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Universidade Estadual de Campinas Faculdade de Engenharia de Alimentos (FEA) Departamento de Cincias de Alimentos (DCA)

TA514 - Bioqumica de Alimentos Turma C

Aula Prtica 04: Efeito do pH na Atividade Cataltica das Enzimas

Grupo 8

Edna Aparecida de Paula Mnica Dubas Gurgueira

116655 118201

Prof Dr Gabriela Alves Macedo

Campinas, 15 de Abril de 2013

1 Introduo As enzimas sofrem os mesmos efeitos estruturais observados com as protenas globulares pela variao de pH e de temperatura. Mudanas extremas de pH podem alterar a estrutura da enzima devido a uma repulso de cargas. Por outro lado, as mudanas de pH que no afetam totalmente a estrutura de uma enzima podem diminuir sua atividade apenas por estar afetando resduos do stio cataltico, como veremos mais adiante. Muitas enzimas apresentam um pH timo, determinado a partir de uma curva do efeito do pH na atividade enzimtica. Porm, muitas enzimas no apresentam uma curva na forma de sino, indicando que no existe um nico valor de pH timo, mas uma faixa de pH timo. Deve-se, tambm, considerar o fato de que podem existir grupos ionizveis no stio ativo. Isso afeta a ligao de substratos e a catlise. [1] O pH timo para a maioria das enzimas fica entre 6 e 8, mas h excees. A pepsina, por exemplo, uma enzima digestiva estomacal, atua eficientemente no pH fortemente cido de nosso estmago (em torno de 2), onde a maioria das enzimas seria desnaturada. A tripsina, por sua vez, uma enzima digestiva que atua no ambiente alcalino do intestino, tendo um pH timo situado em torno de 8. [2] As enzimas so molculas de protena bastante grandes e complexas que agem como catalisadoras em reaes bioqumicas. As amilases so enzimas que catalisam a hidrlise de ligaes -1-4 glicosdicas de polissacardeos, como glicognio, amido ou seus produtos de degradao. Sobre o amido, atuam liberando diversos produtos, incluindo dextrinas e progressivamente pequenos polmeros compostos de unidades de glicose. Produzida na saliva e no pncreas, a amilase tambm produzida por diversos fungos, bactrias e vegetais. As amilases so divididas em dois grupos: as endoamilases e exoamilases. As endoamilases catalisam hidrlises de forma aleatria no interior da molcula do amido. Essa ao causa a formao de ramos lineares de oligossacardeos de cadeias de vrios comprimentos e dessa forma quebram as ligaes glicosdicas -1,4 presentes na parte interna (endo) das cadeias de amilose ou amilopectina. A -amilase a endoamilase mais conhecida. As exoamilases hidrolisam exclusivamente ligaes glicosdicas -1, 4, como a -amilase ou ambas as ligaes -1,4 e -1, 6, como amiloglicosidase e glicosidase. Outros exemplos de exoamilases so a ciclodextrina glicosiltransferase e a -amilasemaltognica. A Amilase, como todas as outras enzimas, funciona como um catalisador, ou seja, no alterada pela reao, mas a torna mais fcil, reduzindo a quantidade de energia necessria para que ocorra. A Amilase digere os amidos catalisando a hidrlise, que a quebra feita pela adio de uma molcula de gua. Desta maneira, o amido mais a gua se torna em maltose (que o equivalente a duas molculas de glicose unidas). Outras enzimas ento fracionam a maltose em glicose, que

absorvida pelas paredes do intestino delgado, e depois de ser levada para o fgado usada como energia. Alm de catalisar a quebra de molculas de amido, a -amilase Fngica uma multi-enzima capaz de fazer mais de 30 funes enzimticas, entre elas a quebra de molculas de gordura e protena. Tambm capaz de converter uma quantidade de amido em maltose 450 vezes maior que seu prprio peso. A -Amilase catalisa a hidrlise de gorduras, transformando-as em glicerol e cidos graxos, as protenas em proteoses e derivados do amido em dextrina e acares mais simples. Possui pH de atividade prximo de 7,0. [3] A determinao de atividade enzimtica envolve a medida de velocidade de reao. Uma unidade (U) de atividade a quantidade de enzima que catalisa a transformao de 1micromol de substrato ou a formao de 1 micromol de produto por minuto, nas estabelecidas condies do ensaio (temperatura, pH, concentrao de substrato). A atividade enzimtica pode ser medida com a enzima pura e em condies que permita que a velocidade de reao seja mxima, o que significa que o substrato deve estar em concentrao elevada, de modo a permitir que toda enzima esteja transformada em um complexo ativado. Neste caso a velocidade da reao, proporcional concentrao enzimtica, ser tambm proporcional ao complexo ativado. A velocidade das reaes enzimticas varia com os fatores diversos como concentrao de enzima ou substrato, temperatura e pH. [4] 2 Objetivo Determinar a faixa de pH timo de atividade da -amilase. 3 Materiais e Mtodos 3.1 Materiais: Soluo de -amilase n 2 (enzima bacteriana comercial Termamyl 120 L diluda 1:2800) Soluo 1% de amido solvel em gua destilada (a suspenso de amido foi aquecida cinco minutos em ebulio e em seguida resfriada a temperatura ambiente) Dez tubos de ensaio contendo 0,4 mL de solues tampo 0,1 Mol/L de diferentes valores de pH (Tampo Citrato-Fosfato 0,1 Mol/L pH 2,6; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0); (Tampo Borato 0,1 Mol/L pH 8,0; 9,0); (Tampo Borato-NaOH 0,1 Mol/L pH 10,0 e 11,0) Soluo de Iodo-KI (0,3% de iodo e 3% de KI) Soluo de HCl 0,1 Mol/L gua destilada

Filme plstico Pipeta Pra Tubos de ensaio Espectrofotmetro

3.2 Mtodos:
Foram pipetados 0,5 mL de soluo de amido solvel nos tubos numerados (pH 2,6; pH 3,0; etc) contendo 0,4 mL de soluo de tampo 0,1 Mol/L de diferentes valores de pH. Os tubos foram identificados com o nmero do grupo.

O tubo controle foi preparado pipetando-se 0,5 mL de soluo 1% amido solvel + 0,5 mL de gua destilada + 0,1 mL de soluo de IodoKI + 0,5 mL de HCl 0,1 Mol/L em tubo de ensaio numerado. O volume foi ajustado para 15 mL com gua destilada.

Os tubos de ensaio foram incubados durante 10 minutos a 50C em banho de gua termostatizado para equilibrar a temperatura.

Foi adicionado exatamente 0,1 mL de soluo de -amilase nos tubos de ensaio contendo substrato em diferentes valores de pH diretamente sobre o substrato em diferentes valores de pH diretamente sobre o substrato e os tubos foram incubados durante exatamanete 5 min a 50 C .

O espectrofotmetro foi calibrado, ajustando o zero de absorbncia com a soluo do tubo branco e a absorbncia das amostras dos tubos teste e controle foi medida a 620 nm.

Os valores de atividade de -amilase (U/mL de enzima comercial) foram calculados. Uma unidade de atividade foi definida como a diminuio de 0,001 de absorbncia por minuto de reao por mL de enzima comercial utilizada.

Aps a incubao foram adicionados 0,5 mL de HCl 0,1 Mol/L nos tubos de ensaio para paralisar a reao.

Foram calculados os valores de atividade de a-amilase em porcentagem de Foi adicionado 0,1 mL de soluo de Iodo-KI (0,3% de iodo e 3% de KI) nos tubos de ensaio e o volume foi ajustado para 15 mL com gua destilada. Atividade Relativa.

O tubo branco foi preparado pipetando 0,1 mL de soluo de iodo + 14,9 mL de gua destilada.

4 Resultados e Discusso 4.1 Determinao de atividade de -amilase A atividade de -amilase foi calculada pela diminuio de 0,001 de absorbncia por minuto de reao por ml de enzima comercial utilizada. Utilizando a frmula abaixo, onde foi considerada a diluio utilizada de enzima (1:2800), 0,1 ml de soluo diluida de enzima, 5 minutos de reao e a subtrao entre a absorbncia da soluo no pH em questo e a soluo onde no havia enzima (tubo controle): Unidade de atividade de -milase: [(abs soluo - abs controle)*2800]/(0,001*5*0,1) Para o clculo de atividade relativa de enzima foi utilizada a soluo com menor valor de absorbncia, ou seja, maior atividade enzimtica como a referncia para 100% de atividade. Desta forma obteve-se a seguinte tabela e grfico:

Tabela 1: Efeito do pH na atividade da -amilase bacteriana


Tampes Citrato-Fosfato 0,1 Mol/L pH 2,6 Citrato-Fosfato 0,1 Mol/L pH 3,0 Citrato-Fosfato 0,1 Mol/L pH 4,0 Citrato-Fosfato 0,1 Mol/L pH 5,0 Citrato-Fosfato 0,1 Mol/L pH 6,0 Citrato-Fosfato 0,1 Mol/L pH 7,0 Borato 0,1 Mol/L pH 8,0 Borato 0,1 Mol/L pH 9,0 Borato-NaOH 0,1 Mol/L pH 10,0 Borato-NaOH 0,1 Mol/L pH 11,0 Tubo controle Abs 620 nm 0,595 0,529 0,381 0,171 0,044 0,143 0,116 0,158 0,180 0,298 0,533 Unidades de Atividade de amilase (U/mL de enzima comercial) 0 22400 851200 2027200 2738400 2184000 2335200 2100000 1976800 1316000 % Atividade Relativa 0,00% 0,82% 31,08% 74,03% 100,00% 79,75% 85,28% 76,69% 72,19% 48,06%

Grfico 1: % atividade relativa x pH

De acordo com os dados obtidos e o grfico acima se pde perceber que o pH timo da enzima -amilase(Termamyl) est em torno de 6, onde apresentou maior atividade enzimtica, porm pela literatura [3] verificamos que o ph timo da enzima 7. Esta pequena discrepncia de valores pode ter ocorrido por alguma falha durante a aplicao da metodologia, como por exemplo perda de pequena quantidade de soluo enzimtica na hora de pipetar. Esperava-se que os valores de absorbncia dos tubos com presena da enzima fossem inferiores ao do tubo controle que no possuia enzima e logo no ocorreria atividade enzimtica, entretanto isso no ocorreu. Isto pode ter acontecido provavelmente por erro de leitura do aparelho espectrofotmetro. Desta forma consideramos a atividade enzimtica neste tubo como sendo 0%, conforme tabelado. O clculo da atividade enzimtica levou em considerao o desaparecimento do substrato, amido, em cada um dos tubos que continham uma mesma concentrao de enzima e substrato, porm com pH variado. 5 Concluso A enzima -amilase possui pH timo de atividade em torno de 6, conforme resultados obtidos experimentalmente que no foram muito discrepantes dos apresentados na literatura [3], evidenciando apenas pequenos erros na aplicao da metologia, passvel de aprimoramento. Quando em meio mais cido ou alcalino do que esta faixa a atividade da enzima tende a diminuir sua atividade gradativamente at ser inativada por desnaturao e em pH abaixo de 3 sua atividade praticamente nula.

6 Referncias Bibliogrficas

1 Efeito de pH na http://www2.bioqmed.ufrj.br/enzimas/pH.htm

Atividade

Enzimtica.

2 http://www.sobiologia.com.br/conteudos/quimica_vida/quimica12.php 3 http://www.embrafarma.com.br/novo/modules/pdf/3c59dc048e8850243be8079a5 c74d079.pdf 4 http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/lista_exerc/enzimas_aspectos_ gerais.pdf