Freskaleche S.

A Planta de Bucaramanga

Manual de Limpieza, Desinfeccin, Esterilizacin y Preparacin de Medios de Cultivos

Ayleen P. Delgado S.
Est. Bacteriologa y laboratorio clnico Universidad de Santander

Leyla Perea
Jefe de control de calidad Freskaleche S.A Planta de Bucaramanga

2011

NOTA ACLARATORIA Este documento es una publicacin exclusiva de Freskaleche S.A, todos sus derechos estn reservados. Este documento no puede ser citado o utilizado para reproduccin o traduccin, parcialmente o en su totalidad; no puede ser usado con propsitos comerciales. Las opiniones expresadas en este documento son responsabilidad exclusiva de los autores. Freskaleche S.A.

CONTENIDO pg. GLOSARIO INTRODUCCIN CAPTULO I LIMPIEZA 1.0 DEFINICIN 1.1 OBJETIVOS DE LA LIMPIEZA 1.2 LIMPIEZA DEL MATERIAL 1.2.1 Recepcin 1.2.2 Clasificacin 1.2.3 Procedimiento de lavado 1.2.3.1 Lavado del material metlico 1.2.3.2 Lavado del material de polietileno, goma, plstico, ltex y vidrio 1.3 PASOS PARA GARANTIZAR LA EFICIENCIA EN LA LIMPIEZA 1.3.1 Descontaminacin 1.3.2 Lavado del material 1.3.2.1 Lavado manual 1.3.2.2 Materiales para el lavado 1.3.2.3 Insumos para el lavado 1.3.3 Calidad del agua 1.4 SECADO 1.5 VALIDACIN DE LA LIMPIEZA CAPTULO II DESINFECCIN 2.0 DEFINICIN 2.1 NIVELES DE DESINFECCIN 2.2 TCNICA BSICA DE LA DESINFECCIN DE ALTO NIVEL (DAN) 2.2.1 Materiales para el usuario 2.2.2 Materiales para el procedimiento 2.2.3 Procedimiento 2.3 MTODOS DE DESINFECCIN 2.3.1 Fsicos 2.3.2 Qumicos 2.4 FACTORES QUE AFECTAN EL PROCESO DE DESINFECCIN CAPTULO III ESTERILIZACIN 3.0 DEFINICIN 3.1 MTODOS DE ESTERILIZACIN 3.2. CALOR AL ROJO 3.3 ESTERILIZACIN POR CALOR SECO 3.3.1 Tipos de estufas o pupineles 3.3.1.1 Estufa de convencin por gravedad 3.3.1.2 Estufa de convencin mecnica 3.3.2 Indicacin del material a esterilizar por calor seco 3.3.2.1 Carga 3.3.2.2 Tiempo y temperatura de carga 3.3.3 Principios operacionales

8 8 8 8 9 9 10 10 11 12 13 13 13 14 14 15 15 16 17 17 17 17 17 18 19 20 20 21 27 29 29 29 29 30 31 31 31 32 32 32 33

3.3.4 Validacin del proceso de esterilizacin por calor seco 3.3.4.1 Tcnica y material 3.4 ESTERILIZACIN A VAPOR 3.4.1 Tipos de esterilizadores a vapor 3.4.1.1 Olla a presin 3.4.1.2 Autoclaves con eliminacin del aire por desplazamiento de la gravedad 3.4.2 Indicaciones del material a esterilizar por autoclave 3.4.3 Factores que afectan la esterilizacin por autoclave 3.4.4 Validacin del proceso de esterilizacin por calor hmedo 3.4.4.1 Tcnica y material CAPTULO IV PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO 4.0 IMPORTANCIA 4.0.1 Utilizacin y almacenamiento del agua 4.0.2 Pesaje y rehidratacin 4.0.3 Disolucin y dispersin 4.0.4 Medida y ajuste de pH 4.0.5 Vertido 4.1 ESTERILIZACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO 4.1.1 Esterilizacin por calor hmedo 4.1.2 Monitoreo 4.2 ALMACENAMIENTO DE LOS MEDIOS DE CULTIVO EN CAJAS DE PETRI 4.3 INCUBACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO 4.4. ELIMINACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO 4.5 CONTROL DE CALIDAD DEL PRODUCTO TERMINADO 4.5.1 Control de calidad fsico-qumico 4.5.2 Control de calidad microbiolgico 4.6 CRITERIOS MNIMOS PARA ASEGURAR UN CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO REFERENCIAS

33 34 35 35 36 37 39 39 40 40 46 46 46 47 47 48 48 49 49 49 50 51 51 52 52 52 53 56

GLOSARIO

cido peractico: Agente qumico capaz de esterilizar los objetos. Amonios Cuaternarios: Son detergentes catatnicos eficaces contra bacterias vegetativas y algunos hongos, aunque no contra las mycobacterias o esporas. Antisepsia: Proceso que destruye la mayora de los organismos patgenos ubicados sobre superficies animadas. Antisptico: Agente qumico que inhibe el desarrollo de los microorganismos, o los destruye, y que es usado sobre tejido vivos. rea de recepcin y limpieza: Zona donde los elementos reusables (instrumental, equipos, etc.) son recibidos, registrados y sometidos a un proceso de limpieza. rea de esterilizacin: Zona donde se ubican las autoclaves por vapor, estufas de calor seco y todo otro equipo esterilizador. rea de almacenamiento de material esterilizado: Zona donde los materiales ya esterilizados son estacionados previamente a su distribucin. Bactericida: Mtodo o agente qumico capaz de matar o destruir bacterias. Bacteriosttico: Mtodo o agente qumico capaz de inhibir el crecimiento bacteriano, pero no necesariamente de matarlas. Biocarga: Es el nmero y tipo de microorganismos viables presentes en un elemento determinado. Bioenzim: Detergente Enzimtico Desincrustante es un detergente neutro concentrado, que ha sido formulado para el lavado en profundidad de material e instrumental mdico quirrgico, equipos de endoscopa, material de laboratorio y en general todo el material hospitalario crtico y menos crtico, previo a la etapa de desinfeccin de alto nivel o esterilizacin. Biofilmes: Pelculas de bacterias o de otros organismos microbianos, que se adhieren a las superficies. Cleanset P-24: Desengrasante bactericida industrial Cloruro de benzalconio: es un desinfectante, bactericida e inhibidor de la actividad viral Contaminado: Se refiere a toda superficie, animada o inanimada, que se sabe aloja microorganismos

Descontaminacin: Es el proceso de remocin de los microorganismos patgenos, de los objetos y equipos, hacindolos a stos seguros para su manipulacin. Desinfeccin: Es el proceso por el cual se mata o se destruye la mayora de los microorganismos patgenos, con la excepcin de las esporas. Desinfeccin de Alto Nivel: Proceso de desinfeccin que mata bacterias vegetativas, bacilos tuberculosos, hongos, virus, pero no necesariamente un alto nmero de esporas bacterianos. Desinfeccin de Nivel Intermedio: Proceso de desinfeccin que mata bacterias vegetativas, la mayora de los hongos, los bacilos tuberculosos, y la mayora de los virus. No mata esporas bacterianas resistentes. Desinfeccin de Bajo Nivel: Proceso que mata la mayora de las bacterias vegetativas, algunos hongos, algunos virus, pero no mata Mycobacterias ni esporas bacterianos. Desinfectante de amplio espectro: Desinfectante que tiene actividad contra una amplia variedad de microorganismos. Esporicida: Agente qumico capaz de matar esporas, especialmente esporas bacterianas. Esterilizacin: Proceso por el cual se destruye todo tipo de microorganismos. Esterilizadora de vapor: Esterilizadora que expone los objetos a vapor bajo alta presin. Fenestrada: Adjetivo utilizado para la descripcin de objetos "agujereados". Gas de xido de etileno: Gas txico altamente inflamable capaz de esterilizar un objeto. Glutaraldehdo: Agente qumico capaz de esterilizar objetos. Inocuidad: Es la condicin de los alimentos que garantiza que no causaran dao al consumidor cuando se preparen y /o consuman de acuerdo con el uso al que se destinan. Limpieza: Proceso que elimina la suciedad orgnica e inorgnica, o cualquier otro material extrao. Verificador de control de esterilizacin: Mtodo que determina si un proceso ha sido completado; no indica si los objetos sometidos a este mtodo estn estriles.

INTRODUCCIN

La limpieza, desinfeccin, esterilizacin y preparacin de medios de cultivos son procesos de rutina en los laboratorios, siendo parte fundamental para evitar la contaminacin de medios, cultivos, materiales, etc. Las fallas en estos procedimientos aumentan la probabilidad de contaminacin tanto de la muestras objeto de anlisis como de los medios de cultivos preparados. Dada la importancia que posee la calidad y confiabilidad de los resultados en un laboratorio de microbiologa de alimentos, es necesario estandarizar estos procesos, garantizando as los resultados emitidos. La estandarizacin y validacin de los procedimientos anteriormente mencionados depende de un conjunto de variables como: los diferentes agentes qumicos empleados segn las reas y la capacitacin del personal, entre otros. Un primer paso en la mejora de estos procesos, es la elaboracin de normas que sirvan de gua para el desarrollo de este cambio, as como la adecuada preparacin y formacin del personal responsable. Este manual se realiza con la finalidad de ofrecer los lineamientos, recomendaciones y fundamentos basados en las normas vigentes, necesarias para cumplir con la tarea de cambio, y dirigido a todas las personas que se encuentran implicadas.

CAPITULO I LIMPIEZA

1.0 DEFINICIN

Es la remocin mecnica de toda materia extraa en el ambiente, en superficies y objetos utilizando para ello el lavado manual o mecnico. Normalmente se usa agua y detergente para este proceso. El propsito de la limpieza es disminuir el nmero de microorganismos a travs de arrastre mecnico y no asegura la destruccin de stos. (1) A continuacin se establecen las recomendaciones para la limpieza profunda del material con acumulacin de suciedad, materia orgnica y otros residuos.

1.1 OBJETIVOS DE LA LIMPIEZA

Eliminar la suciedad y todo el polvo visible del material. Disminuir la carga microbiana de los mismos para hacer segura su manipulacin. Evitar las incrustaciones en el material como restos de cinta, algodn y residuos de agar. Asegurar las condiciones de limpieza para el proceso de esterilizacin. Garantizar el re-uso de artculos no crticos que son sometidos apenas a la limpieza.

1.2 LIMPIEZA DEL MATERIAL

Los siguientes son los pasos que se deben seguir para la limpieza del material contaminado en el laboratorio:

a. Recepcin

b. Clasificacin

c. Procedimiento del lavado

Figura 1. Diagrama general del procedimiento de lavado. 1.2.1 Recepcin La recepcin se realiza en la zona sucia o zona roja a travs de una puerta con su ventana de paso, por la que la persona encargada de esta actividad recibir los materiales e instrumentales, que sern verificados en nmero, estado, procedencia y anotados en el registro respectivo.

Figura 2. rea de recepcin del material para lavado.

1.2.2 Clasificacin

La clasificacin se realiza segn el tipo de material, ste ser clasificado de acuerdo al tipo en: Metlico: tijeras, asas, cucharas, pinzas, cuchillos. Plstico: botellas, tarros para esterilizar, puntas azules y amarillas. Vidrio: cajas de petri, pipetas, frascos Scot de 100, 250, 500 y 1000 ml, erlenmeyers 1000 y 250 ml, vasos de precipitado.

CLASIFICACIN DEL MATERIAL PARA LAVADO

Metlico

Plstico:

Vidrio

Cubetas, tijeras, asas, cucharas, pinzas, cuchillos,

botellas, tarros para esterilizar, puntas azules y amarillas.

Cajas de petri, pipetas, frascos scot, erlenmeyers, vasos de precipitado.

Figura 3. Diagrama de clasificacin del material para lavado.

1.2.3 Procedimiento del lavado del material clasificado

Para este paso es necesario tener en cuenta el material a lavar:

1.2.3.1

Lavado del material metlico

Metal - material inoxidable (tijeras, asas, cucharas, cuchillos, pinzas etc.) 1. Retirar toda la cinta antes de colocar la cubeta en la poza si el lavado es manual. 2. Enjuagar con abundante agua eliminando todo residuo de la solucin de detergente. 3. Realizar un ltimo enjuague. 4. Secar los materiales con un pao limpio. (pinzas, tijeras, etc.) 5. Revisar minuciosamente el instrumental de todo equipo que se decepcione de acuerdo a la descripcin. (verificando el nmero de piezas y estado). 6. Ir abriendo las pinzas e instrumental en bandejas fenestradas o en recipiente de plstico fenestrado. 7. Al trmino, colocar la bandeja en la poza de lavado dentro de un recipiente o lavatorio que contenga el detergente enzimtico para su descontaminacin durante 5-10 minutos. 8. Despus de los 5 minutos llevar la bandeja fenestrada al chorro de agua para eliminar el mximo de residuo orgnico y proceder al lavado

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manual escobillando las cremalleras y los espacios internos de las pinzas. 9. Una vez terminado el periodo de lavado manual, todos los materiales irn a la mesa de pre-secado y escurrido, luego ellos se pasarn por la ventana de paso para su preparacin, mantenimiento y empaque.

1.2.3.2

Lavado de material plstico y vidrio:

Retirar restos adheridos a las superficies si los hubiera (residuo de cinta). Sumergir en detergente enzimtico. Dejar remojando durante 10 a 15 minutos. Retirar y enjuagar con abundante agua y si es posible utilizar corrientes a presin de agua. 5. Realizar ltimo enjuague con agua. 6. Colocar a escurrir y pre-secar al medio ambiente y luego si es posible utilizar fluido de aire comprimido.

1. 2. 3. 4.

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PROCEDIMIENTO DEL LAVADO DE MATERIAL Material metlico. Retirar toda la cinta antes de colocar la cubeta Enjuagar con abundante agua eliminando todo residuo de la solucin de detergente. Realizar un ltimo enjuague. Secar los materiales con un pao limpio. (pinzas, tijeras, etc.) Revisar el instrumental (Verificando el nmero de piezas y estado). Colocar la bandeja en la poza de lavado dentro de un recipiente que contenga el detergente enzimtico para su descontaminacin durante 5-10 minutos. Llevar la bandeja fenestrada al chorro de agua para eliminar el mximo de residuo Proceder al lavado escobillando las cremalleras y los espacios internos de las pinzas. Terminado el periodo de lavado, todos los materiales irn a la mesa de pre-secado y escurrido, luego se pasarn por la ventana de paso para su preparacin, mantenimiento y empaque. Material de plstico y vidrio. Retirar restos adheridos a las superficies. Sumergir en detergente enzimtico. Dejar remojando durante 10 a 15 minutos. Retirar y enjuagar con abundante agua Realizar un ltimo enjuague con agua. Colocar a escurrir y pre-secar al medio ambiente

Figura 4. Diagrama de procedimiento de lavado del material clasificado.

1.3 PASOS PARA GARANTIZAR LA EFICACIA EN LA LIMPIEZA Los pasos para garantizar la eficacia en la limpieza de material son: La descontaminacin. Lavado de material. Calidad del agua.

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1.3.1 Descontaminacin Es un proceso fsico o qumico, que sirve para reducir el nmero de microorganismos de un objeto inanimado dejndolos seguros para su manipulacin. El trmino se aplica a artculos contaminados durante el procesamiento de las muestras o a residuos orgnicos (2). Al utilizar el remojo en solucin de detergente enzimtico como el cleanset p-24 y el bioenzim, detergente enzimtico desincrustante utilizados en Freskaleche , por 5 minutos en un recipiente de plstico, antes de iniciar la limpieza manual o automtica se estara realizando la descontaminacin, el remojo se debe llevar a cabo en una bandeja o recipiente fenestrado (coladera), luego se pasar el material por el chorro de agua logrando as la liberacin y disminucin de la carga microbiana o materia orgnica, para que el operador pueda continuar el proceso de lavado.

1.3.2 Lavado del material

En cuanto al lavado existen tres tipos manual, mecnico y mixto, pero para nuestro laboratorio solo aplica el lavado manual, porque no hay maquinas que realicen este trabajo.

1.3.2.1

Lavado manual

Es un procedimiento realizado de manera directa para la remocin de la suciedad, por friccin aplicada sobre la superficie del material, utilizando una solucin detergente, cepillo y agua. Es bastante usual y por ello hay que tener en cuenta, la prevencin del riesgo ocupacional y los accidentes cortopunzantes, mediante la proteccin individual de operario, con el uso de mandil impermeable, lentes, guantes y mascarilla; los lavaderos o pocetas de lavado debern cumplir con especificaciones tcnicas tales como: profundidad (40 a 50 cm.), los caos o piletas deben tener forma recta y horizontal como se observa en la figura 5 (3).

Figura 5. rea de lavado para el material.

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1.3.2.2

Materiales para el lavado

Equipo de proteccin personal, (mascarilla, lentes, delantal impermeable y guantes). Cepillo y escobillas de cerdas de diferentes tamaos. Recipiente con detergente enzimtico. Recipientes fenestrados (coladeras) de diferentes tamaos.

Figura 6. Materiales para el lavado en el laboratorio.

1.3.2.3

Insumos para el lavado

Los detergentes son compuestos que permiten variar la tensin superficial del agua y son los causantes de la humectacin, penetracin, emulsin y suspensin de la suciedad. Su estructura est compuesta por dos partes: una hidrfila (afinidad con el agua) y otra lipoflica (afinidad con aceites), lo que permite formar puentes de agua y aceite, ayudando a remover la suciedad. (4)

Figura 7. Detergente enzimtico Cleanset P-24 y Bioenzim. 1.3.3 Calidad de agua

En muchos lugares, el agua contiene minerales disueltos, calcio por ejemplo. Si ste es el caso, se dice que es agua dura. Al hervir este tipo de agua, los minerales se depositaran en el interior del recipiente del esterilizador y sobre el
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elemento calefactor, formando una capa. Esta capa est compuesta de un tipo de piedra caliza que no es un buen conductor del calor, reduciendo as la eficacia de la autoclave, por que necesitar producir ms calor y as se consumir ms energa o gas. Tambin se acumulan depsitos minerales sobre las vlvulas, que pueden dejar de funcionar a consecuencia de ello. Lo ideal es usar agua destilada o agua desmineralizada en las autoclaves. Tambin puede ser utilizada el agua preparada mediante el proceso denominado osmosis inversa que es proceso a alta presin en donde se forza el paso del agua por medio de la estructura molecular de una membrana llamada de osmosis inversa. La membrana separa los minerales y agentes contaminantes, incluyendo las sales, los virus, pesticidas y otros materiales, pero permite el paso de las molculas de agua. Esta agua no contiene minerales disueltos. El agua que no contiene minerales o slo una pequea cantidad de ellos, se llama agua blanda. El agua blanda y en especial, el agua desmineralizada o destilada, no causar depsitos de calcio (5).

1.4 SECADO

El secado del material, instrumental y otros artculos es parte fundamental durante el proceso de limpieza, se debe tener en cuenta el grado de humedad de los artculos antecediendo a la esterilizacin, debido a que si no se lleva adecuadamente este paso podra interferir este proceso. El secado puede ser manual o automtico; el secado manual, se realiza en este laboratorio, con un pao o con aire comprimido. Secar bien el equipo a mano con paos suaves de tela muy absorbente o de fibra de celulosa, cuidando de que no queden pelusas o hilachas sobre la superficie e interior de los materiales. En la actualidad se cuenta con cmaras especiales para secado de material tubular y corrugados en un ciclo que puede durar aproximadamente 25 minutos a 2 horas, dependiendo del tipo y la cantidad de materiales a secar. Debe tenerse en cuenta la conexin especfica para diferentes lmenes. En la cmara de secado se pueden colocar materiales de diferentes lmenes teniendo en cuenta que tengan las mismas caractersticas.

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Figura 7. Secado manual del material.

1.5 VALIDACION DE LA LIMPIEZA

La validacin del proceso de limpieza se presenta de modo subjetivo, por no ser posible visualizar el bioburden (definido como el nmero y tipo de microorganismos viables que un artculo puede contener luego de la limpieza), de cada artculo en los procedimientos de limpieza. Por ello es importante adoptar la estandarizacin de protocolos para garantizar la validacin de este proceso (6). En los protocolos debe incluirse la dilucin de los productos de uso, tiempo de inmersin, modo de enjuague y desmonte o desarme de los artculos e instrumentales. Una parte importante para la validacin es la inspeccin visual, despus del procesamiento el operario debe observar atentamente la presencia de cualquier suciedad, particularmente en las cremalleras, para ello consideramos el uso de una lupa. Otro requisito indispensable durante la validacin de la limpieza es la instalacin de sistemas de irrigacin de agua, con lmenes o lavados con dispositivos a presin en la zona sucia, sin ellos no se podra llevar a cabo una buena limpieza.

Figura 8. Inspeccin del material lavado.

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CAPITULO II DESINFECCIN

2.0. DEFINICIN

La desinfeccin es el proceso fsico o qumico por medio del cual se logra eliminar los microorganismos de formas vegetativas en los objetos inanimados, sin que se asegure la eliminacin de esporas bacterianas. En todo artculo semicrtico, que no pueda ser esterilizado deber llevarse a cabo la desinfeccin de acuerdo al criterio de indicacin. (7)

2.1. NIVELES DE DESINFECCIN

Desinfeccin de alto nivel (DAN): Es realizada con agentes qumicos lquidos que eliminan a todos los microorganismos. Como ejemplos: el orthophthaldehdo, el glutaraldehdo, el cido peractico, el dixido de cloro, el perxido de hidrgeno y el formaldehdo, entre otros. Desinfeccin de nivel intermedio (DNI): Se realiza utilizando agentes qumicos que eliminan bacterias vegetativas y algunas esporas bacterianas. Aqu se incluyen el grupo de los fenoles, el hipoclorito de sodio, la cetrimida y el cloruro de benzalconio. Desinfeccin de bajo nivel (DBN): Es realizado por agentes qumicos que eliminan bacterias vegetativas, hongos y algunos virus en un perodo de tiempo corto (menos de 10 minutos). Como por ejemplo, el grupo de amonios cuaternarios. (8)

2.2 TECNICA BASICA PARA LA DESINFECCION DE ALTO NIVEL (DAN)

2.2.1 Materiales para el usuario Mandil impermeable, mascarilla, lentes protectores y guantes.

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Figura 9. Elementos de bioseguridad. 2.2.2 Materiales para el procedimiento Dos contenedores de la forma y tamao ideal de los artculos (uno con tapa). Agua estril, cantidad necesaria. Solucin Glutaraldehdo al 2%. Paos o gasas estriles Campo o contenedor estril

Figura 10. Materiales de uso en el proceso de desinfeccin.

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2.2.3 Procedimiento Sumergir en detergente enzimtico por 5 minutos (de acuerdo a la recomendacin del fabricante). Aspirar la solucin por todos los lmenes del artculo. Realizar limpieza mecnica o manual, observando cuidadosamente el artculo. Utilizar escobillas apropiadas para la limpieza de los lmenes. Enjuagar con abundante agua. Secar. Sumergir completamente el artculo en la solucin de Glutaraldehdo al 2% durante 20 minutos. (En contenedor con tapa). Aspirar la solucin desinfectante dentro de los lmenes o canales. Enjuagar utilizando agua estril todo el artculo teniendo sumo cuidado para evitar contaminacin. Secar con paos o gasa estriles. Guardar y almacenar el artculo en un protector o contenedor estril.

DESINFECCION DEL MATERIAL

Sumergir en detergente enzimtico por 5 minutos.

Realizar limpieza manual, observando cuidadosamente el artculo

Utilizar escobillas apropiadas para la limpieza de los lmenes.

Enjuagar con abundante agua.

Secar cuidadosamente con un pao seco.

Sumergir completamente el artculo en la solucin de Glutaraldehdo al 2% durante 20 minutos.

Vertir la solucin desinfectante dentro de los lmenes o canales.

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Enjuagar con agua estril todo el artculo con sumo cuidado para evitar contaminacin.

Secar con paos o gasas esteriles

Guardar y almacenar en un protector o contenedor esteril

Figura 11. Procedimiento de desinfeccin del material.

2.3 METODOS DE DESINFECCION La desinfeccin es uno de los procedimientos ms antiguos, fue utilizada en un primer momento para eliminar microorganismos de ambiente e higienizar las manos. Existen dos mtodos de desinfeccin: los fsicos y los qumicos. (9) 2.3.1 Mtodos fsicos Pasteurizacin

Utilizado originalmente por Louis Pasteur. Con este proceso se realiza la DAN y por el cual el agua es llevada a 77 C de temperatura durante aproximadamente 30 minutos. As, destruye todos los microorganismos excepto las esporas bacterianas. (9) Hervido

Este mtodo utiliza el agua hirviendo a temperaturas muy altas para lograr la desinfeccin. Para una DAN, se hierven los instrumentos en un recipiente con tapa de 15 a 20 minutos contabilizando el tiempo desde que el agua rompe el hervor. Los objetos deben estar cubiertos por completo con el agua durante el hervido, y no se debe aadir ningn otro elemento mientras est hirviendo. El fuego debe ser suave, por que el fuego alto hace rebotar los objetos, disminuye el nivel de agua y consume ms gas.

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Se recomienda usar tiempos ms prolongados para lugares de gran altura sobre el nivel del mar. Se seca al aire o con una toalla esterilizada antes de volver a utilizar los materiales o almacenarlos. Este mtodo no se utiliza en el medio hospitalario. (9) Radiacin ultravioleta (UV)

Mecanismo de accin: El principal mecanismo del efecto letal de la luz UV sobre las bacterias, se atribuye a su absorcin por el ADN y el resultante dao de este. As, provocan la formacin de uniones covalentes entre los residuos de pirimidina adyacentes pertenecientes a la misma cadena, lo que provoca la formacin de dmeros de pirimidina de tipo ciclobutano. (9) Exposiciones prolongadas produce alteraciones en la forma del ADN e interfiere en el apareamiento normal de las bases. El resultado final es la inhibicin de la sntesis de ADN y secundario a esto, inhibicin del crecimiento y la respiracin, Adems, provoca queratoconjuntivitis en profesionales expuestos a la radiacin. (9) Aplicaciones: Estas radiaciones pueden producirse artificialmente con lmparas de vapor de mercurio. Son igualmente efectivas para grampositivos y gramnegativos. Su principal uso es para esterilizar el aire y superficies, ya que no penetran en slidos y lo hacen pobremente en lquidos. (9)

2.3.2 Mtodos qumicos Es el ms utilizado en nuestro laboratorio, existen mltiples agentes germicidas en forma lquida. Este mtodo requiere muchos controles en su ejecucin. Por ser un mtodo realizado en su mayora de forma manual, todas las etapas del protocolo recomendado por el fabricante y validado deben seguirse celosamente. Las fallas en el proceso de desinfeccin pueden dar lugar a complicaciones infecciosas. Los principales desinfectantes utilizados en el mbito son: orthophthaldehdo, glutaraldehdo, cloro y compuestos clorinados, formaldehdo, perxido de hidrgeno, cido peractico, fenoles y amonios cuaternarios. (9) Orthophthaldehdo:

Este agente qumico es nuevo y se usa para la desinfeccin de alto nivel (DAN). Corresponde al grupo de aldehdos inorgnicos y contiene benzenocarboxialdehdo de 1,2. (9)

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 Mecanismo de accin: Su accin es por alquilacin de los componentes celulares y acta directamente sobre los cidos nuclicos. Espectro: Los estudios han demostrado su excelente actividad microbicida y una mayor actividad frente a mycobacterias que el glutaraldehdo. Es micobactericida y virucida. Ventajas y desventajas: La principal ventaja es que posee una excelente estabilidad en un amplio rango de pH (3-9) y por lo tanto no requiere de activacin. o Presenta adems una excelente compatibilidad con cualquier material o artculo y cuenta con indicadores qumicos. No es carcinognico, pero se recomienda utilizarse en reas ventiladas ya que todava no se ha determinado si puede producir irritacin en los ojos y orificios nasales. Por ahora, el alto costo parece ser la desventaja principal para su uso. Indicaciones de uso: El tiempo que se requiere para la DAN, vara segn los siguientes estndares y fabricantes: o o o o Estndar americano (FDA) (10 a 12 minutos a 20 C.) Estndar en Canad (10 min.) Estndar en Europa (5 min.) En nuestro medio se recomienda utilizarlo 10 a 12 minutos.

Concentraciones de uso: Est indicado en una concentracin del 0.55%. La solucin tiene una duracin de 14 das de reso, y dos aos de vida til. Glutaraldehdo:

Es un compuesto del aldehdo y se presenta en soluciones acuosas, cidas y alcalinas. Las soluciones cidas no son esporicidas, pero utilizando un agente alcalinizante como activador este producto se torna esporicida. Tiene pH alcalino, una vez activado, sufre una drstica disminucin de la activacin a partir de los 14 das. Existen formulaciones que permiten producir una mayor vida til por 28 das. (9) Mecanismo de accin: Su accin es consecuencia de la alquilacin de componentes celulares alterando la sntesis proteica de los cidos ADN y ARN. Espectro: Es esporicida. bactericida, fungicida, virucida, micobactericida y

Ventajas y desventajas: No es corrosivo. Para DAN (45 minutos) a temperatura ambiente tiene actividad germicida en presencia de materia

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orgnica. La gran desventaja del glutaraldehdo es su toxicidad, ya que una vez activado suelen producir vapores irritantes para las mucosas, el sistema respiratorio y la piel. Por ello, debe utilizarse en ambientes muy ventilados y con equipos de proteccin personal. Actualmente existen cabinas para DAN que protegen al operador. Indicaciones de uso: Est indicado para la DAN cuando la esterilizacin no es posible. Tambin en el uso de artculos o materiales de metal como son las esptulas. Concentraciones de uso: En nuestro medio contamos con una solucin al 2%. Se requiere de 45 minutos para hacer DAN a una temperatura de 20C. Existen otras formulaciones de Glutaraldehdo en concentraciones que varan entre 2.4% a 3.4%. En Europa existen concentraciones de 1.5% con tiempos mayores de inmersin. El valor lmite del umbral (VLU/ valor de exposicin) del glutaraldehdo es de 0.02 ppm. a 0.05 ppm., en 8 horas de trabajo. Cloro y Compuestos Clorados:

Los desinfectantes basados en el cloro generalmente estn disponibles en forma lquida como hipoclorito de sodio (leja), o slida como hipoclorito de calcio (dicloroisocianurato de sodio). (9) Mecanismo de accin: Su accin produce inhibicin de las reacciones enzimticas, desnaturalizacin de las protenas e inactivacin de los cidos nuclicos. Espectro: Virucida, fungicida, bactericida (micobactericida). Ventajas y desventajas: Su accin es rpida, de bajo costo y de fcil manejo. Tiene propiedades desodorizantes y actividad microbicida atribuible al cido hipocloroso no disociado. La disociacin de este cido, y por consiguiente la menor actividad, depende del pH, su eficiencia disminuye por el aumento del pH. Tiene actividad corrosiva, se inactiva en presencia de materia orgnica, produce irritacin de las mucosas, se polimeriza por los rayos de sol y necesita estar protegida en envases opacos. o Las soluciones de cloro no deben conservarse en envases destapados por ms de 12 horas debido a la evaporacin del producto activo, haciendo que las concentraciones de cloro disponible disminuyan de 40% a 50%. Concentraciones de uso: La concentracin mnima para eliminar las mycobacterias es de 1000 ppm (0.1%) durante 10 minutos. No deben

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sumergirse objetos por ms de 30 minutos debido a su actividad corrosiva. o Se recomienda adems, el enjuague abundante para evitar irritacin qumica debido a los posibles residuos. o Es importante sealar que existen muchos factores que afectan la estabilidad del cloro, tales como la presencia de iones pesados, pH de la solucin, temperatura de la solucin, presencia de biofilmes, presencia de materias orgnicas y radiacin ultravioleta. Frmula para preparar una solucin de hipoclorito: CC = Litros de agua x ppm / Concentracin de compra Donde: CC: centmetros cbicos de hipoclorito de sodio a agregar a la preparacin Litros de agua: cantidad de solucin final a preparar. Ppm: partes por milln (concentracin final a preparar). Concentracin de compra: Casera 5.25%. Concentrada 10%. Piscinas 12% Concentraciones de uso en el mbito del laboratorio: 10.000 ppm = 1% = Concentracin para desinfeccin de derrames, previa limpieza. 5.000 ppm = 0.5% = Desinfeccin de materiales, previa limpieza. 1.000 ppm = 0.1% = Desinfeccin de reas crticas, previa limpieza. 100 a 500 ppm = 0.01 a 0.05% = Desinfeccin de reas no crticas.

Formaldehido:

El formaldehido es una solucin acuosa con olor penetrante que se polimeriza, formando un depsito blanco dentro de los recipientes, cuando se encuentra a altas concentraciones, y sobre los artculos tras una inmersin prolongada (incluso en concentraciones ms bajas como la formalina del 37% al 40 %).(9) Mecanismo de accin: Produce inactivacin de microorganismos por alquilacin del grupo amino y sulfhidrilo de protenas y del anillo nitrogenado de bases pricas lo que hace alterar la sntesis de los cidos nuclicos. Espectro: Bactericida (micobactericida), fungicida, virucida y esporicida.

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 Desventajas: Presenta olor desagradable, adems de irritar las mucosas. Se considera potencialmente carcinognico. Al utilizarse deben tomarse las precauciones de exposicin ocupacional. Indicaciones: Su uso est limitado a filtros y conservacin de piezas de anatoma patolgica. Debido a su efecto txico e irritante, desde 1996 la formalina bajo cualquier presentacin, est excluida de la lista de desinfectantes en los Estados Unidos de Norteamrica.

Perxido de hidrgeno:

El Perxido de Hidrgeno es un agente oxidante utilizado para DAN. (9) Mecanismo de accin: Su accin antimicrobiana se ejerce por la produccin de radicales libres hidroxilos que daan las membranas lipdicas, el DNA y otros componentes celulares. Espectro: Bactericida (micobactericida), fungicida, virucida y esporicida en concentraciones del 6% al 7%. Ventajas y desventajas: No daa lentes ni artculos de plstico. Es oxidante para artculos metlicos. Presenta toxicidad ocular y tambin puede producir colitis pseudomembranosa por mal enjuague en la DAN. Indicaciones de uso: Est indicado en el uso de DAN por su compatibilidad con este material. Concentraciones de uso: Su presentacin vara entre 3% a 7.5%. Para realizar la desinfeccin de alto nivel la indicacin es de 6% a 7.5% durante 30 minutos. La solucin puede reutilizarse durante 21 das.

cido Peractico:

Tambin denominado cido peroxiactico es un agente oxidante que acta de manera similar al perxido de hidrgeno. (9) Mecanismo de accin: Acta por desnaturalizacin de las protenas alterando la permeabilidad de la pared celular. Espectro: Bactericida, fungicida, virucida y esporicida.

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 Ventajas y desventajas: La mayor ventaja de este elemento es que no produce residuos txicos y tampoco necesita activacin. Puede corroer cobre, bronce o hierro galvanizado. Esta corrosin puede ser controlada con aditivos del pH. o Produce toxicidad ocular e irritacin de las mucosas. Indicaciones de uso: Existen formulaciones asociadas con el perxido de hidrgeno que son indicadas para el reprocesamiento de material. Concentraciones de uso: En concentraciones bajas de 0.1% a 0.2% en un tiempo entre 10 a 15 minutos, tiene rpida accin contra microorganismos (incluyendo las esporas). La solucin tiene una duracin de 14 das. Fenlicos:

Los derivados fenlicos comnmente encontrados como principio activo de las formulaciones son: el ortho-fenil-fenol y el ortho-benzil-para-clorofenol. Los compuestos fenlicos son producidos a travs de la sustitucin de uno o dos tomos de hidrgeno aromtico de fenol con un grupo funcional (alquil, fenil, benzil, halgeno). (9) Mecanismo de accin: En altas concentraciones rompen la pared celular penetrando la clula y precipitando protenas citoplasmticas. En bajas concentraciones, causan la muerte de microorganismos por inactivacin de las enzimas de la pared celular. Espectro: Bactericida (micobactericida), fungicida y virucida. Tiene poca accin en los virus pequeos como echovirus, poliovirus, coxsackievirus. Los fenlicos se inactivan ante la presencia de materias orgnicas. Desventajas: Los fenlicos pueden ser absorbidos por los materiales porosos, tales como el plstico, dejando residuos que producen irritacin en las mucosas de quien los maneja. Indicaciones de uso: Los derivados fenlicos estn indicados principalmente en la desinfeccin de artculos no crticos y en superficies lisas. Su uso no es indicado en artculos semicrticos debido a la ausencia de datos sobre su eficacia germicida. Asimismo, su utilizacin est contraindicada en la limpieza de incubadoras y otras superficies. o Hoy en da y debido a su baja eficacia y a los riesgos descritos, prcticamente no tiene indicaciones de uso en el medio de laboratorios. Concentraciones de uso: Las concentraciones varan segn la presentacin del producto.

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Amonios cuaternarios:

Los compuestos ms usados son cloruro de alquil- dimetil-benzil-amonio, cloruro de alquil-didecildimetil-amonio, y el cloruro de dialquil- dimetil-amonio. (9) Mecanismo de accin: Su accin se debe a la inactivacin de enzimas productoras de energa, a la desnaturalizacin de las protenas celulares y a la ruptura de la membrana celular. Espectro: Fungicida, bactericida y virucida slo contra los virus lipoflicos. No es esporicida, ni micobactericida, ni tampoco presenta accin sobre los virus hidroflicos. Ventajas y desventajas: Constituye un buen agente para la limpieza debido a su baja toxicidad. Los restos de gasa y algodn pueden afectar su accin. Indicaciones de uso: Por su baja toxicidad puede ser utilizado para la desinfeccin de superficies y mobiliario. Concentraciones de uso: Las concentraciones de uso varan de acuerdo con la combinacin de compuestos de amonio cuaternarios en cada formulacin comercial.

2.4 FACTORES QUE AFECTAN EL PROCESO DE DESINFECCION 1. Cantidad y ubicacin de los microorganismos. Cuanto mayor es la biocarga, mayor es el tiempo que un desinfectante necesita para actuar. Por ello, es fundamental realizar una escrupulosa limpieza de las superficies de los instrumentos, ms an, cuando estos tienen componentes mltiples y deben ser desarmados y limpiados pieza por pieza. 2. Resistencia de los microorganismos al agente qumico. Se refiere principalmente al espectro de accin que tiene el mtodo o agente utilizado. 3. Concentracin de los agentes. Se relaciona con la potencia de accin de cada uno de los agentes para que produzcan la accin esperada. Las concentraciones varan con respecto a los agentes desinfectantes y en algunos casos pueden relacionarse con un efecto deletreo sobre el material (corrosin).

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4. Factores fsicos y qumicos. Algunos desinfectantes tienen especificadas la temperatura ambiente a la que deben ser utilizados para su efectividad. El pH favorece la actividad de los desinfectantes. 5. Materias orgnicas. La presencia de materias orgnicas como suero, sangre, pus, materia fecal u otras sustancias orgnicas, pueden inactivar la accin de algunos desinfectantes comprometiendo su efectividad. 6. Duracin de la exposicin. Cada mtodo de desinfeccin y cada agente tiene un tiempo especfico necesario para lograr el nivel deseado. 7. Presencia de materiales extracelulares o biofilmes. Muchos microorganismos producen masas gruesas de clulas y materiales extracelulares o biofilmes que generan una barrera contra el proceso de desinfeccin. Por tal razn, los desinfectantes debern saturar antes a los biofilmes, para poder eliminar a los microorganismos all presentes.

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CAPITULO III ESTERILIZACIN

3.0 DEFINICIN

La esterilizacin es el proceso de eliminacin de toda forma de vida, incluidas las esporas. Es un trmino absoluto que implica prdida de la viabilidad o eliminacin de todos los microorganismos contenidos en un objeto o sustancia, acondicionado de tal modo que impida su posterior contaminacin. Se trata de un trmino probabilstico, de modo que tras un adecuado proceso de esterilizacin, se debe llegar a una probabilidad de encontrar microorganismos igual o menor que una unidad contaminada en un milln de unidades sometidas a un proceso de esterilizacin. (11) Existen varios mtodos de esterilizacin, detallados a continuacin.

3.1 METODOS DE ESTERILIZACIN Los mtodos utilizados corrientemente en los laboratorios microbiolgicos son: Calor al rojo (flameado). Calor seco (aire caliente). Vapor a presin (esterilizacin en autoclave). NOTA: En Este Manual nos enfocaremos solo en los mtodos utilizados en el laboratorio de microbiologa de Freskaleche S.A Planta De Bucaramanga. La incineracin es tambin un mtodo de esterilizacin, pero se aplica fuera del laboratorio para la eliminacin final de los desechos producidos en l y se considera por separado. (11)

3.2 CALOR AL ROJO (FLAMEADO) Los instrumentos tales como las asas y alambres de siembra y varillas secas se esterilizan calentndolas en la llama de un mechero bunsen hasta que se ponen al rojo. Los microincineradores se recomiendan para esterilizar asas de inoculacin contaminadas con material muy infeccioso para evitar el riesgo de chisporrotear partculas contaminadas sobre las zonas de alrededor. (11)

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Figura 12. Esterilizacin del asa bacteriolgica.

3.3 ESTERILIZACIN POR CALOR SECO La esterilizacin por calor seco produce desecacin o deshidratacin de la clula eliminando el contenido del agua, produciendo niveles elevados de electrolitos, fusin de membranas. Estos efectos se deben a la transferencia de calor desde los materiales a los microorganismos que estn en contacto con stos. La accin destructiva del calor sobre protenas y lpidos requiere mayor temperatura cuando el material est seco o la actividad de agua del medio es baja. Se aplica en un horno calentado elctricamente que se controla mediante termostatos y que est provisto de un gran ventilador circulante que asegura la uniformidad de la temperatura en todas las partes del contenido. Los equipos modernos disponen de controles electrnicos que pueden llevar la temperatura al nivel requerido, mantenerla en ese punto durante un tiempo establecido previamente y desconectar seguidamente la corriente. En algunos modelos se incorpora una cerradura solenoide para impedir que la estufa sea abierta antes de que se complete el ciclo. Este dispositivo salvaguarda y protege al personal de quemaduras accidentales. El material que puede esterilizarse por este mtodo incluye placas de petri, matraces y pipetas de vidrio y objetos de metal. Pueden adquiriese de diversos proveedores cajas y cilindros metlicos que almacenan convenientemente el material de vidrio durante la esterilizacin y lo conservan estril hasta su utilizacin. (11) NOTA: Todo material resistente al calor e incompatible con la humedad debe ser esterilizado por calor seco.

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3.3.1 Tipos de estufas o pupineles Existen dos tipos de estufas, que comnmente se utilizan: Estufa de conveccin por gravedad. Estufa de conveccin mecnica (circulacin de aire forzado). Estufa de conveccin por gravedad

3.3.1.1

Est compuesta por una cmara revestida de resistencia elctrica en su pared interior, posee un canal u orificio de drenaje de aire en la pared superior, la circulacin depende de las corrientes producidas por la subida de la temperatura y el choque con las diferencias de temperaturas, por ello su proceso es ms lento y menos uniforme. (11)

Figura 13. Estufa de convencin de gravedad. 3.3.1.2 Estufa de conveccin mecnica

Este equipo posee un dispositivo que produce un rpido movimiento de volumen grande de aire caliente, facilitando la transmisin del calor directamente a la carga o paquete, se utiliza menos tiempo y tiene un equilibrio trmico. (11)

Figura 14. Estufa de convencin mecnica disponible en el laboratorio.

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3.3.2 Indicaciones del material a esterilizar por calor seco La recomendacin para la esterilizacin de ciertos materiales deriva de su facilidad de penetracin en slidos, lquidos no acuosos y cavidades cerradas. Su comportamiento con el metal es menos corrosivo pero ms oxidante. Por otra parte, no erosiona el vidrio como lo hace el vapor. (11) 3.3.2.1 Carga El aire no es un buen conductor del calor, por lo que las estufas deben cargarse sin apretar el contenido, de forma que queden abundantes espacios para permitir que circule el aire caliente. (11) 3.3.2.2 Tiempos y temperaturas de carga Cuando se calculan los tiempos de funcionamiento para el equipo de esterilizacin por aire caliente, deben considerarse tres perodos: El perodo de ascenso de la temperatura, que es el tiempo necesario para que toda la carga alcance la temperatura de esterilizacin; puede llevar alrededor de 1 hora. (11) Los perodos de mantenimiento a las diferentes temperaturas de esterilizacin recomendadas por el Medical Rescarch Councill que son 160C durante 45 minutos, 170C durante 18 minutos, 180C durante 7 1/2 minutos y 190C durante 1 1/2 minutos. El perodo de enfriamiento, que se realiza gradualmente para prevenir la rotura del material de vidrio como consecuencia de un descenso demasiado rpido de la temperatura. Este perodo puede llevar 2 horas. (11) Los siguientes instrumentos, materiales y sustancias pueden esterilizarse en calor seco: Instrumentos cortantes y de acero inoxidable (tijeras, pinzas) Agujas, jeringas de cristal, tubos, pipetas de vidrio, Polvos estables al calor Lquidos y sustancias liposolubles e hidrfugas tales como aceites, silicona, parafina, vaselina, cremas y polvos de talco.

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Figura 15. Relacin Tiempo Temperatura para esterilizacin Es importante sealar que el tiempo de exposicin debe ser contabilizado despus que se ha alcanzado la temperatura requerida y no desde la carga del esterilizador porque puede requerirse un tiempo prolongado para alcanzar la temperatura de esterilizacin. (11)

3.3.3 Principios operacionales A fin de evitar que ocurran fallas en el proceso de esterilizacin por calor seco es importante tener en cuenta los siguientes factores: 1. Validacin del equipo y calibracin de los instrumentos, solicitado al fabricante en una carta indicando el punto ms fro durante las variaciones de temperatura dentro de la cmara del esterilizador. 2. Una esterilizacin ser eficiente cuando el punto ms fro registre 170 C en exposicin por dos horas, adems de utilizar Indicadores biolgicos. 3. Seleccin del material desde el punto de vista de conductibilidad trmica. No esterilizar ni utilizar textiles, ni papel. 4. Distribucin de la carga, con espacio suficiente cada paquete para una buena circulacin ideal, adems de observar que los paquetes no toquen las paredes. 5. Utilizar empaques adecuados como por ejemplo cajas metlicas, papel aluminio y frascos de vidrio refractario. (11) 3.3.4 Validacin del proceso de esterilizacin por calor seco NOTA: Asegurar que la esterilizacin por calor seco sea adecuada, segura y efectiva.
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El proceso de validacin por medio del cual se muestra con evidencia la esterilizacin por este mtodo, garantiza que ello se realice siempre de una misma forma y con calidad. La finalidad es garantizar que se cumplan los parmetros preestablecidos para esterilizar por medio del calor seco. 3.3.4.1 Tcnica y material Calidad del equipo: instalaciones elctricas (voltaje), estructura, dimensin, ventilacin. Calidad de operacin: manual de operacin, instrucciones de mantenimiento, relacin de repuestos ms comunes, servicio tcnico. Calidad del desempeo: parmetros fsicos, tipos de empaques, tipos de carga. Registros de cargas: tipos de materiales, cantidad, volumen, disposicin de materiales y capacidad. Indicadores qumicos. (11) ESTERILIZACIN POR CALOR SECO Instrumentos cortantes, de acero inoxidable y vidrio cajas de petri, pipetas de vidrio, erlenmeyers, tijeras, cuchillos. Colocar los indicadores qumicos al material a esterilizar. Deben cargarse sin apretar el contenido, de forma que queden abundantes espacios para permitir que circule el aire caliente. Contabilizar el tiempo de esterilizacion de 2 horas, luego de alcanzar la temperatura requerida . La temperatura de esterilizacin por calor seco debe permanecer entre 160C - 170C Trascurrida las 2 horas requeridas, se procede al el perodo de enfriamiento. Se realiza gradualmente para prevenir la rotura del material de vidrio. Retirar del horno y almacenar. Figura 16. Proceso de esterilizacin por calor seco.

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3.4 ESTERILIZACIN A VAPOR. NOTA: Todo material resistente al calor, compatible con humedad debe ser auto clavado. La esterilizacin a vapor es el procedimiento de esterilizacin ms comn y es el mtodo de preferencia excepto para los materiales que no pueden resistir el calor y la humedad creada por el proceso. El equipo a utilizarse se denomina autoclave, esterilizadores de pre vaco y autoclaves instantneas. El mecanismo de accin del calor hmedo es por desnaturalizacin de las protenas. La autoclave tiene la ventaja de producir un elevamiento de temperatura en forma rpida, con cortos tiempos de esterilizacin y no dejar residuos txicos en el material. (11) La eficiencia del vapor como agente esterilizante depende de: El contenido en humedad El contenido en calor La penetracin La Mezcla de vapor y aire u otras impurezas que pudiera contener.

Una buena esterilizacin por autoclave depende de la eliminacin de todo el aire de la cmara y de la carga, y los materiales que van a esterilizarse deben colocarse sin apretar. Los artculos limpios pueden ponerse en cestillos de alambre, pero el material contaminado (cultivos desechados) debe estar en recipientes de fondo slido en una altura no mayor de 8 cm. Deben dejarse grandes espacios de aire alrededor de cada recipiente y ninguno debe estar cerrado. (11)

3.4.1 Tipos de esterilizadores a vapor: nicamente deben usarse autoclaves diseados para trabajo de laboratorio y que puedan recibir carga mixta. Las autoclaves de carga porosa y los esterilizadores de lquidos embotellados son raramente satisfactorios para el trabajo de laboratorio. (11) Existen dos variedades de autoclave de laboratorio: El tipo de olla a presin. Los modelos de desplazamiento de la gravedad con descarga automtica de aire y vapor condensado.

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3.4.1.1 Olla a presin Se utilizan todava en muchas partes del mundo. El tipo ms comn es un aparato para agua hirviendo a presin. Tiene una cmara vertical de metal provista de una tapa metlica fuerte que se aprieta y cierra hermticamente mediante un aro de goma. Se disponen en la tapa una espita para la salida del aire y del vapor, un indicador de presin y una vlvula de seguridad. El agua del fondo de la autoclave se calienta mediante mecheros de gas exterior, un calentador elctrico de inmersin o un serpentn de vapor. (11)

Grafica 17. Autoclave olla a presin

Figura 18. Componentes del Autoclave Instrucciones para el funcionamiento.

1. Debe haber agua suficiente dentro de la cmara. Se carga la autoclave y se aprieta la tapa manteniendo la espita de descarga abierta.
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2. Se ajusta seguidamente la vlvula de seguridad a la temperatura requerida y se conecta la fuente de calor. 3. Cuando el agua hierva, fluir vapor por la espita de descarga, arrastrando con l el aire existente en la cmara. 4. Se deja que salgan libremente el aire y el vapor hasta que se haya eliminado todo el aire. 5. Puede comprobarse que se ha eliminado fijando un extremo de un trozo de tubo de goma a la espita de descarga e introduciendo el otro extremo en un cubo u otro recipiente similar que contenga agua. 6. El vapor se condensa en el agua y las burbujas de aire salen a la superficie; cuando se ha eliminado todo el aire de la cmara, cesa el burbujeo en el cubo. 7. Cuando se ha alcanzado esta fase, se cierra la espita de descarga de aire vapor y se quita el tubo de goma. 8. La presin del vapor se eleva en la cmara hasta que la presin deseada, generalmente 1,054 kg/cm2, se alcanza y fluye vapor por la vlvula de seguridad. 9. Cuando la carga ha alcanzado la temperatura requerida, se mantiene la presin durante 15 minutos. 10. Al trmino del perodo de esterilizacin, se apaga el calentador y se deja que la autoclave se enfre. Se abre la espita de descarga de aire vapor muy lentamente una vez que el indicador de presin ha llegado a cero (presin atmosfrica). 11. Si la espita se abre demasiado pronto, cuando la autoclave est todava bajo presin, cualquier lquido que haya en su interior (medios de cultivo lquido, etc.), hervir de forma explosiva e incluso pueden explosionar las botellas que contengan lquidos. 12. Se deja que el contenido se enfre. Segn la naturaleza de los materiales que se estn esterilizando, el perodo de enfriamiento necesario puede ser de varias horas para que los grandes frascos de agar se enfren hasta 80C y puedan cogerse con la mano sin riesgo.

3.4.1.2

Autoclaves con eliminacin del aire por desplazamiento de la gravedad.

Estas autoclaves estn por lo general dispuestas horizontalmente y son de forma rectangular, permitiendo que la cmara se cargue ms fcilmente. Puede

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utilizarse un sistema de bandejas y carretilla, revestido de una camisa. Autoclaves similares pueden construirse sin camisa. La puerta debe tener un mecanismo de seguridad que impida pueda ser abierta mientras la cmara est bajo presin. La camisa que rodea a la autoclave est compuesta de una pared externa que encierra un espacio estrecho alrededor de la cmara, que se llena con vapor a presin para mantener la pared de la cmara templada. El vapor penetra en la camisa desde la fuente principal que se halla a alta presin, a travs de una vlvula que reduce la presin hasta el nivel de funcionamiento. La presin de funcionamiento se mide en un indicador de presin independiente fijado a la camisa. Esta camisa tiene un drenaje independiente para eliminar el aire y la condensacin. El vapor penetra en la cmara de la misma fuente que suministra el vapor a la camisa. Se introduce de forma tal que es desviado hacia arriba y llena la cmara desde la parte superior hacia la inferior, impulsando as al aire y al condensado a fluir en el fondo de la cmara por el desplazamiento de la gravedad. El desage est provisto de filtros para impedir que se obture por residuos. El desage lleva generalmente un termmetro para registrar la temperatura del vapor que fluye. La temperatura registrada por el termmetro del desage es generalmente inferior a la de la cmara. La diferencia debe determinarse mediante ensayos con termopares. Tambin cuenta con una vlvula sensible al vapor. La vlvula automtica de vapor o sensible al vapor est diseada para asegurar que nicamente se retiene dentro de la cmara vapor saturado y que el aire y el lquido condensado, se eliminan automticamente. Recibe el nombre de near tosteam sensible al vapor porque se abre si la temperatura desciende unos 2C por debajo de la del vapor saturado y se cierra alrededor de los 2C por encima de la temperatura del vapor saturado. El sifn funciona por expansin y contraccin de un fuelle metlico que abre y cierra una vlvula. El desage descarga en un embudo, de tal forma que hay una separacin entre el desage y el embudo. Esta disposicin asegura que no retroceder agua contaminada desde la tubera a la cmara. (11) Instrucciones para el funcionamiento

1. Si la autoclave est provisto de camisa, esta camisa debe llevarse a la temperatura de funcionamiento en primer lugar. 2. Se carga la cmara, se cierra la puerta y se abre la vlvula de vapor, dejando que la corriente de vapor entre la parte superior de la cmara. 3. El aire y el agua de condensacin fluyen a travs del desage del fondo. 4. Cuando el termmetro del desage llegue a la temperatura requerida, debe dejarse un tiempo adicional para que la carga alcance dicha temperatura.

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5. Este tiempo debe determinarse inicialmente y peridicamente para cada autoclave, como ya se indicar ms adelante. Salvo que se haga esto, es poco probable que la carga se esterilice. 6. Se prosigue el ciclo de la autoclave para el tiempo de mantenimiento. Cuando se ha completado, se cierran las vlvulas de vapor y se deja que la autoclave se enfre hasta que el indicador de temperatura seala 80C. 7. No debe abrirse la autoclave hasta este momento. 8. Al principi s entreabrir o abrir muy ligeramente y se mantendr en esa posicin durante varios minutos para permitir que salga el vapor y se enfre posteriormente la carga.

3.4.2 Indicaciones del material a esterilizar por autoclave Textiles (algodn, hilo, fibras sintticas, etc.): el apresto del tejido puede dificultar el paso del vapor y la succin por la bomba de vaco, por lo que se recomienda, en el caso de la ropa nueva, su lavado previo a fin de disminuirlo. Metales (instrumentales, lavatorios, semilunas, tambores, etc.): el material metlico requiere un lavado y secado previo a la esterilizacin. Vidrios o cristal: en algunas ocasiones es preferible su esterilizacin por calor seco, pero es factible hacerlo tambin por vapor saturado. Lquidos (agua destilada y soluciones farmacolgicas): como norma general se tendr en cuenta que el llenado del recipiente no debe sobrepasar los 2/3 de su capacidad total. Gomas y plsticos termo resistentes: el material debe estar limpio y seco, a fin de asegurar la eliminacin de materia orgnica. (11)

3.4.3 Factores que afectan la esterilizacin por autoclave Eliminacin incompleta del aire en el esterilizador: Disminuye la temperatura y afecta la esterilizacin. Las burbujas de aire atrapadas en los paquetes actan impidiendo la difusin y expansin del vapor. Esto ocurre por fallas en las bombas de vaco o en las autoclaves de desplazamiento por gravedad por eliminacin incompleta del aire. Vapor sobrecalentado: El vapor sobrecalentado puede afectar el poder microbicida debido a que pierde humedad y acta en ese caso slo como aire caliente. Esto puede ocurrir porque el vapor no est en contacto con el agua desde la cual se forma. Es totalmente seco y no puede ser utilizado en autoclaves. Su temperatura sube rpidamente.

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 El vapor saturado: Puede sobrecalentarse por una rpida reduccin de la presin (ms de 50% de una vez) mantenindose mayor presin y temperatura en la camisa que en la cmara. Otro motivo es por re secamiento producido por su paso a travs de materiales que tienen menos de 50% de humedad relativa (como es el caso de algunos textiles que se almacenan a altas temperaturas). Preparacin del material: La preparacin del material en relacin con tipo de artculos, empaque o envoltura, tamao y disposicin al interior de la cmara tambin son factores importantes en la esterilizacin porque pueden afectar la eliminacin del aire, la difusin del calor, vapor y el precalentamiento de la cmara. (11) 3.4.4 Validacin del proceso de esterilizacin por calor hmedo NOTA: La esterilizacin por calor hmedo sobre presin debe ser validada para garantizar la seguridad, adecuacin y efectividad del proceso. La validacin del proceso de esterilizacin, mostrar con evidencia la esterilizacin por este mtodo, garantizando que ello se realice siempre de una misma forma y con una misma calidad. La finalidad es garantizar los parmetros preestablecidos para esterilizar por medio del calor hmedo. 3.4.4.1 Tcnica y material Un problema muy frecuente en nuestro medio posiblemente por el costo es el mantenimiento preventivo, ya que lo ms comn es esperar que la mquina falle. Esta validacin se realizar verificando la calidad de los siguientes elementos: Ambiente: se verificarn las instalaciones dentro del rea fsica (estructura, dimensin, climatizacin, necesidad de instalacin de redes de vapor, aire comprimido), instalacin hidrulica, dureza del agua, instalaciones elctricas, voltaje, dispositivo de proteccin, instalacin con fuente propia y calidad del vapor. Equipamiento: se verificar la estructura de instalacin de la autoclave, adaptacin fsica, armona, ventilacin prxima a las puertas de la autoclave, distancias mnimas entre paredes y equipo para mantenimiento. Operacin: se debe verificar la existencia de un manual de operacin, una relacin de repuestos ms comunes, servicio tcnico registrado, comprobante de certificacin de funcionamiento.

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 Desempeo: se realiza mediante la evaluacin de la eficacia y eficiencia. En Autoclaves de pre vacio se chequearan 3 ciclos con test de Bowie & Dick, seguidos de 3 ciclos completos con testeo qumico y biolgico durante 3 das consecutivos con carga. En Autoclaves gravitacionales el test se realizara con la cmara vaca. Indicador Biolgico: Se utiliza el indicador biolgico 1262 Attest (tapn marrn), fabricado para 3M ESPE, est diseado para el control de procesos de esterilizacin con vapor. La presencia de esporas de Geobacillus stearothermophilus se detecta a simple vista por un cambio de color (el medio cambia a amarillo). El cambio a color amarillo indica que se ha producido un fallo en el proceso de esterilizacin. La lectura final de un resultado negativo (el medio permanece morado) se hace despus de 48 horas de incubacin del indicador. Frecuencia del control: Para mejorar el rendimiento del proceso de esterilizacin, los indicadores biolgicos Attest deben colocarse en una bandeja o en un paquete de prueba adecuado, que represente el mayor desafo al proceso, y deben usarse para el control de cada carga. Cuidado: Hay una ampolla de cristal dentro del frasco de plstico del indicador biolgico. La compresin o la manipulacin excesiva del indicador biolgico antes de que se enfre puede provocar la explosin de la ampolla de cristal. utilice guantes y gafas de proteccin al extraer extraiga el indicador biolgico del esterilizador. utilice gafas de proteccin al comprimir el indicador biolgico. Sujete el indicador biolgico por la tapa al romperlo y presionar su contenido. No rompa la ampolla de vidrio con los dedos. No haga rodar el indicador biolgico entre los dedos para humedecer la tira de esporas. Precauciones: No use el indicador biolgico 1262 Attest para el control de: 1. Ciclos de esterilizacin con vapor por gravedad a 132C, durante al menos 3 minutos.

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2. Esterilizadores con calor seco, vapores qumicos, xido de etileno u otros procesos de esterilizacin a baja temperatura. Instrucciones para el uso: 1. Identifique el indicador biolgico Attest anotando en la etiqueta del indicador el esterilizador, el nmero de la carga y la fecha de procesamiento. 2. Coloque un indicador biolgico Attest en forma horizontal o con el tapn hacia arriba en una bandeja o en un paquete de prueba adecuado (de acuerdo con las prcticas recomendadas), para cargas 3. Coloque la bandeja o paquete de prueba en una carga completa en el rea ms difcil de penetrar por el agente esterilizante . sta se encuentra generalmente en el estante inferior, cerca de la puerta y sobre el desage. 4. Procese la carga como de costumbre. 5. Despus de completar el ciclo y usando gafas de seguridad y guantes, abra totalmente la puerta del esterilizador durante un mnimo de 5 minutos antes de retirar el indicador biolgico Attest. 6. Cuando el indicador biolgico no est incluido en un paquete de prueba u otro material de empaquetado que absorba calor, retire el indicador biolgico del esterilizador y deje enfriarlo durante al menos 10 minutos antes de romperlo. 7. Cuando el indicador biolgico est contenido en un paquete de prueba u otro material de empaquetado que absorba calor, debe retirarse del esterilizador y dejarlo abierto durante 5 minutos para disipar el calor antes de retirar elindicador biolgico. Despus deje que el indicador biolgico se enfre fuera del paquete de prueba durante al menos 10 minutos antes de romperlo. 8. Compruebe el indicador qumico que est en la etiqueta del indicador biolgico. Un cambio de color de rosa a marrn confirma que el indicador biolgico ha sido expuesto al proceso de esterilizacin al vapor. Este cambio de color no indica que el proceso fuera suficiente para conseguir la esterilidad. Si el indicador qumico no cambi, revise el proceso de esterilizacin. 9. Usando gafas de seguridad, rompa e incube el indicador biolgico a 56 2C.

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10. Incube al menos un indicador biolgico Attest sin procesar (control positivo) cada da que incube un indicador procesado. El indicador del control positivo debe tener la misma fecha de fabricacin y el mismo nmero de lote que el indicador procesado que se encuentra en la incubadora. 11. Escriba una C y una fecha en la etiqueta del indicador para control positivo. Active e incube el control a 56 2C. 12. Incube el indicador biolgico procesado y el indicador usado como control durante 48 horas a 56 2C . 13. Un color amarillo en el indicador procesado demuestra crecimiento bacteriano y por lo tanto, un fallo en el proceso de esterilizacin. Si no hay cambio de color, el proceso de esterilizacin fue adecuado. El resultado final negativo se hace despus de 48 horas de incubacin. El indicador usado como control positivo debe mostrar un cambio de color a amarillo para que los resultados del indicador procesado sean vlidos. 14. Registre los resultados del indicador biolgico procesado y del control. Siempre pruebe el esterilizador y no lo use hasta que el resultado del indicador biolgico sea negativo. Eliminacin: Deseche los indicadores biolgicos Attest usados, se esteriliza cualquier indicador biolgico positivo en esterilizadores por vapor asistidos por vaco a 121C durante al menos 15 minutos, 132C durante 4 minutos o en un esterilizador por vapor con desplazamiento del aire por gravedad a 132C durante 10 minutos. Almacenamiento y caducidad del producto: A. Almacene los indicadores biolgicos Attest en condiciones ambientales normales: 15-30C, 35-60 % de humedad relativa. B. No guarde estos indicadores biolgicos esterilizantes u otros productos qumicos. cerca de agentes

C. Los indicadores biolgicos Attest tienen una caducidad de 24 meses Ninguna persona est autorizada a facilitar ninguna informacin que difiera en algn modo de la informacin suministrada en esta hoja de instrucciones. Nota: Las pruebas de tipo Bowie & Dick son tests que se realizan para controlar la bomba de vaco del autoclave para constatar la no presencia de burbujas de aire en el mismo

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 Si el test de Bowie & Dick indicara algn problema, el esterilizador debera ponerse fuera de servicio, hasta que se repare el problema de esterilizacin. Los test de Bowie & Dick se presentan habitualmente en el mercado bajo la forma de una hoja desechable (que debe ser usada en el interior de un paquete de toallas, cuya preparacin se encuentra especficamente normada) o de un paquete desechable, tambin conocido por su nombre en ingls Test Pack (el uso de este paquete preparado de control es equivalente al armado del paquete de toallas recomendado por las Normas AAMI).

Figura 19. Indicador para uso en ensayos especficos (Clase 2: segn clasificacin IRAM 37101-1 / ISO11140-1), Para uso en equipos de Vapor asistidos por bombas de vaco.

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PROCESO DE ESTERILIZACIN EN AUTOCLAVE Colocar el material a esterilizar dentro del autoclave tarros scot,tarros de plastico, puntas azules y amarillos. El material debe colocarse correctamente dentro del equipo para que permita la correcta distribucin del vapor de agua. Colocar la ampolla del indicador biolgico en el lugar que se considere ms difcil que llegue el vapor. Esperar que se alcancen los 121C y comenzar a contar el tiempo de esterilizacin por 15 min. Cuando termine el tiempo de esterilizacin, apagar el autoclave. Esperar que bajen la presin y la temperatura del equipo para abrirlo y retirar el material. Retirar el indicador biolgico e incubarlo bajo las condiciones que seale el fabricante. Esperar que el material alcance la temperatura ambiente antes de almacenarlo. Despus del periodo de incubacin observar las caractersticas del indicador biolgico. Figura 20. Proceso de esterilizacin por autoclave.

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CAPITULO IV PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO

4.0 IMPORTANCIA

La importancia que tiene la calidad en la elaboracin de los medios de cultivo deshidratados as como su preparacin, conservacin y uso, es el punto de partida para lograr que los resultados de los estudios microbiolgicos sean confiables. Se recomienda un especial cuidado en la preparacin de los medio de cultivo por ser uno de los pasos fundamentales para un buen resultado de un examen microbiolgico. Se deben respetar las buenas prcticas de laboratorio y seguir las instrucciones del fabricante para el manejo y preparacin de medios deshidratados y otros componentes, particularmente aquellos que tengan materiales peligrosos, como: sales biliares (que pueden producir irritacin de las vas respiratorias cuando son inhalados, se plantea incluso que un contacto prolongado con la piel, genera rash cutneo), y otros agentes selectivos. Es necesario documentar todos los datos relevantes como: peso, volumen, pH, fecha de preparacin, condiciones de esterilizacin y operario. Cuando se trate de medios preparados con componentes individuales se recomienda seguir exactamente la formula y registrar todos los detalles como se indico anteriormente, adems de la identificacin completa como cdigo y nmero de lote de todos los componentes que se use. (12)

4.0.1 Utilizacin y almacenamiento del agua

Se recomienda utilizar agua destilada o agua con calidad equivalente, es decir, libre de sustancias que puedan inhibir o influenciar el crecimiento de microorganismos en condiciones de ensayo. Si el agua destilada se prepara con agua clorada, se recomienda neutralizar el cloro antes de destilarla. El agua destilada se debe almacenar en recipientes fabricados preferiblemente con materiales inertes como vidrio neutro y polietileno libre de cualquier sustancia inhibitoria. Para considerar que el agua destilada es de buena calidad, es aconsejable que esta tanga una resistividad no inferior a 300.000 cm. (12)

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Figura 21. Zona de almacenamiento de agua.

4.0.2 Pesaje y rehidratacin Para la preparacin del medio de cultivo, se pesa cuidadosamente la cantidad adecuada del medio deshidratado (teniendo cuidado de no inhalar el polvo, especialmente cuando el medio contiene sustancias txicas) y agregarle progresivamente la cantidad necesaria de agua, evitando que se formen grumos. (12)

Figura 22. Pesaje y rehidratacin del medio de cultivo.

4.0.3 Disolucin y dispersin Se debe disolver el medio deshidratado rpidamente mezclando de forma instantnea y repetidamente y llevarlo al calor si es necesario hacerlo. Los medios que contienen agar se deben dejar hidratar antes de calentar y luego mezclar para disolver, cuando el medio se prepare con componentes individuales, es aconsejable agregar cada componente por separado y esperar su disolucin total antes de completar el volumen definitivo. (12)

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4.0.4 Medida y ajuste del pH El pH se mide con un medidor y si es necesario se ajusta. Cuando el medio se prepara con componentes individuales, para que despus de esterilizar y enfriar a 25 C el medio tenga el pH requerido 0,2 unidades de pH, normalmente se ajusta con una solucin de aproximadamente 40 g/l (cerca de 1 mol/l) de Hidrxido de sodio (NaOH) o aproximadamente 36,5 g/l (cerca de 1 mol/l) de acido clorhdrico (HCl) si as se requiere. (12)

Figura 23. Medida y ajuste del pH para el medio de cultivo. 4.0.5 Vertido El medio disuelto se debe verter en recipientes adecuados con un volumen 1, 2 a 3 veces superior al del medio para evitar su derrame al someterlo a la esterilizacin. Nota: Es importante verificar siempre el estado de limpieza de la cristalera empleada, la presencia de residuos de detergentes u otras sustancias qumicas o biolgicas en los mismos puede ocasionar alteraciones en la preparacin. (12)

Figura 24. Vertido de los medios de cultivo.

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4.1 ESTERILIZACIN

4.1.1 Esterilizacin por calor hmedo

La esterilizacin por calor hmedo se hace en una autoclave o preparador de medio. La operacin en la autoclave demora, generalmente, 15 min a 121 C. cuando los volmenes son superiores a 1000 ml, se adapta el ciclo de esterilizacin. En todos los casos se recomienda seguir las instrucciones especificadas en la norma internacional, nacional o las instrucciones del fabricante. Es necesario monitorear el comportamiento de la autoclave para asegurar que alcanza la temperatura deseada en condiciones tpicas de carga. Es esencial controlar la eficiencia de la esterilizacin con el uso de la cinta indicadora. Despus de calentar, se enfra el medio para evitar el exceso de ebullicin. Esto es importante con medios sensibles como el utilizado para el aislamiento de bacterias del gnero Enterobacteriaceae. (12)

Figura 25. Preparacin de los medios de cultivo para llevar a la autoclave.

4.1.2 Monitoreo Despus de esterilizar, hirviendo, filtrando o en el autoclave, se recomienda monitorear todos los medios, con respecto al pH, el color, la esterilidad y la consistencia. (12)

Figura 25. Control de esterilidad para los medios del cultivo 24 horas despus de su preparacin.
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4.2 PREPARACION Y ALMACENAMIENTO DE LOS MEDIOS EN CAJAS DE PETRI. Despus de esterilizar el medio de cultivo, se vierte en las cajas de Petri utilizando una zona estril mediante la utilizacin de mecheros preferiblemente de gas hasta obtener un espesor no inferior a dos mm, para cajas de 9 cm se requiere normalmente 15 ml. Se deja enfriar y solidificar el agar colocando las cajas de Petri tapadas, en una superficie horizontal fra. El medio solidificado, se guarda en condiciones que eviten modificaciones en su composicin, en un sitio oscuro y/o en el refrigerador de 4C a 12C, en bolsas cerradas, durante una semana como mximo, o como indique el fabricante o la norma especfica. Las cajas se deben rotular en la base, con la fecha de preparacin y/o la fecha de vencimiento y la identificacin del medio preparado o mediante cdigos que cumplan este requisito. La vida til de las cajas llenas, aumentar si se guardan en bolsas plsticas selladas y con el medio hacia arriba para evitar condensaciones adems deben estar fras antes de colocarlas en las bolsas. No es aconsejable secar la superficie de las cajas de agar antes de guardarlas en fro, en general, para inocular un medio de cultivo slido, se deben secar preferiblemente retirando las tapas y con la superficie del agar hacia abajo, en un horno a temperatura entre 25C y 50C, o en una cmara de flujo laminar, hasta que desaparezcan las gticas de la superficie del medio, se aconseja no secar demasiado. (12)

Figura 26. Procedimiento de preparacin y almacenamiento de los medios de cultivo.

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4.3 INCUBACIN Es recomendable incubar las cajas en pilas de no ms de 6 unidades, solo en el caso de utilizar jarras anaerbicas se pueden apilar ms de 6, dejar espacio para que circule el aire y se equilibre la temperatura de incubacin tan rpido como sea posible. Cuando el medio sea lquido, el tiempo necesario para alcanzar la temperatura de incubacin depende de varios factores: el volumen, la carga, el recipiente, la clase de incubadora. (12)

Figura 27. Incubacin de los medios de cultivo. 4.4. ELIMINACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Se recomienda eliminar tanto los medios contaminados como los que no se hayan utilizado en forma segura, de acuerdo con las regulaciones locales o nacionales. Estos deben ser esterilizados en el autoclave por 40 min a 120 C, desechar su contenido los slidos van a la basura y los lquidos se vierten a la poceta, luego el material es dirigido a la zona de lavado donde se proceder al los procesos de desinfeccin, lavado y esterilizacin, Mencionados en los captulos anteriores. (12)

Figura 28. Medios de cultivos para desechar.

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4.5 CONTROL DE CALIDAD DEL PRODUCTO TERMINADO

En la mayora de los laboratorios no se presta mucha atencin al comportamiento de los medios de cultivo y por ende se pueden obtener resultados que no sean del todo correctos. Para su control, es necesario realizar una prueba de productividad donde se determine el rendimiento, la recuperacin, el crecimiento de un microorganismo que habitualmente se desarrolla en un medio de cultivo y la selectividad o supresin del crecimiento del microorganismo que se espera sea inhibido en el medio. Normalmente se determina con controles positivos la productividad y no la selectividad. En ocasiones, por costos, algunos laboratorios trabajan con medios de cultivo con fecha de vencimiento ya expirada y/o alteradas. (12) 4.5.1 Control de calidad Fsico Qumico

Es aconsejable que los ensayos incluyan como mnimo las siguientes condiciones: Valoracin de pH medido entre 20C y 25C Mediante observacin: la cantidad de llenado y/o espesor de la capa, color, calidad, presencia de artefactos pticos, estabilidad, consistencia y humedad del gel.

4.5.2 Control de calidad Microbiolgico

Los ensayos deben incluir lo siguiente: Esterilidad: Se aconseja que se compruebe la esterilidad de una cantidad de medios por cada lote. Microorganismos de ensayo: Se prueba la caracterstica del medio con cepas positivas robustas, con caracterstica tpicas. Se debe usar un agar de referencia que puede ser Agar Infusin Cerebro Corazn (BHI), Agar Tripticasa de Soya (TSA o CASOY) o Agar Estndar para conteo en placa (SPC). El espesor de la capa de agar debe ser de unos 4 mm y estar bien secas (pre incubados a 35C por 2 horas o 55C por 10 minutos mximo). Todos los medios de cultivo selectivos utilizados durante el trabajo ordinario deben ir acompaados de un control positivo microorganismo(s) que se desea(n) recuperar o microorganismo(s) deseado(s)- y otro negativo -microorganismo(s) que se desea(n) inhibir total o parcialmente- llamado interferente.

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Los medios no selectivos deben ir acompaados de un control positivo. Todos los medios de cultivo de cada lote adquirido por el laboratorio deben ser probados para demostrar su capacidad de reproductibilidad, selectividad y estabilidad. Las cepas de control se usan para determinar la eficiencia de los medios de cultivo sintticos y semisintticos deshidratados, estas cepas son cultivos de un microorganismo conocido y certificado por alguna entidad o laboratorio conocido, como American Type Culture Collection (ATCC, USA) que cuenta con la coleccin ms amplia de bacterias, hongos y levaduras patgenas y no patgenas o la National Collection of Type Cultures (NCTC, Gran Bretaa), la cual produce una coleccin de bacterias en general. Otras colecciones de cepas son: DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganisman., hongos y bacterias no patgenas). NCIB (National Collection of Industrial Bacteria: Bacterias no patgenas). NRRL (Northern Regional Research Laboratory ARS Culture Collection: Microorganismos de importancia agrcola). (12)

4.6 CRITERIOS MNIMOS PARA ASEGURAR UN CONTROL DE CALIDAD DE MEDIOS DE CULTIVO

Para asegurar un control de calidad de los medios de cultivo es necesario seguir las recomendaciones siguientes: A cada lote se le deben realizar pruebas de funcionalidad del medio preparado para confirmar que es satisfactorio y que cumple con las especificaciones para el propsito sealado. El laboratorio deber tener un criterio serio para la compra de medios de cultivo, as como para su almacenamiento y conservacin. Realizar un procedimiento operativo estandarizado para la preparacin, manipulacin y conservacin de cada medio de cultivo. Desarrollar o implementar mtodos y procedimientos para verificar la esterilidad, pH, capacidad de crecimiento, pruebas de funcionalidad (productividad, selectividad y estabilidad), etc. Seleccionar los microorganismos de prueba (cepas control) de acuerdo con el tipo de medio a evaluar. Implementar un programa definido para la esterilizacin, eliminacin y disposicin final de los medios de cultivos usados. Utilizar agua destilada o desmineralizada para la preparacin de medios de cultivo que satisfagan las exigencias requeridas. Preparar y aplicar un programa de supervisin de la calidad del agua destilada, comprobar que no contenga trazas de compuestos inhibidores o bactericidas, control de pH, minerales, etc.

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Utilizar para la preparacin, medios de cultivo, equipo, materiales, reactivos, que cumplan con los requisitos de calidad adecuados. Conservar y registrar los resultados de las pruebas control. Cuando no se conozca la fecha de vencimiento de un medio de cultivo lo ideal es descartarlo, pero en el caso donde que deba ser usado para cualquier ensayo, se debe valorar primero su funcionalidad. Los medios de cultivo deshidratados deben contar con una hoja de registro que contenga mnimo la siguiente informacin: nombre, marca, nmero de lote, fecha de adquisicin, fecha de apertura, fecha de vencimiento, nmero de codificacin, datos de preparacin, indicador biolgico usado para su control, resultados de los controles de calidad, nombre del preparador y observaciones. Los medios de cultivo son higroscpicos (esto es que al ser deshidratados ganan humedad del medio ambiente con facilidad), por lo tanto deben mantenerse bien cerrados para evitar cambios a nivel de pH, alteraciones del color, de las sustancias que los componen, de la solubilidad, etc. Deben almacenarse a temperatura ambiente (entre los 15C a 25C), en ambiente seco y libre de luz, as como boca abajo para evitar la entrada de aire sobre los mismos. Los medios de cultivo preparados deben almacenarse a temperaturas entre los 12C a 15C por 1 o 2 semanas, para prolongar su periodo de uso los medios pueden ser almacenados en refrigeracin cuidando siempre que la temperatura no sea inferior de 0C ya que se desestabiliza el gel. En cualquier caso, deben protegerse de la luz. Los medios de cultivo y los reactivos se deben almacenar en frascos color mbar u oscuros cuando as lo indiquen los fabricantes, y despus de preparados se deben proteger de la luz ya sea envolviendo el frasco en papel aluminio, otro papel o medio oscuro, o depositndolos en un cuarto oscuro. Si un medio o reactivo cambia de color o se hidrata, se deben dar de baja. No mezclar lotes de producto. Para ajustar el pH de un medio no se deben emplear cidos o bases dbiles sino fuertes como el cido clorhdrico (HCl) y el Hidrxido de Sodio (NaOH) 0,1 N. Todos los lotes deben cumplir con la prueba de esterilidad para verificar que pueden ser usados sin problemas de contaminacin. (12)

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PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO PESAJE Y REHIDRATACIN Pesar cuidadosamente la cantidad adecuada del medio deshidratado y agregarle progresivamente la cantidad necesaria de agua DISOLUCIN Y DISPERSIN Disolver el medio deshidratado rpidamente mezclando de forma instantnea y repetidamente y llevarlo al calor si es necesario hacerlo

MEDIDA Y AJUSTE DEL pH El pH se mide con un medidor y si es necesario se ajusta. Vertido El medio disuelto se debe verter en recipientes adecuados con un volumen 1, 2 a 3 veces superior al del medio para evitar su derrame al someterlo a la esterilizacin. ESTERILIZACIN Se hace en un autoclave, 15 min a 121 C. MONITOREO Monitorear todos los medios, con respecto al pH, el color, la esterilidad y la consistencia. INCUBACIN Incubar tan rpido como sea posible durante 24 horas a 37C CONTROL DE CALIDAD DEL PRODUCTO TERMINADO Control de calidad Fsico Qumico Valoracin de pH medido entre 20C y 25C Mediante observacin: la cantidad de llenado y/o espesor de la capa, color, calidad, presencia de artefactos pticos, estabilidad, consistencia y humedad del gel. CONTROL DE CALIDAD MICROBIOLGICO Esterilidad y Microorganismos de ensayo Figura 29. Proceso para la preparacin de medios de cultivo y control de calidad.

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REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

1. Principles and practice. Infection control and applied epidemiology. Cap. 15 y 16, 1996. 2. Manual de desinfeccin y esterilizacin. Ministerio de salud de chile. Pg. 6, 1995. 3. Esterilizacin de productos sanitarios. European Society for hospital sterile suply. Heart consultancy. Pg. 108-183, 1999 4. Tlusty, F.R.O. Uso de detergentes enzimticos rev. Sobecc, vol.1, n.1, pg.148, 1996. 5. Rutala Wa, desinfection and sterilization, 1998. 6. Rutala Wa, Selection and Use of desinfectants in health care en Mayhall g. Hospital epidemiology ed. 1996, pg. 913-936. 7. REQUIREMENTS OF PARAMETRIC RELEASE OF STEAM STERILIZED PRODUCTS. Philip Scheneider Proceedings of the World Conference, Central Services Orlando,1999 8. Recomendaciones Prcticas para procesos Establecimientos de Salud. 2000 Brasil. de Esterilizacin en

9. Martin MA, Wenzel RP. Esterilizacin, desinfeccin y eliminacin de deshechos infecciosos. En: Mandell, Bennett, Dolin, Mandell, Douglas y Bennett. Enfermedades Infecciosas. Principios y prcticas. 4ta ed. Ed. Panamericana. 1995; 2892-2900. 10. Asociacin Argentina de Enfermeros en Control de Infecciones. Taller Multidisciplinario de Referentes: Reuso de Material Mdico. Julio 2002, Buenos Aires, Argentina. 11. AAMI. Proposed Recommend Practices for Sterilization in the Practice Setting (1994). 12. Norma GTC 78 e ISO / TS 11133-2:2003 gua general para el aseguramiento de la calidad para la preparacin de los medios de cultivo. 13. Alfa M J.,PhD; P De Cagne, RT; N. Olson, BSc; T. Puchalski, BA. Comparison of lon Plasma, Vaporized Hidrogen Peroxide, and 100% Ethilenne Oxide Sterilizars to the 12/88 Ethilene oxide gas Sterilizer. Infect.Control and Hospital Epidemiol. 1996; 17:92-100. 14. Norma DIN 58948 (1998) sobre esterilizacin por formaldehdo. E N 8665 (1998) Norma europea sobre indicadores para probar eficacia de esterilizadores de Formaldehdo. 15. Norma ISO 11140-1 Indicadores Qumicos.
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16. Norma tcnica Columbiana (NTC) 4092. 17. Culture media for Food Microbiology. Progress in indudtrial Microbiology, Vol.34, 1995, Eds. Corry J.E.L, Curtis, G.D.W and Barird, R.M Elsevier, Amsterdam. 18. ISO 9001:2002, Quiality management systems-Requirements. 19. Norma tcnica Colombiana, (NTC) 17025.

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