Facultad de Ciencia y Tecnología

Análisis químico y biológico preliminar de las semillas de

Annona muricata L. (Annonaceae)
Irma Rojas, Rosalba Santiago, Gabriela Arvizu, Daneli Muñoz,
Daniel Pérez y Melissa Sucilla
Universidad Simón Bolívar

Resumen

El estudio fitoquímico biodirigido del extracto activo obtenido de las semillas de Annona
muricata L. (Annonaceae), empleando el ensayo de toxicidad en Artemia salina para detectar
la actividad biológica, permitió el aislamiento de dos grupos de metabolitos secundarios. De
manera adicional, se determinó el potencial antimicrobiano de algunas de las fracciones
activas del extracto orgánico de A. muricata, a través de la evaluación de la inhibición del
crecimiento de Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa.

Abstract

The study of the extract of Annona muricata L. (Annonaceae) seeds, using the toxicity test in
Artemi salina in order to detect biological activity, resulted in the isolation of two groups of
fractions of secondary metabolits. Moreover, it was determined the antimicrobian potencial
of some active fractions of the organic A. muricata´s extract, through the evaluation of the
growing inhibition of Staphylococcus aureus and Pseudomona aeruginosa.

Introducción En este contexto, en la Licenciatura en Químico

La riqueza florística de México se encuentra en el
cuarto lugar a nivel mundial en cuanto a número
de especies, por lo que se considera uno de los países
con recursos naturales más importantes del mundo.
Sin embargo, el porcentaje de especies estudiadas
desde el punto de vista químico y biológico es
relativamente bajo y, si bien es cierto que la inves-
tigación científica de la flora mexicana se ha desta-
cado por un notable y sostenido avance en el estudio
fitoquímico de muchas especies botánicas, tan sólo
un escaso número de compuestos aislados e identi-
ficados han sido evaluados para determinar sus
propiedades biológicas.
De lo anterior se desprende que el potencial de las
plantas en México, como una fuente de nuevos princi-
pios activos, incluyendo aquellos con propiedades
herbicidas, antitumorales y antimicrobianas, aún no
se ha explorado adecuadamente. Por otro lado, cabe
subrayar que el interés científico por el estudio de
las plantas mexicanas como fuente de principios
bioactivos, se ha visto incrementado en los últimos
años y cada vez es más notable la incorporación del
esquema de trabajo interdisciplinario en los progra-
mas de investigación.
Farmacéutico Biólogo de la Facultad de Ciencia y
Tecnología de la Universidad Simón Bolívar se ha
emprendido un proyecto interdisciplinario cuyo
objetivo fundamental es determinar el potencial
fitotóxico, citotóxico y antimicrobiano de especies
medicinales selectas de la flora mexicana y de los
productos derivados de las mismas, con la finalidad
de contribuir al desarrollo de nuevos agentes herbici-
das, antitumorales y antimicrobianos de origen ve-
getal, que sean biodegradables y de menor toxicidad
que los productos sintéticos convencionales utiliza-
dos actualmente.
En lo que se refiere a las especies que gozan de
prestigio en la medicina tradicional –como remedios
para la prevención y tratamiento de diferentes tipos
de cáncer–, destacan, por su potencial antitumoral
demostrado, aquellas pertenecientes a la familia
Annonaceae, entre las que se incluye la especie
Annona muricata L. (Gleye et al., 1997; Zeng et al.,
1996; Rieser et al., 1996; Wu et al., 1995a,b).
Annona muricata L. –conocida comúnmente en
México como guanábana (Figura 1)– es una especie
que se encuentra distribuida en la mayor parte de
las áreas tropicales de Veracruz, Oaxaca, Tabasco,

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 F a c u l t a d d e C i e n c i a y T e c n o l o g í a

Morelos y Quintana Roo, y se caracteriza por ser un
árbol pequeño (3-10 m) y vertical, de hojas verdes
perennes, grandes, oscuras y brillantes. Posee flores
amarillo verdosas y frutos de cáscara espinosa y pul-
pa blanca con semillas ovales y negras (Alonso, Lara,
Esquivel y Mata, 1999).
Figura 1. Annona muricata L. (Annonaceae)
grupo de metabolitos secundarios denominados
genéricamente acetogeninas, los cuales son
derivados de ácidos grasos lineales de 32 o 34 átomos
de carbono y de una unidad de ácido pirúvico, y
que generalmente contienen uno, dos o tres anillos
de tetrahidrofurano (Figura 2) (Gleye et al., 1997;
Rieser et al., 1996; Zeng et al., 1996; Wu et al., 1995a,b).
Estos productos han demostrado un marcado efecto
citotóxico, aún sobre tumores resistentes a los fár-
macos convencionales (Oberlies, Croy, Harrison y
McLaughilin 1997; Zeng et al., 1996).

Figura 2. Ejemplos de acetogeninas aisladas de Annona muricata L.

A B C D x y z R

1 S S cis R 4 2 1 OH

2 S S cis - 4 2 1 =O

3 S S cis R 5 1 1 OH

4 R R cis S 4 1 2 OH

5 R R cis R 4 1 2 OH
b
1:cis-annonacina; 2: cis-annonacina-10-ona; 3: cis-goniotalamicina;
4: arianacina; 5: javoricina.
En a se muestra el fruto de la guanábana y en b se aprecia el
fruto seccionado, las flechas indican la localización de las semillas.

Con base en lo expuesto anteriormente, se consideró

En la medicina tradicional mexicana, se le atribuyen
numerosas propiedades medicinales a esta especie,
destacando su uso como infusión para tratar diarrea,
disentería y gripe. La decocción de la corteza se reco-
mienda contra el asma y la flor hervida para el dolor
de estómago (Alonso et al., 1999). Otras características
destacables son su acción antibacteriana, antiparasi-
taria, antiespasmódica, astringente, citotóxica, febrí-
fuga, insecticida, sedativa, vasodilatadora y vermífuga
(Alonso et al., 1999).
Desde el punto de vista químico y biológico, esta
especie ha sido objeto de numerosas investigaciones,
entre las cuales sobresalen los trabajos que desde
1997 se han llevado a cabo en la Universidad de
Purdue, Indiana (Estados Unidos), para determinar
su efecto sobre diversos tipos de tumores. Como
resultado de estos estudios se ha logrado aislar a un
conveniente realizar el estudio fitoquímico biodirigi-
do de las semillas de A. muricata y la presente diserta-
ción describe los resultados obtenidos a la fecha.
Objetivo
El objetivo fundamental del estudio fitoquímico
biodirigido de las semillas de Annona muricata L.
(Annonaceae) es determinar el potencial citotóxico
y antimicrobiano de la especie, a través de la evalua-
ción tanto de su toxicidad para el crustáceo Artemia
salina Leach, como de la investigación del efecto de
algunas de las fracciones obtenidas del extracto
orgánico sobre el crecimiento de bacterias Gram
positivas y Gram negativas, con la finalidad de
obtener los constituyentes bioactivos y así contribuir

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 F a c u l t a d
al desarrollo de nuevos agentes antitumorales y
antimicrobianos de origen vegetal, que sean más
eficaces y de menor toxicidad que los productos
convencionales utilizados actualmente.
Metodología
Material vegetal. Las semillas de Annona muricata
se obtuvieron a partir del fruto entero, el cual fue
adquirido en el mercado de Mixcoac, México, D. F.,
en febrero del 2004. Las semillas se lavaron, se seca-
ron a temperatura ambiente y se fragmentaron en
una licuadora.
Extracción y fraccionamiento. Las semillas secas
se extrajeron exhaustivamente por maceración a
temperatura ambiente con Hex, CHCl3 y EtOH (10 g
con cada disolvente), y con base en los resultados
de la evaluación de la toxicidad para A. salina (TAS)
de estos extractos (Tabla 1), se realizó una extrac-
ción a gran escala con CHCl3 (concentración letal
media, CL50 < 10 ppm), para lo cual se emplearon
450 g de semillas secas y pulverizadas. El proceso
se llevó a cabo en dos ocasiones, utilizando un volu-
men total de 2.5 L de CHCl3 y dejando entre cada
maceración un periodo de 72 horas, al término de
cada una de las cuales el extracto se filtró y se con-
centró al vacío, al final se obtuvo un total de 4 g ex-
tracto seco.
El extracto activo se fraccionó de manera preliminar
mediante un proceso de partición con una mezcla
de CHCl3-H2O (1:1). La fracción clorofórmica activa
AM-1 (3.2 g, TAS CL50 < 10 µg/ml), utilizando una
mezcla de Hexano-MeOH (1:1). El ensayo de TAS
indicó que la fracción metanólica (AM-3) concen-
traba la actividad biológica (CL50 < 10 ppm). La
cromatografía en columna abierta de esta fracción
(2.2 g), utilizando gel de sílice (60 g) y un gradiente
de Hex/AcOEt/MeOH, permitió la obtención de 35
fracciones de 30 ml cada una, combinándose con
aquellas que presentaron características cromato-
gráficas similares. Como resultado de este proceso
se generaron cuatro grupos de fracciones secunda-
rias, identificadas como AM3-I (Hex/AcOEt 1:1); AM3-II
(AcOEt 100%); AM3-III (AcOEt/MeOH 95:5), y AM3-IV
(AcOEt/MeOH 1:1), de las cuales AM3-II y AM3-III
resultaron activas biológicamente (CL50 < 10 µg/ml).
La separación de los constituyentes de estas fraccio-
nes se llevó a cabo mediante CCF preparativa sobre
gel de sílice utilizando Hex/AcOEt (6:4) y CHCl3/MeOH
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d e C i e n c i a y T e c n o l o g í a
(9:1), respectivamente. Este último procedimiento
permitió obtener cuatro grupos de constituyentes
(AM3-IIa, AM3-IIb, AM3-IIIa y AM3-IIIb).
Ensayos biológicos
Determinación de la toxicidad para el crustáceo
Artemia salina Leach (TAS). El potencial citotóxico
de los extractos, fracciones y grupos de compuestos
se determinó mediante la evaluación de su toxicidad
para el crustáceo Artemia salina Leach (McLaughlin,
1991; Anderson, Gotees y McLaughlin, 1991; Meyer
et al., 1982). Los extractos se consideraron activos
cuando presentaron CL50 menores a 1000 µg/ml, mien-
tras que para las fracciones se tomaron en cuenta
valores menores a 20 µg/ml (Anderson et al., 1991;
McLaughlin, 1991). La selección del bioensayo se rea-
lizó considerando que en repetidas ocasiones se ha
encontrado una magnífica correlación entre la pre-
sencia de acetogeninas citotóxicas y la toxicidad de-
mostrada frente al crustáceo por los extractos crudos
obtenidos a partir de distintas especies de anoná-
ceas (Rupprecht, Hui, McLaughlin, 1990; Fang et al.,
1993; Gu et al., 1995). De manera adicional, el ensayo
es simple, rápido y económico (Meyer et al., 1982;
McLaughlin, 1991; Anderson et al., 1991).
Determinación de la actividad antimicrobiana.
Los microorganismos utilizados para el presente
estudio se obtuvieron en el cepario de Microbiología
Médica de la Universidad Simón Bolívar: Pseudomo-
nas aeruginosa y Staphylococcus aureus, los cuales
fueron cultivados en medio sólido de infusión
cerebro-corazón (medio BHI de BIOXON).
El potencial antimicrobiano de las fracciones activas
AM3-II y AM3-III fueron evaluados de forma cualita-
tiva utilizando el ensayo de difusión en disco (Gutié-
rrez et al., 1996; Vander y Vlietinck, 1991; Clark, El y
Li, 1981). Los discos de papel de 12 mm de diámetro
se impregnaron con 100 µl de las disoluciones de cada
fracción para obtener concentraciones de 10, 100 y
1000 µg/ml por disco y se dejaron secar a temperatura
ambiente. Las placas de medio se sembraron por du-
plicado y se inocularon con 106 bacterias/ml, pos-
teriormente se colocaron tres discos con una misma
concentración en forma equidistante y se incubaron
a 37 °C durante 24 horas. Para cada microorganismo
se preparó un control positivo de crecimiento y un
control de inhibición microbiana con el antibiótico
de referencia: (ampicilina para S. aureus y gentami-
9
 F a c u l t a d d e C i e n c i a y T e c n o l o g í a

cina para P. aeruginosa) a una concentración de
10 µg/ml. También se midieron los diámetros de las
zonas de inhibición.
Resultados
Las semillas de A. muricata fueron sometidas a un
proceso de extracción a pequeña escala, vía macera-
ción, con tres diferentes disolventes orgánicos (Hex,
CHCl3 y EtOH). Los extractos obtenidos se evaluaron
para determinar su toxicidad para el crustáceo Artemia
salina Leach (TAS). De manera general, un extracto o
fracción se considera activo en este ensayo cuando
presentan CL50 < 1000 µg/ml, mientras que para los
compuestos puros se considera una CL50 < 200 µg/ml
(McLaughlin, 1991), sin embargo, en el caso de las espe-
cies de Anonáceas, la actividad se considera significa-
tiva cuando las fracciones muestran CL50 <20 µg/ml
(Ruenpprecht et al., 1990; Fang et al., 1993; Gu et al.,
1995; Chávez y Mata, 1998a,b) Los resultados de la
evaluación biológica se encuentran incluidos en la
Tabla 1 y de ellos se desprende que el extracto más
activo fue el adquirido con CHCl3, donde se obtuvo un
CL50 <10 µg/ml, por lo que en seguida se realizó una
extracción a gran escala con este disolvente, mientras
que el de menor actividad fue el obtenido con hexano
con una CL50 >1000 µg/ml, extracto que no fue incluido
en la siguiente fase de la evaluación.
Tabla 1. Toxicidad para Artemia salina L. de los extractos y
fracciones de Annona muricata
Extracto o fracción CL50 (µg/ml)
Exto. Hex (pequeña escala) > 1000
Exto. CHCl3 (pequeña escala) < 10
Exto. EtOH (pequeña escala) 210
permitió confirmar que la fracción clorofórmica
(AM-1) mantenía la actividad biológica, por lo que la
fase acuosa fue descartada. Posteriormente, la fracción
AM-1 se sometió a un segundo proceso de partición
con una mezcla de Hex/MeOH. La evaluación biológica
de las fracciones hexánica (AM-2) y metanólica (AM-3)
permitió detectar que esta última concentraba la
mayor actividad tóxica (Tabla 1), por lo que se procedió
a separarla por cromatografía en columna abierta
sobre gel de sílice. Este proceso permitió la obtención
de cuatro grupos de fracciones secundarias, de las
cuales sólo las identificadas como AM-3-II y AM-3-III
resultaron activas. Sucesivas cromatografías en capa
fina de estas fracciones permitieron el aislamiento de
cuatro grupos de compuestos (AM-3-IIa y b y AM-3-IIIa y
b), cuya actividad biológica aún no ha sido deter-
minada. Cabe mencionar que, debido a la similitud
de los factores de retención (Rf) de los compuestos
que integran estos grupos, aún no ha sido posible su
separación y purificación.
De manera adicional, se determinó, de forma cuali-
tativa, el potencial antimicrobiano de las fracciones
activas AM3-II y AM3-III, a través de la evaluación
de su efecto sobre el crecimiento de especies de
bacterias Gram positivas (Staphylococcus aureus) y
Gram negativas (Pseudomonas aeruginosa), utili-
zando un método de difusión en disco (Clark et al.,
1981; Vander y Vlietinck, 1991; Gutiérrez et al., 1996).
Los resultados de estas evaluaciones indican que
únicamente la fracción AM3-III inhibió el crecimiento
de S. aureus, se observaron halos de inhibición de
17, 19 y 21 mm, a las concentraciones de 10, 100 y
1000 µg/ml, respectivamente (Figura 3), correspon-
dientes al 70, 80 y 90% de inhibición (Tabla 2),
comparada con la inhibición del crecimiento que
presentó esta cepa cuando fue incubada en presen-
cia de ampicilina a una concentración de 10 µg/ml
(control positivo).

AM-1 en CHCl3 < 10 Figura 3. Efecto de inhibición sobre el crecimiento de S. aureus de

AM-2 en hexano > 1000 la fracción AM3-III

AM-3 en hexano 57.4

AM3-I > 1000

AM3-II < 10
a b
AM3-III < 10

AM3-IV > 1000

El extracto clorofórmico se fraccionó de manera c d e

preliminar aplicando un método de partición con
a. Control positivo de crecimiento; b. control de inhibición con anti-
CHCl3/H2O, mediante el cual se obtuvieron las fraccio- biótico (ampicilina 10 µg/ml); c-e. inhibición del crecimiento con 10,
nes AM-1, AM-2 y AM-3. La determinación de la TAS 100 y 1000 µg/ml de la fracción, respectivamente.

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Tabla 2. Efecto de las fracciones obtenidas del extracto de las semillas de Annona muricata sobre el crecimiento de Staphylococcus aureus
y Pseudomonas aeruginosa
Staphylococcus aureus
Fracción
Concentración (µg/ml)a
10 100
AM3-II 0% 0%
AM3-III 70% 80%
Ampicilina 100%
a
Los datos expresan los porcentajes de inhibición respecto al control (ampicilina) y representan el promedio de tres determinaciones.
Discusión
La búsqueda de compuestos naturales bioactivos
(antifúngicos y antimicrobianos) se encuentra ple-
namente justificada, debido a que la mayoría de los
plaguicidas actuales son altamente eficaces para
combatir las diferentes plagas que afectan a los cul-
tivos de importancia económica. Sin embargo, mu-
chos de ellos producen daños irreversibles al ecosis-
tema, debido al alto grado de contaminación que
ocasionan en el suelo, aire y agua (Justum, Heaney,
Perrin y Wege, 1997). Así mismo, además de producir
daños neurotóxicos en los organismos vivos, un gran
número de estos agentes ha inducido la aparición
de especies resistentes que ahora resultan difíciles
de erradicar.
Por otra parte, en los últimos años, como conse-
cuencia de la aparición de micosis y otras infecciones
oportunistas asociadas con el Síndrome de Inmuno-
deficiencia Adquirida, así como de la resistencia que
han desarrollado los agentes patógenos a los anti-
bióticos que son utilizados actualmente y los graves
efectos secundarios que ocasionan, es de interés cien-
tífico el estudio de plantas medicinales como fuentes
de principios bioactivos. A este respecto, se seleccionó
la especie de Annona muricata L. (Annonaceae),
debido a que en la medicina tradicional se le atribuyen
numerosas propiedades medicinales –el uso de hojas
como infusión para tratar diarrea, disentería y gripe;
la corteza para el tratamiento del asma, y la flor
hervida para el dolor de estómago (Alonso et al.,
1999)–, y a que es objeto de estudio desde 1997 en la
Universidad de Purdue, Indiana (Estados Unidos), para
determinar su efecto sobre diversos tipos de tumores.
Sin embargo, a la fecha no se ha reportado el análisis
químico-biológico de las semillas.
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F a c u l t a d d e C i e n c i a y T e c n o l o g í a
Pseudomonas aeruginosa
Concentración (µg/ml)a
1000 10 100 1000
0% 0% 0% 0%
90% 0% 0% 0%
100%
Los resultados muestran que después de un frac-
cionamiento preliminar para la selección de
citotoxicidad en Artemia salina y un fracciona-
miento por partición en donde se obtienen grupos
de compuestos con propiedades fisicoquímicas
similares (resultados obtenidos cualitativamente),
las fracciones activas AM3-II y AM3-III presentan
una citotoxicidad muy baja. Ambas fracciones
fueron probadas como antimicrobianos con una
cepa de bacterias Gram negativas (Pseudomonas
aeruginosa) y una cepa de bacterias Gram posi-
tivas (Staphylococcus aureus). Los datos obtenidos
de estas pruebas indicaron que sólo la fracción
AM-3 III presentó actividad antimicrobiana,
inhibiendo 90% del crecimiento de la cepa de
Staphylococcus aureus a una concentración de
1000 µg/ml y no contra la cepa Gram negativa.
Cabe señalar que estos resultados son prelimina-
res y no son concluyentes acerca del efecto antimi-
crobiano que pudieran presentar las fracciones,
pues es necesario ampliar el número de especies
bacterianas sobre las que se efectúen las evalua-
ciones, así como determinar la actividad sobre di-
ferentes especies de hongos.
Conclusiones
Los resultados de la presente investigación indi-
can que la preselección de especies vegetales,
fundamentada en consideraciones quimiotaxo-
nómicas y etnobotánicas, y de selección, basada
en la aplicación de ensayos biológicos apropiados,
pueden conducir al descubrimiento de productos
biodinámicos.
El fraccionamiento biodirigido del extracto acti-
vo de Annona muricata, empleando el ensayo
11
 F a c u l t a d d e C i e n c i a y T e c n o l o g í a
de toxicidad para Artemia salina para detectar la
actividad biológica, permitió la obtención de dos
grupos de fracciones biodinámicas (AM3-II y AM3-III),
cada una constituida por una mezcla de por lo menos
dos compuestos mayoritarios (AM3-IIa, AM3-IIb,
AM3-IIIa y AM3-IIIb), de acuerdo con el análisis cro-
matográfico en capa fina de las mismas.
Los ensayos para evaluar el potencial antimicrobiano
de las fracciones AM3-II y AM3-III permitieron
detectar que la fracción AM3-III inhibe selectivamente
el crecimiento de algunos microorganismos Gram
positivos, tales como Staphylococcus aureus, y que
no presenta efecto sobre bacterias Gram negativas,
como Pseudomonas aeruginosa.*
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* Agradecemos la valiosa participación de los siguientes alumnos
en esta investigación: Gabriel Baltierra, Angélica Cibrián, Aída
Delgado, Olga Jiménez, Ariana Leonor, Mariana Nishizaki,
Alejandra Ordaz, Érik Rito y Gabriela Rosas.