Cuantificacin de compuestos por cromatografa: Mtodo del Patrn Interno

Apellidos, nombre Departamento Centro

Fernndez Segovia, Isabel (isferse1@tal.upv.es) Garca Martnez, Eva (evgarmar@tal.upv.es) Departamento de Tecnologa de Alimentos ETSIAMN - Universitat Politcnica de Valncia

1 Resumen de las ideas clave

La cromatografa de gases y la cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC) son dos tcnicas de separacin de analitos que permiten identificar y cuantificar un gran nmero de compuestos. Para la cuantificacin de compuestos, existen diversas tcnicas como la normalizacin de reas, el mtodo de patrn externo o el mtodo de patrn interno. En este objeto de aprendizaje se va a describir cmo llevar a cabo la cuantificacin de compuestos por el mtodo de patrn interno.

2 Introduccin
En las tcnicas de cromatografa de gases y HPLC, cuando se realiza un anlisis, se obtiene un cromatograma. Un cromatograma es la representacin grfica de la seal que da el detector al paso de los distintos analitos en funcin del tiempo. En un cromatograma se observan una serie de picos que se corresponden con los analitos detectados. Cada pico sale a un tiempo de retencin (tR) determinado y tiene una altura y rea determinadas. El tR es el parmetro que se emplea para llevar a cabo el anlisis cualitativo. Para hacer un anlisis cuantitativo se puede utilizar la altura del pico o el rea, siendo ste ltimo el ms empleado por su mayor precisin.

3 Objetivos
Los objetivos de este artculo son que el alumno sea capaz de: Disear el procedimiento a seguir para cuantificar compuestos por cromatografa en columna mediante el mtodo del patrn interno. Cuantificar un compuesto presente en una muestra a partir de los cromatogramas de los patrones y de la muestra.

4 Desarrollo
El anlisis de alimentos y el control de calidad requieren metodologas que sean exactas, precisas, muy sensibles y con bajos lmites de deteccin. Por ejemplo, en el campo de control oficial de alimentos, las concentraciones de algunos compuestos txicos que es necesario determinar son de magnitudes muy bajas, por lo que se requieren potentes tcnicas de anlisis que permitan la identificacin y cuantificacin de estos compuestos. En este sentido la cromatografa de gases y la cromatografa lquida de alta resolucin son dos de las tcnicas ms adecuadas. Debido a la importancia de estos mtodos de anlisis, es necesario saber disear procedimientos adecuados para la cuantificacin de compuestos analizados por ambas tcnicas.

4.1 Preparacin de cromatogramas

patrones

obtencin

de

los

Cuando se quiere cuantificar un compuesto presente en una muestra por el mtodo del patrn interno, los pasos a seguir son los siguientes: 1. Preparar una serie de disoluciones de concentraciones crecientes, del patrn correspondiente al compuesto a cuantificar. El intervalo de concentraciones ha de ser similar a la concentracin del analito en la muestra problema. 2. Aadir a cada uno de los patrones y a la muestra una misma cantidad o concentracin de patrn interno. El patrn interno ha de ser un compuesto de naturaleza similar al analito a determinar, pero que no est presente en la muestra. Por ejemplo, en un anlisis de azcares en fresas un patrn interno podra ser lactosa, ya que se trata de un azcar, pero no est presente en las fresas. 3. Inyectar el mismo volumen en el cromatgrafo de cada una de las disoluciones patrn que contienen el patrn interno, as como del extracto de la muestra que tambin contiene el patrn interno. De esta forma tendremos los distintos cromatogramas de los patrones (un cromatograma para cada disolucin patrn) y el cromatograma de la muestra.

Ejemplo 1: Si se quiere determinar un analito cuya concentracin en el extracto de la muestra, se espera que est comprendida en un margen de 350 a 550 mg/L, se podran preparar e inyectar en el cromatgrafo 4 disoluciones patrn que adems contuvieran una misma concentracin de patrn interno (p.i.), con las siguientes concentraciones: Patrn 1: 300 mg/L analito + 350 mg/L p.i. Patrn 2: 400 mg/L analito + 350 mg/L p.i. Patrn 3: 500 mg/L analito + 350 mg/L p.i. Patrn 4: 600 mg/L analito + 350 mg/L p.i.

A la muestra se le adicionara patrn interno, de forma que la concentracin de patrn interno en el extracto de la muestra fuera la misma que en las disoluciones patrn y se inyectara en el cromatgrafo. As, la muestra tendra una concentracin desconocida de analito y 350 mg/L de patrn interno: Muestra: ? mg/L analito + 350 mg/L p.i.

Los cromatogramas obtenidos al inyectar cada una de las disoluciones patrn y la muestra seran los que se muestran en las Figuras 1 a 5.

Figura 1. Cromatograma de la l disolucin patrn 1 (300 300 mg/L analito + 350 mg/L p.i.). p.i.

Figura 2. Cromatograma de la disolucin patrn 2 (400 (400 mg/L analito + 350 mg/L p.i.). p.i.

En el cromatograma de cada disolucin patrn y en el cromatograma de la muestra saldr el pico correspondiente al analito y el pico correspondiente al patrn interno. En la Figura 5, 5 donde se muestra el cromatograma de la muestra, adems del pico del analito analito y del pico del p.i., se observan una serie de picos que corresponderan a otros compuestos presentes en la muestra distintos del analito que estamos cuantificando. Tal y como se muestra en las Figuras 1-5, 1 el tR del pico del analito ser el mismo en todos los cromatogramas; cromatogramas el tR del pico del patrn interno ser distinto del tR del analito y se mantendr constante en todos los cromatogramas. El El rea de los picos ser diferente dependiendo de la concentracin de analito; a ; por tanto, el rea del pico de analito ir aumentando conforme aumenta la concentracin en los

patrones (rea del patrn 1 < rea patrn 2< rea patrn 3 < rea patrn 4). 4) Dado que la concentracin de patrn interno se mantiene constante en todas las l disoluciones patrn y en la muestra, muestra el rea del p.i. debera ser similar en todos los cromatogramas.

(500 mg/L analito + 350 mg/L p.i.). p.i. Figura 3. Cromatograma de la disolucin patrn 3 (500

Figura 4. Cromatograma de la disolucin patrn 4 (600 mg/L analito + 350 mg/L p.i.). p.i.

Figura 5. Cromatograma de la muestra (? mg/L analito + 350 mg/L p.i.). p.i.

4.2 Cuantificacin uantificacin del analito

Cmo se puede cuantificar el analito en la muestra con los datos del cromatograma? En primer lugar hay que hacer una tabla que contenga los siguientes datos: concentracin de analito, analito, concentracin de patrn interno, rea del pico del analito y rea del pico del patrn interno. Se calcular la concentracin de analito/concentracin de p.i. y el rea del analito/rea del p.i., incluyndose estos valores en la tabla. Con estos datos se construir la recta de calibrado, mediante la representacin del rea del analito/rea del p.i. frente a concentracin del analito/concentracin del p.i.. p.i. Con la ecuacin de la recta podemos calcular calcular la concentracin de analito/concentracin /concentracin del p.i. sustituyendo y por el rea del analito/rea analito del p.i. en el cromatograma de la muestra y despejando x que corresponde a la concentracin de analito/concentracin analito/concentracin de p.i. p.i La concentracin de analito se calcular multiplicando el valor obtenido para x por la concentracin del p.i. Vemoslo con un ejemplo. Continuacin Ejemplo 1: 1 Siguiendo con el ejemplo anterior, supongamos que las reas obtenidas han sido las que se muestran mues en la Tabla 1. Representando rea del analito/rea del p.i frente a concentracin de analito/concentracin de p.i. se obtiene la recta de calibrado que se muestra en la Figura 6.

C analito (mg/L) Patrn 1 Patrn 2 Patrn 3 Patrn 4 Muestra 300 400 500 600 ?

rea analito 450,7 804,9 1150,2 1405,6 1268,4

C p.i. (mg/L) 350 350 350 350 350

rea p.i. 905,7 901,3 890,1 897,8 903,6

C analito/C p.i.

Area analito/rea p.i.

0,86 1,14 1,43 1,71 ?/350

0,50 0,89 1,29 1,57 1,40

Tabla 1. Concentraciones y reas de los picos del analito y del patrn interno (p.i.) obtenidas en los cromatogramas de los patrones y en el de la muestra.

2 1,6 A analito/A p.i. 1,2 0,8 0,4 0 0 0,5 1 1,5 C analito/C p.i. 2 2,5 3 y = 1,2611x - 0,5593 R = 0,993

Figura 6. Recta de calibrado obtenida con los datos de la Tabla 1. Para calcular la concentracin en el extracto de la muestra se siguen estos dos pasos: En la ecuacin de la recta de calibrado se sustituye y por el rea de analito/rea de p.i. obtenida en el cromatograma de la muestra (1268,4/903,6 = 1,40) y se despeja x que es la concentracin de analito/concentracin de p.i. en el extracto de la muestra: C analito/C p.i. = x = (1,40+0,5593)/1,2611 = 1,56 La concentracin de analito se obtiene multiplicando el valor calculado para x (1,56) por la concentracin de p.i. (350 mg/L):

C de analito en el extracto de la muestra = 1,56 * 350 (mg/L) = 544,8 mg/L

5 Cierre
A lo largo de este objeto de aprendizaje hemos visto cmo preparar una serie de patrones para cuantificar un compuesto por cromatografa de gases o por HPLC, utilizando el mtodo del patrn interno. Asimismo, se ha detallado qu parmetro del cromatograma se utiliza para cuantificar y cules son los pasos a seguir en la determinacin de la concentracin de analito en una muestra por este mtodo.

6 Bibliografa
[1] Nielsen, S.S: Food Analysis, Ed. Kluwer Academic / Plenum Publishers, New York, 2003, pg. 437460.

[2] Skoog, D.A.; Leary, J.J: Anlisis Instrumental, Ed. McGraw Hill / Interamericana de Espaa, Madrid, 1994, pg. 674703.

[3] Valcrcel, M.; Gmez, A: Tcnicas Analticas de Separacin, Ed. Revert, Barcelona, 1994, pg. 655676.