixo sinal das bandas e harmnicas na regio do NIR, amostras slidas no necessitam ser diludas, e no so sentidos os efeitos de no linearidade.

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Relao da emisso de luz na regio do infravermelho com alimentos Todas as ligaes orgnicas tm bandas de absoro na regio do NIR enquanto que os minerais s so detectados quando em complexos orgnicos ou quelatos, ou indiretamente por sua ligao com pontes de hidrognio, ou seja, dosados como derivados orgnicos. Por causa da baixa massa atmica do hidrognio (H), as harmnicas e combinaes de banda do H tornam os grupos funcionais C-H, O-H e N-H dominantes no espectro do NIR em alimentos. Outras importantes absores moleculares na regio do NIR incluem a carbonila (vibraes longas entre as duplas ligaes C=O), vibraes de C-C e C -com metais. Quando uma radiao monocromtica interage com uma amostra ela pode ser absorvida, transmitida ou refletida, conforme a Figura 1.O caminho da luz incidida sobre a amostra vai determinar a medida utilizada para a concentrao. A difuso ocorre quando a radiao transmitida atravs da superfcie emergente aps parcial absoro e difundida ao acaso em reflexes, refraes e difraes nas camadas da amostra. A difuso depende das caractersticas fsicas da amostra, com particular importncia para tamanho de partcula, contedo de umidade e temperatura. Como a maior parte dos alimentos opaca, as medidas de refletncia so mais adequadas para a anlise do NIRS, entretanto o NIRS pode analisar materiais lquidos com vrios graus de viscosidade e transparncia, sendo que, para o ltimo caso, podem ser utilizadas medidas de transmitncia ou transreflectncia.Uma vez que alguma luz absorvida e a restante refletida, o estudo dessa reflexo pode ser utilizado para determinar a quantidade absorvida (OSBORNE, 1981). A luz pode apresentar alguns comportamentos que no so adequados para as medidas do NIRS, como a reflexo especular, por exemplo.Isso porque, se toda a luz refletida, nada absorvido, ento no h justificativa para utilizao do NIRS. Entretanto, os alimentos no so totalmente opacos e apresentam alguma reflectncia especular, alm daquela reflectncia difusa.Desse modo os aparelhos de NIRS tm que ser calibrados para que avaliem somente a reflectncia difusa.(OSBORNE, 1981). Outras importantes perdas de energia da amostra podem ocorrer por absorbncia, refrao interna, difuso interna e reflexo especular, e essas perdas podem determinar erros e efeitos no lineares no espectro do NIRS.Por isso existem alguns modelos matemticos e pr-tratamentos dos dados espectrais utilizados para corrigir essas distores.Esse ponto ser comentado mais adiante. A reflectncia difusa, mais comumente usado no NIRS, utilizada em amostras em que a variao do comprimento de onda vai de 1100 at 2500 nm, enquanto que a transmitncia medida de 800 a 1100 nm. Essas medidas vo ser determinadas pelo tipo de ligaes moleculares dos alimentos.Protena bruta est relacionada com a ligao N-H de comprimento de onda 1500-1510nm, amido com 1540nm, fibra com 2092 nm, aminocido a 2242 nm e extrato etreo 2310nm (DEAVILE &FLINN, 2000) Nesse aspecto importante acrescentar que seria fcil lidar com o NIRS se o espectro se apresentasse claro e distinto para os vrios componentes da amostra, entretanto, no assim que ocorre.A interpretao do espectro de uma amostra de um alimento mais complicada do que a interpretao de compostos orgnicos puros.Isto porque os alimentos apresentam grande nmero de ligaes moleculares que caracterizam diversos compostos orgnicos, mas que absorvem luz de um mesmo comprimento de onda.Ou seja, um alimento apresenta um espectro com muitas bandas de vibrao e harmnicas sobrepostas e a relao entre concentrao e energia absorvida de uma amostra formada por uma sobreposio de vrias bandas espectrais dos diferentes constituintes. Assim o espectro se apresenta como uma mistura de vrios picos sobrepostos e indistintos. Essa sobreposio vai depender das substncias presentes em cada alimento, e as vezes podem ser variveis dentro de um mesmo alimento, quando comparamos amostras distintas. Com a falta de distino das medidas dos picos do espectro fica difcil redizer a composio do alimento a partir de modelos matemticos simples, que indicam quais os comprimentos de onda correspondentes a cada composto molecular.Como no existe um modelo matemtico para descrever a difuso em uma amostra contendo uma distribuio heterognea de substncias qumicas, o NIRS utiliza o artifcio de comparar resultados obtidos por laboratrio com os espectros obtidos por ele.Assim, o NIRS um mtodo secundrio que requer calibrao usando amostras de

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composio conhecidas e determinadas por uma tcnica qumica padro (tcnicas primrias). Para obter uma calibrao de determinado nutriente, como por exemplo, as protenas, necessrio um grande nmero de amostras, isso porque, embora exista uma relao entre carboidratos e protena na populao de referncia, esse relacionamento no representa a populao geral.Ou seja, essa relao pode existir em um determinado alimento, mas, no existir em outro.Mais alm, pode existir em uma amostra de um alimento e no em outra daquele mesmo alimento.Dessa forma as amostras utilizadas para calibrar o equipamento e para desenvolver as equaes devem representar muito bem a populao a ser predita no futuro.Nesse caso, utiliza-se um grande nmero de amostras colhidas em diferentes anos e regies geogrficas distintas, que caracterizem e reflitam as possveis mudanas a serem preditas (alguns autores citam entre 100 e 500 amostras para estabelecer espectros). Depois de calibrado o equipamento para um determinado componente amostral, ele ainda no est pronto para ser utilizado, pois a acurcia de calibrao deve ser testada em um processo denominado validao. Nesse caso, vrias amostras desconhecidas so analisadas pelo NIRS, usando a calibrao a ser testada e pela tcnica de referncia na bancada do laboratrio de anlises qumicas. A diferena entre o valor predito pelo NIRS e o real, obtido pela anlise de referncia, utilizada para calcular o erro-padro de predio, que determina a acurcia da calibrao. A seleo do tratamento matemtico final para representar melhor equao para cada varivel estudada ser baseada no valor mais baixo do erro-padro de calibrao (EPC) e no erro-padro de validao (EPV), combinados com os valores de coeficientes de determinao (R2 ), obtidos nas etapas de validao e calibrao (Saliba et al, 2001). Esquema do funcionamento do NIRS Os diversos modelos disponveis de equipamentos de NIRS diferem em muitos aspectos, entretanto, todos eles apresentam cinco componentes com os quais se pode operar com transmitncia ou reflectncia : 1.Fonte de luz 2.Seletor de comprimento de onda 3.Coletor de amostra 4.Detector para converso da energia radiante em sinal eltrico 5.Processador do sinal (medidor) Esquema bsico de um instrumento de transmitncia e reflectncia (adaptado de Givens et al.1997) A maioria dos sistemas consiste em um largo espectro de luz de tungstnio (utilizado para emisses de 320 a 2500 nm)emitindo discretos comprimentos de onda que so selecionadas por um sistema de filtro e que alcanam um detector de radiao. A deteco da radiao do NIRS ocorre fotoeltricamente.Os ftons incidem diretamente sobre os eltrons do material fotossensitivo do detector, que produz um sinal fotoeltrico. O material fotossensitivo mais utilizado o sulfito de chumbo (1600 a 2600 nm)ou slica para baixos comprimentos de ondas.O sinal do detector amplificado e linearizado. Os sensores de sulfito de chumbo so adequados para medir comprimentos de onda entre 1600 a 2600 nm. Nessa faixa se encontra a maioria dos componentes orgnicos como leos, protena, umidade, celulose, fibra e acares e todos podem ser determinados por essa poro do espectro. Entretanto, os detetores de chumbo apresentam baixa sensibilidade luz de baixa intensidade, no sendo adequados para medir ondas entre 900 a 1100 nm. Os detetores de PbS no conseguem medir a luz que incide sobre gros de espessura razovel.Como a medio de reflectncia feita pela observao do espectro do raio de luz quando refletido da superfcie da amostra, concluiu-se que esses detetores no permitiam estabelecer padres de reflectncia consistentes em gros inteiros devido ao tamanho e forma dos gros.Alm do mais, a superfcie interna do gro no tem a mesma distribuio de componentes de seu interior.Por essa razo, os gros devem ser pulverizados de forma fina e homognea, de modo que a reflectncia ocorra por igual em toda a extenso das amostras (ROSENTHAL, 1986). Entretanto, descobriu-se, em 1979 (Norris e colaboradores)que uma faixa muito baixa do espectro (900 a 1100)permite determinar, por transmitncia, componentes de cereais inteiros, no modos Conhecida como NIT. Para tal tipo de amostra desenvolveu-se instrumentos com um sistema de

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retculas hologrficas com capacidade de varrer todos os comprimentos de ondas. Segundo ROSENTHAL (1986), todos os aparelhos de infravermelho podem ser divididos em duas categorias: Aqueles que usam filtros de estreita faixa de passagem de raios e medem um nmero limitado de comprimentos de ondas. Normalmente so utilizados em mdia 5-15 filtros. Instrumentos com capacidade de varredura dos comprimentos de ondas, que trabalham com redes hologrficas que registram os comprimentos de onda de 2 em 2 nm (em mdia). Ja com modelos disponiveis para registros a cada 0,5 a 0,5 nm Os primeiros so mais populares por serem mais baratos do que os de varredura e servem para determinar componentes em produtos "simples", como umidade em soja, trigo, sorgo etc., mas no se prestam para determinaes em amostras compostas como as raes e para outras variaveis. No caso de amostras com um nmero razovel de ingredientes utiliza-se um NIRS de varredura.O NIRS de varredura possui uma rede hologrfica que pode detectar o espectro de 2 nm a 2nm na faixa de 400 a 1100 (transmitncia) e de 1100 a 2500mn (reflectncia). As respostas so convertidas em logaritmo (usualmente log 10 =1/R), por comparao transmitncia ou reflectncia de uma amostra padro (cermica).Esses resultados so finalmente coletados como valores de log 10 1/R, estocados e processados usando modelos matemticos e estatsticos em programas computacionais especficos. Calibrao do NIRS Como o funcionamento do NIRS envolve modelos matemticos de espectros de amostras conhecidas para predizer amostras desconhecidas, utilizam-se regresses lineares mltiplas e regresses quadrticas. Os dados de log.de 1/R 'de um nmero de amostras podem ser calibrados contra valores obtidos por um mtodo aceito (protena -pelo mtodo Kjeldahl, por exemplo)antes do NIRS ser utilizado para anlise. O procedimento usual de calibrao do NIRS envolve : Seleo de amostras representativas; Anlises de referncia e espectros conhecidos; Pr-tratamento dos dados; Modelos estatsticos; Validao de metodologias O pr-tratamento dos dados visa eliminar modelos no lineares devido interferncia ptica causada por difuso de luz e reflexo especular. O prximo passo derivar um modelo matemtico relacionando os dados espectrais s amostras de referncia (processo denominado quimiometria). Para minimizar interferncias de espectros de muitos constituintes sobrepostos e de variaes de difuso de luz, as medidas de diferentes comprimentos de onda podem ser combinadas. Diversos mtodos multivariveis de calibrao so disponveis, sendo que a maioria deles apresentam-se como regresses multilineares: Y =a +b1X1 +b2X2 +...bkXk. Onde : Y =varivel a ser medida X1, X2...XK =variveis independentes b1, b2...bk =coeficientes de inclinao a =intercepta Na regresso mltipla um grupo de X fixos e valores conhecidos de Y determinam os coeficientes b, que sero utilizados para predizer os Y desconhecidos. Alm das regresses mltiplas, outros modelos matemticos podem ser utilizados para a predio

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de uma varivel.Quando nem todos os comprimentos de onda so necessrios no modelo, podem ser selecionados alguns comprimentosdeondas.Nessecaso, utiliza-se a regresso de Step-up , onde seleciona-se variveis X que tenham apresentado altas correlaes comY.Emseguida, computam-se todas as correlaes restantes. As variveis de alta correlao so fixadas ao modelo, enquanto que as remanescentes so adicionadas at que a equao no apresente mais melhoras efetivas no ajuste.As variveis adicionais quasesempremelhoramoajuste das amostras de calibrao. O modelo de Stepwise semelhante ao Step-up, exceto que os comprimentos de onda no so forados a permanecer no modelo quando selecionados.Quando um novo comprimento de onda adicionado ao modelo, outro removido, combinando todos eles, at que se encontrem os comprimentos de ondas que melhor se ajustem ao modelo.A regresso de Stepwise apresenta menores desvios padro (SD)e erros padro de calibrao (SE)do que o modelo Step-up, porque mais combinaes so avaliadas. Regresso de componentes principais (PCR) O PCR basicamente um procedimento de reduo de dados.Ele utilizado para reduzir dados espectrais (comprimentos de ondas) intercorrelacionados, a uns poucos jogos de variveis independentes chamadas de componentes principais. uma regresso linear mltipla de vrios registros.Desde que os registros (ou pontos)so independentes, no necessrio utilizar o stepwise. Esse procedimento tambm no envolve valores laboratoriais nos clculos. Regresso de parciais mnimos quadrados (PLS) Terceiro mtodo de calibrao utilizado e o primeiro a ser empregado para calibrao do NIRS em 1980. similar ao PCR, mas, envolve valores de mtodos de laboratrio em seus clculos.O PLS melhor que o PCR para predizer valores de laboratrio uma vez que a considerao dos mesmos no clculo fornece informaes relevantes. Outros mtodos utilizados incluem o Artificial Neural network ( ANN) , uma tcnica de calibrao que envolve a resoluo de relacionamentos no lineares nos dados espectrais. Pr-tratamento espectral Os dados espectrais devem ser corrigidos, pois, sofrem inmeras interferncias.As interferncias causadas por propriedades fsicas da amostra, como o tamanho de partcula, podem ser corrigidas no espectro total por frmulas matemticas.Duas correes para tamanho de partculas so mais utilizadas:variao padro normal (SNV) e a correo de difuso multiplicativa (MSC).Se o espectro do NIRS no fosse afetado por tamanho de partcula, coeficiente de difuso e variaes no caminho da onda, as calibraes poderiam ser executadas diretamente dos dados de absorbncia, mas como isso ocorre, os pr-tratamentos espectrais so necessrios. Algumas modificaes locais podem ser separadas do resto do espectro por derivaes. As derivativas podem ser calculadas de vrias formas, mas a mais popular a Segmented gap method incluindo primeira e segunda derivativas. O sucesso da calibrao do NIRS depende: Do relacionamento entre o erro do mtodo de referncia (ou calibrao do NIRS)e a extenso na composio da populao de amostra. Quanto menor for o SE/SD, melhor a acurcia, onde SE:erro-padro do mtodo de calibrao e SD:desvio-padro da populao amostral; Da diversidade relativa na composio e pr-tratamento amostral (ex. secagem e moagem), da calibrao e validao dos jogos de amostra; Da habilidade do aparelho em detectar mudanas espectrais que se relacionem com mudanas na composio medidas convencionalmente, e escolher um modelo que seja adequado s amostras futuras; Do erro amostral, isto , da homogeneidade e apresentao da amostra. Os fatores que contribuem para a preciso dos instrumentos na medio dos constituintes qumicos incluem: A quantidade de informao espectral gerada pelo aparelho; Capacidade matemtica e estatstica dos programas computacionais; Preciso da qumica laboratorial utilizada para calibrar o aparelho; Seleo abrangente de amostras de calibrao.

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Mtodos de referncia para a calibrao do NIRS Vrias tcnicas de laboratrio so utilizadas para calibrar o NIRS. Como o NIRS reflete essas metodologias, obvio que o grau de preciso e de repetibilidade das mesmas vo afetar largamente o grau de preciso do NIRS.As tcnicas escolhidas devem ser avaliadas por um programa de qualidade analtico rigoroso, com quantificao do desvio-padro, coeficiente de variao e repetibilidade mdia do erro de cada metodologia. permitida, segundo o Ministrio da Agricultura, uma repetibilidade mdia do erro de at 10 % para as metodologias mais simples, como protena, fibra, matria seca, extrato etreo e cinzas, entretanto, os planos de controle de qualidade analticos propostos no momento sugerem menores erros analticos, compreendidos entre 2, 5 a 5, 0 %para metodologias de bancada, e menores ainda para metodologias utilizando instrumentos de preciso como a espectrofotogametria de absoro atmica e a cromatografia. Os reagentes e vidrarias devem passar por um rigoroso controle de qualidade, e alm disso, devem ser estabelecidos mapas de controle de contaminao e recuperao de amostras.

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