Laboratorio de Anlisis Qumico II

INGENIERA BIOTECNOLGICA

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ESPECTROFOTOMETRA DEL VISIBLE SELECCIN DE LA LONGITUD DE ONDA ANALTICA

I OBJETIVOS
Operar adecuadamente el espectrofotmetro computarizzado Shimadzu 160 - A . Obtener espectros o Curva de absorcin Seleccionar la longitud de onda de trabajo, mxima o analtica

II GENERALIDADES
En cada tipo de sustancias los tomos, iones o molculas absorben con cierta preferencia longitudes de onda de una determinada gama de frecuencias; esto hace que los tomos, iones o molculas puedan identificarse mediante la longitud de onda a que se da lugar la absorcin. En el anlisis espectrofotomtrico, las mediciones de absorbancia se realizan ordinariamente a una longitud de onda que corresponda a un mximo del espectro de absorcin. Para ello en una determinacin deber obtenerse siempre una curva de absorcin o espectro de absorcin para ubicar en ella el pico ms alto y seleccionar la longitud de onda a la cual se produce ese mximo de absorcin. A esta longitud de onda se denomina longitud de onda analtica, de trabajo o mxima y es la longitud de onda a la cual se realiza la medicin cuantitativa. A esta longitud de onda la variacin de absorbancia por unidad de concentracin es mxima, con lo cual se obtiene la sensibilidad mxima.

III FUNDAMENTO
Para encontrar la curva de absorcin se irradia a la solucin coloreada con energa radiante de una gama de longitudes de onda de tal manera que a cada longitud de onda se mide su valor de absorbancia o de % de transmitancia; esta energa absorbida se traduce en un espectro de absorcin que es obtenido en funcin de los valores de absorbancia o de % de transmitancia frente a las longitudes de onda. En la curva se ubica el mxima pico que corresponde a un mximo de absorbancia el cual corresponde a una longitud de onda determinada; a esta longitud se denomina longitud de onda analtica, ptima o de trabajo.

IV ARREGLO EXPERIMENTAL

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Espectrofotmetro Shimadzu 160 - A. Cubeta: 1cm de trayecto ptico. Regin de trabajo: espectro visible (400 - 600 NM). Blanco: agua destilada.

Fiolas de 100 y 250 ml. Buretas de 25ml. Vasos de precipitacin de 250ml.

Solucin Stock de permanganato de potasio 0,1000 N. Solucin de permanganato de potasio con concentracin de 100 mg/L de manganeso o ppm. Soluciones standares o patrones.

1.- PREPARACIN DE SOLUCIONES STNDARES O PATRONES Preparar a partir de la solucin stock de KMnO4 0,1000 N 250 ml de una solucin de 100 p.p.m. referida a manganeso y luego preparar por dilucin los siguientes patrones: 4, 6, 8,10, 12, y 16 ppm. Para un volumen de 100 ml. 2.- SELECCIN DE MODO BSICO DE TRABAJO Cuando el interruptor de potencia es llevado a on , el instrumento es inicializado en 3 minutos, y entonces indica en pantalla el men de modo bsico,

MENU DE MODO BASICO

Modo No 1.- Fotmetro 2.- Espectro 3.- Barrido de tiempo 4.- Cintica 5.- Cuantitativo 6.- Multicomponente 7.- Memoria 8.- Sealamiento de condicin 9.- Enlace Presione el Nro 2 y luego la tecla ENTER para seleccionar el modo espectro . El blanco a emplear es agua destilada. 3.- AJUSTE DE PARMETROS ANALTICOS Luego que el modo bsico es seleccionado, es necesario primero establecer los parmetros analticos de medicin siguientes:

MOSTRARIO DE CAMBIO DE PARAMETRO

Espectro Cambio de parmetros s/n 8

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INGENIERA BIOTECNOLGICA E = 450,0 Inferior = + 0,00 A

1.- s = 600,0 nm 2.- Medicin (ABS / T %) = ABS. 3.- Superior = + 1,00 A 4.- Velocidad de barrido = rpida 5.- Ciclo T = 60 seg. N =1 6.- Cubrir Si 7.- Copiar No 8.- Barrido OBS No 9.- Fila

Si desea cambiar un parmetro presione la tecla Yes e ingrese el nmero del parmetro correspondiente, y luego ingrese el nuevo valor para el parmetro indicado por el cursor. Ahora si el ingreso es errneo presione la tecla CE y reingrese el nuevo valor. Cuando el parmetro indicado por el cursor no ser cambiado, presione directamente la tecla ENTER . Cuando el proceso de cambio de parmetro est completo, presione la tecla NO para terminar el procedimiento .

4.- MEDICIN DE STNDARES

Una vez ajustados los parmetros de medicin y al presionar la tecla No para el cambio de parmetro aparece el mensaje de insertar una muestra y presionar la tecla Star / Stop .El espectro medido es indicado en la pantalla.

5.- PROCESAMIENTO DE DATOS

Cuando la medicin termina, se indica el mensaje PROCESAMIENTO DE DATOS S/N. a) Si no es necesario el procedimiento de datos, presionar NO y es posible indicar la longitud de onda y valor medido a cualquier posicin deseada en el espectro medido, la cual es recogida por el cursor usando la techa ----- o ------ .Al espectro medido puede ser grabado en copia con la techa COPY . b) Si es necesario un procesamiento de datos, presionar SI y es posible hacer los siguientes procesamientos de datos: *0 Para almacenar el espectro medido en la memoria ... presionar 1 ENTER (nmero de canal) ENTER. *1 Para expandir o comprimir el espectro ...presionar 2 ENTER, y entonces ajustar los parmetros de escala en la abcisa y ordenada de acuerdo con la indicacin del cursor presionando (valores) ENTER, sino hay cambio necesario, slo presionar ENTER. Despus de que el espectro es indicado con nuevos parmetros de escala, el sistema pregunta VOLVER A LA CURVA ORIGINAL S/ N . Si presiona SI se obtiene de nuevo el espectro original; si presiona la tecla NO el espectro expandido es almacenado en la memoria. Para hacer una deteccin de pico ...presionar 3 ENTER, y entonces cada pico y valle son marcados y tambin sus longitudes de onda y valores son impresos. Para obtener un espectro derivado o espectro suavizado... presionar 4 ENTER y luego ingresar la orden derivada presionando (N) ENTER de acuerdo con la indicacin de la pantalla. Cuando el procedimiento es terminado, con la escala automticamente ajustada al valor derivado. El suavizado corresponde a la orden derivada. Para imprimir datos a intervalos de longitud de onda regulares ... Presionar 5 ENTER (intervalo de longitud de onda) y presionar ENTER Para plotear los datos en el ploteador X-Y,... presionar 6 ENTER. Cuando termine sus procedimientos de datos aparece en pantalla la curva debidamente suavizada con los parmetros de absorbancia frente a las longitudes de onda en NM. Con el cursor ubicar el pico ms alto de la curva, apareciendo en pantalla los valores de absorbancia y longitudes de onda que corresponde a ese pico. 9

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IX. INTERPRETACION DE DATOS

Absorbancia frente a longitudes de onda

El espectro medido puede ser grabado en copia con la tecla de COPY . Imprimir las curvas espectrales en un sistema de coordenadas teniendo en cuenta los siguientes parmetros:

Porcentaje de transmitancia frente a longitudes de onda.

X DISCUSION DE DATOS
Sealar las conclusiones que se desprenden de los grficos obtenidos.

XI CUESTIONARIO
1.- Defnase brevemente: a) La radiacin monocromtica b) El espectro de absorcin c) Porque es importante monocromatizar la radiacin policromtica 2.- describir la diferencia entre un espectrofotmetro y un fotmetro 10

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3.- En la longitud de onda de trabajo obtenida en la parte experimental a 525 nm calcular la cantidad de energa que le corresponde a esa radiacin. Compararla con una longitud de onda de 260 nm 4.- Que tipo de informacin proporciona el espectro de absorcin 5.- Seale algunas razones el porque determina la longitud de onda analtica o de trabajo 6.- Indicar que formas conoce para representar una curva de absorcin 7.- Que es un espectro de absorcin atmica y que es un espectro de absorcin molecular

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INFORME DE LABORATORIO # 1
SELECCIN DE LA LONGITUD DE ONDA DE TRABAJO
Fecha Anlisis Mtodo : 17/03/11 : Obtencin de espectro de Absorcin y determinacin de la Longitud de Onda de Trabajo : Espectrofotomtrico del visible

Clculos:
a) Expresar la concentracin en ppm referida a manganeso, una solucin de 0.1004 N, de KMnO 4 (Solucin Stock)

0.004 N =

meq 0.031606g KMnO4 54.94g Mn 1000 mg 1000ml mg KMnO4 x x x x = 1103.19 Mn ml 1g 1L 1meq KMnO4 158.03g KMnO4 L

b) Preparar 250ml de una solucin de 100 ppm a partir de la solucin Stock de 1103.19 ppm

V1 xN 1 = V2 xN 2

V1 x 1103.19 ppm = 250ml x 100 ppm V1 = 22.66 ml

Preparacin:

c) Preparacin de las soluciones patrones V1 x 100ppm = 2 ppm x 100 ml 1. 2. 3. 4. 2 ppm V1 = 4 ppm V2 = 8 ppm V3 = 12 ppm V4 = 2.0 ml 4.0 ml 8.0 ml 12.0 ml 12

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Espectro de Absorcin

Donde:
PO P b c a : : : : : : Energa radiante incidente Energa radiante transmitida Trayecto ptico b= 1cm Concentracin Absortividad del liquido (Constante) Longitud de Onda nm

Rango visible = 400 750nm Rango de trabajo = 450 600nm Intervalo = 10nm

Transmitancia
T=
P PO

%T =

PO x100% P

Absorvancia
Abs = Log

1 = - LogT T

Abs = a.b.c

TABLA DE RESULTADOS
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OBTENER LOS VALORES DE ABSORBANCIA (ABS) DE LA SOLUCIN PROBLEMA INTERVALO DE LONGITUDES DE ONDA DE 450 - 600 NM, MEDIDOS ESPECTROFOTMETRO E IMPRIMIR PARA OBTENER COPIA DE LOS DATOS.

EN UN EN EL

Espectro de absorcin en trminos de absorbancia ( ABS ) frente a las longitudes de onda ( nm )

ESPECTRO DEL PORCENTAJE LONGITUDES DE ONDA (NM)

DE

TRANSMITANCIA (%

T)

FRENTE

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CONCLUSIONES
La transmitancia se define como la cantidad de energa que atraviesa un cuerpo en determinada cantidad de tiempo

La transmitancia ptica se refiere a la cantidad de luz que atraviesa un cuerpo, en una determinada Cuando

longitud de onda. Cuando un haz de luz incide sobre un cuerpo traslcido, una parte de esa luz es absorbida por el mismo, y otra fraccin de ese haz de luz atraversar el cuerpo, segn su transmitancia . un haz de luz incide sobre un cuerpo traslcido, una parte de esta luz es absorbida por el cuerpo, y el haz de luz restante atraviesa dicho cuerpo. A mayor cantidad de luz absorbida, mayor ser la absorbancia del cuerpo, y menor cantidad de luz ser transmitida por dicho cuerpo

A mayor intensidad de color, mayor ser la absorbancia de la solucin en una determinada longitud de
onda. La absorbancia es entonces directamente proporcional a la concentracin del analito.

DISCUSIN DE RESULTADOS

CUESTIONARIO
1.- Defnase brevemente: a) La radiacin monocromtica: b) El espectro de absorcin c) Porque es importante monocromatizar la radiacin policromtica El monocromador asla las radiaciones de longitud de onda deseada que inciden o se reflejan desde el conjunto, se usa para obtener luz monocromtica. 16

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Est constituido por las rendijas de entrada y salida, colimadores y el elemento de dispersin. El colimador se ubica entre la rendija de entrada y salida. Es un lente que lleva el haz de luz que entra con una determinada longitud de onda hacia un prisma el cual separa todas las longitudes de onda de ese haz y la longitud deseada se dirige hacia otra lente que direcciona ese haz hacia la rendija de salida. 2.- Describir la diferencia entre un espectrofotmetro y un fotmetro Espectrofotmetro: Es un instrumento que permite comparar la radiacin absorbida o transmitida por una solucin que contiene una cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia Es un instrumento usado en la fsica ptica que sirve para medir, en funcin de la longitud de onda, la relacin entre valores de una misma magnitud fotomtrica relativos a dos haces de radiaciones. Tambin es utilizado en los laboratorios de qumica para la cuantificacin de sustancias y microorganismos. Hay varios tipos de espectrofotmetros, puede ser de absorcin atmica o espectrofotmetro de masa. Este instrumento tiene la capacidad de proyectar un haz de luz monocromtica a travs de una muestra y medir la cantidad de luz que es absorbida por dicha muestra. Esto le permite al operador realizar dos funciones: 1. Dar informacin sobre la naturaleza de la sustancia en la muestra Manganeso 2. Indicar indirectamente qu cantidad de la sustancia que nos interesa est presente en la muestra. 1103.19 Fotmetro 3.- En la longitud de onda de trabajo obtenida en la parte experimental a 525 nm. Calcular la cantidad de energa que le corresponde a esa radiacin. Compararla con una longitud de onda de 260 nm

mg Mn L

c: 3x105 km/s = 3x108 m/s= 3x 1010cm/s : Longitud de Onda h: Constante de Planck = 6.626 x 10-34 J.s = 6.626 x 10-27 ergios.s E: Energia de un Foton (6 .626 x 10-34 J.s) (3x108 m/s) (525nm)(1m/10-9) = 3.78 x10-27 (6 .626 x 10-34 J.s) (3x108 m/s) (260nm)(1m/10-9) = 7.64x10-28
4.- Que tipo de informacin proporciona el espectro de absorcin Espectro viene a ser una especie de imagen de la energa radiante absorbida o emitida por un cuerpo, cuando interacciona con la materia. El espectro de absorcin es una grfica de porcentaje de transmitancia, absorbancia, logaritmo de absorbancia o absortividad molar de un analito en funcin de la longitud de onda o del nmero de onda y ocasionalmente de la frecuencia. El espectro de absorcin es una grfica que indica en que forma la absorbancia depende de la longitud de onda. Las curvas espectrales son caractersticas de la sustancia absorbente y, por tanto, estas curvas pueden utilizarse para el anlisis cualitativo del soluto. Algunas sustancias dan espectros con 17

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muchos picos como los compuestos orgnicos y son mucho ms complicados que las inorgnicas. 5.- Seale algunas razones el porque determina la longitud de onda analtica o de trabajo 6.- Indicar que formas conoce para representar una curva de absorcin 7.- Que es un espectro de absorcin atmica y que es un espectro de absorcin molecular Espectros de absorcin atmica Al incidir radiacin policromtica visible y U.V. sobre una sustancia constituida por partculas monoatmicas; nicamente son absorbidas algunas frecuencias de esa gama. Por ejemplo; para el caso particular del Sodio, al estado monoatmico, absorbe radiacin correspondiente a 589,00 a 589,59 nm los electrones del tomo de sodio pasa de un nivel 3s a 3p. Se reduce en un espectro con un pico fuerte absorcin a esa longitud de onda. La radiacin visible U.V. solo puede provocar transiciones o excitaciones en niveles exteriores llamados de valencia. Espectros moleculares Las molculas absorben energa de varias formas, sobre todo cuando se trata de molculas en estado condensado. La energa interna de una molcula en su forma total corresponde a: E total = E electrnica + E vibratoria + E rotatoria

ANEXOS
Espectrofotmetro Virtual http://www.uhu.es/quimiorg/uv2.html Funcionaminto de un espectrofotmetro de luz visble e ultravioleta http://www.youtube.com/watch?v=UZR6ghjCqaE Esquema espectrofotmetro UV-VIS http://www.youtube.com/watch?v=On4sESp0U7o

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