Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular

CINETICA ENZIMATICA: VALORACION DE FOSFATASA ALCALINA

1.- FUNDAMENTO TEORICO Cintica enzimtica Las reacciones qumicas en los sistemas biolgicos slo ocurren en presencia de catalizadores, que son protenas especficas denominadas enzimas. La presencia de una enzima se detecta por las reacciones especficas que cataliza. Toda reaccin enzimtica puede esquematizarse como sigue: E+S E-S E+P

As, la enzima se combina con un sustrato (S) que se transforma en un producto (P). El tiempo que tarda una determinada cantidad de S en transformarse en P es lo que caracteriza a la enzima, y se denomina velocidad o actividad enzimtica (V) que se define como cantidad de sustrato transformado (o de producto formado) en la unidad de tiempo. Para muchas enzimas, la velocidad de catlisis, (V) vara con la concentracin de sustrato [S] en la forma que muestra la fig.1.

Figura 1: representacin de V en funcin de [S], para una enzima que sigue la cintica de Michaelis-Menten.

Figura 2: representacin de dobles recprocos de la cintica enzimtica. (Lineweaver-Burk)

Los parmetros cinticos de una enzima, Vmx. y KM pueden calcularse utilizando distintos tipos de representacin grfica. Uno de ellos es el de dobles recprocos que aparece en la figura 2 y se utiliza posteriormente en esta prctica

Medida de la actividad enzimatica a) Los mtodos ms comunes de valoracin de enzimas son: b) Volumtricos, cuando en la reaccin enzimtica se consume o se produce un producto gaseoso. c) Colorimtricos, cuando el producto formado es coloreado o da color en una reaccin posterior (por ejemplo en la valoracin de la fosfatasa alcalina). d) Espectrofotomtricos, para aquellas reacciones enzimticas que utilizan NAD(P) o NAD(P)H como coenzimas. e) Radiomtricos, utilizando un sustrato marcado radiactivamente. Fosfatasa alcalina Las fosfatasas alcalinas son un grupo de enzimas similares, que catalizan la liberacin de cido fosfrico de algunos steres monofosfricos a un pH elevado. Son por tanto fosfohidrolasas ortofosfricas (EC 3.1.3.1)

Son protenas de membrana cuya estructura es la de una glicoprotena. La parte glucdica est formada por cadenas de oligosacridos que llevan generalmente en el extremo ms alejado de la protena cido silico. El papel fisiolgico de la fosfatasa alcalina no est totalmente clarificado pero se cree que est en relacin con el transporte, ya que es particularmente abundante en aquellos tejidos que tienen funciones de transporte de nutrientes y en el hueso durante el proceso de calcificacin (nio, adulto con fracturas recientes, etc). Los niveles en suero se ven elevados en enfermedades seas y hepticas. La fosfatasa alcalina es un ejemplo de enzima cuya actividad puede ser medida por un mtodo colorimtrico. Este se basa en la transformacin de un sustrato, el p-nitrofenilfosfato (p-NFP), en p-nitrofenol (p-NF), producto coloreado que en solucin alcalina absorbe a 405 nm.

Incolor o

Amarillo (max 405 nm)

2.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL 2.1.- Recta de calibrado de p-NF. La primera parte de la prctica consiste en la obtencin de la curva de calibrado del p-nitrofenol (pNF), que se utilizar en el apartado 3 para calcular la [pNF] producido en la reaccin enzimtica a partir de las absorbancias obtenidas. Disponer 6 tubos como sigue: tubo 0 1 2 3 4 5 tampn 1,5 ml 1,5 ml 1,5 ml 1,5 ml 1,5 ml 1,5 ml agua 1,20 ml 1,17 ml 1,14 ml 1,11 ml 1,05 ml 1,00 ml pNF 625M -0,03 ml 0,06 ml 0,09 ml 0,15 ml 0,20 ml NaOH 0.2N 0.3 ml 0.3 ml 0.3 ml 0.3 ml 0.3 ml 0,3 ml [pNF]/tubo (producto)

Abs. 405 nm

Calcular la concentracin de pNF (producto) en cada tubo teniendo en cuenta que: VC = V'C' y antalo en la tabla anterior. Representar grficamente las absorbancias frente a la concentracin de pNF en cada tubo y trazar la recta de calibrado. 2.2.- Efecto de la concentracin de sustrato A continuacin se realiza un estudio del efecto de la [S] sobre la velocidad de reaccin enzimtica. A partir de dicho estudio se determinarn los parmetros cinticos Vmx y KM. 2.2.1 Preparar 6 tubos del siguiente modo (el extracto de hueso debe ser lo ltimo que se aade): p-NFP 10 mM (sustrato) -0,03 ml 0,06 ml 0,15 ml 0,30 ml 0,60 ml [p-NF] (producto formado en la reaccin )

tubo 0 1 2 3 4 5

tampn 1,5 ml 1,5 ml 1,5 ml 1,5 ml 1,5 ml 1,5 ml

agua 1,10 ml 1,07 ml 1,04 ml 0.95 ml 0,80 ml 0,50 ml

extracto de hueso 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml

Abs. 405nm

[p-NF] V = -------------t

a) b) c) d) e) f)

Agitar Incubar los tubos a temperatura ambiente durante 10 minutos. Aadir 0,3 ml de NaOH 0,2 N (para detener la reaccin) Leer absorbancias a 405 nm, frente al blanco. Interpolar el valor de estas absorbancias en la recta patrn de p-NF (apartado 2.1) con el fin de conocer la concentracin de producto obtenido. Anotar cada valor en la tabla, indicando las unidades. Calcular la velocidad de reaccin o actividad enzimtica, V, y anotar los valores en la tabla de arriba.

2.2.2 Calcular la concentracin de sustrato [p-NFP] en cada tubo, teniendo en cuenta que: VC = V'C' y antalo en la siguiente tabla junto con la velocidad. Calcula las inversas de ambos parmetros.

Tubo 1 2 3 4 5

[S]

1/[S]

1/V

3. TRATAMIENTO Y DISCUSIN DE LOS RESULTADOS 3.1.- Representar grficamente V frente a [S] (representacin de Michaelis-Menten) 3.2.- Representar grficamente 1/V frente a 1/[S] (representacin de dobles recprocos de Lineweaver- Burk). 3.3.- Calcular la KM y la Vmx de la fosfatasa alcalina para p-NFP como sustrato, a partir de la grfica anterior. 4. MATERIAL Y REACTIVOS -Tubos de ensayo - Colormetro y cubetas de colormetro - NaOH 0,2 N -Tampn carbonato/bicarbonato 20 mM, pH 10,5

- Sustrato: p-nitrofenilfosfato (p-NFP) 10mM - Producto: p-nitrofenol (p-NF) 625 M - Muestra: extracto de hueso