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I.

Nmero y ttulo del experimento Unidad 3: Trabajo prctico N2 de Cromatografa Lquida de Alta Resolucin (HPLC).

Estudio comparativo del contenido de cafena, comercializadas en la cuidad de Talca. Muestra: N39. II. Resumen En el presente prctico de laboratorio instrumental, se determin la concentracin de Cafena en una muestra de bebida cola ( Muestra n39). Para cuantificar la cafena se utilizo la tcnica de Cromatografa Lquida de Alta Resolucin (HPLC), el cromatgrafo manipulado tena integrado un detector de arreglo de diodo, que arrojo un cromatograma con lo diferentes componentes de la bebida gaseosa. Posteriormente se confeccion una curvade calibracin (rea/Concentracin) con los datos estndares entregados en la actividad y el resultado del rea del compuesto en estudio (Cafena) entregado por el procesador de datos, con ello, se interpola en la curva, obteniendo la concentracin de la muestra problema en cuestin.

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III.

Introduccin La Cromatografa es la tcnica de separacin de los constituyentes de una mezcla. Se ha

convertido en un mtodo analtico de primer orden para identificar y cuantificar los componentes de una fase lquida o gaseosa homognea. El principio bsico se fundamenta en los equilibrios de distribucin de los compuestos presentes entre dos fases no miscibles, donde una de ellas, llamada fase estacionaria, est se encuentra inmovilizada en una columna o fijada en un soporte y la otra, llamada fase mvil, se desplaza al contacto de la primera. La elusin (proceso por el cual, se separan los solutos a travs de una fase estacionaria por el movimiento de una fase mvil) a velocidades diferentes de los compuestospresentes por la fase mvil conduce a su separacin. De todos los mtodos analticos e instrumentales, la cromatografa es el que tiene el mayor campo de aplicabilidad y por ello, ocupa una posicin dominante. La Cromatografa de Lquidos es una tcnica ampliamente utilizada que permite separar fsicamente y cuantificar los distintos componentes de una solucin. En toda cromatografa existe un contacto entre dos fases, una fija que suele llamarse fase estacionaria, y una fase mvil que fluye permanentemente durante el anlisis, y que en esta caso es un lquido. Las sustancias que permanecen ms tiempo, libres en la fase mvil, avanzan ms rpidamente con el fluir de la
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misma y las que quedan ms unidas a la fase estacionaria o retenidas avanzan menos y por tanto tardaran ms en salir o fluir. Este es el principio fundamental de la cromatografa. Dentro de la cromatografa liquida destaca la Cromatografa Lquida de Alta Resolucin, que es la tcnica cromatogrfica ms utilizada en la actualidad. Los componentes bsicos para un sistema para HPLC son: Depsitos para la fase mvil (disolvente). Sistema de bombeo para proporcionar presin a la fase mvil. Sistema de inyeccin de muestras. Columna cromatogrfica Termostato para las columnas. Detectores. Sistema para el tratamiento de datos y registrador. Los disolventes ms usados en HPLC son agua, tampn acuoso y disolventes orgnicos como el metanol. Deben ser espectroscpicamente puros, exentos de partculas slidas y desgasificados, esto se lleva a cabo con un gas inerte muy poco soluble como el helio. Como fase estacionaria lo ms comn es usar partculas microporosas esfricas de slice muy poco, que son permeables al disolvente.

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Figura N1: Cromatgrafo de HPLC.

IV.

Hiptesis y Objetivos Hiptesis: Confirmaremos si la concentracin de cafena en nuestra muestra de bebida cola

(merkat cola), que es la que se exhibe comercialmente en la etiqueta. Verificaremos los resultados obtenidos a travs de una comparacin con la muestra original y con los estudios realizados por el SERNAC. Sin embargo, nuestra muestra, no esta dentro de gaseosas analizadas, es por esto que solo realizaremos una experimentacin con la muestra original. Objetivos Objetivo general: El propsito del presente estudio es evaluar el contenido de cafena de las bebidas cola de las diferentes marcas a la venta en supermercados de la ciudad de Talca, con la tcnica de Cromatografa Lquida.

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Objetivos especficos: Determinar, mediante anlisis de laboratorio, el contenido de cafena y evaluar si los resultados analticos obtenidos determinan diferencias significativas entre ellas. Verificar si se cumple, en las etiquetas de los productos, con los requisitos de composicin y de rotulacin establecidos por la autoridad sanitaria y dems normas vigentes. Aportar informacin til y confiable sobre las efectivas ingesta de cafena, asociadas al consumo de estos productos.

V.

Datos y resultados a. Muestra La muestra de estudio est constituida por 11 bebidas Colas, las cuales varan en su forma de composicin, es decir, light o normal. Estas muestras fueron recopiladas en desde los supermercados de la ciudad de Talca, tales como Jumbo, Lder, Diproc, Santa Isabel y Unimarc entre los das 12 y 15 de Julio de 2010.

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La muestra entregada a nuestro grupo fue la muestra N 39, la cual pertenece a Merkat Cola.

Figura N 2: Fotografa de la etiqueta de la muestra N 39, correspondiente a Merkat Cola.

Esta bebida de fantasa est compuesta por ingredientes tales como: agua carbonatada, colorante natural caramelo, acido fosfrico, saborizante natural, ciclamato de sodio, aspartamo, acesulfamo de potasio, cido ctrico, benzoato de sodio y cafena. En esta muestra se estudiar la concentracin de cafena. Cafena: Nombre qumico: 1, 3,7-trimetilxantina. Frmula qumica: C8H10N4O2 Masa molar: 194.19 g x mol-1

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Figura N2: Estructura molecular de la cafena.

b. Procedimientos - Previo al laboratorio se desgasificaron las 11 muestras mediante ultrasonido. - El equipo de cromatografa liquida (HPLC), se estabiliza dejndolo en con las siguientes condiciones: la fase mvil est compuesta con una mezcla (80:20) de agua/metanol y un flujo de 1,5 ml/min. - Se toma 100 l de la muestra N 39 (Merkat Cola) con la jeringa de inyeccin para cebar esta. - Luego se vuelven a tomar 100 l para ser inyectados en el cormatgrafo, en donde 80 l son utilizados para cebar el inyector y los 20 l restantes sern objeto del anlisis por parte del equipo. - Se baja la palanca para cerrar el inyector y comenzar con el anlisis. - El proceso tarda alrededor de 7 minutos y el peak de la concentracin de cafena es aprox. en 3 min.

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- El equipo nos entrega un cromatograma el cual se imprime porque mediante este se realizan los clculos de la concentracin de cafena en la muestra.

c. Aparatos Intrumento: HPLC con Detector: DAD, Espectro 220 a 350, longitud de onda visualizacin cromatograma: 274 nm. Precolumnas: LiChroCART 125-4 LChrosper 60 Columna: RP-Select B (5um). Volumen del Loop: 20 l.

Figura N2: Fotografa del cromatgrafo de HPLC. Laboratorio N 2: Cromatografa Liquida (HPLC) Pgina 9

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d. Datos - Volumen de la muestra inyectada: 100 l. - Volumen del loop: 20 l Tabla N 1: rea y Tiempo de retencin (Tr) Tiempo de retencin (Tr) min. Cafena 2,83 rea 241272

Tabla N1: Tabla que contiene los datos dados por el cromatograma de la contramuestra de Merkat Cola.

As mismo, estos datos son comparados al momento de realizar los clculos con la muestra principal que ha sido realizada con el grupo de la maana, cuyos resultados estn dados en la siguiente tabla. Tabla N 2: rea y Tiempo de retencin (Tr) Tiempo de retencin (Tr) min. Cafena 2,73 rea 250889

Tabla N2: Tabla que contiene los datos dados por el cromatograma de la muestra de Merkat Cola, realizado por el otro grupo.

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e. Clculos Para obtener la concentracin de cafena que contiene nuestra muestra hemos utilizado una curva de calibracin con concentraciones de estndares (6, 12, 25, 50, 100 y 150 ppm) para los cuales se obtuvo una determinada rea. Se utilizaron 2 muestras para cada estndar, es decir, una muestra y una contra muestra, de las cuales se promedio el rea. Los resultados correspondientes al rea promedio de cada concentracin estndar sern los que emplearemos para crear la curva de calibracin. Luego de tener la curva podemos interpolar el rea que nos proporcion el cromatografo de nuestra muestra problema correspondiente al pico de cafena y as obtener su concentracin por interpolacin. Otra forma de obtener el contenido de cafena en nuestra muestra problema es por medio de la ecuacin de la recta:
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Y= a + bX

Donde Y, es el rea, a es el intercepto, b la pendiente y X la variable independiente la Concentracin. Para nuestra muestra la ecuacin de la recta slo con los estndares sera la siguiente: rea = 27453 + 19893 [ Mp ]

La ecuacin de la recta considerando el origen resulta de la siguiente forma: rea = 20062 + 19963 [ Mp ]

Y por ltimo al forzar a la recta a pasar por el punto 0 se obtiene esta ecuacin: rea = 20156 [ Mp ] Segn el anlisis realizado por el cromatografo pudimos obtener un pico a un

tiempo de retencin de 2,83 que sera el ms cercano y parecido al tiempo de retencin de la cafena, por lo tanto asumimos que el pico observado es el correspondiente a la cafena contenida en nuestra muestra problema, el rea resultante de aquel pico fue de 241272. Al reemplazar el rea de nuestra muestra en las ecuaciones anteriormente mencionadas se obtuvo los siguientes valores de concentracin: a) Ecuacin de la recta considerando slo los estndares: rea = 27453 + 19893 [ Mp ]

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241272 = 27453 + 19893 [ Mp ] [ Mp ] = 10,8 11 b) Ecuacin de la recta que pasa por el origen: rea = 20062 + 19963 [ Mp ] 241272 = 20062 + 19963 [ Mp ] [ Mp ] = 11,08 11.1.

c) Ecuacin de la recta que pasa por el punto 0: rea = 20156 [ Mp ] 241272 = 20156 [ Mp ] [ Mp ] = 11,97 12 f. Resultados originales Para poder visualizar las diferencias en las concentraciones obtenidas segn la recta utilizada se presenta la siguiente tabulacin de datos. Tabla N 3: Resumen de los datos calculados por las tres formas diferentes para la concentracin Concentracin Pendiente Intercepto Coef. Curva Ecuacin Obtenida (m) (a) Correlacin (r) (ppm) y = 19963x + (0,0) 19963 20062 0,9997 11,1 20062 Punto 0 20156 0 0,9994 y = 20156x 12 Slo y = 19893x + 19893 27453 0,9997 11 estndares 27453

g. Clculos de errores

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Ya que La bebida (MERKAT COLA) correspondiente a nuestra muestra problema y los ndices de cafena permitidos no se encuentran registrados en los datos del SERNAC es necesario calcular el % Error relativo de cada concentracin obtenida relacionndolas con los datos obtenidos por el grupo de la maana que posee la otra botella de MERKAT COLA considerada como la muestra original. La frmula para obtener el % de error relativo es la siguiente: % Error Relativo = Valor terico Valor obtenido Valor terico x 100

Como para obtener la concentracin de cafena en nuestra muestra ocupamos 3 frmulas distintas y por consecuencia 3 resultados diferentes es necesario calcular el % de Error relativo para los tres valores partiendo por calcular el Valor terico, que es el promedio entre la Muestra problema (grupo 1, maana) y La Contra muestra (grupo 2, tarde). Para cada ecuacin hay un valor terico distinto. Valor terico = Mp1 + Mp2 / 2 a) Clculo % Error Relativo para Curva estndar: Valor terico = 11,2 + 11 / 2 = 11,1 % Error Relativo = (11,1 11 / 11,1) x 100 = 0,9 %

b) Clculo % Error Relativo para curva que pasa por origen: Valor terico = 11,7 + 11,1 / 2 = 11,4 % Error Relativo = (11,4 11,1 / 11,4) x 100 = 2,63 %

c) Clculo % Error Relativo para curva que pasa por punto 0:

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Valor terico = 12,4 + 12 = 12,2 % Error Relativo = (12,2 12 / 12,2) x 100 = 1,64 %

h. Anlisis Como La bebida que estamos analizando como muestra problema y de la cual queremos saber la cantidad de cafena que posee ningn registro certificado acerca de sus componente y sus concentraciones y tampoco tenemos un referente entregado por el SERNAC, podemos comparar nuestros resultados solamente con los obtenidos por el grupo que posee la otra botella de MERKAT COLA, grupo 1.
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Anteriormente calculamos el porcentaje de Error relativo de las concentraciones obtenidas con las distintas frmulas y para ello se tom en cuenta los resultados obtenidos por el primer grupo para poder tener el valor terico real ya que ambas muestras corresponden a la misma marca, si bien son de distintas botellas, pero el valor si no es igual debera ser muy similar, pero ya que debemos considerar los errores de procedimiento podemos aceptar cierto margen de error. Si observamos los % de error relativos calculados anteriormente y los promediamos, el % de Error relativo promedio = 1,72 %, lo que quiere decir que los datos obtenidos se alejan en un 1,72% del valor terico real, es decir que los datos son en un 98, 28% confiables. Porcentaje suficiente para decir que nuestros datos estn muy cercanos a los obtenidos por el grupo anterior y que ese porcentaje de error obtenido slo corresponde a un error de procedimiento o de manejo de los aparatos (Muy comn en la inyeccin de muestras de cromatografa). Adems de el clculo de % de error, otro parmetro para calcular el % de cafena pero de una forma ms amplia fue el hacer un ranking de las Bebidas analizadas segn su concentracin de cafena de mayor a menor. Segn lo que nos muestra la tabla de ranking que se encuentra en los anexos, la bebida analizada por nuestro grupo se encuentra en 6to lugar con una concentracin promedio de 11,58 ppm, que al ser comparado con las dems bebidas parece ser una concentracin media, ya que no es un valor muy alto como el de la bebida Coca cola light que presenta una concentracin promedio de 133,55 ppm, ni muy baja.

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VI.

Conclusin A modo de concluir este informe y basndonos en toda la recopilacin de datos, los clculos

realizados anteriormente en base al rea entregada por el cromatgrafo de HPLC y las comparaciones con los resultados del grupo que trabajo en la maana con otra botella de la misma marca de bebida, podemos decir que estos resultados son confiables y nos entregan informacin verdica acerca de la concentracin de cafena contenida en una botella comercializada de 2 litros de marca MERKAT COLA. Lo que no se pudo deducir es si la concentracin de cafena obtenida cumple con los requisitos establecidos por el Servicio

Nacional del Consumidor (SERNAC) ya que en los datos informados por el estudio realizado por aquella institucin en el ao 2004 no se encuentra registrada la marca de bebida que hemos analizado en el laboratorio, limitando nuestras comparaciones a los datos obtenidos por el otro grupo.

VII.

Bibliografa

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Bender, G. Mtodos instrumentales de anlisis en qumica clnica . Editorial Acribia, S.A. Zaragoza, Espaa, 1992, Pg 187 209. Skoog, D., Holler, J. & Nieman, T. Principios de Anlisis Instrumental. Editorial McGraw Hill, Interamericana de Espaa, 2001. Pg. 785 805.

Linkografa [http://es.wikipedia.org/wiki/Cromatograf%C3%ADa_l %C3%ADquida_de_alta_eficacia], extrado el jueves 22 de Julio de 2010. [http://labquimica.wordpress.com/2008/02/07/cromatografia-liquida-de-altaeficiencia-hplc/], extrado el jueves 22 de Julio de 2010. [http://www.profeonline.com/laboratorioquimico/mod_12/docs/cromatografia_f undamentos_y_aplicaciones.pdf], extrado el jueves 22 de Julio de 2010.

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VIII. a)

Anexos

GRFICO REA V/S CONCENTRACIN CONSIDERANDO SLO LOS ESTNDARES

REA

CONCENTRACIN

b) GRFICO REA V/S CONCETRACIN CUANDO LA ECUACIN DE LA RECTA PASA POR EL ORIGEN

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REA

CONCENTRACIN (ppm) c) GRFICO REA V/S CONCENTRACIN CUANDO LA ECUACIN DE LA RECTA PASA POR EL PUNTO 0

REA

CONCENTRACIN (ppm)

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Tabla N 4: Ranking realizado con las 11 muestras de bebida colas de acuerdo con la cantidad de cafena, se muestran de mayor a menor. Ranking 1 2 3 4 5 6 7 8 Marca Coca Cola Light Coca Cola Serrano Pepsi Coca Cola Coca Cola Zero Kontiki Cola Rap Cola Merkat Cola ppm promedio 133,55 128,83 111,52 101,63 100,27 71,22 45,03 11,58
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9 10 11

Lider Cola Ms Sabor Cola* Acuenta Cola

0,2 0,18 0,14

Tabla N 4: Esta tabla adjunta las concentraciones de cafena en cada una de las muestras como promedio de la muestra y contramuestra. Estn ordenadas de mayor a menor en donde la muestra N 39 le corresponde el 8 lugar con un 11,58 ppm de Cafena.

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