Componentes fundamentales de la clula

Aminocidos y Pptidos

 Las

protenas son cadenas de aminocidos unidos por enlaces peptdicos (amdicos). 20 aa componen las . 8 aa esenciales para la especie humana: treonina, metionina, lisina, valina, leucina, triptfano,, isoleucina y fenilalanina (adems puede aadirse la histidina como esencial durante el crecimiento, pero no para el adulto) Todos los aa presentes en las pertenecen a la serie L.

Configuracin absoluta

 Los

aminocidos suelen representarse en forma neutra con sus correspondientes grupos -COOH y -NH2, aunque es ms adecuado presentarlos como zwitter- iones o iones dipolares. O O

R OH NH2

R O
+ NH3
ZWITTER ION

O R OH
+ NH3
Forma cida

O OHH3O+ R NH3
+

O OHO
-

R NH2
Forma bsica

O H3O+

Forma neutra

Alcalinidad creciente

 Se

clasifican atendiendo a varios criterios.

1 Naturaleza polar o no polar de las cadenas laterales 2 Presencia de grupos cidos o bsicos 3 Presencia de otros grupos funcionales adems de cidos y bases.

4 Los tomos de C de la cadena lateral se nombran con las letras b,g,d,e. El tomo de carbono terminal se nombra con la letra .

O R OH NH3
+

pKa1

R NH3
+

pKa2
O
-

R NH2

Forma bsica
O
-

Forma cida

Forma neutra (pI)

Mtodo para separar molculas en base a su carga. pH en que la molcula no tiene carga neta= punto isoelctrico.

pI= pKa1+pKa2 2
pK1 es el que est disociado al pH del punto isoelctrico

a) Cules de los siguientes aa tienen una carga neta de +2 en a pH bajo? b) Cules de los siguientes aa tienen una carga neta de -2 en a pH alto?

Aminocido cido asprtico Alanina Arginina

pH bajo

pH alto

cido glutmico Leucina

Lisina

a) Cules de los siguientes aa tienen una carga neta de +2 en a pH bajo? b) Cules de los siguientes aa tienen una carga neta de -2 en a pH alto?

Aminocido cido asprtico Alanina Arginina

pH bajo

pH alto X

cido glutmico Leucina

Lisina X

 Determine

histidina

el punto isoelctrico de la

Datos:

Sus valores de pKa son 1,82; 6,0 y 9,17, de acuerdo con la siguiente tabla.
pK 1 2 3 Valor de pK 1,82 6,0 9,17 Grupo funcional a- COOH a- NH3+ RH+

O N N H2
+

O O
-

O O
-

pKa1= 1,82
OH NH3
+

N N H2
+

pKa2= 6,0

N N H NH3
+

pKa3= 9,17

N N H NH2

NH3

+2

+1

-1

pI= 6,0+9,17= 2

7,858

La RESONANCIA refuerza la estabilidad del enlace

Los tomos que forman parte del enlace peptdico se ubican en el mismo plano

O H3C NH2 OH

O OH H3C NH2 O NH

O OH

+ H2N

Alanine (Ala)

Glycine (Gly)

Alanilglicina

Aminocidos y funciones

cido Glutmico

El glutamato monosdico se emplea como exaltador de sabor de alimentos.

Histidina

Su derivado, la histamina,- no contiene el grupo COOH- es un potente vasodilatador. Las histaminas se libaran como parte de la respuesta inmunolgica, aumentando el flujo sanguneo y la concentracin localizada de glbulos blancos.
Al ser el aminocido ms pequeo es uno de los ms solubles en agua. Su unin a otras molculas las hace ms solubles en agua y facilita su excrecin por va urinaria. Muchos medicamentos contienen o producen por oxidacin grupos OH o -NH2 que se unen a la glicina, permitiendo que el producto final se elimine de la sangre.

Glicina

Dipptidos y funciones

Aspartamo

Se trata del ster metlico del dipptido L- aspartil L- fenilalanina. Es 200 veces ms dulce que el azcar. El ismero D es amargo. Est contraindicado su uso en fenilcetonricos.

Tripptidos y funciones

Glutatin

Tiene importancia fisiolgica en la captura de agentes oxidantes. Son pptidos cclicos con nueve residuos de aa. Son hormonas. La oxitocina induce el parto produciendo la contraccin de los msculos del tero y estimila la produccin de leche. La vasopresina controla la presin arterial, regulando la contraccin del msculo liso. Es antidiurtica. Dos pentapptidos presentes en el encfalo son encefalinas. Son analgsicos naturales. Sus estructuras tridimensionales son similares a las de los opiceos. Se cree que debido a esta semejanza los opiceos se unen a los receptores de encefalinas.

Oxitocina y Vasopresina

Encefalinas

n aminocidos

protenas

Monmeros: Compuestos por planos amdicos que contienen enlaces peptdicos

Estos planos pueden rotar en torno a los C que los unen para crear la conformacin tridimiensional de las .

Conformacin Nativa

Estructura tridimensional de una protena que tienen actividad biolgica.

Nota: En una molcula de gran tamao existe ms de un plegamiento con posible actividad biolgica.

Estructura primaria
Estructura secundaria

Orden en que se unen los aa

Plegamiento o forma tridimensional que adopta la cadena polipeptdica

a- hlice

Lmina b plegada

La estructura secundaria tiene interacciones repetitivas, que son el resultado de la formacin de puentes de H entre los grupos amida (N-H) y carbonilo (C=O) del esqueleto polipeptdico

En muchas el plegado de partes de la cadena es independiente del plegado de otra. Tales porciones plegadas independientemente se denominan DOMINIOS o ESTRUCTURA SUPERSECUNDARIA.

Estructura terciaria

Disposicin final de todos los tomos de la ; incluidos los grupos R (cadenas laterales) y grupos prostticos (grupos de tomos que no provienen de aa)

Las pueden contar con varias cadenas polipeptdicas; llamadas SUBUNIDADES. Estructura cuaternaria Es el arreglo subunidades. espacial de las

Las diferentes subunidades se enlazan mediante interacciones no covalentes; Puentes de H Interacciones electrostticas Interacciones hidrofbicas

Estructura Primaria de las Protenas

Sucesin de aminocidos define

ESTRUCTURA PRIMARIA

Estructura tridimensional
determina Propiedades de las protenas condicionan Funcionalidad biolgica

Los Hechos

Glbulos rojos no pueden captar O2 en forma eficiente Enfermedad gentica Glbulos en forma de hoz Clulas deformes tienden a quedar atrapadas en vasos sanguneos pequeos; luego, bloquean la circulacin y daan los rganos.

La causa

Se produce por un cambio de un residuo de aa en la estructura primaria de la .

 Para

investigar los cambios funcionales inducidos por cambios estructurales en la estructura primaria de una protena

se pueden emplear tcnicas de molecular (Mutagnesis sitio-dirigida)

biologa

Se sustituye un residuo de aa por otro y se examinan la conformacin de la alterada y su funcionalidad biolgica.

Para

determinar la sucesin de aa en una debe seguirse previamente una secuencia de pasos de aislamiento y purificacin.

Examinaremos algunos de ellos

 Purificacin

de protenas

Comprende etapas de separacin y aislamiento.

Tcnicas de separacin Por tamao Por carga Por polaridad

1- Ruptura de las clulas Mtodos

Lisis celular ( homogeneizacin con licuadora) Sonicacin Ciclos de congelacin y descongelacin Agregado de detergente( para protenas de membrana)

presin

sonicacin

Ciclos de congelacin y descongelacin

2- Centrifugacin diferencial Ultracentrfugacin

(500 g) Forma una pastilla de clulas y ncleos enteros+ lquido sobrenadante Lquido (contiene del citoplasma) (10.000 g)
Si se buscan nucleares, seguir por aqu

Ncleos

Sedimentan mitocondrias

Protenas solubles

3- Separacin grosera basada en solubilidad

Se aade (NH4)2SO4 al agua. El agua forma enlaces ion- dipolo con la sal. Se reduce la disponibilidad de agua para hidratar la Las comienzan a actuar hidrofbicamente entre ellas Se aumenta paulatinamente la concentracin de la sal y se separan por centrifugacin las .

1 paso: 40% p/p (NH4)2SO4 2 paso: 60% p/p (NH4)2SO4

4- Cromatografa en columna 4.1-Cromatografa por tamiz molecular

Por exclusin de tamao o filtracin en gel

Separa por tamao Es til para con variados Mr Fase estacionaria:

Partculas de gel que forman enlaces cruzados Tienen poros que permiten el pasaje de molculas grandes reteniendo a las ms pequeas que eluyen en ltimo lugar. Materiales que forman los geles comerciales: Agarosa (Sephadex) o Poliacrilamida (Bio-Cel). El tamao de poro y el intervalo de exclusin (Mr de la que eluye sin quedar atrapada en los poros) son suministrados por el fabricante.

4.2- Cromatografa de afinidad

La fase estacionaria (polmero) est unida por enlaces covalentes con algn compuesto ligando- que se un ESPECFICAMENTE a la deseada. El resto de las no se unen a la columna. La p de inters eluye de la columna agregando elevadas concentraciones del ligando como eluyente o bien alterando el pH o la fza. Inica. Rinde muy puras.

4.3- Cromatografa por intercambio inico

Similar a la cromatografa por afinidad Columna con resina que se une a la de inters Interaccin es poco especfica y se basa en la carga neta. La resina tiene un ligando con carga (+) o (-)

Si la resina tiene carga (-) es un intercambiador catinico y viceversa. La resina de intercambio se equilibra con un buffer de pH y fuerza inica apropiadas La resina se une a contraiones Se carga la mezcla de Las protenas cuya carga neta sea opuesta a la del intercambiador quedan atrapadas en la columna, intercambindose por los contraiones unidos. Las que no exhiban carga o presentan carga opuesta, salen con el eluyente. El eluyente se cambia por un buffer cuyo pH anule la carga de la unida recuperndose en la corriente de salida.

5- Electroforesis

Se basa en el movimiento de partculas cargadas dentro de un campo elctrico SDS-PAGE: ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA + DODECILSULFATO DE SODIO. El SDS desnaturaliza por completo a la , rompiendo las interacciones no covalentes que dan lugar a las estructuras 2, 3 y 4. Otorga carga negativa a todas las , por lo cual se desplazarn hacia el NODO. La acrilamida ofrece mayor resistencia a las p ms grandes que avanzan a menor velocidad.

SDS-PAGE con enfoque isoelctrico

Distintas protenas tienen diferente punto isoelctrico. El gel se prepara con un gradiente de pH. Cuando las protenas migran por accin del campo elctrico, encuentran el pH de su pto. Isoelctrico y se estacionan. (Recordad que la carga neta =0 en el pI!) SDS-PAGE bidimensional

Combina ambas tcnicas

Teir con Coomasie

Desteir con CH3COOH/MeOH

La se trata con HCL 6M 100-110C durante 12-36 h.

Se produce la hidrlisis de los enlaces peptdicos. Se liberan los AA.

Un analizador de AA determina la identidad de los AA y los % de abundancia relativa de c/u.

El anlisis cuali-cuanatitativo se realiza por HPLC

Puede ser til para determinar si la p tiene una o ms cadenas polipeptdicas. La cadena polipeptdica se trunca en sitios especficos por va enzimtica. Los pptidos obtenidos se analizan por el Mtodo de Edman.

El reactivo de Edman (isotiocianato de fenilo) reacciona con el residuo N terminal del pptido. El aa modificado puede escindirse e identificarse dejando libre el resto del pptido y se repite.

Estructura secundaria de las protenas

Dentro de cada AA hay dos enlaces cuya rotacin es ms o menos libre:

El enlace entre el C a y el N amnico El enlace entre el C a y el C carboxlico

Estos se conocen como NGULOS DE RAMACHANDRAN, y se denotan al ngulo C-C al ngulo C-N

a- hlice

Lmina b u hoja plegada

Son estructuras peridicas Sus caractersticas se repiten a intervalos regulares

Puede producir una formacin bidimensional

Pueden intervenir una o ms cadenas polipeptdicas.

Se estabiliza con puentes de H paralelos al eje de la hlice

Contando desde el extremo N-terminal, el grupo C=O de cada residuo de AA forma un puente de H con el grupo N-H del AA que est a 4 residuos en la sucesin Hay 3,6 residuos por vuelta de hlice El paso de la hlice es de 5,4 Amstrng (540 pm). Todas las cadenas laterales estn fuera de la hlice.

Factores desestabilizantes de la a-hlice

Presencia de prolina Cmulos de residuos cargados con el mismo signo Impedimento estrico por cadenas laterales voluminosas.

Las protenas tienen cantidades variables de estructura a-hlice. (desde el 5% hasta el 100%).

 Se

forman puentes de H entre diferentes partes de una sla cadena que se pliega sobre s misma , o entre cadenas. Existen lminas plegadas paralelas o antiparalelas.

Cuando la cadena polipeptdica se pliega sobre s misma se combinan a hlices, estructuras b y otras formas de estructura secundaria. Patrones:

Un patrn es una estructura secundaria repetitiva

Dan informacin sobre el plegamiento de las , pero no sobre su funcin biolgica.

Dominios:

Protenas que tienen el mismo tipo de funcin tienen un patrn similar de AA.

La funcin biolgica de las protenas est asociada a dominios con conformacin similar.

Tipos de estructuras supersecundarias.

Algunos estn formados por a-hlices, otros por estructuras b, y otros por combinaciones de las dos. De entre las ms abundantes, podemos destacar:

hlice-giro-hlice coiled-coil Mano EF 4 hlices Horquilla b Meandro b

Barril b Hlice b b -a- b Rossmann

Formada por dos a-hlices cortas, conectadas entre s mediante un tramo sin estructura secundaria (o a veces un giro b). Es caracterstico de protenas que interaccionan con el DNA.

Es un motivo estructural formado por dos a-hlices yuxtapuestas (izquierda). A menudo, estas dos hlices interaccionan entre s mediante cadenas laterales de leucina (en color azul), originando una estructura llamada "cremallera de leucina" que aparece frecuentemente en protenas que interaccionan con el DNA.

Formada por dos a-hlices conectadas entre s por un giro. Est presente en protenas que se unen a calcio. La unin al Ca2+ (color verde) se lleva a cabo gracias a las tres cadenas laterales de Asp localizadas en la secuencia que conecta las dos hlices (color claro).

Dos estructuras b adyacentes se orientan de forma antiparalela (rojo), y estn conectadas por medio de un segmento con estructura al azar (blanco). Se encuentra con mucha frecuencia en las protenas y no se le relaciona con ninguna funcin concreta.

Numerosas estructuras b orientadas de forma antiparalela se entrecruzan entre s dando lugar a una especie de canasta o barril, donde los residuos hidrofbicos se acumulan en el interior. Este motivo estructural aparece en la protena que une retinol, donde 8 estructuras b adoptan esta configuracin y la molcula de retinol se acomoda en el interior, dejando fuera nicamente su grupo OH.

Compuesto por dos estructuras b que se orientan de forma paralela (rojo en la figura) mediante un segmento que contiene una hlice a (verde) y dos segmentos con estructura al azar (blanco).

Es una de las ms abundantes en los vertebrados (tejido conectivo, huesos). Constitudo por fibras insolubles en agua, muy resistentes. Formado por tres cadenas polipectdicas, enrolladas formando una hlice triple. Cada cadena tiene una sucesin repetidas de 3 AA.

X-Hip-Gli X-Pro-Gli

Hip= hidroxiprolina X= cualquier AA

El colgeno tambin contiene hidroxilisina. Las tres cadenas se trenzan en una organizacin superhelicoidal para formar un cilindro rgido: tropocolgeno.

Longitud: 300 nm

Dimetro: 1,5 nm

Las tres cadenas se mantienen unidas por puente de H en los que intervienen la hidroxiprolina e hidroxilisina.

El colgeno est unido en forma intramolecular e intermolecular mediante enlaces covalentes formados por reacciones de los residuos de lisina e histidina. La cantidad de enlaces cruzados aumenta con la edad. La enzima que hidroxila la prolina del colgeno requiere vit.C.

Estructuras terciaria y cuaternaria de las Protenas

Comprende el acomodo tridimiensional de todos los tomos de la molcula de la protena

Determinacin de estructura

CRISTALOGRAFA POR RAYOS X o RMN (2-D)

Si tienen varias SUBNIDADES

-Puentes de H -Interacciones hidrofbicas -Atraccin electrosttica -Formacin de complejos

-Cadenas laterales -con cistena

Protena globular Una sola cadena polipeptdica con 153 residuos de aa. Incluye un grupo prosttico (HEMO) que tambin est presente en la hemoglobina. Presenta 8 regiones helicoidales que contiene el 75% de los residuos de aa y se designan con las letras A hasta H. Los puentes de H de las cadenas helicoidales estabilizan las regiones helicoidales. Las cadenas laterales tambin participan en algunos enlaces puente de H. Los residuos polares se ubican en el exterior de la molcula. Y los no polares estn en el interior.

Residuo de His

Hay dos residuos de His en el interior de la molcula que participan en la unin con el grupo HEMO, plano y el oxgeno capturado.

El grupo HEMO encaja en una bolsa hidrofbica dentro de la molcula y se mantiene fijo mediante interacciones hidrobbicas entre el anillo porfirnico y las cadenas laterales de la .

Residuo de His

Desnaturalizacin: Ruptura de interacciones no covalentes

implica prdida de la estructura tridimensional nativa-. Agentes desnaturalizantes: Calor, valores extremos de pH, unin con detergentes,

PLEGADO: Co-asistido por protenas chaperonas

CHAPERONAS: PROTEINAS QUE FACILITAN EL PLEGAMIENTO DE OTRAS PROTEINAS. PROTEINAS DE CHOQUE TERMICO (HSP): SE EXPRESAN ANTE DETERMINADAS CIRCUNSTANCIAS DE ESTRES AMBIENTAL.
Ejemplo: hps 70

La hps 70 es una protena producida por Eschericchia coli cuando se la cultiva a 70C Las chaperonas se encuentran en citosol, ER, mitocondria, ncleo. Las chaperonas actan en protenas recin sintetizadas, en protenas que atraviesan membranas o en protenas que sido desnaturalizadas.

Aparece slo en las protenas que tienen ms de una cadena polipeptdica. Cada cadena es una subunidad.
El nmero de cadenas oscila entre 2 y 12 Las cadenas pueden ser iguales o distintas. Se habla de dmeros, trmeros, tetrmeros, etc.

Las cadenas interactan entre s en forma no covalente.

Interacciones puentes de hidrofbicas.

H,

electrostticas, interacciones

Algunas protenas con estructura cuaternaria son alostricas (ejemplo: hemoglobina)

Esto es, exhiben cambios estructurales durante la unin con molculas pequeas O2 en la hemoglobina- como resultado de interacciones no covalentes.

DESOXIHEMOGLOBINA (apoenzima)

Hemoglobina SEMEJANZAS

Mioglobina

Las cadenas son similares a la cadena de la mioglobina. Contienen grupo hemo. Se unen al O2 en forma reversible. DIFERENCIAS Tetrmero formado cadenas polipeptdicas. por 4 Formada por una sla cadena polipeptdica.

Las dos cadenas a son idnticas, al igual que las dos b.

Se une a 4 molculas de O2
La unin al O2 presenta cooperatividad positiva. Tiene menor % de saturacin de O2. Transporta O2.

Se une a 1 molcula de O2.

Tiene mayor %de saturacin de O2.

Almacena O2 en los msculos.

Son glucoprotenas que se encuentran en las membranas celulares del tejido nervioso. Causantes de las enfermedades scrapie ( en ovejas), BSE (en bovinos) y Encefalopata espongiforme en humanos. La enfermedad se produce cuando la protena se pliega en forma incorrecta PrPSC en lugar de plegarse en la conformacin normal PrP. La forma anormal de la p puede inducir la transformacin de formas normales. Los priones normales tienen un alto porcentaje de a hlice, pero las formas anormales contienen ms lminas b. Esta anomala provoca interacciones entre protenas, que forman placas insolubles (Idem Alzheimer). Muchos individuos no contraen la enfermedad si no entran en contacto con priones anormales de otra fuente.

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