Prcticas de Farmacologa y Farmacoterapia

EFECTO DE ACETILCOLINA SOBRE ILEON AISLADO DE RATA: CONSTRUCCIN DE CURVAS DOSIS RESPUESTA

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EFECTO DE ACh SOBRE ILEON AISLADO DE RATA: CONSTRUCCIN DE CURVA DOSIS-RESPUESTA.

En la bsqueda de receptores especficos que median la accin observada tras la administracin de frmacos en el animal entero, as como su potencia relativa en comparacin con otros agonistas o antagonistas, el farmaclogo comenz a utilizar la tcnica del rgano aislado como pieza ineludible en el estudio del mecanismo de accin de los frmacos. La utilizacin del rgano aislado como reactivo farmacolgico aporta varias ventajas respecto a los preparados in vivo: Posibilita la cuantificacin precisa de la respuesta o efecto Conocimiento exacto de la concentracin del frmaco sin interferencias de procesos de acceso y disposicin. Eliminacin de respuestas de carcter reflejo (neuronal) o retroalimentacin humoral.

Sin embargo tambin posee sus limitaciones ya que la tcnica exige una gran minuciosidad y un correcto montaje del preparado. A pesar de intentar mantener las condiciones fisiolgicas, debemos tener en cuenta que el rgano va a estar en un medio artificial.

transductor

SSF amplificador sistema de registro bao M organo aislado

Figura 1.- Esquema de los elementos necesarios para la realizacin de un experimento con rgano aislado.

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1. Bao de rganos Se denomina as al conjunto de materiales necesarios para realizar experiencias en rganos animales. En realidad, son varios elementos que constituyen un sistema que intenta reproducir las condiciones fisico-qumicas fisiolgicas necesarias para que el rgano responda. a) Copa de Tejido: Es un vaso de cristal de volumen fijo (50 ml), en el que se dispone la pieza de tejido mediante un sistema de sujecin (varilla). Esta copa se llena de solucin nutricia y se sita inmersa en el bao propiamente dicho. Recibe una entrada para aireacin y una conduccin regulable para el medio de incubacin. Se debe comprobar que el llenado de la copa se efecta siempre al mismo nivel. Los frmacos se administran con una pipeta o una jeringa en el interior de la copa. El volumen de solucin de frmaco aadido total no debe ser superior al 10% del volumen total de la copa. b) Aireacin: Se realiza a travs de conducciones adecuadas, regulables, a partir de aireadores (aire) o botellas de gas (oxgeno o carbgeno, que contiene 95% O2 y 5% CO2). Habitualmente se utiliza carbgeno, salvo en caso de mayor requerimiento metablico (msculo esqueltico) en el que se utiliza oxgeno. Cuando el medio contiene NaHCO3 como tampn, conviene utilizar carbgeno, ya que el oxgeno puro hara perder CO2 y el pH se elevara hasta valores mayores de 8, con el consiguiente deterioro de la actividad del rgano. c) Temperatura: El control de la temperatura se realiza mediante un bao mara con un termostato, en el cual se encuentra introducida la copa de tejidos. La solucin nutricia se hace circular a travs de un serpentn sumergido, antes de alcanzar la preparacin. Se debe evitar administrar las disoluciones de frmaco an fras. d) Solucin Salina Fisiolgica: Se entiende por solucin salina fisiolgica (SSF), aquella diseada para mantener la viabilidad del rgano aislado. Diferentes preparados exigen distintas SSF de acuerdo a las caractersticas de cada uno. El principio que determina la composicin de la SSF es la aproximacin artificial a las condiciones fisiolgicas del entorno en que se encuentra dicho rgano o tejido cuando forma parte del organismo. Se deben, pues, tratar de respetar los siguientes parmetros:

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Composicin electroltica Osmolaridad pH Presin parcial de O2 y CO2

Fuente de energa (metablica) Temperatura Tensin mecnica

Como fuente de energa se utiliza la dextrosa y ms raramente otros sustratos como sucrosa o aminocidos. En nuestro experimento usaremos la solucin nutricia llamada Solucin de KrebsHenseleit, cuya composicin milimolar es la siguiente: e) NaCl ......................118 mM KCl........................4.75 mM NaHCO3...................25 mM MgSO4....................1.2 mM CaCl2......................1.8 mM KH2PO4...................1.2 mM Glucosa...................11 mM

Sistema de registro: Est dotado de amplificador y registrador. Los cambios de tensin, es decir la contraccin del msculo liso del preparado utilizado, deben ser adecuadamente amplificados a fin de obtener un registro que se pueda medir. El transductor isomtrico permite la traduccin de los cambios en la tensin mecnica originados por la contraccin del msculo liso, en cambios de corriente elctrica, que posteriormente sern aumentados por un amplificador al que va conectado. Este a su vez enva su seal a un registrador. La seal llega a un ordenador, que gracias al programa Biopac, registra en la pantalla la actividad mecnica del msculo (la seal elctrica se transforma en un mensaje digital que comprende el ordenador). Tambin podra utilizarse un registro poligrfico, es decir, la seal elctrica mueve unas agujas con unos rotuladores que dibujan en un papel la contraccin del rgano.

MSCULO

TRANSDUCTOR

AMPLIFICADOR

REGISTRADOR

Figura 2.- Esquema de la ruta seguida por la seal.

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2. Montaje del preparado En primer lugar se procede al sacrificio del animal, en nuestro caso, ratas de raza Wistar de peso comprendido entre 300 y 350 g. Posteriormente procedemos a identificar y extraer el rgano segn el mtodo general de Magnus. Previo al montaje, el rgano debe ser colocado en una placa Petri conteniendo SSF oxigenada a temperatura ambiente, procedindose a la eliminacin del tejido superfluo y limpieza intraluminal en el caso del ileon. Una vez limpio, se procede a cortar el segmento a montar en el bao. A continuacin se colocarn dos puntos opuestos de sujecin (hilo) donde uno de los cuales se fija a la varilla y el otro hilo se acopla a un transductor isomtrico ajustado con la correspondiente tensin inicial (0.7-1g). La sujecin se realiza con la ayuda de una aguja; por el extremo que se unir al transductor introducimos el hilo pinchando tan solo una vez en el rgano de manera que el medio nutritivo pueda penetrar a la luz del ileon (pico de flauta). En el otro extremo, que se anclar a la varilla, se pincha dos veces en el tejido, dejndose un asa de hilo antes de atarlo para no estrangular el rgano. transductor ileon varilla

Figura 3.- Esquema del montaje del ileon aislado de rata.

La preparacin se deja estabilizar durante 30 min. Una vez conseguida una linea basal estable, podemos aadir al bao agonistas que provoquen contraccin de la musculatura lisa. Al contraerse el ileon, ste tira de del transductor con una fuerza que se transforma en una seal elctrica. Despus de ser ampliada por el amplificador, podremos observar en la pantalla del ordenador una subida de la lnea basal.

agonista 1.2 gr Figura 4.- Contraccin del ileon aislado de rata

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3. Mecanismo de contraccin del msculo liso En el intestino delgado podemos distinguir tres porciones: duodeno, yeyuno e ileon. Esta ltima est constituida por distintas capas celulares: serosa, muscular, plexos nerviosos, submucosa y mucosa. De todas ellas nos centraremos en la muscular, ya que son las clulas de musculatura lisa del ileon las que van a contraerse en respuesta a diversos estimulos y por tanto las responsables de la respuesta que nosotros vamos a registrar. Entre los distintos neurotransmisores con capacidad de producir contraccin del ileon se encuentran ACh, histamina, noradrenalina...ya que el ileon posee receptores para estos mediadores. Concretamente ACh es un agonista de receptores muscarnicos y nicotnicos. El nicotnico es un receptor preganglionar, y no se encuentra en el ileon, sino en el ganglio donde sinaptan las neuronas que inervan el intestino. Esto quiere decir que mientras que el rgano aislado (sin inervacin) no responde a la estimulacin del receptor nicotnico, en el animal entero, esta estimulacin s provocara respuesta. SIST. PARASIMPTICO

PREGANG

SIST. SIMPTICO

POSTGANG NICOTINICO MUSCARNICO

ILEON

HISTAMINA Figura 5.- Inervacin de la musculatura lisa del ileon

En esta prctica nosotros vamos a aadir al bao de rganos ACh. La ACh en el bao va a interaccionar con receptores muscarnicos, concretamente M3. Tras su estimulacin se desencadenan una serie de procesos que conducen a un incremento de [Ca ] intracelular, provocando la contraccin del musculo liso. Recordemos que el receptor M3 est asociado a
2+

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una proteina G cuya activacin estimula la actividad de la fosfolipasa C (PLC). En el esquema podemos ver los segundos mensajeros y mecanismos implicados en la contraccin.

Colina + acetilo

ACE ACh

atropina

fisostigmina

M3

G q

+
PLC

IP3
Ca C 2+

DAG

a [Ca C 2+] a

+
PKC

Ca 2+ C

contraccin

diltiazem

Figura 6.- Mecanismo de accin de ACh, atropina, diltiazem y fisostigmina

El ileon presenta una contraccin bifsica, con un componente fsico (un pico de contraccin) seguido de otro tnico (una meseta mantenida). El pico de contraccin se asocia con la liberacin de Ca
2+

de los depsitos intracelulares y la contraccin tnica con la entrada de Ca

2+

a travs de canales. Otro agonista que provoca contraccin del ileon en la especie humana es la histamina, sin embargo, en el ileon de rata no se detecta contraccin provocada por histamina. Esto es debido a que en la rata existen pocos receptores a histamina, por ello para estudiar frmacos cuyo mecanismo este relacionado con estos receptores, tendremos que recurrir a otra especie, normalmente la cobaya. A continuacin comprobaremos que la ACh contrae el ileon de rata y observaremos el efecto provocado pro otros agonistas.

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4. Respuesta del ileon a diferentes agonistas Una vez tenemos listo el ileon en el bao de rganos y tras haber estabilizado durante un 30 min, vamos a comprobar el efecto de diferentes agonistas. El protocolo que vamos a seguir es el siguiente: Contraccin a ACh 10 M. Aadimos 0.25 ml de ACh 2x10 M Renovamos la SSF y una vez que vuelva a su estado basal dejamos estabilizar el rgano unos 15 min. Probamos diferentes agonistas en distintos baos: o o o KCl 120 mM (0.2 ml de KCl 4M) 5-HT 10 M (0.25 ml de 5-HT 2x10 M) NA 10 M (0.25 ml de NA 2x10 M)
-5 -3 -5 -3 -5 -3

Anotamos los resultados obtenidos. Han contrado todos los agonistas? Qu efecto ha tenido cada uno? Explica su mecanismo de accin.

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5. Realizacin de curvas dosis-respuesta Ya sabemos que la ACh produce contraccin del ileon, a continuacin vamos a comprobar como este efecto depende de la concentracin de ACh en contacto con los receptores, es decir, vamos a realizar una curva concentracin respuesta a ACh. Para ello, aadiremos al bao ACh de manera acumulativa, manteniendo las

dosis anteriores (sin renovar la SSF entre las adiciones de frmaco). Comenzaremos por ACh 10 M y alcanzaremos 3x10 M.
ACh
-9 -4

Figura 6.- Contraccin en respuesta a la adcin acumulativa de ACh

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Procedemos a preparar 5 soluciones de ACh de concentraciones crecientes, de las cuales se administran al bao las siguientes cantidades: solucin preparada orden 1. sol 2x10 M
-7

volumen administrado 0.25 ml 0.50 ml 0.25 ml 0.50 ml 0.25 ml 0.50 ml 0.25 ml 0.50 ml 0.25 ml 0.50 ml 0.25 ml 0.50 ml

concentracin en bao 10 M 3x10 M 10 M 3x10 M 10 M 3x10 M 10 M 3x10 M 10 M 3x10 M 10 M 3x10 M

-4 -4 -5 -5 -6 -6 -7 -7 -8 -8 -9 -9

2. 3.

sol 2x10 M

-6

4. 5.

sol 2x10 M

-5

6. 7.

sol 2x10 M

-4

8. 9.

sol 2x10

-3

10. 11.

sol 2x10

-2

12.

En la pantalla del ordenador comprobaremos como aparece una contraccin parecida a la recogida en la figura 6. 6. Construccin de la curva dosis-respuesta Una vez obtenidas las grficas, se miden contraccin en gramos, se corrigen los resultados restando el valor basal de contraccin y se expresan los resultados en porcentajes del efecto mximo, al que se considera 100% de efecto. La representacin grfica del experimento se suele realizar utilizando la escala logartmica, resultando una curva de forma sigmoidea. En el eje de ordenadas se representa el porcentaje de efecto y en el de abscisas el log de la concentracin molar de agonista (ACh). Una vez representada la curva, se puede calcular la dosis eficaz 50 (DE50), que se define como la concentracin de frmaco capaz de provocar el 50% de efecto. Al ser un numero exponecial negativo, se suele representar como pD2. pD2 = -log DE50

10

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Para realizar este clculo es muy til utilizar la parte de la cuva con valores de y=20 a y=80%. En esa zona, el comportamiento es lineal y por tanto el clculo matemtico de una ecuacin (y=mx + b) se simplifica. En esta tabla podemos anotar los resultados obtenidos en nuestro experimento, para luego poder construir la curva dosis-respuesta. conc ACh basal 10 M 3x10 M 10 M 3x10 M 10 M 3x10 M 10 M 3x10 M 10 M 3x10 M 10 M 3x10 M
-4 -4 -5 -5 -6 -6 -7 -7 -8 -8 -9 -9

log [ACh] -9 -8.5 -8 -7.5 -7 -6.5 -6 -5.5 -5 -4.5 -4 -3.5

Contraccin (g)

Contrac-Basal 0

% Efecto (E/Emax) x 100

Una vez obtenidos los puntos, representamos nuestra curva aproximando al modelo sigmoideo.

100

% Efecto

50

DE50 = 3x10-7
0 -10 -9 -8 -7 -6

pD2 = 6.5
-5 -4

log [ACh]

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7.- Empleo del rgano aislado para identificar mecanismos de accin

Como ejemplo prctico de utilidad de los experimentos con rgano aislado para identificar mecanismos de accin, vamos a estudiar los mecanismos de tres frmacos:

Atropina: antagonista competitivo reversible del receptor muscarnico Diltiazem. antagonista de los canales de Ca . Al impedir la entrada de Ca contraccin provocada por ACh comportndose como agonista no competitivo.
2+ 2+

inhibe la

Fisostigmina: inhibidor de la enzima acetilcolinesterasa, encargada de la destruccin de la ACh. Potencia la accin de la ACh porque inhibe su degradacin.

Para comprobar estos mecanismos procedemos a realizar el siguiente experimento: 1. Construir la curva concentracin-respuesta a ACh en ileon aislado de rata 2. Lavar el tejido durante 30 min 3. Incubar con ATROPINA (10
-8

M) 15 min de incubacin y repetir la curva concentracin-

repuesta (por ejemplo en los baos 1 y 4) 4. Incubar con DILTIAZEM (10

-6

M) 15 min de incubacin y repetir la curva concentracin-

repuesta (por ejemplo en los baos 2 y 5) 5. Incubar con FISOSTIGMINA (10 M). La Fisostigmina se aade al bao de rganos justo antes de repetir la curva dosis-respuesta. (por ejemplo en los baos 3 y 6) 6. Volver a construir la curva concentracin-respuesta a ACh Con los resultados obtenidos seremos capaces de identificar cada frmaco, ya que tienen mecanismos de accin distintos y por tanto, las modificaciones que consigan de las curvas dosis-respuesta a ACh sern diferentes.
-7

Atropina

ACh

ACh

En la figura se recogen unos resultados tpicos de la curva dosis-respuesta a ACh en presencia de atropina. La representacin de las curvas dosis-respuesta se hace de manera similar a lo

12

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recogido en la seccin anterior. Debemos tener en cuenta que nuestra intencin es comparar la curva en presencia de los frmacos ensayados (la segunda) con la realizada en ausencia de ellos (la primera, en la que solo tenamos ACh). Por este motivo, a la hora de calcular el efecto mximo, deberemos tomar como valor de referencia el mximo conseguido en la primera curva. Teniendo en cuenta los mecanismos de accin de diltiazem, atropina y fisostigmina resumidos en el esquema de la figura 6, Cmo esperas que modifiquen estos frmacos las curvas dosisrespuesta a ACh?. Se asemejan los resultados obtenidos a los esperados?. Discute los resultados.

Bibliografia Florez J. Farmacologia Humana Ed Masson (4 edicin) 2003. Barastegui Almagro C. Esquemas y prcticas de Farmacologa. Ed Espaxs 1976.

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Preparacin de disoluciones
1.- Preparacin de la solucin slina fisiolgica de Krebs-Henseleit Solucin Madre para 1L peso 82.6 g 3.5 g 1.94 g 4.22 g PM 58.44 246.48 136.09 74.56

NaCl MgSO4. 7H2O PO4KH2 KCl

Disolucin de CaCl2 0.1 M para 500ml

CaCl2

7.36 g

147

Preparacin Krebs Henseleit para 1L

84 ml de solucin madre 2 g de glucosa 2 g de NaHCO3 20 ml CaCl2 (0.1 M)

Preparacin de ACh 2x10 M para 25 ml 0.0904 g / 25 ml Preparacin de diluciones

-2

4.5 ml H2O

9 ml H2O

9 ml H2O

9 ml H2O

9 ml H2O

0.5 ml ml

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

ACh 2x10 M

-1

2x10 M

-2

2x10 M

-3

2x10 M

-4

2x10 M

-5

2x10 M

-6

9 ml

1 ml

2x10 M

-7

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Preparacin de Antagonistas
1.- ATROPINA
solucin stock en el congelador 10 M. Preparacin de diluciones: 9 ml H2O 9 ml H2O 1 ml 1 ml
-3

9 ml H2O

1 ml

Atropina 10 M

-3

Atropina 10 M
-6

-4

Atropina 10 M

-5

Atropina 10 M
-8

-6

Aadir al bao 0.5 ml de la disolucin 10 M, la concentracin alcanzada en bao ser 10 M

2.- DILTIAZEM
solucin stock en el congelador 10 M. Preparacin de diluciones 9 ml H2O
-3

1 ml

Diltiazem 10 M

-3

Diltiazem 10 M

-4

Aadimos 0.5 ml de la disolucin 10 M, en bao tendremos 10 M

-4

-6

3.- FISOSTIGMINA
solucin stock en el congelador 10 M. Preparacin de diluciones 9 ml H2O 9 ml H2O
-3

1 ml

1 ml

Fisostigm 10 M

-3

Fisostigm 10 M
-5

-4

Fisostigm 10 M
-7

-5

Aadimos 0.5 ml de la disolucin 10 M, en bao tendremos 10 M

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