UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA UNAD ESCUELA DE CIENCIAS BASICAS, TECNOLOGA E INGENIERIA CONTENIDO DIDCTICO DEL CURSO: 210101

1 MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

211624 MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS CLAUDIA PATRICIA ZAMBRANO PARRA

MARTHA VINASCO Acreditadora

BOGOTA Septiembre de 2010

ASPECTOS DE PROPIEDAD INTELECTUAL Y VERSIONAMIENTO

El presente mdulo fue diseado en el ao 2005 por Carmen Eugenia Pia Lpez, M.Sc. Ciencias Biolgicas; M.Sc. Docencia Universitaria; Especialista en Nutricin Animal Sostenible; Especialista en Informtica y Multimedia. Docente de la UNAD desde 1986. El mdulo se modific en el ao 2010 por Claudia Patricia Zambrano Parra, M.Sc. Microbiologa. Docente-ctedra de la UNAD desde el 2009, para darle el nfasis requerido en el rea de la microbiologa de alimentos. Las siguientes son las modificaciones realizadas: 1. reas temticas Se modificaron los aspectos relacionados con los Conceptos generales y la diversidad microbiana para darle un mayor nfasis al rea de la microbiologa de alimentos. Igualmente se incorpor una unidad denominada: Importancia de la microbiologa de alimentos, en la que se incluye Microorganismos asociados a procesos industriales y enfermedades transmitidas por alimentos, microorganismos indicadores de alimentos y microbiologa de ambientes, superficie y manipuladores. Adicionalmente, el captulo 2.2 sobre Tcnicas de seguridad, cultivo, mtodos de recuento y control se modific para darle un mayor nfasis al aspecto experimental en el rea de alimentos. 2. Mejoramiento didctico Carmen Pia realiz la adecuacin de unidades para manejo mediante el sistema de crditos con el tiempo regulado para 3 crditos acadmicos y la realizacin de estrategias de aprendizaje por fases de reconocimiento, profundizacin y transferencia. Claudia Zambrano modific las estrategias de aprendizaje (fases de reconocimiento, profundizacin y transferencia) para darle el nfasis necesario al rea de microbiologa de alimentos. Este documento se puede copiar, distribuir y comunicar pblicamente bajo las condiciones siguientes: Reconocimiento. Debe reconocer los crditos de la obra de la manera especificada por el autor o el licenciador (pero no de una manera que sugiera que tiene su apoyo o apoyan el uso que hace de su obra). No comercial. No puede utilizar esta obra para fines comerciales. Sin obras derivadas. No se puede alterar, transformar o generar una obra derivada a partir de esta obra. Al reutilizar o distribuir la obra, tiene que dejar bien claro los trminos de la licencia de esta obra. Alguna de estas condiciones puede no aplicarse si se obtiene el permiso del titular de los derechos de autor Nada en esta menoscaba o restringe los derechos morales del autor.

CONTENIDO

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Introduccin Justificacin Unidad 1. Conceptos Generales Capitulo 1. Generalidades Leccin 1. Definicin de microbiologa Leccin 2. Historia y clasificacin de los microorganismos Leccin 3. Campos de aplicacin Leccin 4. Entidades de referencia Captulo 2. Diversidad Microbiana Leccin 5. Introduccin Leccin 6. Microorganismos acelulares: Virus Leccin 7. Microorganismos acelulares: Viroides y priones Leccin 8. Microorganismos celulares procaroticos: Bacterias Leccin 9. Microorganismos celulares eucaroticos: Hongos, Protozoos y Helmintos Leccin 10. Otros microorganismos de inters alimenticio Captulo 3. Crecimiento bacteriano Leccin 11. Metabolismo Bacteriano Leccin 12. Crecimiento Bacteriano Leccin 13. Fases de crecimiento bacteriano Leccin 14. Factores fsicos Leccin 15. Factores qumicos

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Unidad 2. Importancia de la microbiologa de alimentos Captulo 4. Microorganismos asociados a procesos industriales Leccin 16. Fermentacin alcohlica Leccin 17. Fermentacin lctica Leccin 18. Produccin de cido actico Leccin 19. Produccin de cido citrco Leccin 20. Otros procesos industriales Captulo 5. Microorganismos indicadores de alimentos Leccin 21. Mesfilos

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Leccin 22. Coliformes Leccin 23. Salmonella Leccin 24. Clostridium sulfito reductores Leccin 25. Staphylococo aureus Leccin 26. Hongos y levaduras Leccin 27. Listeria monocytogenes Leccin 28. Escherichia coli O157:H7 Leccin 29. Bacillus cereus Captulo 6. Enfermedades transmitidas por alimentos (ETAs) Leccin 30. Enfermedades transmitidas por alimentos de tipo txico Leccin 31. Enfermedades transmitidas por alimentos de tipo infeccioso Leccin 32. Enfermedades transmitidas por alimentos causadas por protozoos Leccin 33. Enfermedades transmitidas por alimentos causadas por helmintos Leccin 34. Enfermedades transmitidas por alimentos causadas por virus Captulo 7. Microbiologa de ambientes y manipuladores Leccin 35. Evaluacin del ambiente Leccin 36. Evaluacin de los manipuladores de alimentos 82 82 83 83 84 84 85 85 86 87 88 90 91 92 94 94 95

Unidad 3. Tcnicas de laboratorio utilizadas en el rea de alimentos Captulo 8. Generalidades Leccin 37. Microscopa Leccin 38. Preparacin en fresco Leccin 39. Tipos de tinciones Leccin 40. Medios de cultivo

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Captulo 9. Tcnicas de cultivo en alimentos Leccin 41. Tcnicas de diluciones seriadas Leccin 42. Sistemas de siembra y recuento de colonias Leccin 43. Tcnicas de cultivo Leccin 44. Tcnicas de identificacin de microorganismos Leccin 45. Tcnicas microbiolgicas utilizadas en la evaluacin del ambiente Glosario

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Bibliografa 121

6 INDICE DE FIGURAS

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Figura 1. Experimento de Francisco Redi Figura 2. Experimentos realizados por Louis Pasteur Figura 3. Los tres dominios del mundo viviente Figura 4. Microfotografa de Adenovirus Figura 5. Virus Bacteriofgo Figura 6. Bacteriofgo infectando una bacteria Figura 7. Esquema de bacteria Figura 8. Biparticin Figura 9. Levaduras Figura 10. Hifas septadas multinucleadas Figura 11. Hongos del pan Figura 12. Paramecio Figura 13. Entamoeba Histoltica Figura 14. Balantidium Figura 15. Giardia Lamblia Figura 16. Plasmodium Figura 17. Fasciola Heptica Figura 18. Taenia Saginata Figura 19. Nemtodo gastrointestinal Figura 20. Clasificacin de los seres vivos Figura 21. Curva de crecimiento bacteriano Figura 22. Fermentacin alcohlica Figura 23. Produccin de cerveza Figura 24. Fermentacin lctica Figura 25. Produccin de citrato Figura 26. Tipos de ETAs Figura 27. Tincin de Gram Figura 28. Tcnicas de dilucin seriada

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7 INDICE DE TABLAS

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Tabla 1. Clasificacin de bacterias segn su morfologa Tabla 2. Procesos fermentativos Tabla 3. Nmero de clulas bacterianas por generacin Tabla 4. Clculos del crecimiento bacteriano Tabla 5. Microorganismos productores de enzimas Tabla 6. Principales medios de cultivo para aislamiento bacteriano

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8 INTRODUCCIN

El curso de Microbiologa de alimentos busca que el estudiante de Ingeniera de Alimentos, conozca el funcionamiento y accin de los microorganismos asociados con la produccin de alimentos, ya sean beneficiosos o perjudiciales, y de esta forma pueda establecer una interaccin provechosa, en una industria que debe estar en permanente evolucin y actualizacin y donde el consumidor cada vez toma una posicin ms activa frente a la calidad del producto que est comprando. El anlisis microbiolgico de los alimentos tiene como finalidad evaluar las prcticas de manufactura del alimento producido, convirtindose as en un indicador directo de la lnea de produccin y elaboracin del alimento. Es decir, seala la calidad y seguridad del alimento elaborado, aspectos fundamentales para el posicionamiento y proyeccin del producto alimenticio. Por otro lado, el ingeniero de alimentos debe tener un slido conocimiento microbiolgico de su rea, pues esto le facilita la implantacin de sistemas de calidad, como las buenas prcticas de manufactura o el sistema HACCP, entre otros, necesarios dentro de la industria alimenticia para obtener productos de alta calidad. El curso est diseado para estudiantes de educacin a distancia con aprovechamiento de ambientes virtuales de aprendizaje, por consiguiente hace nfasis en la autogestin formativa mediada, sin excluir interacciones directas entre tutor y estudiante y de los estudiantes entre s.

JUSTIFICACIN

Las actuales reglamentaciones nacionales e internacionales sobre los productos alimenticios, han llevado a mantener un estricto control microbiolgico dentro de toda la cadena de transformacin del producto, que va desde las materias primas hasta el producto final. Estas exigencias sanitarias y fitosanitarias requiere de ingenieros de alimentos con slidos conocimientos microbiolgicos, que le permitan identificar los potenciales peligros en un producto determinado y adems facilite su proyeccin a un mercado cada vez ms globalizado. Es decir, con esta visin microbiolgica, dada por el curso de microbiologa de alimentos, el ingeniero de alimentos puede establecer las fuentes y modos de contaminacin, los efectos sobre el procesamiento del alimento, la supervivencia de los microorganismos y sus toxinas, la multiplicacin durante la produccin y el almacenamiento, entre otros. Estos conceptos, le permiten al ingeniero de alimentos tomar decisiones fundamentadas, desde el punto de visto microbiolgico, con el nico fin de mantener su producto en ptimas condiciones. Igualmente, se hace necesario el componente prctico del curso pues es all donde se da la transferencia del conocimiento y adems se le da al ingeniero de alimentos, el soporte metodolgico necesario para que pueda sustentar las validaciones necesarias de su proceso productivo. As mismo, el ingeniero de alimentos tiene que desarrollar programas de inocuidad alimentaria, como buenas prcticas de manufactura o el sistema HACCP, que benefician en primera instancia al consumidor, pero que obviamente le permite a la industria alimenticia tener un valor agregado sobre el producto final, pues los sistemas de calidad son una carta de presentacin del producto elaborado, que facilita las relaciones comerciales a todo nivel. Finalmente, el objetivo industrial principal es obtener un producto conforme a las disposiciones legales, de forma que puedan evitarse las alteraciones microbiolgicas que afecten la calidad del producto final y la salud del consumidor.

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Uso de Iconos En todos los casos deben hacer click sobre el icono para abrirlo

Indica que hay un documento en .pdf como lectura complementaria

Indica que hay una direccin electrnica para profundizar.

Indica que hay un video informativo.

Indica que se habla de una utilidad concreta de la microbiologa, relacionada con la unidad revisada.

11 UNIDAD DIDCTICA 1 CONCEPTOS GENERALES

UNIDAD 1. Conceptos Generales La Unidad 1 le permite al estudiante conocer la evolucin de la microbiologa al ubicarlo histricamente en esta rea de estudio. Igualmente le facilita la contextualizacin de los conceptos microbiolgicos en las diferentes reas de aplicacin y su utilidad dentro de las entidades de referencia. Adems, la Unidad 1 introduce al estudiante en la multivariedad microbiana y sus interacciones con el medio que los rodea, determinando los principales factores que afectan su metabolismo y crecimiento. La comprensin de los conceptos generales relacionados con el rea de la microbiologa requiere que el estudiante se ubique histricamente, aplique los mismos en diferentes reas de trabajo y los valide en entidades de referencia. Igualmente es necesario que el estudiante evidencie la diversidad microbiana y las diferentes interacciones que se dan en el crecimiento bacteriano. 1. El estudiante explica el concepto de microbiologa, la utilidad del mismo y las entidades de referencia que regulan su rea de trabajo. Competencias 2. El estudiante interpreta los diferentes acontecimientos histricos relacionados con el rea de microbiologa. 3. El estudiante analiza y argumenta las posibilidades de accin en los diferentes campos de aplicacin de la microbiologa. 4. El estudiante identifica los diferentes microorganismos, su metabolismo y los factores que afectan el crecimiento. Lograr que el estudiante profundice en los conceptos bsicos de microbiologa teniendo en cuenta el contexto histrico, los campos de aplicacin y las entidades de referencia tiles para esta rea en particular. Igualmente se busca que el estudiante identifique la diversidad microbiana y el funcionamiento metablico de los mismos. 1. Que el estudiante identifique claramente el concepto de microbiologa y su utilidad en el rea de trabajo. 2. Que el estudiante establezca la importancia de un contexto histrico y la forma como ste puede determinar el desarrollo de la microbiologa. 3. Que el estudiante identifique los campos de aplicacin de la microbiologa de manera que pueda ubicarse claramente en cada uno de ellos. 4. Que el estudiante determine la importancia de las entidades de referencia en su campo laboral. 5. Que el estudiante conozca la diversidad microbiana y su accionar metablico frente al medio que lo rodea.

Introduccin

Justificacin

Propsito

Objetivos

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Horas de trabajo acadmico Palabras clave

El contenido de esta unidad corresponde a un crdito acadmico, que equivale a 12 horas de acompaamiento tutorial y 36 horas de trabajo independiente. Microbiologa, Historia, aplicacin, entidades de referencia, diversidad microbiana, crecimiento, metabolismo.

Mapa Conceptual Unidad 1: Generalidades

Captulo 1 Generalidades La microbiologa, como ciencia, se ha desarrollado en la medida que se disean nuevos instrumentos pticos o electrnicos que amplifican organismos no detectados a simple vista. En un primer momento no se le dio importancia al hecho de encontrar organismos en sustratos como el agua, suelo y alimentos, sin embargo, mucho tiempo despus se supo que estos microorganismos realizaban cambios qumicos tanto tiles como nocivos en su medio e incluso que algunos podan producir enfermedades. Estos conocimientos estimularon la investigacin,

13 lo que llevo a las aplicaciones que actualmente tiene la microbiologa, como por ejemplo el rea de alimentos o la biotecnologa. Por otro lado, las reas de trabajo de la microbiologa requieren una serie de entidades cuya finalidad es la de regular y controlar las prcticas realizadas para cada caso. Las lecciones que se encuentran en este captulo son: Leccin 1. Definicin de Microbiologa Leccin 2. Historia y Clasificacin de microorganismos Leccin 3. Campos de Aplicacin Leccin 4. Entidades de Referencia

Leccin 1. Definicin de Microbiologa La microbiologa estudia los microorganismos u organismos generalmente microscpicos, aunque algunos pueden ser observados a simple vista. El objeto material de la microbiologa viene delimitado por el tamao de los seres que investiga, lo que supone que abarca una enorme heterogeneidad de tipos estructurales, funcionales y taxonmicos: desde partculas no celulares como los virus, viroides y priones, hasta organismos celulares tan diferentes como las bacterias (eubacterias y arqueas), los protozoos, algunas algas, los hongos y levaduras. La microbiologa es una disciplina que aporta tanto conceptos, como tcnicas y metodologas tiles para la gestin industrial de muchos procesos, que aprovechan la capacidad de los microorganismos para la produccin rpida de una serie de insumos y de transformaciones de materiales, necesarios para el desarrollo humano y econmico, tales como aumento y rendimiento de cultivos, biofertilizantes, biocontrol, vectores para transferencias de informacin gentica en el desarrollo de plantas transgnicas, produccin de compuestos qumicos y aditivos para alimentos, eliminacin de materiales contaminantes y residuos txicos del medio ambiente entre otras.

14 Leccin 2. Historia y Clasificacin de los microorganismos Historia La historia y evolucin del estudio de los microorganismos se remonta a Girolamo Fracastore (1478-1553), mdico y humanista, quien se considera la primera persona que, desde el punto de vista cientfico, relaciona la enfermedad con la presencia de un parsito, y lo detalla en su obra "De contagione et contagiosis morbis" en la que introdujo el concepto "Seminaria morbis" (semilla de enfermedad) y en la que explica el origen del mal francs o morbus gallicus, actualmente conocida como sfilis1. El nacimiento de la microbiologa, debi esperar la aparicin del microscopio a comienzos del siglo XVII por el holands Antony van Leeuwenhoek. l se dedico en su tiempo libre, al arte de la fusin del vidrio y el tallado de los lentes, que lo llevo a lograr la amplificacin de lo que observaba, hasta 40 y 160 veces. Sus descubrimientos los relat detalladamente a la Sociedad Real de Londres mediante cartas peridicas que les enviaba.

Lectura complementaria sobre Antony Van Leewenhoek, donde encontrarn una descripcin de la vida de este comerciante, quien revolucion el mbito cientfico al usar lentes que permitieron descubrir un nuevo mundo microscpico.

Los primeros tratados editados sobre la naciente ciencia de la microscopa fueron publicados en el siglo XVII, por Pierre Borel, mdico, anticuario y fillogo francs, en 1656: por Henry Power, mdico ingls, en 1663-1664; y por Henry Hooke, quien en 1665 public su renombrada Micrographia 2. Despus de los estudios de Leeuwenhoek y Hooke, el inters por los microorganismos disminuy y solo surge nuevamente gracias a Louis Pasteur, a quien se le atribuye, con justa razn, la creacin de la microbiologa como una ciencia. Pasteur inicia el estudio sistemtico de los procesos fermentativos, lo que lo lleva a concluir que las fermentaciones eran el producto de la accin microbiana. Por otro lado, para explicar el origen de la vida, desde la antigedad, se vena manejando el concepto que sostena que la Tierra an conservaba parte de su
Llorente-Bousquets y col.1995. Historia de la biologa comparada. De Nicols de Cusa a Francis Bacn. Vol. III. UNAM.Mxico. p.59. 2 Herrera, J.R. 2001. El pensamiento biolgico a travs del microscopio. Fondo de cultura econmico. Mxico. p.17
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15 capacidad original para generar vida, lo que se denomin la Teora de la Generacin espontanea. Es decir, que a partir de materiales orgnicos en descomposicin se producian espontneamente los seres vivos. En contra de esta teora, los italianos Francisco Redi (mediados siglo XVII) y Lazzaro Spallanzani (mediados siglo XVIII), realizaron una serie de experimentos: Redi coloc pedazos de carne en frascos abiertos y cerrados y not que slo aparecan gusanos en los frascos abiertos (figura 1), obviamente depositados por las moscas y Spallanzani prob distintas infusiones vegetales, tiempos y temperaturas de calentamiento. Sus resultados, segn sus propias palabras, pusieron en evidencia que el nmero de animalillos desarrollados, es proporcional a la comunicacin con el aire externo. El aire conduce a los grmenes a las infusiones, o ayuda a la expansin de aquellos all presentes 3.

Figura 1. Experimento de Francisco Redi

Fuente:http://aportes.educ.ar/biologia/nucleo-teorico/recorrido-historico/comoseoriginalavida/los_primeros_experimentos.php

Pasteur particip de la polmica apoyado de sus experimentos en los que haba demostrado que cada fermentacin era producida por un tipo especfico de microorganismo. Durante cuatro aos, Pasteur recorri el mundo explicando sus experimentos, anulando as, la teora de la generacin espontanea al punto que jams volvi a ser considerada seriamente. Para demostrar que el calentamiento no destrua ningn principio vital u origen de la vida en el aire, sino a los microorganismos presentes, Pasteur recurri a experimentos muy ingeniosos, por ejemplo, utiliz recipientes con cuellos largos y curvos, en los que coloc un caldo que haba hervido durante algunos minutos. Al retirarlo del fuego, el aire entraba por el cuello, pero los microbios quedaban atrapados en l, lo que impeda que contaminaran el lquido y permita conservarlo

Herrera, J.R. 2001. El pensamiento biolgico a travs del microscopio. Fondo de cultura econmico. Mxico. p.17

16 estril indefinidamente. Slo cuando se rompa el cuello, aparecan organismos en el caldo (Figura 2).

Figura 2. Experimentos realizados por Louis Pasteur.

Fuente: http://es.geocities.com/joakinicu/imagen0016.htm

Clasificacin taxonmica En cuanto a la clasificacin taxonmica de los microorganismos, en un principio no fue muy clara, puesto que la microbiologa como ciencia, solo sera aceptada una vez Pasteur inicia sus trabajos experimentales. El gran naturalista sueco Carl von

17 Linn, padre de la taxonoma, muestra en su Systema natura, de 1758 (casi 100 aos despus de los estudios de Leeuwenhoek), el desconocimiento que se tena en ese momento sobre los microorganismos, pues los clasifica en un extrao grupo llamado Chaos infusorium 4 Desde la poca de Linn, la organizacin de los seres vivos comprenda dos reinos: plantas y animales. Los conceptos ms claros para la clasificacin inicial de las bacterias fueron introducidos por Ferdinand Julius Cohn (1872) quien seal la imposibilidad de aplicar los mismos parmetros que hasta ese momento se utilizaban para plantas y animales, por considerar que eran organismos totalmente diferentes5. Ernest Heinrich Haeckel, bilogo alemn, en 1866 propone un tercer reino que denomina Protista, en el cual incluye todos los organismos sencillos, como protozoos, algas, hongos y mneras (bacterias) y en 1969 el norteamericano Robert H. Whittaker, establece un sistema de cinco reinos, basado en la distincin entre clulas procaroticas y eucaroticas: Monera, que incluy organismos procaroticos como las algas azul verdosas y las bacterias. Protistas, que incluy organismos eucaroticos como euglenoides, diatomeas, dinoflagelados y protozooarios. Plantas Hongos Animales

Whittaker no incluy los virus por no considerarlos organismos vivos6. Posteriormente, con la aparicin del microscopio electrnico y las tcnicas moleculares se determin que los seres vivos se pueden clasificar en tres grandes dominios (una categora taxonmica ms grande que los reinos): Bacterias, Archeas y Eucariotas. El dominio Bacteria, comprende las bacterias verdaderas, el dominio Archea (griego achaios, antiguos) que comprende un grupo de procariotas con caractersticas extremas metablicas y el dominio Eucariotas (Eucarya) que incluye todos los dems organismos vivos de la tierra: protozoos, hongos, plantas y animales. Un grupo importante de bilogos, basndose en estudios genticos, han concluido que los tres dominios tienen un nico antecesor comn, y que las Archeas actuales tienen ms cercana con las clulas eucaroticas que con las mismas bacterias (procariotes)7. Figura 3.
Herrera, J.R. 2001. El pensamiento biolgico a travs del microscopio. Fondo de cultura econmico. Mxico. p.17. 5 Ganten, D y col. 2004. Vida, Naturaleza y Ciencia. Editorial Santillana. Bogot, Colombia. p.643 6 Carpenter, P. 1979. Microbiologa. Editorial Interamericana. Mxico. p.27 7 Purves, W.K. et col.2004. Life. The science of biology. 7a.Edicin.Edit. Sinauer Associates. U.S.A. p. 525.
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Figura 3. Los tres dominios del mundo viviente. Las relaciones e interrelaciones entre los seres vivos
todava siguen siendo muy controversiales y permanentemente se estn actualizando. Fuente: Imagen tomada y adaptada de The Science of Biology. (2004).

Segn el sistema binomial propuesto por Linneo, el nombre cientfico de un organismo incluye dos palabras, esto es, el gnero y la especie. El gnero se refiere al conjunto de caractersticas que comparte un grupo de organismos, por ejemplo: Felis, representa a un grupo de animales felinos que se caracterizan por ser carnvoros, de tamao pequeo y colas cortas. Dentro de este gnero, encontramos las siguientes especies: Felis chaus (gato selvtico o de los pantanos), Felis manul (gato de las estepas de Mongolia, Siberia y Tbet), Felis margarita (gato del desierto). Por convenciones internacionales, el gnero se escribe la primera letra en mayscula y la especie toda en minscula. Adems se subraya el nombre completo y se escribe en cursiva. En el caso de las bacterias, un ejemplo es el gnero de los Streptococcus, que pueden crecer en condiciones arobicas, anaerobias o en presencia de CO2 y formar colonias pequeas y puntiformes. A continuacin se mencionan algunas de las especies ms importantes, dentro de este gnero: El Streptococcus pyogenes relacionado con cuadros de faringitis, sinusitis, artritis, entre otros. El Streptococcus agalactiae causante de la meningitis en los recin nacidos y el Streptococcus pneumoniae, que en nios menores de 14 aos y recin nacidos puede causar otitis media, neumona y meningitis.

Leccin 3. Campos de Aplicacin La relacin de la microbiologa con otras disciplinas ha generado el desarrollo de otros campos del conocimiento como:

19 La microbiologa industrial se encarga de estudiar y manipular los microorganismos a gran escala para que produzcan compuestos o realicen funciones tiles como la produccin y transformacin de alimentos, frmacos, vacunas, disolventes orgnicos. Por ejemplo la protena unicelular utilizada en la alimentacin animal y producida por microorganismos cultivados sobre desechos industriales, da rendimientos muchsimo ms elevados que la producida en las cosechas. La microbiologa clnica estudia e identifica los agentes causantes de enfermedades y su proceso infeccioso, as como la respuesta inmunolgica del paciente (sistema inmune y proteccin ante agresiones externas), y la seleccin del tratamiento antimicrobiano. La microbiologa agrcola estudia los procesos microbianos tiles para el crecimiento de las plantas, adems de las enfermedades de las plantas causadas por hongos, bacterias, virus, viroides entre otros. La microbiologa Sanitaria desarrolla procesos de ingeniera a gran escala para el tratamiento de residuos. La microbiologa del agua potable investiga y aplica mtodos para eliminar las bacterias patgenas en redes de agua. Igualmente gracias al estudio de los microorganismos, en la actualidad, se han desarrollado otras ramas de la Biologa, como son la Gentica Microbiana, la Ingeniera gentica y la Biotecnologa. La gentica microbiana estudia la funcin de los genes, su expresin y regulacin. La Ingeniera gentica con importante aplicacin tanto en la en la parte clnica y en la agricultura. Mediante tcnicas de ADN recombinante se han producido protenas como la insulina, la hormona del crecimiento, el interfern, el factor VIII de coagulacin, las beta endorfinas que suprimen el dolor, vacunas contra microorganismos causantes de enfermedades La biotecnologa microbiana se conoce como el manejo, modificacin gentica y propagacin de microorganismos vivos mediante el uso de tecnologas como el cultivo de tejidos y la ingeniera gentica, que dan como resultado la obtencin de microorganismos nuevos o mejorados. Otra de las grandes aplicaciones y sobre todo de inters para el curso, corresponde a la microbiologa de alimentos, que se encarga de estudiar los microorganismos como transformadores de alimentos y como agentes de deterioro de alimentos. En el primer caso selecciona, mantiene y mejora microorganismos tiles en la generacin de productos alimenticios, con nuevas caractersticas sensoriales: texturas, olores o sabores. En el segundo caso se encarga de

20 desarrollar mecanismos para prevenir y controlar el contacto de ciertos microorganismos con los alimentos. Esta rea de la microbiologa se fundamenta en el hecho que los microorganismos producen cambios tiles y nocivos en los alimentos. La elaboracin de muchos productos sera imposible sin la participacin de los microorganismos, por ejemplo: la cerveza, el pan, el queso, entre otros. Los cidos producidos por algunos microorganismos evitan, en ciertos alimentos, la actividad microbiana molesta o no conveniente, por ejemplo en: encurtidos y leches fermentadas. En cuanto a la descomposicin de los alimentos, por accin de los microorganismos, los ejemplos los encontramos permanentemente en la vida diaria.

Leccin 4. Entidades de Referencia Se entiende por entidades de referencia aquellas instituciones que debido a sus objetivos, condiciones tcnicas, operativas y de investigacin se convierten en referentes o puntos de apoyo para una determinada rea de trabajo, en este caso el rea de alimentos. Dentro de estas entidades encontramos: INVIMA (Instituto Nacional de Vigilancia de Medicamentos y Alimentos) Es un establecimiento pblico del orden nacional, de carcter cientfico y tecnolgico, con personera jurdica, autonoma administrativa y patrimonio independiente, perteneciente al Sistema de Salud, adscrito al Ministerio de la Proteccin Social y con sujecin a las disposiciones generales que regulan su funcionamiento. Sus objetivos y jurisdiccin son los siguientes: - Ejecutar las polticas formuladas por el Ministerio de la Proteccin Social en materia de vigilancia sanitaria y de control de calidad de: medicamentos, productos biolgicos, alimentos, bebidas alcohlicas, cosmticos, dispositivos, elementos mdico-quirrgicos, odontolgicos, productos naturales, homeopticos y los generados por biotecnologa, reactivos de diagnstico y otros que puedan tener impacto en la salud individual y colectiva. - Actuar como institucin de referencia nacional y promover el desarrollo cientfico y tecnolgico referido a los productos descritos en el artculo anteriormente sealado. El INVIMA tiene jurisdiccin en todo el territorio nacional; el domicilio y sede de sus rganos administrativos principales est en la ciudad de Bogot D.C. Esta entidad es un referente importante en cuanto a la normatividad colombiana de medicamentos y alimentos.

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El INVIMA fue creado en 1995 y una de sus principales funciones es la de emitir la normatividad relacionada con los medicamentos y alimentos, a nivel nacional.

ICONTEC (Instituto Colombiano de Normas Tcnicas Colombianas) Esta institucin es una Entidad reconocida por el Gobierno Nacional cuya funcin principal es la elaboracin, adopcin y publicacin de las normas tcnicas nacionales y la adopcin como tales, de las normas elaboradas por otros entes. Segn el decreto 2269 de 1993, por el cual se reglamenta el sistema nacional de normalizacin, certificacin y metrologa, se define la norma tcnica como el documento establecido por consenso y aprobado por un organismo reconocido, que suministra, para uso comn y repetido, reglas, directrices y caractersticas para las actividades o sus resultados, encaminados al logro ptimo de orden en un contexto dado. Las normas tcnicas se deben basar en los resultados consolidados de la ciencia, la tecnologa y la experiencia y sus objetivos deben estar enfocados haca el beneficio comn para la comunidad. En el rea de alimentos, las normas tcnicas colombianas indican las condiciones organolpticas y fsico-qumicas del producto, las tcnicas recomendadas para la identificacin de microorganismos y las especificaciones relacionadas con el empaque, entre otros.

El ICONTEC adems de ser la entidad encargada de promover las Normas Tcnicas Colombianas (NTC), tambin es un organismo de certificacin, reconocido a nivel internacional.

CODEX ALIMENTARIUS El Codex Alimentarius es una entidad de referencia a nivel mundial sobre el manejo y cuidado de los alimentos. Dicha institucin agrupa un conjunto de normas, cdigos de prcticas, directrices, y otras recomendaciones, relacionados todos con el manejo adecuado de los alimentos. Algunos de estos textos son muy generales y otros muy especficos. Algunos contienen requisitos detallados sobre un alimento o grupos de alimentos; otros tienen por objeto el funcionamiento y la gestin de procesos de produccin o el funcionamiento de sistemas de reglamentacin pblica de la inocuidad de los alimentos y la proteccin de los consumidores.

22 El nombre del Codex Alimentarius actual deriva del cdigo austraco. En el Imperio austrohngaro, entre 1897 y 1922, se elabor una coleccin de normas y descripciones de productos para una gran variedad de alimentos bajo el ttulo de Codees Alimentarius Austriacus. Aunque careca de fuerza jurdica, fue utilizado como referencia por los tribunales con el fin de determinar normas de identificacin para ciertos alimentos. El 11 perodo de sesiones de la Conferencia de la FAO en 1961 y la 16 Asamblea Mundial de la Salud (OMS) en 1963 aprobaron las resoluciones por las que se estableca la Comisin del Codex Alimentarius. Los dos rganos adoptaron tambin los Estatutos y el Reglamento de la Comisin. La FAO y la OMS ayudan a los pases en desarrollo a aplicar las normas del Codex y a reforzar los sistemas nacionales de control alimentario as como a aprovechar las oportunidades del comercio internacional de alimentos. Una de las contribuciones ms importantes de la FAO y la OMS a la labor de la Comisin es el asesoramiento cientfico, en especial la evaluacin de riesgos, prestado por comits y consultas de expertos. Normalmente la Comisin del Codex se rene cada dos aos, alternativamente en la Sede de la FAO y en la Sede de la OMS en Ginebra. En el 2005, la Comisin estaba integrada por 171 pases, que representaban el 98 por ciento de la poblacin mundial. El creciente inters mundial por todas las actividades del Codex indica claramente la aceptacin en todo el mundo de los conceptos del Codex, que se refieren a la armonizacin, la proteccin de los consumidores y la facilitacin del comercio internacional.

El Codex Alimenticius es un organismo de orden internacional cuya normatividad sirve de base para las diferentes legislaciones alimenticias en los pases miembros.

Infovideo del Codex Alimenticius que explica la organizacin, desempeo y objetivos de este organismo.

Cul fue la principal contribucin de Leeuwenhoek a la microbiologa? Qu son las tcnicas aspticas y de qu modo contribuy Pasteur a su impulso? En qu se diferencian la virologa, la bacteriologa y la parasitologa? Qu utilidad prctica tiene el conocimiento de las entidades de referencia en el rea de alimentos?

Preguntas de repaso

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Para qu sirve la microbiologa? El manejo gentico de los microorganismos ha permitido que estos se conviertan en una herramienta muy til dentro de la biotecnologa. Hasta principios de los 80s se utilizaba insulina, extrada del pncreas de vacas y cerdos, para el manejo de los diabticos. Actualmente se produce la insulina a partir de bacterias que han sido modificadas genticamente para este fin. Lo primero que se realiz fue la construccin de genes sintticos para cada una de las dos cadenas de polipeptdos que forman la molcula de la insulina. Luego esto genes se insertaron en un plasmido-vector junto con el gen que sintetizaba la enzima -galactosidasa, y que servira de marcador. Finalmente se obtuvieron los dos polipeptdos de las bacterias, separados por la -galactosidasa y unidos por mtodos qumicos para formar la insulina humana8 .

Captulo 2 Diversidad microbiana

El concepto de diversidad microbiana se refiere al hecho de la increble variedad de microorganismos y su importancia ecolgica en el mantenimiento del equilibrio del ambiente, sin que por ello se excluya el hecho que tambin son agentes causales de enfermedades tanto en plantas como animales y por supuesto el hombre. Por lo tanto, es importante conocer las caractersticas morfolgicas y funcionales de los distintos grupos de microorganismos (virus, priones, bacterias y hongos) de manera que sea ms fcil su identificacin y su estudio en aplicaciones industriales y de alimentos. Adems esta amplia variedad microbiana ha llevado a que la microbiologa se especialice en reas como la virologa (ciencia que estudia los virus), la parasitologa (ciencia que estudia los helmintos), la micologa (ciencia que estudia los hongos) y la bacteriologa (ciencia que estudia las bacterias). Las lecciones que se encuentran en este captulo son: Leccin 5. Introduccin

Tortora, G.J. y col. 2007. Introduccin a la microbiologa. Edit. Mdica Panamericana. 9. Edicin. Buenos Aires.p266.

24 Leccin 6. Microorganismos acelulares: Virus. Leccin 7. Otros microorganismos acelulares: Viroides y Priones. Leccin 8. Microorganismos celulares procaroticos: Bacterias. Leccin 9. Microorganismos celulares eucaroticos: Hongos, Protozoos y Helmintos.

Leccin 10. Otros microorganismos de inters alimenticio: Cianobacterias y Microalgas.

Leccin 5. Introduccin Los microorganismos son los seres ms numerosos que habitan en todas las regiones del planeta: suelo, aire, agua, hielo, rocas, cuerpo del hombre y de los animales, en plantas, alimentos. Sin ellos nuestro planeta no podra sobrevivir. La mayora son de tamao microscpico, aunque los hay visibles a simple vista como es el caso de algunos hongos y algas. A excepcin de los virus, los microorganismos pueden existir como clulas individuales o como colonias de clulas. Una clula microbiana puede realizar de forma independiente todos los procesos metablicos necesarios para vivir. De acuerdo con su estructura celular los microorganismos pueden ser procariotas y eucariotas. Dentro de los procariotas se encuentran las bacterias: eubacterias y arqueas, microorganismos unicelulares. Dentro de los eucariotas se agrupan: los hongos filamentosos pluricelulares de mayor tamao y las levaduras unicelulares pertenecientes al reino Fungi, las algas (rojas, diatomeas y verdes) y los protozoos pertenecientes al reino protista. Tambin encontramos microorganismos acelulares de tamao submicroscpico como son los virus, viroides, virusoides y priones. Los microorganismos pueden ser: parsitos cuando son agentes causantes de enfermedades, simbiontes cuando son habitantes de la flora normal de la piel, cavidades y tracto digestivo del hombre y de los animales y saprofitas la gran mayora, ayudando a la descomposicin de la materia orgnica muerta. Tambin son benficos cuando se utilizan en medicina, en la industria y en el control de la contaminacin. El papel de los microorganismos en el mantenimiento de los ecosistemas es de vital importancia, ya que son los responsables del reciclamiento de la materia. En los ciclos biogeoqumicos, todos los ecosistemas terrestres y acuticos dependen de los microorganismos para sostener sus requerimientos nutricionales.

25 Las bacterias pueden vivir como parsitos afectando los organismos donde habitan, como simbiontes formando parte de la flora bacteriana normal de la piel, cavidades y tracto digestivo del hombre y de los animales y saprofitas la gran mayora, ayudando a la descomposicin de la materia orgnica muerta.

Leccin 6. Microorganismos acelulares: Los Virus Caractersticas de los virus Los virus se encuentran en todos los lugares: aire, agua, suelo, en todos los materiales y no como estructuras aisladas, sino parasitando las clulas de bacterias, hongos, plantas, animales y el hombre. Son organismos submicroscpicos (observables solo a travs del microscopio electrnico), de forma variable, pueden ser alargados, en forma de de valos puntiagudos o de ladrillos con las esquinas redondas, otros son polidricos, icosadricos (polgono de 20 lados), otros tienen apariencia de cuerdas con bucles, otros como los bacterifagos que atacan a las bacterias, tienen forma ms compleja su estructura presenta cabeza y cola (Figura 4).

Figura 4. Microfotografas de Adenovirus

Fuente: http://www.emc.maricopa.edu/faculty/farabee/BIOBK/BioBookDiversity_1.htm

Organizacin y composicin de los Virus Los virus contienen solamente un tipo de cido nucleico que puede ser: ADN (cido desoxirribonucleico) o ARN (cido ribonucleico). El cido nucleco est rodeado por una cubierta de protena denominada cpside viral, la cual tiene como funcin proteger el cido nucleico vrico de la accin de las nucleasas presentes en los lquidos biolgicos, adems de propiciar la unin del virus con los receptores de la clula a infectar. La cpside a su vez est constituida por fragmentos de protenas llamadas cpsomeros y constituye la mayor parte de la

26 masa del virus. La cpside y el cido nucleco se denominan: nucleocpside. Algunos tipos de virus, poseen una envoltura externa que envuelve la cpside y que est constituida por lpidos y protenas. La envoltura tiene su origen en la membrana de la clula infectada y es tomada en el momento en que el virus abandona la clula. La presencia de lpidos en la envoltura hace que los virus sean sensibles a disolventes de grasa como el ter. A esta estructura completa se la denomina partcula vrica o virin. Los virus por ser organismos acelulares, carecen de ribosomas, de sistemas productores de energa (ATP) y de sistemas enzimticos, elementos necesarios para realizar sus procesos metablicos de manera independiente, como son su crecimiento y replicacin. Por esto, el genoma viral utiliza el metabolismo de la clula hospedadora, constituyndose los virus en parsitos intracelulares obligados, motivo por el cual se les sita en el lmite entre lo vivo y lo no vivo. Los virus tienen especificidad por el tipo de clula a infectar, es decir un virus puede infectar una clula vegetal pero no una animal y solamente un tipo de clula dentro del organismo animal o vegetal.

Infovideo de Enciclopedia Planeta sobre los componentes bsicos de los virus.

Mecanismos de accin Los virus pueden actuar de dos formas distintas: - Como agentes infecciosos productores de enfermedades en el hombre, las plantas y los animales. Se reproducen en el interior de las clulas que infectan, de donde obtienen todo el material y los mecanismos requeridos para su replicacin. Al no poseer metabolismo propio son insensibles a los antibiticos y a otros frmacos que actan sobre las vas metablicas, siendo en su mayora susceptibles al interfern. - Como agentes genticos que modifican el material hereditario de las clulas que infectan, al unirse a su material gentico y causar variabilidad gentica, un ejemplo es la accin de los bacterifagos (virus que infectan a las bacterias).

Ciclo vital de los virus o mecanismo de replicacin ltico

27 El ciclo vital de los virus consta de las siguientes cuatro fases: entrada en la clula, eclipse, multiplicacin y liberacin del virus. Veremos primero el ciclo vital de un virus, explicado de la forma ms general posible, para pasar a continuacin a estudiar las diversas modalidades que pueden presentarse en cada una de las fases del ciclo.

1. Entrada La entrada en la clula consta a su vez de dos etapas: la adsorcin o fijacin del virus en la superficie celular y la penetracin a travs de la membrana. En la fase de fijacin, el virus se une a la membrana de la clula hospedadora de forma estable. Hay una alta especificidad en la fijacin de un virus a la membrana de su clula hospedadora, porque se ha de producir la unin entre protenas especificas de la cpside vrica y glicoprotenas de la membrana plasmtica de la clula que lo hospeda. Cada virus ha ido adquiriendo sitios de unin especficos, para anclarse en la membrana de un determinado tipo de clula. La penetracin o inyeccin, a travs de la membrana, sigue diversas modalidades. Como resultado, bien el virus completo, bien solamente su cido nucleico, logra invadir el citoplasma celular. Por regla general, se necesita el concurso de muchos virus para que alguno de ellos logre penetrar en la clula. 2. Eclipse La fase de eclipse corresponde a un tiempo, despus de la penetracin, en que el virus parece desaparecer, pues no se advierte ningn indicio de su presencia ni de su actividad. Lo que ocurre en esta fase es que se da un desensamblaje de las piezas del virus (si es que ha penetrado completo), y su cido nucleico queda asimilado en las estructuras celulares aptas para los procesos de replicacin y trascripcin. Esta fase, es variable de unos tipos de virus a otros. Durante esta fase se produce la sntesis del ARN, necesario para generar las copias de protenas de la cpside. Tambin se produce la continua formacin de cidos nucleicos virales. Termina con la sntesis de los ARNm necesarios para que se sinteticen las protenas que actuarn en la multiplicacin del virus. Si el cido nucleico del virus es ADN, este se inserta en el ADN de la clula hospedera y de esta manera el virus logra que la clula hospedera fabrique las protenas vricas. El cido nucleico viral se replica en la clula que parsita utilizando las enzimas, el material y los mecanismos de la clula que lo hospeda. Si el cido nucleico del virus es ARN, el virus debe primero cambiar su ARN en ADN, empleando la maquinaria de la clula hospedera para poder insertarse y

28 enzimas como la transcriptasa reversa. Luego, la clula hospedera fabrica las protenas vricas y el cido nucleico viral se replica en la clula que parsita utilizando las enzimas, el material y los mecanismos de la clula que hospeda. 3. Replicacin y ensamblaje La replicacin del virus consiste tanto en la replicacin de su cido nucleico como en la sntesis de las protenas de la cpside. Los cidos nucleicos y las protenas recin sintetizadas, se ensamblan rpidamente, producindose nuevas partculas vricas. En esta fase se produce la unin de los capsmeros para formar la cpside y el empaquetamiento del cido nucleico viral dentro de ella.

4. Liberacin y Lisis La liberacin del virus consiste en la salida de las nuevas partculas vricas o viriones, que podrn infectar nuevas clulas iniciando un nuevo ciclo. Los viriones salen de la clula, mediante la lisis o ruptura enzimtica de la pared bacteriana que conlleva a la muerte celular. Los nuevos virus se encuentran en situacin de infectar una nueva clula. Modalidades de penetracin en la clula Los virus sin envoltura lipdica se introducen en la clula con cpside y todo, lo cual puede realizarse de dos maneras: Por penetracin directa, donde despus de la fijacin, el virus abre una brecha en la membrana y se introduce en el citoplasma. Por endocitosis, la membrana forma una invaginacin en torno al virus, llegando a formar una vescula que penetra en la clula. Formada la vescula, el virus abre una brecha en la membrana de la misma con ayuda de algunas enzimas hidrolticas que l mismo transporta, penetrando as en el citoplasma.

Los virus con envoltura lipdica burlan la barrera de la membrana celular porque su cubierta lipdica se funde con la membrana, ya que tienen la misma naturaleza. Esta fusin de membranas puede realizarse en dos lugares distintos: Fusin en la superficie celular, de manera que el virin penetra directamente en el citoplasma. Fusin con un lisosoma, por lo que se forma una vescula por endocitosis, a la que se une un lisosoma para digerir la partcula introducida; entonces, la

29 cubierta lipdica del virus se funde con la membrana del lisosoma y el virin escapa hacia el citoplasma. Modalidades de fase de eclipse Segn la duracin de la fase de eclipse, se suelen distinguir dos modalidades de ciclo infeccioso de un virus: Ciclo ordinario: el cido nucleico vrico procede inmediatamente a la transcripcin de su mensaje gentico en los ARNm necesarios para su multiplicacin, y prosigue rpidamente el ciclo vital. Este tipo de ciclo es el ms extendido en la naturaleza. Ciclo lisognico: Ocurre en los bacterifagos. El ADN vrico se cierra por sus extremos generando un ADN circular. Este ADN se inserta en el ADN bacteriano en un lugar especfico en el que la secuencia de nucletidos bacterianos es semejante a alguna regin del ADN vrico (Figura 5).

En el ciclo lisognico, la bacteria prosigue sus funciones vitales sin que el virus realice ninguna accin, y cuando el ADN bacteriano se duplica tambin lo hace el ADN vrico, de manera que el genoma del virus pasa a las dos bacterias hijas. La multiplicacin bacteriana puede seguir durante generaciones sin que el virus se manifieste. Pero ante una alteracin de las condiciones ambientales, el ADN vrico se separa del bacteriano y prosigue entonces las restantes fases de ciclo infeccioso, produciendo la muerte de la bacteria y nuevos ejemplares del virus (Figura 6).

Figura 5. Representacin esquemtica de un virus bacterifago. Fuente: Carmen Eugenia Pia

Figura 6. Representacin esquemtica de bacterifago infectando una bacteria. Fuente: Carmen Eugenia Pia

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Modalidades de multiplicacin del virus La multiplicacin del virus consta de la replicacin de su material gentico, de la transcripcin de su mensaje en una molcula de ARNm y de la traduccin del mensaje para producir las protenas vricas, tanto las que formarn parte de la cpside como las protenas enzimticas, necesarias para el ensamblaje de las piezas del virin. Los ribosomas y la mayor parte de las enzimas que los cidos nucleicos vricos utilizan en estos procesos son los de la clula infectada. Posteriormente a estos procesos, tiene lugar el ensamblaje de las piezas del virus para construir nuevos viriones. Modalidades de liberacin de los nuevos virus Despus del ensamblaje del virus tiene lugar la liberacin de los nuevos individuos, que tendrn la capacidad de infectar nuevas clulas. Las principales modalidades de liberacin de los virus dan nombre a nuevas variantes de su ciclo vital: Ciclo ltico y lisognico Estos dos ciclos configuran las etapas reproductoras de un virus bacterifago. En referencia al ciclo ltico, ste se inicia con el anclaje del cuerpo vrico a la superficie de la bacteria y la posterior inyeccin de parte de su material gentico en el interior de la bacteria. El paso posterior es el aprovechamiento del medio interno de la bacteria para sintetizar ms virus a partir de componentes citoplasmticos, tales como protenas. Cuando se han fabricado los suficientes cuerpos vricos, la bacteria se lisa (rompe) y se liberan. En cuanto al ciclo lisognico, el proceso se inicia con la inyeccin del material gentico del virus en la bacteria, del mismo modo que en el proceso anteriormente expuesto; los filamentos de ADN inyectados a presin del cuerpo vrico se combinan con el material gentico de la bacteria, denominndose ste proceso Recombinacin Gnica. Dicha combinacin da como resultado una secuencia de nucletidos bacteriana y vrica, con la cual se sintetizan nuevos virus. ste ciclo puede dar a su vez un nuevo ciclo ltico. Los nuevos virus no esperan a la muerte de la clula hospedadora para abandonarla, sino que van saliendo de la clula al mismo tiempo que se van produciendo, de manera que la clula puede seguir viva y produciendo nuevas partculas vricas. La liberacin puede hacerse de dos maneras: Los virus sin envoltura lipoproteica salen directamente, sin arrastrar ningn resto de la membrana plasmtica, bien sea abriendo una brecha en la

31 membrana, o bien aprovechando los mecanismos de exocitosis o salida de sustancias al exterior de la clula. Los virus con envoltura lipoproteica salen por gemacin, es decir, se rodean de una porcin de membrana plasmtica que acaba separndose de la clula y constituye la cubierta lipoproteica del nuevo virus.

Leccin 7. Otros microorganismos acelulares: Viroides y Priones. Los Viroides son molculas de ARN circular que carecen de cubierta viral o cpside, son de tamao menor que los virus. Su ARN est formado por muy pocas bases nitrogenadas (246-399) que guarda la informacin para su propia sntesis en un hospedador adecuado al que causa, frecuentemente, una alteracin patolgica. Atacan principalmente clulas vegetales causando enfermedades. Debido a que los viroides no codifican para ninguna protena deben necesariamente reclutar protenas y vas metablicas de la clula hospedera para completar su ciclo infeccioso. Se les considera como la etapa primitiva de los virus. Algunos producen enfermedades en plantas, como la papa, el pepino, el tomate, la naranja, la vid, el coco, entre otros, causando importantes prdidas econmicas. Los Priones se definen como partculas protecas infecciosas y son causantes de un grupo de enfermedades neurodegenerativas que tienen caractersticas comunes, como presentar un perodo de incubacin bastante largo (usualmente varios meses o aos, incluso dcadas), luego del cual aparecen sntomas neurolgicos progresivos que llevan a la muerte del individuo infectado9. La protena causante de este tipo de enfermedades se conoce como Protena pronica scrapie (PrPsc) y es idntica, en cuanto a la secuencia de aminocidos, a una protena sintetizada por el husped, PrPc, pero que difiere en su estructura secundaria y terciaria, es decir, en la forma como se organiza en el espacio. El cambio de configuracin de la protena del prin es crucial, ya que las protenas con lminas beta son muy resistentes a las enzimas proteolticas, al calor y no se disuelven en agua. Pero sobre todo, la protena alterada tiene una caracterstica
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McEwen,J.G. 1994. Los priones. Innovacin y ciencia. Vol.III.No.4. 39-42p.

32 nica: interacciona con una molcula de protena normal, le cambia la conformacin y la hace capaz de transformar las estructuras de ms protenas normales. Ah radica al parecer, el poder infectivo de los priones. Un ejemplo de una enfermedad pronica, es la Encefalopata espongiforme bovina (EEB), que ataca el ganado bovino y que se conoce con el nombre comn de la enfermedad de las vacas locas, debido a la descoordinacin motora de los animales y puede ser transmitida al hombre a partir de la carne infectada.

Leccin 8. Microorganismos celulares procaroticos: Bacterias. Estructuras de las bacterias

La estructura bacteriana se divide en dos grupos: la estructura externa, que no se encuentra en todas las clulas y participa en funciones especializadas; y la estructura interna que se encuentra en todas las clulas procariotas y es probablemente esencial para su supervivencia. Dentro de las estructuras externas se encuentran: la pared celular, los flagelos, las esporas, las fimbrias o pelos y la cpsula. Estas estructuras no siempre se encuentran en todas las bacterias, razn por la cual se estima que no son esenciales. Estructuras externas - Pared celular Es una estructura rgida, se encuentra rodeando la membrana citoplasmtica de casi todas las bacterias, posee una gran rigidez lo cual le confiere gran resistencia. Se considera esencial para el desarrollo y divisin bacteriana; cumple con dos

33 funciones importantes: mantener la forma de la clula y evitar que la clula colapse debido a las diferencias de presin osmtica por el constante intercambio de fluidos. El grosor de la pared oscila entre de 10 y 80 nanmetros. La pared celular constituye una porcin apreciable del peso seco total de la clula; dependiendo de la especie y de las condiciones de cultivo puede representar del 10 al 40 % del peso seco del organismo. La pared celular en las bacterias, se encuentra formada bsicamente por peptidoglicano (molcula formada por protenas y carbohidratos o azcares). La coloracin de Gram, permite diferenciar dos grandes grupos de bacterias: las Gram positivas y Gram negativas. Las primeras tienen una pared celular ms gruesa que las segundas, lo que permite diferenciarlas en el momento de la coloracin.

Curso de Microbiologa general, licenciatura de Biologa, de la Universidad de Granada, donde explica en detalle la composicin de la pared celular en organismos procaroticos.

- Membrana plasmtica La membrana plasmtica, en las bacterias, presenta invaginaciones hacia el citoplasma llamados mesosomas, que contienen enzimas que participan en la duplicacin del ADN. Tambin en la membrana plasmtica, se localizan enzimas que intervienen en la produccin de energa (ATP), funcin que en la clula eucaritica cumple la mitocondria.

Curso de Microbiologa general, licenciatura de Biologa, de la Universidad de Granada, donde explica en detalle la composicin de la membrana plasmtica y su funcionamiento.

- Flagelos Los flagelos estn presentes en la mayora de bacterias, generalmente son rgidos, implantados en la membrana celular mediante un corpsculo basal.

34 Permiten a la mayora de bacterias la movilidad en medios lquidos. La movilidad, o sea, el movimiento de traslacin de un punto a otro en forma rpida y de zig zag permite a las bacterias responder, por ejemplo, a estmulos qumicos cuando las bacterias son atradas a determinados compuestos como la glucosa, la galactosa (quimiotactismo positivo) o por el contrario huyen de algunos compuestos como los antibiticos (quimiotactismo negativo). La movilidad debe distinguirse del movimiento pasivo de las bacterias en una sola direccin como consecuencia de las corrientes en la preparacin, o del movimiento Browniano que es la constante vibracin de las bacterias en un punto fijo, comportamiento que se presenta por estar suspendidas en medio lquido y por su pequeo tamao. - Fimbrias Son muy numerosas y cortas. No tienen funcin de motilidad y se encuentran relacionadas con diversas funciones como la de permitir la adherencia a las superficies de tejidos, ser sitios de adsorcin para virus bacterianos y adems pueden servir como pelos sexuales para el paso de ADN de una clula a otra.

Curso de Microbiologa general, licenciatura de Biologa, de la Universidad de Granada, donde explica en detalle los organlos que le permiten el movimiento a la bacteria.

- Cpsula Es una estructura de material viscoso que rodea la pared celular de muchas bacterias que se encuentran en su ambiente natural. No cumple ninguna funcin metablica pero sirve a las bacterias para adherirse a sus sustratos o para la formacin de colonias mediante la adhesin de bacterias hermanas. Cuando una bacteria encapsulada invade a un husped, la cpsula evita que los mecanismos de defensa del husped destruyan la bacteria.

Curso de Microbiologa general, licenciatura de Biologa, de la Universidad de Granada, donde explica en detalle las estructuras superficiales de las bacterias, como por ejemplo, la cpsula

Estructuras internas - El Citoplasma

35 Se encuentra delimitado por la membrana celular y presenta un aspecto viscoso constituido por agua y sustancias como iones, protenas, enzimas, lpidos, carbohidratos. En l se encuentran: materiales de reserva, ARN, ribosomas, un nucleoide que se ubica en la zona central. En algunas bacterias se encuentran dispersos, por el citoplasma, fragmentos circulares de ADN con informacin gentica, llamados plsmidos. En bacterias fotosintticas se encuentran los pigmentos fotosintticos. En el citoplasma se realizan los procesos metablicos de la clula bacteriana.

- Los ribosomas Son organelos con apariencia de grnulos y que se hallan dispersos en el citoplasma bacteriano. Algunos se agrupan en cadena y se les denomina polirribosomas; estn compuestos por cido ribonucleico - ARN (60%) y protena (40%). Su funcin es la sntesis de protena. - La regin nuclear Est localizada hacia el centro en la clula y se compone principalmente de ADN aunque tambin puede encontrarse ARN y protenas asociadas a ste. El ADN est dispuesto en un cromosoma largo y circular, algunas veces llamado nucleoide, genforo o cuerpo cromatnico. - Los mesosomas Son repliegues y extensiones de la membrana citoplasmtica que intervienen en procesos metablicos y de reproduccin de la clula bacteriana. - Los cuerpos de inclusin Tambin llamados grnulos y que corresponden a materiales de reserva como lpidos, hierro, azufre que se almacenan en el citoplasma, en los perodos de suficiente aporte nutricional para ser utilizados en pocas de inanicin.

- Los plsmidos Son pequeas molculas circulares de ADN extracromosmico que se encuentran en la regin nuclear de algunas bacterias. Las molculas de ADN plsmico, a pesar de encontrarse fuera del cromosoma, toman una conformacin de doble hlice al igual que el ADN de los cromosomas.

36 Los plsmidos se replican de manera independiente al cromosoma y contienen informacin gentica adicional a la contenida en el nucleoide y que le es til a la bacteria para su supervivencia, en condiciones desfavorables. Por ejemplo, transmite el cdigo que hace resistentes a las bacterias frente a los antibiticos, la capacidad de apareamiento, la resistencia y tolerancia a los materiales txicos. Los plsmidos son muy utilizados en ingeniera gentica, ya que por su tamao resulta fcil manipularlos; se pueden aislar, introducir en ellos informacin y llevarlos a otras clulas bacterianas viables, en las cuales se expresa la nueva informacin que ellos portan.

- Las vesculas Se encuentran en ciertas bacterias que habitan sistemas acuticos y que les sirven para flotar, contrarrestando la atraccin gravitatoria y as lograr el ptimo de luz. - Endosporas Son estructuras generalmente de forma esfrica que se forman en ciertas bacterias Gram positivas (casi siempre bacilos), como respuesta a condiciones ambientales adversas (poca humedad, temperaturas extremas, agentes qumicos y fsicos etc.). Cuando las condiciones ambientales vuelven a ser favorables la endospora se transforma de nuevo a la forma vegetativa. Las esporas bacterianas debido a su amplia difusin en la naturaleza y su tolerancia a la sequedad o a otros agentes letales, se encuentran habitualmente en las especias, granos de cereales, frutos secos, harina, almidones y leche en polvo10.

Curso de Microbiologa general, licenciatura de Biologa, de la Universidad de Granada, donde explica en detalle los diferentes organelos que se encuentran en el citoplasma bacteriano.

Reproduccin de bacterias

La mayora de bacterias se reproducen asexualmente por fisin binaria o biparticin. Algunas especies de bacterias filamentosas se reproducen por esporas
10

Yousef, A and Carlstrom, C. 2006. Microbiologa de los alimentos. Manual de Laboratorio. Edit. Acribia. Zaragoza. Espaa. p.52.

37 que se forman en los extremos de los filamentos. Durante la biparticin, la clula bacteriana da origen a dos clulas idnticas a la original o clones. El resultado de la fisin binaria son dos clulas hijas por cada clula madre, as, una clula se divide en dos, dos en cuatro, cuatro en ocho y as sucesivamente. La sntesis de la pared, el crecimiento bacteriano y la duplicacin del ADN regulan la divisin celular. Este mecanismo de divisin celular es ms rpido y menos organizado que la mitosis y la meiosis. El proceso de divisin ocurre en tres fases principales:

1. Elongacin o alargamiento de la clula y duplicacin del material gentico o ADN, 2. Separacin de ADN dentro de las clulas hijas formadas y 3. La citocinesis o separacin celular.

El proceso de biparticin se inicia con el alargamiento de la clula bacteriana y la duplicacin del ADN, luego en el centro de la bacteria, la pared celular y la membrana plasmtica se invaginan con la consecuente formacin de un tabique transversal o mesosoma que divide la clula bacteriana en dos y separa las dos regiones de ADN cromosmico. La separacin de las dos clulas va acompaada de la segregacin en cada una de ellas de uno de los dos genomas que provienen de la duplicacin del ADN original (Figura 8).

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Figura 8. Representacin de la reproduccin de una bacteria

Fuente: Carmen Eugenia Pia Lpez

Intercambios genticos en bacterias Sin embargo en algunas bacterias ocurren intercambios genticos, es decir, intercambio de genes, como resultado de tres mecanismos: transformacin, conjugacin, transduccin e intercambio de plsmidos:
Consiste en el intercambio gentico producido cuando una bacteria es capaz de captar fragmentos de ADN, de otra bacteria que se encuentran dispersos en el medio donde vive.

Transformacin

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Conjugacin

En este proceso, una bacteria donadora, denominada F+, transmite a travs de un puente o pili sexual, un fragmento de ADN, a otra bacteria receptora, denominada F-. La bacteria que se llama F+ posee un plsmido, adems del cromosoma bacteriano. En este caso la transferencia de ADN de una bacteria a otra, se realiza a travs de un virus bacterifago, que se comporta como un vector intermediario entre las dos bacterias.

Transduccin

Fuente: Mdulo Microbiologa. UNAD. Carmen Pia

Clasificacin de las Bacterias - Por su forma y agrupacin Los modelos de agrupamiento celular de las bacterias son caractersticos de especies definidas y se utiliza como uno de los criterios de clasificacin. Cuando las clulas microbianas, como los cocos, se dividen pueden permanecer unidas unas con otras, formando arreglos caractersticos y que se denominan colonias. Los bacilos se dividen nicamente en un plano, pero en algunas ocasiones pueden encontrarse clulas unidas por los extremos o por los lados debido a la etapa del desarrollo en que se encuentren o a las condiciones del cultivo. Las bacterias en espiral generalmente no se agrupan, crecen individuales y aisladas. En la siguiente tabla se resumen algunos de los aspectos fundamentales en la clasificacin de las bacterias:

Por forma

Por ordenamiento

Por composicin de la pared Representacin celular que reacciona a la tincin de Gram

40 Coco Coco nico o micrococo (esfrico) Cuando los cocos se dividen en un solo plano vertical, se separan y conservan su individualidad. Diplococo cuando las clulas hijas se presentan en parejas

Gram negativas: no retienen el cristal violeta, conservan el colorante rojo por ejemplo safranina y son susceptibles a las cefalosporinas.

Estreptococo en cadena Cuando las clulas hijas forman cadenas

Estafilococo las clulas permanecen unidas pero despus de una divisin celular en dos o ms planos y los cocos forman grupos irregulares en ocasiones de gran volumen similares a racimos de uvas. Sarcina grupo de ocho cocos La divisin celular se produce formando paquetes de ocho clulas Tetracoco La divisin celular se produce en dos o tres planos perpendiculares formando grupos de cuatro clulas.

Gram positivas: absorben y conservan el colorante cristal violeta, son susceptibles a la penicilina y estreptomicina.

Espirilos

En forma de espiral

Bacilos

En forma de bastn

Tabla 1. Clasificacin de bacterias segn su morfologa. Fuente Carmen Eugenia Pia Lpez.............

- Por su requerimiento de oxgeno Otro aspecto a tener en cuenta, en la clasificacin de bacterias, es la necesidad de oxgeno para sobrevivir. En este caso, las bacterias dependen en buena medida

41 de la disponibilidad de las enzimas eliminadoras de perxidos y superxidos. En la siguiente tabla se encuentran los diferentes grupos de bacterias, de acuerdo a su requerimiento de oxgeno:

Aerobias estrictas

Dependen exclusivamente del oxgeno para su crecimiento. Son bacterias que se desarrollan en ausencia total de oxgeno, utilizan aceptores finales distintos del oxgeno: CO2, H2 y N2, o poseen metabolismo estrictamente fermentativo. Pueden desarrollarse en presencia o ausencia de oxgeno, aunque predominan en medios anaerbicos. Bacterias que slo se pueden desarrollar en presencia de bajas tensiones de O2 (menos del 12%, en lugar del 20% que es la atmosfrica) y altas tensiones de CO2.

Anaerobias estrictas

Anaerobias Facultativas

Microaerfilas

Fuente: Mdulo Microbiologa. UNAD. Carmen Pia

- Por su ptimo de temperatura Segn la temperatura ptima de crecimiento, las bacterias se clasifican en:

Termfilas Mesfilas

Bacterias que se desarrollan entre 25 y 80C, ptima entre 50 y60 C. Bacterias que se desarrollan entre 10 y 45 C, ptima entre 20 y 40 C. Bacterias que se desarrollan entre -5 y 30 C, ptima entre10 y 20 C.

Psicrfilas

Fuente: Mdulo Microbiologa. UNAD. Carmen Pia

- Segn el pH en que se desarrollan Segn el pH de crecimiento, las bacterias se clasifican en:

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Acidfilas Neutrfilas Basfilas

Bacterias que se desarrollan a pH entre 1.0 y 5.0. Bacterias que se desarrollan a pH entre 5.5 y 8.5. Bacterias que se desarrollan pH entre 9.0 y 10.0.

Fuente: Mdulo Microbiologa. UNAD. Carmen Pia

- Por su forma de nutricin Segn su metabolismo interno, las nutricionales diversos y se clasifican en: bacterias presentan requerimientos

Auttrofas quimiosintticas o fotosintticas

Las bacterias auttrofas fotosintticas utilizan la luz del sol y el bixido de carbono para fabricar su alimento. Las auttrofas quimiosintticas utilizan compuestos inorgnicos, por ejemplo, el azufre para fabricar su alimento. Su fuente de energa es el CO2. Bacterias que mediante la absorcin pueden utilizar fuente de carbono orgnico para su alimentacin.

Hetertrofas

Fuente: Mdulo Microbiologa. UNAD. Carmen Pia

Leccin 9. Microorganismos celulares eucaroticos: Hongos, Protozoos y Helmintos.

43 Los Hongos Introduccin Los hongos pertenecen al dominio Eucarya o Eucariota, Reino Fungi. Presentan diferentes formas, desde microorganismos unicelulares de forma redonda u ovalada llamadas las levaduras hasta pluricelulares como los hongos filamentosos o mohos, que pueden formar largas cadenas de clulas. Su tamao y complejidad son superiores al de las bacterias. Habitan en ambientes hmedos y oscuros, sobre el suelo, las frutas, el pan, el queso, las plantas, el cuerpo del hombre y de los animales, en el agua dulce y salada. Se desarrollan mejor en ambientes ligeramente cidos (pH: 5). La mayora son aerbicos aunque hay algunas especies facultativas. Su nutricin es hetertrofa, carecen de clorofila y adquieren su energa de compuestos orgnicos del suelo y del agua. Se considera que los hongos saprfitos juegan un papel importante en la degradacin de la materia orgnica muerta, y en el aumento de la fertilidad del suelo.

Levaduras Las levaduras son hongos unicelulares de forma esfrica, alargada u ovalada, presentan diferentes colores: blanco, rosado, beige o rojo. Su tamao oscila entre 2,5 10 micras de ancho y 4,5 - 21 micras de largo. Son microorganismos anaerobios facultativos (Figura 9).
Figura 9. Levaduras en gemacin Fuente: Carmen Eugenia Pia

La levadura aerbica produce dixido de carbono, agua y ms biomasa, mientras que la levadura anaerobia fermenta el azcar en alcohol y dixido de carbono y tiene un crecimiento ms lento. La mayora se reproducen asexualmente, por gemacin. En este tipo de reproduccin a la levadura-madre le brota un botn o yema. Al mismo tiempo que el botn aumenta de tamao, el ncleo de la clula madre, mediante el proceso de mitosis, se divide en dos, transfirindole uno a la clula hija o botn. Poco a poco la yema se va desprendiendo de la levadura-madre, dando origen a una levadura hija, idntica a la madre. Una levadura puede producir hasta 24 clulas hijas. Las levaduras tambin pueden reproducirse por fisin binaria. Algunas no separan la clula hija o gema y forman pseudomicelio, caracterstica que se usa para identificar y clasificar la levadura. Por ejemplo, la Candida albicans.

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Las levaduras pueden habitar en el suelo, sobre las mucosas, en la superficie de vegetales. La mayora son mesfilas, con una temperatura mxima de crecimiento entre 24 y 48C. Se encuentran en un rango amplio de pH el cual est comprendido entre 2,5 y 8. Son incapaces de moverse por lo que nicamente pueden ser arrastrados a travs de corrientes de aire, en fluidos o por insectos. En el sentido ms estricto de la palabra, no existen levaduras patgenas por naturaleza; las que se relacionan con las enfermedades, tanto en el hombre como en los animales, son incapaces de producir infeccin en un individuo sano. Se deben presentar algunas alteraciones en las defensas celulares del husped, en la fisiologa o en la composicin de la flora normal para que pueda producirse la colonizacin e infeccin por levaduras. Hongos Pluricelulares o Mohos Los hongos pluricelulares o mohos estn formados por una serie de filamentos o tubos rgidos denominados hifas; dentro de las hifas se encuentra el citoplasma que contiene varios ncleos y organelos como: mitocondrias, ribosomas, vacuolas, aparato de Golgi, retculo endoplasmtico y lisosomas. Las hifas pueden especializarse en estructuras denominadas Micelios. Existen dos tipos de micelio: - El micelio vegetativo que crece por toda la superficie del sustrato y tiene como funcin absorber los nutrientes necesarios para el hongo y fijar el hongo al sustrato. - El micelio areo o reproductor que produce las esporas sexuales y asexuales.

Las hifas pueden ser septadas, es decir, presentar tabiques transversales que separan las clulas o aseptadas (cenocticas) con clulas multinucleadas (Figura 10).

Figura 10. Hifas septadas multinucleadas Fuente: Carmen Eugenia Pia

Los hongos presentan una pared celular, compuesta de varias capas constituidas de estructuras amorfas como los mananos (polmeros ramificados de la manosa), los glucanos (polmeros de la glucosa) y por quitina, que es un polisacrido estructural que tambin se encuentra en el exoesqueleto de los artrpodos. La

45 pared celular le da la rigidez al hongo y le permite la nutricin absortiva. Los hongos se pueden reproducir por procesos asexuales, sexuales o parasexuales. La forma de reproduccin se constituye en un criterio para su clasificacin. Los patgenos generalmente se reproducen de forma asexual, aunque algunas especies pueden tener reproduccin sexual y asexual, dependiendo de las condiciones ambientales.

Reproduccin asexual Los hongos imperfectos se reproducen asexualmente de tres formas: por fragmentacin o fisin y por la formacin de esporas.
Es una de las formas ms sencillas de reproduccin y consiste en la fragmentacin, crecimiento y ramificacin de las hifas para dar origen una nueva colonia. Este mecanismo se usa en los subcultivos de laboratorio. Este tipo de reproduccin puede ser de dos tipos: por doble fisin de las hifas, formando clulas unicelulares de forma cilndrica llamadas artrosporas, las cuales se liberan cuando las hifas se separan para germinar en el medio adecuado; En el segundo tipo hay una fragmentacin de las hifas que desarrollan esporas redondas cubiertas por paredes gruesas llamadas clamidosporas, resistentes a condiciones adversas como el calor y la desecacin.

Fragmentacin del micelio

Formacin de esporas

Fuente: Mdulo Microbiologa. UNAD. Carmen Pia

Tipos de esporas asexuales Esporangiosporas Son esporas que se producen dentro de de una envoltura denominada esporangio. En este tipo de reproduccin el ncleo de la clula madre se divide en varios ncleos y cada uno toma una parte del citoplasma de la clula madre, que luego se rodea de una membrana celular. Al romperse el esporangio, las esporas salen y al caer en el sustrato adecuado dan origen a nuevas hifas (Figura 8). Ejemplo: Mucor o Rhizopus nigricans.

Animacin del curso de Botnica, de la Universidad de Extremadura (Espaa), donde se observa la formacin y liberacin de esporangiosporas en un hongo llamado Mucor.

46 Conidiosporas Son esporas desnudas que se forman en los extremos de las hifas mediante gemacin. En este caso el micelio especializado se denomina conidiforo (Figura 11). Ejemplo: Aspergillus flavus.

Figura 11. Hongo del pan: Rhizopus nigricans modificado (Esporangiospora)

Fuente: http://darwin.baruch.cuny.edu/bio1003/fungi.html

Conidios en Penicillium (Conidiospora)

Reproduccin Sexual La reproduccin sexual es otra forma de reproduccin de los hongos e implica la unin de 2 ncleos: uno donante y otro receptor, para formar un ncleo cigtico diploide, que por meiosis origina 4 ncleos haploides. A los hongos con reproduccin sexual se los denomina perfectos. La reproduccin sexual comprende 3 fases:
Unin los dos protoplastos de las hifas y de los sus ncleos en una sola clula. Fusin de los dos ncleos que se haban reunido en la plasmogamia. Se reduce el nmero de cromosomas, se forman gametos haploides.

Plasmogamia

Cariogamia

Meiosis

Fuente: Mdulo Microbiologa. UNAD. Carmen Pia

Despus de la fusin de los ncleos, de las dos clulas, que comparten el ADN y de ocurrida la meiosis, se forman las esporas con caractersticas heredadas de cada uno de sus progenitores. Cada espora tiene capacidad para desarrollar una nueva colonia.

Tipos de esporas Sexuales

47 Ascosporas Son unicelulares. Generalmente se desarrollan 4 a 8 dentro una clula denominada asca. Basidiosporas Son unicelulares. Se forman en estructuras llamadas basidios, en nmero de 4. Zigosporas Son de mayor tamao, con pared celular gruesa y se desarrollan al fusionarse dos hifas sexualmente compatibles. Oosporas Se forman por la unin de dos clulas gamticas, oogonio y anteridio En condiciones ptimas para la germinacin, las oosporas dan origen al micelio y esporangios los cuales infectan las plantas. Reproduccin parasexual La reproduccin parasexual es un mecanismo raro de la naturaleza, en el que las hifas se unen, sin fusin nuclear posterior y da lugar a una clula con ms de un ncleo funcional y de diferente procedencia gentica. En algunas ocasiones pueden conjugarse los ncleos y aparecer un ncleo diploide heterocigtico. El hecho comprobado por primera vez fue en Aspergillus nidulans.

Los Protozoos Caractersticas Este tipo de microorganismos hace parte del Reino de los Protistos. Son organismos eucaroticos, hetertrofos, mviles, incoloros, unicelulares, carecen de pared celular, algunos tienen vacuolas digestivas y excretoras, flagelos y cilios. Se encuentran en su mayora en medios acuticos, aunque algunos son endoparsitos y otros ectoparsitos. Los protozoarios parsitos se pueden encontrar en sangre de humanos y animales y en lquidos tisulares de plantas. Algunos necesitan varios hospedadores para completar su ciclo de vida, presentando en cada uno de ellos una morfologa, metabolismo y tipo de reproduccin diferente.

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Durante su ciclo de vida pueden existir de dos formas: trofozoto y quiste. En la fase de trofozoto, los protozoarios realizan sus funciones normales de nutricin y crecimiento y es la forma en la que produce la enfermedad. En la fase de quiste, el protozoario se encuentra fuera del husped y puede resistir condiciones extremas como la desecacin, bajas temperaturas y en un medio hmedo logra sobrevivir por aos (Figura 12).

Figura 12. Paramecio

Fuente : Carmen Eugenia Pia Lpez

Nutricin La mayora de los protozoarios son hetertrofos, sin embargo algunos son auttrofos. La alimentacin suele realizarse mediante la captura del alimento, como por ejemplo algas, bacterias y otros protozoarios, que penetran en el citoplasma por mecanismos de difusin de transporte activo. Algunos protozoarios pueden alimentarse a travs de aberturas de la membrana celular, llamadas poros bucales, otros como las amebas rodean el alimento mediante pseudpodos (fagocitosis). Algunos protozoarios absorben el alimento a travs de su membrana celular. Por ejemplo, el paramecio succiona el alimento produciendo un torbellino con los cilios. El alimento es digerido por las vacuolas nutritivas, localizadas en el citoplasma y luego los residuos son expulsados por las vacuolas fecales. Respiracin Los protozoarios respiran por difusin, a travs de la membrana celular y por las partculas de agua absorbidas con el alimento. Expulsan el gas carbnico por las vesculas o vacuolas pulstiles. Cuando la vacuola pulstil est llena de agua, se abre y libera al exterior el CO2.

Reproduccin Se reproducen asexualmente por divisin binaria, por gemacin y por esporulacin

49 (fragmentacin de la clula madre en esporas) del trofozoito o forma vegetativa del protozoo. Cuando sucede este ltimo caso, pueden permanecer mucho tiempo enquistados en una cpsula. Otro tipo de reproduccin asexual es la divisin mltiple, caracterstica de las amebas. En algunos grupos de protozoarios, la reproduccin asexual alterna con fases de reproduccin sexual, esto debido a cambios desfavorables del medio. Tambin se pueden reproducir sexualmente. Este tipo de reproduccin se inicia con la formacin de gametos, macrogametos y microgametos, por diferenciacin de las clulas del trofozoito. Su unin da lugar a la formacin del cigoto, seguido de divisiones meoticas. La fusin celular puede ser total, dando lugar a un cigoto (singamia), como sucede en los esporozoos o parcial, por conjugacin, como sucede en algunos ciliados. En la conjugacin, el macroncleo de un protozoario se degenera y el microncleo, por divisiones meioticas, da origen a cuatro microncleos con reduccin de su material gentico. Uno de estos microncleos es transferido de un protozoo al otro para formar el cigoto y los otros tres microncleos se degeneran. Luego el cigoto formado, realizando divisin mltiple (reproduccin asexual) da lugar a numerosas clulas denominadas esporozoitos. En este tipo de reproduccin se produce un intercambio de informacin gentica entre dos protozoos. Clasificacin Segn la forma como se desplazan los protozoos se clasifican en11:

sacordinos ciliados flagelados esporozoos.

Sacordinos

11

Pia, C. 2010. Mdulo Microbiologa General. UNAD.

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Figura 13. Entamoeba histoltica.

Fuente: http://hpd.botanic.hr/ bio/ odgovori/odgovor315.htm

Se desplazan por medio de pseudpodos, que son prolongaciones de la clula y que les sirven adems para capturar el alimento, englobarlo (proceso de fagocitosis) y formar una vacuola digestiva, donde el alimento es digerido por accin de enzimas. La mayora son parsitos del hombre y habitan en el tracto gastrointestinal y cavidad oral. Un ejemplo es la Entamoeba histoltica (Figura 13).

Ciliados

Figura 14. Balantidium

Fuente: http://www.ufrgs.br/parasite/siteantigo/Imagensatlas/Protozoa/Balantidium.htm

Su forma es ovalada, se desplazan y capturan el alimento por medio de cilios, filamentos cortos, vibrtiles y numerosos que rodean su cuerpo. Poseen una hendidura bucal o boca en el citoplasma para la ingestin de alimentos al final se presenta el citostoma y la citofaringe que se continan, en el interior del citoplasma, con las vesculas alimenticias. El citoplasma realiza movimiento de ciclosis. Poseen vacuolas contrctiles que ayudan a expulsar el agua y residuos de la digestin a travs del poro anal o citopigio. Se caracterizan por ser los nicos organismos con dos ncleos un microncleo para la reproduccin y un macroncleo para la alimentacin. Se reproducen de dos formas: asexual por biparticin y sexual por conjugacin. Un ejemplo es el Balantidium coli (Figura 14).

Flagelados

Se desplazan por medio de flagelos, filamentos largos y poco numerosos. Muchos son de vida libre y necesitan vectores (insectos) para su transmisin. Tambin pueden transmitirse por aguas o alimentos contaminados. Un ejemplo es la Giardia Lamblia (Figura 15). Figura 15. Giardia Lamblia
Fuente: http://www.inselhunde.de/ giardien.htm

51 Esporozoos

Carecen de rganos de locomocin. Todos son parsitos obligados de clulas del hombre y de los animales. Presentan una estructura apical que permite la penetracin intracelular. Se reproducen en dos fases: una asexual y otra sexual, dependiendo de la fase pueden estar como: trofozoito, gameto o cigoto (Figura 16). Figura 16. Plasmodium
Fuente: http://www.cdc.gov/malaria/ spotlights/ index_100504.htm

Helmintos Aunque no son microorganismos en el sentido estricto, tienen importancia en el rea de alimentos debido a los procesos infecciosos que causan. Comprenden dos tipos: gusanos aplanados (cestodos y trematodos) y gusanos redondos (nematodos). Corresponden a un grupo de parsitos animales multicelulares y que durante algunos estadios del ciclo vital, se presentan en tamaos microscpicos. Los helmintos parsitos deben estar altamente especializados para vivir dentro de sus huspedes12 :

- Pueden carecer de aparato digestivo, pues absorben nutrientes a partir del alimento, lquidos corporales y tejidos del husped. - Su sistema nervioso es reducido, pues no necesitan buscar alimento y el ambiente dentro del husped se mantiene relativamente constante.

- Carecen de medios de locomocin o son muy limitados pues son transferidos de un husped a otro.

12

Tortora, G.J. y col. 2007. Introduccin a la microbiologa. Edit. Mdica Panamericana. 9. Edicin. Buenos Aires.p370.

52 - Su aparato reproductor suele ser complejo, por las grandes cantidades de huevos con las que infectan un husped.

El ciclo vital de los helmintos es muy complejo pues pueden requerir mltiples huspedes para completar cada estado larvario, adems de un husped definitivo para el parsito adulto.

Trematodos
Llamados dstomas y caracterizados por ser de cuerpos planos, en forma de hoja, con una ventosa oral y ventral, que son las que mantienen fijo al microorganismo, en el sitio que colonizan al husped. Los trematodos obtienen el alimento por la absorcin a travs de su cubierta externa inerte, denominada cutcula (Figura 17).

Figura 17. Fasciola Heptica

Fuente:http://www.ferato.com/wiki/index.php/Fascioliasis

Cestodos
Son parsitos intestinales, tambin conocidos como tenas. La cabeza o esclex tiene unas ventosas que sirven para que el parsito se adhiera a la mucosa intestinal. Carecen de aparato digestivo por lo que toman los nutrientes a travs de su cutcula. El cuerpo est formado por segmentos llamados progltides, donde se pueden encontrar ambos rganos reproductores (masculino y femenino) y sacos llenos de huevos, que colonizaran posteriormente el husped (Figura 18). Figura18. Taenia Saginata
Fuente: http://www.manualmerck.net/?id=210&cn=1761

Nematodos

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Presentan un sistema digestivo completo. Casi todas las especies son dioicas. Los machos son ms pequeos que las hembras. Algunas especies de nematodos viven libremente en el suelo y agua y otros son parsitos de plantas y animales. Tambin algunos pasan su ciclo vital completo, de huevo a adulto maduro, en un nico husped. Las infecciones por nematodos, en seres humanos, pueden dividirse en dos categoras: aquellas en las que el elemento infeccioso es el huevo y aquellas en las que es la larva (Figura 19).

Figura 19. Nematodo Gastrointestinal

Fuente: http://www.portalechero.com/ ver_items_descrip.asp?wVarItem=2153

Leccin 10. Otros microorganismos de inters alimenticio: Cianobacterias y microalgas. Cianobacterias Son organismos procaroticos, que pueden ser unicelulares o pluricelulares (filamentosos) y que hacen parte del grupo de las bacterias fotosintticas oxignicas, es decir, que pese a su naturaleza elemental, se caracterizan por realizar el proceso de la fotosntesis en una estructura celular tpicamente bacteriana. Algunas asimilan nitrgeno atmosfrico. Viven sin demasiadas exigencias nutricionales, con luz pueden mantenerse en medios artificiales minerales. El CO2 atmosfrico constituye una excelente fuente de carbono para las cianobacterias, por lo que contribuyen en la productividad de materia orgnica de la Tierra. Se emplea biomasa cianobacteriana para alimentacin humana, de peces, crustceos, aves de corral y ganadera. Un ejemplo, de amplio uso en el rea de alimentos, es la Spirulina, cianobacteria filamentosa pluricelular fotoautotrfica, de ambiente acutico con elevada alcalinidad y salinidad. Tiene un alto contenido proteico, -caroteno y cidos grasos esenciales como el cido linoleco y gamma linolnico.

Microalgas

Organismos eucaroticos, auttroficos, pertenecientes al reino Protista. Presentan pared celular, clorofila, algunas poseen otros pigmentos como carotenos, ficoxantina o ficobilinas que pueden enmascarar la clorofila. La mayora son unicelulares, como las algas doradas o diatomeas. Tambin pueden ser multicelulares, como las algas verdes y las rojas. Su tamao vara desde algas microscpicas de 1 micrmetro hasta las que se observan a simple vista, como las

54 algas verdes que crecen en las aguas aposadas o las que se encuentran en los acuarios o en el mar. Su reproduccin puede asexual por fisin binaria longitudinal y sexual por produccin de esporas cuando las condiciones del medio son extremas. Existen en el mercado alimenticio dos tipos de microalgas: Chlorella y Dunaliella Salina, la primera por su alto contenido proteco y la segunda por la presencia de -caroteno.
De acuerdo a sus caractersticas celulares qu diferencia hay entre las bacterias, hongos y virus? Preguntas de repaso Por qu es importante conocer la diversidad nutricional de las bacterias? Por qu es importante la cpside para un virus? En qu se diferencian los priones de los virus?

Para qu sirve la microbiologa? Antiguamente los panes se hacan crecer con levaduras silvestres del aire, que haban quedado atrapadas en la masa. Y para poder preparar el pan al da siguiente, los panaderos conservaban un cultivo de levadura iniciador. Actualmente, el pan se prepara con harina de trigo, agua, azcar, sal, mantequilla y un microorganismo vivo, llamado Saccharomyces cerevisiae, un tipo de levadura. Cuando se mezcla la harina de trigo y el agua, una enzima presente en la harina rompe el almidn, en dos azcares, maltosa y glucosa. Una vez mezclados todos los dems ingredientes, la levadura metaboliza los azcares formados (maltosa y glucosa) y produce etanol (alcohol) y CO2 (dixido de carbono) como productos de desecho. El CO2 eleva la masa del pan y el etanol se evapora durante la coccin. Este proceso se conoce como fermentacin.

Captulo 3. Caractersticas del Crecimiento bacteriano La dispersin tan amplia de los microorganismos en el suelo, aire, agua, sustratos biolgicos naturales y medios artificiales de cultivo, con velocidades de reproduccin y de crecimiento verdaderamente notables, han obligado a investigar y a aplicar tcnicas de manejo y bioseguridad microbiana. Por lo tanto, el conocimiento de las opciones de control del crecimiento bacteriano significa identificar los parmetros extrnsecos e intrnsecos que afecten el metabolismo y el crecimiento microbiano y poderlos aplicar en estrategias y tcnicas que permitan un manejo inocuo e idneo de las reas de trabajo.

55 Las lecciones que se encuentran en este captulo son: Leccin 11: Metabolismo bacteriano Leccin 12: Crecimiento bacteriano Leccin 13: Fases de crecimiento bacteriano Leccin 14: Parmetros extrnsecos Leccin 15: Parmetros intrnsecos

Leccin 11: Metabolismo bacteriano El metabolismo bacteriano se define como la suma de procesos internos, fsicos y qumicos, gracias a los cuales sobreviven y conservan las bacterias. Para realizar dichos procesos, la bacteria requiere de una serie de nutrientes que despus de pasar por su membrana celular se emplean como material sinttico, es decir para producir otras sustancias, o para que la bacteria obtenga la energa necesaria para su crecimiento, reparacin, reproduccin o desplazamiento. Las reacciones especficas metablicas de las bacterias les permiten, por ejemplo, vivir de la celulosa, del petrleo o reciclar elementos utilizados previamente por otros microorganismos. Prcticamente cualquier sustancia terrestre puede servir de alimento a un microorganismo, sin embargo ningn microorganismo es capaz de utilizar todos los alimentos presentes en un sustrato o medio de cultivo. Algunos de estos nutrientes, como por ejemplo los carbohidratos (azcares), son empleados por un pequeo grupo de microorganismos, pero otro no usan en absoluto dichas sustancias. Las diferencias en la capacidad de empleo de las sustancias alimenticias, constituye una de de las principales bases para la identificacin de microorganismos, siendo esto muy til en el laboratorio (pruebas bioqumicas). Todas las especies, y en algunos casos los gneros, se clasifican segn los compuestos que utilizan y los productos que se forman a partir de ellos. En la figura 20 se observa la organizacin de los seres vivos, de acuerdo al tipo de nutricin, que existe en la naturaleza y se hace nfasis en las procariotas.

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Figura 20. Clasificacin de los seres vivos segn su tipo de nutricin.

Fuente: Claudia Zambrano

Fermentacin La fermentacin puede definirse como cualquier proceso metablico que: - libere energa a partir de un azcar u otra molcula orgnica. - no necesite la presencia de oxgeno ni de una cadena de electrones - utilice una molcula orgnica como aceptor final de electrones y - slo produce pequeas cantidades de ATP, debido a que gran parte de la energa original almacenada en la glucosa se mantiene en los enlaces qumicos de los productos finales orgnicos (cido lctico, etanol)13. En general en la fermentacin, los microorganismos producen metabolitos primarios, como el etanol, o secundarios, como la penicilina. En el caso del metabolito primario, este se produce al mismo tiempo que las nuevas bacterias y
13

Tortora, G.J. y col. 2007. Introduccin a la microbiologa. Edit. Mdica Panamericana. 9. Edicin. Buenos Aires.p144.

57 su curva de produccin est directamente relacionada con la curva de crecimiento del microorganismo. Para el caso del metabolito secundario, solo se empieza a producir al final de la fase logartmica y tiene su mxima produccin en la fase estacionaria de la curva de crecimiento. La fermentacin industrial se refiere al cultivo, en gran escala, de microorganismos para producir una sustancia valiosa comercialmente. A continuacin se enumeran algunos procesos fermentativos utilizados en el rea de alimentos:
Sustrato Extracto de malta Frutas (uva especialmente) Desechos agrcolas Etanol Leche Cereal en granos, azcar Repollo Carne cido lctico Melaza Producto Final de la fermentacin Etanol Etanol Etanol cido actico cido lctico cido lctico cido lctico cido lctico cido propinico y CO2 Acetona y butanol Proceso Industrial comercial Cerveza Vino Combustible Vinagre Queso, Yogur Pan Chucrut Salchicha ahumada Queso Gruyer Materia prima de productos farmacuticos y uso industrial Materia prima de productos farmacuticos y uso industrial Aromatizador Combustible o Microorganismo que interviene Saccharomyces cerevisiae (levadura) Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus Saccharomyces cerevisiae Acetobacter (bacterias) Lactobacillus, Streptococcus (bacterias) Lactobacillus delbruckii Lactobacillus plantarum Pediococcus (bacteria) Propionibacterium freudenreichii (bacteria) Clostridium acetobutylicum (bacteria) Saccharomyces cerevisiae Aspergillus (Hongo filamentoso) Methanosarcina (bacteria)

Melaza

Glicerol

Melaza cido actico

cido ctrico Metano

Tabla 2. Procesos fermentativos donde intervienen microorganismos

Fuente: Claudia Zambrano

En trminos generales, existen varios tipos de fermentacin, entre las ms importantes y relacionadas con el rea de los alimentos encontramos: - La fermentacin alcohlica que transforma los jugos azucarados de los frutos en bebidas alcohlicas, por ejemplo, el vino. - La fermentacin actica que transforma el vino en vinagre. - La fermentacin lctica que es la responsable de la coagulacin de la leche.

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Leccin 12: Crecimiento bacteriano El crecimiento microbiano hace referencia al aumento del nmero de microorganismos a lo largo del tiempo y no al aumento de tamao de un microorganismo. El aumento del nmero de microorganismos permite la formacin de colonias o de poblaciones. Es por eso que en microbiologa el crecimiento se estudia por poblaciones y no en microorganismos individuales. Las bacterias se reproducen generalmente por fisin binaria. El resultado de la fisin binaria son dos clulas hijas por cada clula madre, as, una clula se divide en dos, dos en cuatro y cuatro en ocho y as sucesivamente. El intervalo de tiempo que transcurre para la formacin de dos clulas a partir de la clula madre se llama tiempo de generacin o tiempo generacional y al igual que la tasa de crecimiento o cambio en el nmero de clulas por unidad de tiempo, vara en dependencia de las condiciones genticas de las bacterias y de los factores nutricionales. Si partimos de una clula al cabo de una generacin habr duplicado su nmero y as sucesivamente en cada generacin. Como se puede observar el crecimiento se produce en progresin geomtrica y no aritmtica (Tabla 3).

Tabla 3. Nmero de clulas bacterianas por generacin. Fuente: Mdulo Microbiologa. UNAD. Carmen Eugenia Pia

En algunas bacterias como en el caso la E. coli, en condiciones ptimas la duplicacin celular se realiza cada 20 minutos, es as como en 10 horas se habrn producido 30 generaciones, es decir mil millones de clulas bacterianas. A partir de una clula de E. coli, se obtiene al cabo de 10 horas o sea 600 minutos, 600/20=30 generaciones. El nmero de clulas entonces sera 230

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Aspectos para el clculo del crecimiento microbiano

Tabla 4. Clculos del crecimiento bacteriano Fuente: Mdulo Microbiologa. UNAD. Carmen Eugenia Pia

Leccin 13: Fases de crecimiento bacteriano El incremento en el nmero de las clulas en una poblacin se denomina crecimiento exponencial o logartmico. Si se inoculan unas bacterias en un medio de cultivo fresco y se cuantifica la poblacin en intervalos de tiempo se puede obtener una curva que represente el crecimiento bacteriano, como la que se observa a continuacin.

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Figura 21. Curva de crecimiento bacteriano donde se relaciona nmero de clulas contra tiempo de generacin. Fuente: Mdulo Microbiologa. UNAD. Carmen Eugenia Pia.

La curva de crecimiento de la poblacin tiene cuatro fases (Figura 21): 1) fase lag o fase de latencia es el periodo de adaptacin de los microorganismos a un nuevo ambiente. En este periodo el nmero de clulas no se incrementa, sino que se mantiene constante por un largo perodo que puede durar desde 1 hora hasta varios das. En esta fase las clulas presentan gran actividad metablica, que se manifiesta por el aumento del volumen celular.

2) fase log. o logartmica o de crecimiento exponencial, durante este periodo las clulas se empiezan a dividir en forma constante y la actividad metablica (produccin de metabolitos, respiracin celular, sntesis de protenas, entre otros) es mxima, por lo que es la etapa preferida a nivel industrial. El nmero de clulas vivas en reproduccin es mucho mayor que las clulas que mueren. El tiempo generacional es mximo y constante. Las clulas muestran su morfologa: color, agrupacin, forma, entre otras. En el momento final de esta fase y como resultado de la alta tasa de reproduccin, comienzan a escasear los nutrientes y el ambiente se torna txico por el exceso de productos de desecho. Es el momento en el cual las clulas son ms sensibles a los antimicrobianos o a las radiaciones que pueden intervenir negativamente en su crecimiento. Esta fase se representa por una lnea recta ascendente.

3) fase estacionaria, en este periodo se generan dos factores limitantes del crecimiento: aporte nutricional y productos txicos de desecho. Si la poblacin no se reproduce ni muere, el nmero de clulas permanece constante y depender del balance que logren las clulas con el medio ambiente. Es un periodo de equilibrio.

4) fase de muerte o de declive logartmico, en esta fase las clulas no se reproducen, solo mueren y son destruidas por lisis en forma exponencial a causa del incremento en las cantidades de cido y otros desechos dainos en el ambiente. Leccin 14: Factores Fsicos

61 Dentro del grupo de factores fsicos que influyen en el crecimiento bacteriano, se encuentran: Temperatura, pH y Presin Osmtica. Temperatura Es uno de los factores ambientales que ms influye en el crecimiento de los microorganismos. Al aumentar la temperatura aumenta la velocidad de las reacciones enzimticas y por consiguiente el metabolismo bacteriano, hasta una cierta temperatura a la cual las protenas, DNA y otras macromolculas son sensibles y se desnaturalizan. En caso contrario, es decir a temperaturas bajas, se disminuye la actividad metablica del microorganismo. Se puede hablar por consiguiente de una taxonoma microbiana referida a rangos ptimos de adaptacin a la temperatura. Esta clasificacin contempla los tres casos siguientes:
Bacterias adaptadas a bajas temperaturas, en trminos generales se maneja un rango de 0 C a 20 C como lmites normales para su crecimiento.

Psicrfilos

Mesfilos

Bacterias que viven en temperaturas moderadas, en un rango de 20C a 40C. Los microorganismos mesfilos, son los ms comunes. Por ejemplo, la temperatura ptima para la mayora de las bacterias patgenas se aproxima a los 37 C.

Termfilos

Bacterias que soportan altas temperaturas, contemplan como rangos usuales de tolerancia de 40 C. a 80 C. y por consiguiente sus endosporas son normalmente resistentes al calor.

Fuente: Mdulo Microbiologa. UNAD. Carmen Eugenia Pia

En el rea de alimentos existe una tendencia a clasificar los organismos psicrfilos como sicrtrofos, refirindose a aquellos que crecen a bajas temperaturas y afectan los alimentos. La refrigeracin es el mtodo ms comn de conservacin de alimentos, pues disminuye la velocidad de reproduccin de los microorganismos. En este caso, las bacterias pueden sobrevivir a bajas temperaturas y permanecer en estado de latencia pero su nmero comienza a

62 disminuir. Mientras esto ocurre pueden degradar lentamente los alimentos y descomponerlos14. En el caso de los termfilos, otro grupo de inters en el rea de alimentos, pueden formar endosporas que presentan una alta resistencia al calor y pueden sobrevivir al tratamiento trmico, por ejemplo, el caso de los enlatados. Las elevadas temperaturas de almacenamiento del enlatado pueden causar la germinacin y el crecimiento de las endosporas sobrevivientes y de este modo afectar el alimento.

pH En la mayora de bacterias el pH (acidez o alcalinidad de una solucin o medio de crecimiento) de rango neutro (6,5 a 7,5) es el ms adecuado para el crecimiento bacteriano y muy pocas bacterias soportan pH inferiores a 4.0. Por esta razn el manejo de la acidez es un recurso para el control microbiolgico. Por ejemplo, el caso de algunos quesos que se preservan del deterioro, por los cidos producidos por la fermentacin bacteriana. Una tabla de rangos de tolerancia a la acidez es la siguiente: Bacterias Acidfilas Neutrfilas Alcalfilas pH 1,0 a 6,0 6,5 a 7,5 8,0 a 11,0

Fuente: Mdulo Microbiologa. UNAD. Carmen Eugenia Pia

El intervalo ptimo de pH para mohos y levaduras est entre 5,0 y 6,0.

Presin osmtica Los microorganismos estn formados por un 80-90% de agua y por consiguiente son fcilmente afectados por soluciones hipertnicas o sea con una concentracin de solutos mayor a la de la clula microbiana, razn por la cual esta pierde agua por el efecto conocido como plasmlisis. Por consiguiente, la adicin de sales o de azcar, produce una contraccin celular que evita el crecimiento bacteriano, un sistema muy usado en el rea de alimentos, como el pescado salado, la miel y la leche.
14

Tortora, G.J. y col. 2007. Introduccin a la microbiologa. Edit. Mdica Panamericana. 9. Edicin. Buenos Aires.p160.

63

Sin embargo existen las bacterias llamadas halfilas extremas que requieren alta concentracin salina para supervivir (alrededor del 30% de sal). Otro grupo es el de las halfilas facultativas, que no necesitan altas concentraciones salinas pero pueden soportar concentraciones entre el 2 y 15% de sal. Se comprende entonces la tcnica usada para solidificar los medios de cultivo microbiano con agar, con una concentracin del orden del 1,5%.

Leccin 15: Factores qumicos Dentro de los parmetros qumicos encontramos los nutrientes (macro y micronutrientes), el oxgeno y agentes qumicos antimicrobianos. Macronutrientes Las fuentes de carbono son necesarias para el crecimiento bacteriano ya que este elemento es una estructura bsica en todos los compuestos orgnicos que constituyen la clula viva. Por consiguiente, los microorganismos obtienen su carbono a partir de compuestos orgnicos (microorganismos quimiohetertrofos), o del bixido de Carbono (quimioauttrofos y fotoauttrofos). Para el caso del Nitrgeno, los microorganismos lo utilizan principalmente para formar el grupo amino de los aminocidos constituyentes de las protenas. En algunos casos de simbiosis, el nitrgeno fijado por bacterias se comparte con ciertas plantas (generalmente leguminosas), lo cual permite aumentar la fertilidad del suelo. El Azufre se utiliza generalmente para sintetizar aminocidos y vitaminas como la timina y la biotina. El Fsforo se utiliza en sntesis de cidos nucleicos y de los fosfolpidos de las membranas celulares. De manera similar los microorganismos necesitan otros elementos como potasio, magnesio y calcio necesarios como cofactores de las enzimas. Micronutrientes Por otra parte, los microorganismos requieren algunos elementos minerales en cantidades muy pequeas, como es el caso del: hierro, cobre, molibdeno y zinc, los cuales son esenciales como cofactores en la actividad enzimtica.

64

Oxgeno Los requerimientos de este elemento en los microorganismos varan considerablemente, lo que permite clasificarlas de acuerdo a sus necesidades o no del oxgeno:

Aerobios

Microorganismos que utilizan el oxgeno molecular, con el cual producen ms energa a partir de los nutrientes. Microorganismos que utilizan el oxgeno disponible, pero si no lo hay pueden crecer mediante procesos de fermentacin o respiracin anaerbica. Microorganismos para los cuales el oxgeno es txico y por consiguiente no lo utilizan. Microorganismos que no pueden utilizar oxgeno para su crecimiento pero lo toleran bastante bien. Microorganismos que crecen solo en concentraciones de oxgeno menores que las del aire.

Anaerobios facultativos

Anaerobios obligados

Anaerobio aerotolerante

Microaerfila

Fuente: Mdulo Microbiologa. UNAD. Carmen Pia

Agentes antimicrobianos que afectan el crecimiento A partir del descubrimiento de la penicilina se han observado reacciones de inhibicin del crecimiento microbiano, en medios slidos, por causa de sustancias producidas por otros microorganismos, sustancias que por tal motivo se llaman antibiticos. Algo ms de la mitad de los antibiticos de amplio uso son producidos por la bacteria Streptomyces. Otros antibiticos son producidos por bacterias del gnero Bacillus y algunos son generados por mohos de los gneros Penicillium y Cephalosporium. Es necesario diferenciar entre dos conceptos: Los agentes bactericidas eliminan las bacterias y los agentes bacteriostticos solo impiden su crecimiento, contribuyendo a que las propias defensas del husped destruyan a los microorganismos patgenos. Espectro de actividad antimicrobiana Los antibiticos presentan cierta selectividad sobre los tipos de clulas microbianas que pueden afectar, por ejemplo, la penicilina es efectiva contra

65 bacterias Gram Positivas, pero ataca a pocas bacterias Gram Negativas. Los antibiticos que atacan a un alto nmero de Gram Positivas y Gram Negativas se denominan de amplio espectro y se recurre a ellos cuando no es segura la identidad del patgeno. Desafortunadamente estos antibiticos destruyen gran parte de la flora normal del husped y aquellos microorganismos patgenos que no son destruidos por el antibitico pueden atacar ms fuertemente al organismo husped por el desequilibrio de la flora.

Mecanismo de accin de los antibiticos o agentes antimicrobianos Los principales mecanismos antibiticos son los siguientes: Inhibicin de la sntesis de la pared celular. Algunos antibiticos interfieren con las sntesis del peptidoglucano necesario para la construccin de la pared celular de bacterias Gram positivas y Gram Negativas. De esta manera, la pared celular de la bacteria patgena se debilita y no puede crecer normalmente. Inhibicin de la sntesis de protenas. Algunos antibiticos como el Cloranfenicol, la Eritromicina y las Tetraciclinas inhiben la sntesis de protenas, en ciertos tipos de ribosomas, de las bacterias patgenas y de esta manera se anula su actividad fisiolgica. Alteracin de la membrana citoplasmtica. Antibiticos como la Polimixina B daan la permeabilidad de la membrana citoplasmtica y otros frmacos antifngicos como la Nistatina, Anfotericina B y Ketoconasol desorganizan la membrana citoplasmtica causando la destruccin celular al liberar el contenido citoplasmtico. Inhibicin de la sntesis de cidos nucleicos. Este tipo de accin evita el desarrollo normal del microorganismo, pero tiene un efecto txico en el ADN y ARN de los mamferos, como es el caso del antivrico Idoxuridina. Son ms selectivamente txicos para las bacterias, afectando menos al husped la Rifampicina y el cido Nalidixico. Inhibicin de la actividad enzimtica. Algunos antibiticos se comportan como antimetabolitos, que por su parecido al sustrato normal de una enzima necesaria en la produccin de cido flico, interfieren con esta sntesis y detienen el crecimiento del microorganismo. Es el caso de la sulfanilamida. Otros agentes de accin similar son las sulfotas y el Timetropin.

66
Qu funcin cumplen las enzimas en los organismos vivos? Preguntas de repaso Cules son las diferencias entre respiracin aerbica y anaerbica? Qu importancia tienen las pruebas bioqumicas en microbiologa? Cul es la diferencia entre organismos quimitrotofos y fottrofos?

Para qu sirve la microbiologa? El estudio detallado de los factores que afectan el crecimiento bacteriano tiene una gran utilidad en la fermentacin industrial. Los tanques utilizados en dicha fermentacin se conocen como biorreactores y se disean teniendo en cuenta aireacin, control de pH y control de temperatura, factores que afectan directamente el crecimiento de los microorganismos y por ende el producto que ellos elaboran. El alto valor de los productos elaborados por los microorganismos y las clulas eucariticas modificadas, ha estimulado el desarrollo de nuevos tipos de biorreactores que incluso son manejados por computador, de manera que todos los factores sean controlados y/o modificados ptimamente15.

15

Yousef, A and Carlstrom,C. 2006. Microbiologa de los alimentos. Manual de Laboratorio. Edit. Acribia. Zaragoza. Espaa. p.145.

67

UNIDAD DIDCTICA 2 IMPORTANCIA DE LA MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

UNIDAD 2. Importancia de la microbiologa industrial En la Unidad 2 el estudiante evidencia como de acuerdo a sus caractersticas metablicas los microorganismos intervienen en procesos industriales o actan de forma perjudicial produciendo, Introduccin en el hombre, enfermedades transmitidas por los alimentos. Tambin le permite determinar la influencia del ambiente y los manipuladores en la calidad del producto alimenticio. El conocimiento sobre las diferentes formas de accin que tienen los microorganismos sobre los alimentos y las reas de trabajo permitir al estudiante elaborar un producto alimenticio idneo e inocuo para el consumidor. 1. El estudiante explica las diferentes formas de accin de los microorganismos sobre los alimentos. 2. El estudiante interpreta los hallazgos microbiolgicos obtenidos en ambientes y manipuladores de manera que pueda ejercer un control sobre los mismos. 3. El estudiante analiza y argumenta las posibilidades de accin microbiolgica en los diferentes procesos industriales donde intervienen microorganismos. 4. El estudiante identifica las diferentes enfermedades transmitidas por los alimentos cuyo agente causal es un microorganismo. Contribuir a que el estudiante reconozca la influencia que tienen los microorganismos sobre los alimentos y la manera de controlarlos o manejarlos con el fin de optimizar sus procesos, elaborando as un producto alimenticio de ptima calidad. 1. Que el estudiante identifique los microorganismos asociados con problemas en la calidad del alimento. Objetivos 2. Que el estudiante determine la importancia microorganismos asociados a procesos industriales. de los

Justificacin

Competencias

Propsito

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3. Que el estudiante establezca la relacin entre el microorganismo causal y la enfermedad transmitida por el alimento.

Horas de trabajo acadmico Palabras clave

El contenido de esta unidad corresponde a un crdito acadmico, que equivale a 12 horas de acompaamiento tutorial y 36 horas de trabajo independiente. Procesos industriales, fermentacin, microorganismos indicadores, enfermedades transmitidas por alimentos.

Mapa Conceptual Unidad 2: Importancia de la microbiologa de alimentos

Capitulo 4. Microorganismos asociados a procesos industriales La importancia de los microorganismos en procesos como la fermentacin ha sido evidente desde tiempos de Pasteur, quien dijo que la fermentacin es la vida sin aire y a partir de esta idea se puede definir la fermentacin como un proceso donde la energa que requieren los microorganismos para vivir puede ser obtenida

69 mediante reacciones donde no interviene el oxgeno. El microorganismo no causa la fermentacin; es el mecanismo que utiliza para vivir16 . Como se observa en la figura 20 una forma de clasificar los organismos es de acuerdo a la fuente de energa que utilizan: los fottrofos, son aquellos que utilizan la luz como fuente de energa y los quimiottrofos, que utilizan la energa liberada a partir de diferentes compuestos qumicos. Para este ltimo caso, si el oxgeno acta como aceptor de electrones se habla de la respiracin (metabolismo arobico), pero si el proceso ocurre en ausencia de oxgeno, se llama fermentacin (metabolismo anaerbico). Las lecciones que se encuentran en este captulo son: Leccin 16. Fermentacin alcohlica Leccin 17. Fermentacin lctica Leccin 18. Produccin de cido actico Leccin 19. Produccin de cido ctrico Leccin 20. Otros procesos industriales

Leccin 16. Fermentacin alcohlica La ecuacin general de la fermentacin alcohlica es la siguiente: C6H12O6 (Glucosa) + Levadura 2 C2H5OH (Etanol) + 2CO2

En esta ecuacin se indica que un azcar es el sustrato (C6H12O6) y que la reaccin es anaerbica. En unos casos se utiliza el CO2, para la elaboracin del pan y en otros se aprovecha el etanol. La degradacin de la glucosa en condiciones de anaerobiosis libera una pequea cantidad de energa que el organismo utiliza para impulsar sus propias reacciones de sntesis de materia orgnica. El proceso degradativo que implican liberacin de energa se llaman catabolismo y el proceso de sntesis o produccin de biomolculas se denomina anabolismo. El catabolismo de la glucosa se realiza mediante una va universal denominada va glicoltica o en honor de sus
16

Herrera, J.R. 2001. El pensamiento biolgico a travs del microscopio. Fondo de cultura econmico. Mxico. p.66.

70 descubridores va de Embden-Meyerhoff-Parnas17. En el siguiente esquema se representa esta va:

Figura 22. Fermentacin alcohlica. Se relacionan los principales productos y transformaciones que ocurren en la fermentacin pues se producen varias sustancias intermedias durante el proceso. El nmero que se observa al lado de cada molcula se refiere al nmero de molculas producidas. Fuente: Imagen tomada y adaptada de The Science of Biology. (2004).

En la figura 22 se observa que el primer paso para cualquier tipo de fermentacin es la glicolisis, donde la glucosa pasa a cido pirvico y luego este es convertido a acetaldehdo con liberacin de CO2. El NADH + H+ de la glicolisis acta como un agente reductor, para permitir la conversin del acetaldehdo a etanol, es decir acta como una coenzima (pequeas molculas que se requieren en forma indispensable para ayudar al funcionamiento de algunas enzimas). Igualmente se produce una pequea

17

Herrera, J.R. 2001. El pensamiento biolgico a travs del microscopio. Fondo de cultura econmico. Mxico. p.69.

71 cantidad de ATP (2 molculas de Adenosin Trifosfato) que es utilizada por el organismo para sus reacciones internas18 . La fermentacin alcohlica vara de acuerdo al producto que se quiere obtener: cerveza, vino, licores destilados o alcohol industrial. La cerveza se elabora de granos, los vinos a partir de jugos de frutas y los licores destilados y el alcohol industrial pueden elaborarse de uno u otro tipo de material.

Saccharomyces cereviciae Saccharomyces cereviciae es la levadura utilizada en la fermentacin alcohlica que permite la elaboracin de la cerveza y produce dos tipos de fermentacin llamadas superior e inferior, denominadas as por el lugar donde se deposita la levadura. Esta propiedad fsica se conoce como floculacin, y le permite a la levadura agruparse de manera que se puedan sedimentar (fermentacin inferior) o permanecer en la superficie del lquido (fermentacin superior). Las cervezas inglesas (11% de alcohol) emplean la fermentacin superior y las alemanas, menos fuertes, ms carbonatadas, ms claras, menos aromticas y con menor contenido alcohlico (3,5% de alcohol) la fermentacin inferior. Cada tipo de fermentacin influye en el aroma, sabor, olor, cantidad de gas carbnico, de alcohol, entre otros. Se necesitan aproximadamente casi 4g de levadura/litro de cerveza independientemente del tipo de fermentacin utilizada19. Existen una serie de factores que influyen en la reproduccin de la levadura durante la fermentacin y que deben ser controlados para lograr un adecuado proceso: - Concentracin de Oxgeno, es un elemento necesario para la reproduccin acelerada de la levadura lo que favorece el proceso de fermentacin. - Intervalos de temperatura, por ser un microorganismo que crece entre 25 -30:C, el aumento de la temperatura durante la fermentacin favorece la reproduccin de la levadura. - Componentes del mosto, por ser el mosto la materia prima que transforma la levadura debe tener unos requerimiento nutricionales altos, que favorezcan la reproduccin de la levadura y por consiguiente el proceso de fermentacin.

Purves, W.K. et col.2004. Life. The science of biology. 7a.Edicin.Edit. Sinauer Associates. U.S.A. p. 256. 19 Crdova Frunz, J.L. 2002. La qumica y la cocina. 3. Ed. Fondo de cultura econmico. Mxico. p 35.

18

72

Elaboracin de la cerveza Prcticamente cualquier material con almidn puede hacerse fermentar con levadura. La cebada es el cereal ms utilizado en la elaboracin de la cerveza. La semilla de la cebada tiene una gran masa de tejido que constituye las reservas alimenticias para la germinacin de la planta. Estas reservas son principalmente, polisacridos, es decir, molculas hechas de unidades de azcares como glucosa y maltosa (monosacridos). Germinacin La malta es el germinado de la cebada. Durante la germinacin de la cebada se producen, dentro del grano, las enzimas amilasas que rompen los polisacridos en sus componentes mnimos (monosacridos) y sobre estos monosacridos es donde la levadura puede actuar. Esto se debe a que la levadura solo puede metabolizar los azcares simples. Para detener la germinacin se hace un calentamiento suave que no daa las enzimas. Un calentamiento excesivo produce un grano ms oscuro, empleado para elaborar la cerveza oscura. Maceracin La maceracin de la malta en agua caliente se realiza para facilitar el rompimiento de los polisacridos. Las enzimas (producidas en la germinacin) comienzan a romper los polisacridos y a producir pptidos, aminocidos, azcares, etc., los cuales se disuelven en el agua dando lugar al mosto, el liquido que se fermentar ms tarde. Luego se mezcla la malta con agua a 40 C y se deja en reposo por 30 min. En este punto las enzimas que descomponen las protenas tienen sus condiciones ideales para la produccin de pptidos y aminocidos, que se convierten en alimento para las levaduras. En otro recipiente se prepara una infusin del cereal macerado con agua y se lleva a una temperatura cercana a la ebullicin. Cuando alcanza una textura gelatinosa se aade a la malta obtenindose una mezcla que se calienta por etapas hasta alcanzar los 77 C. En este punto la mezcla y la temperatura favorecen la accin de las amilasas. Despus de mantener la mezcla a 77 C por media hora se eleva la temperatura hasta 80 C con la finalidad de destruir las enzimas y poder controlar la fermentacin. A continuacin se cuela la mezcla o mosto a fin de obtener un lquido transparente que se pone a hervir por 30 a 60 min. para destruir cualquier enzima remanente, esterilizarlo y concentrarlo un poco. Luego se aade a intervalos regulares, la flor seca del lpulo y se lleva a ebullicin lo que permite extraer sustancias que

73 contribuyen al sabor y aroma de la cerveza. Despus de la ebullicin se eliminan los restos del lpulo y se enfra a 10 C.

Fermentacin Durante la fermentacin las levaduras no solo se multiplican casi tres veces sino que tienen tiempo de transformar los azcares del mosto a alcohol y CO2 que se recoge para aadirlo despus. Son ms de 12 reacciones enzimticas que producen la fermentacin de azcares a alcohol, todas exotrmicas (reacciones que liberan calor) por lo que el tanque debe refrigerarse. La fermentacin requiere unos 9 das, se realiza en el citoplasma de la levadura, produce un contenido alcohlico en el mosto de un 4,6% (v/v), baja el pH a 4,0 y produce CO2. Al final de la fermentacin la levadura se recoge para volverla a emplear. En las cerveceras los cultivos se renuevan cada 10 meses, aproximadamente, pues se contaminan con otros microorganismos20. Maduracin Una vez terminada la fermentacin se filtra la mayor parte de la levadura y sustancias en suspensin, se almacena cerca de los 0 C por perodos que van de semanas a meses a fin de mejorar el sabor y aroma. Todava no son claras las reacciones que ocurren en esta etapa de la elaboracin de la cerveza. Durante el almacenamiento se adiciona CO2, que adems de mejorar la frescura del producto ayuda a eliminar el oxgeno disuelto que disminuye la vida media de la cerveza. Una vez la cerveza se embotella o enlata se pasteuriza a 60 C por 15 minutos para evitar la accin de microorganismos patgenos. Las propiedades alimenticias de la cerveza lo son tambin para los microorganismos que pueden sobrevivir a la pasteurizacin y sustancias que inhiben su crecimiento. Sin embargo, la acidez y el alcohol de la cerveza son inhibidores de los microorganismos patgenos (Figura 23).

Crdova Frunz, J.L. 2002. La qumica y la cocina. 3. Ed. Fondo de cultura econmico. Mxico. p 40.

20

74

Figura 23. Produccin de la cerveza Fuente:http://www.clubplaneta.com.mx/bar/proceso_de_elaboracion_de_la_cerveza.htm

Infovideo que presenta la elaboracin de la cerveza y la accin de las levaduras

75

Infovideo de History Channel que consta de 5 captulos en los cuales detalla la elaboracin de la cerveza. Incluye su historia, clases de cerveza y accin de la levadura.

Leccin 17. Fermentacin lctica La reaccin general de este tipo de fermentacin es la siguiente: C6H12O6 (Glucosa) + BAL 2 H3C-CH(OH)-COOH (cido lctico)

En este caso la lactosa la encontramos principalmente en la leche de animales y el hombre y a partir de este sustrato las bacterias cido lcticas (BAL) transforman este disacrido (glucosa + galactosa) en cido lctico, lo que permite la elaboracin de yogur, kfir y quesos. La va glicoltica o glicolisis de la fermentacin lctica, al igual que la fermentacin alcohlica, produce cido pirvico, ATP y NADH + H+. Este ltimo acta como un agente reductor que permite la conversin del piruvato a cido lctico (Figura 22).

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Figura 24. Fermentacin lctica. Se relacionan los principales productos y transformaciones que ocurren en la fermentacin pues se producen varias sustancias intermedias durante el proceso. El nmero que se observa al lado de cada molcula se refiere al nmero de molculas producidas. Fuente: Imagen tomada y adaptada de The Science of Biology. (2004).

Bacterias cido lcticas Comprenden un grupo heterogneo de bacterias Gram (+), que incluyen cocos y bacilos. Son bacterias no formadoras de esporas, microaerfilas o anaerobias pero aerotolerantes y pueden metabolizar los carbohidratos mediante diferentes rutas fermentativas. Son bacterias exigentes para su crecimiento por lo que requieren sustratos como la leche para un adecuado metabolismo. La mayora crece a temperaturas mesfilas, aunque se pueden encontrar psicrfilas y termfilas. De acuerdo a la forma de metabolizar la glucosa se pueden clasificar en21:

21

Yousef, A and Carlstrom,C. 2006. Microbiologa de los alimentos. Manual de Laboratorio. Edit. Acribia. Zaragoza. Espaa. p.55.

77 - Bacterias Homolcticas o tambin llamadas Homofermentativas, aquellas que utilizan la va glicoltica, por lo tanto solo producen cido lctico.

C6H12O6 (Glucosa) + BAL

2 H3C-CH(OH)-COOH (cido lctico) + 2 ATP

- Bacterias Heterolctica o tambin llamadas Heterofermentativas, son bacterias que producen un metabolito intermedio llamado triosa fosfato y que por accin de la enzima fosfocetolasa se convierte en cido lctico. Esta ruta tambin se conoce como la ruta de la fosfocetolasa y adems de cido lctico y ATP producen etanol y CO2.

C6H12O6 (Glucosa)+ BAL

H3C-CH(OH)-COOH(cido lctico) + C2H5OH (Etanol) + CO2 + ATP

Una diferencia importante y destacable en estos dos grupos de BAL, es que en el caso de las bacterias Homolcticas producen 2 molculas de ATP mientras que las Heterolcticas una sola molcula de ATP. Dentro del grupo de bacterias cido lcticas se encuentran por lo menos 10 gneros: Corynebacterium, Enterococos, Lactococos, Lactobacillus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus y Vagococcus22.

Elaboracin del Queso La fermentacin lctica ocupa el segundo lugar despus de la fermentacin alcohlica, entre las industrias que se basan en procesos microbiolgicos. Las etapas generales en la elaboracin del queso son las siguientes:

Pre-tratamiento de la leche La leche, materia prima en la elaboracin del queso, debe tener las siguientes condiciones:

22

Ibis. p. 57

78 - Bajo recuento bacteriano, pues si es muy alto este recuento puede haber una excesiva produccin de gas y olores desagradables en el producto final. Por esto es necesario refrigerar rpidamente la leche una vez ordeada. - No debe tener enzimas que perjudiquen la elaboracin del producto, por ejemplo, la lactoperoxidasa inhibe el crecimiento de algunas bacterias lcticas importantes en la fabricacin del queso y las lipasas y proteasas pueden modificar el aroma y sabor del queso. - Es necesaria la homogenizacin de la leche, proceso que reduce el tamao de los glbulos grasos, para la elaboracin del queso crema, quesos blandos y quesos para untar.

Coagulacin El proceso de coagulacin de la leche se realiza por: - Acidificacin, es decir, el pH de la leche disminuye por accin de bacterias iniciadoras lcticas que fermentan la lactosa a cido lctico. Esta disminucin del pH reduce la solubilidad de las casenas (principales protenas de la leche) y acelera la coagulacin enzimtica del queso. Adems el pH cido facilita la extraccin del suero y controla el desarrollo de flora bacteriana indeseable. - Accin de enzimas que hidrolizan especficamente una fraccin de la casena. Dicha fraccin tiene como funcin estabilizar las micelas (agregados circulares multimoleculares) de casena de la leche, en presencia de calcio, en una suspensin coloidal. Por consiguiente, si est bloqueada esta fraccin se desestabiliza la micela haciendo que coagule la leche.

Separacin del cuajo y el suero Este proceso se conoce como sinresis del suero y que consiste en separar la cuajada slida del suero lquido y que puede acelerarse por cortes a la cuajada, aumento de la temperatura, reduccin del pH por bacterias lcticas o simplemente separacin fsica. En este punto se puede moldear la cuajada de acuerdo al producto final.

Maduracin del queso Se refiere al paso que permite la elaboracin de los diferentes tipos de quesos:

79 - Usando microorganismos, por ejemplo: Propionibacterium (queso Suizo), Penicillium roqueforti (queso Azul) o Penicillium camemberti (queso camembert). - Usando enzimas por ejemplo, esterasas pregstricas (queso Romano y Provolone).

Infovideo que presenta la elaboracin del queso

Leccin 18. Produccin de cido Actico La ecuacin general de la produccin de cido actico (vinagre) es la siguiente:

C2H5OH (Etanol) + O2 + Bacteria

CH3COOH (cido Actico) + H2O

Segn la ecuacin se observa que se requiere una fuente de alcohol etlico (que puede provenir de la fermentacin de levaduras) y la reaccin es de tipo arobica. El vinagre es una solucin que contiene por lo menos 4% de cido actico y pequeas cantidades de alcohol, glicerina, esteres, azcares y sales.

Acetobacteriaceae La familia Acetobacteriaceae est conformada por dos grandes gneros: Acetobacter spp. y Gluconobacter spp. formadoras ambas de cido actico y que se diferencian por que el Acetobacter spp puede oxidar el cido actico a CO2 y H2O, mientras que las Gluconobacter spp no. La especie Acetobacter, entre las que se encuentran A. aceti, A. orleanensis, A. schutzenbachii, entre otras, se localizan ampliamente en el suelo y el aire y por lo general aparecen en uvas, manzanas y otras frutas, por lo que fcilmente se produce la fermentacin actica despus de la fermentacin alcohlica espontanea, salvo que se evite este proceso. Son bacterias elipsoides y esfricas, sueltas o unidas en cadenas de dos o ms. Inmviles o mviles por medio de

80 flagelos pertricos. Se manifiestan como gram negativos en su juventud y volubles con respecto al Gram en su madurez. Son aerobios, catalasa positivos, formadores de indol y de H2S. Gluconobacter spp son clulas elipsoides o redondeadas. Gram negativas o Gram variables, mviles por flagelos polares o inmviles, aerobios. Productores de indol y de H2S23. Elaboracin del Vinagre Existen dos mtodos utilizados en la elaboracin del Vinagre, que dependen de la forma de aireacin: - Mtodos Lentos, como el procedimiento casero y el mtodo francs o de Orleans, en los cuales no hay movimiento del lquido alcohlico durante la acetificacin (formacin del cido actico). - Mtodos Rpidos como el mtodo del generador y el sistema de fermentacin sumergida, en los cuales hay movimiento del lquido alcohlico. El mtodo ms utilizado es el del generador que consiste en un tanque de aproximadamente 5 m de dimetro por seis m de alto y en cuyo fondo perforado se colocan virutas de madera. En una tapa falsa perforada se hace que pase el aire hacia arriba por las virutas. Las virutas son empapadas lo mejor posible en vinagre de la mejor calidad para inocularlas con una cepa de la familia Acetobacteriacea, es decir, las virutas son el soporte fsico para los microorganismos. Una solucin alcohlica distribuida en la tapa superior escurre lentamente por las virutas. La oxidacin bacteriana de alcohol a cido actico, en las virutas, desencadena la produccin de calor y el generador funciona como una chimenea, haciendo que el aire pase por el fondo. En algunos casos se hace necesario usar serpetines que mantengan la temperatura entre 25 a 30 oC. La produccin final del vinagre requiere de la recirculacin por el generador varias veces.

Lectura de profundizacin sobre la produccin del vinagre

23

Beryeys Manual of Determinative Bacteriology. 9a. Ed. 1994. p.279

81 Leccin 19. Produccin de cido ctrico (o citrato) El cido ctrico se utiliza como acidulante en bebidas, como auxiliar en la fabricacin de mermeladas, como aditivo general en las industrias de repostera, como antioxidante y ajustador de pH de muchos alimentos. La materia prima utilizada para la produccin de citrato son las melazas o jarabes de glucosa, enriquecidas con nitrgeno y sales. Para la elaboracin del cido ctrico se trabaja con cepas de Aspergillus niger y Candida guillermondii, que pueden crecer a un pH por debajo de 2.0, muy til para la produccin del citrato y que sintetizan la enzima piruvato carboxilasa que es la que permite la conversin del cido pirvico a oxalacetato y este a citrato, por unin con un Acetil-CoA (metabolismo aerobio) Figura 23. La fermentacin se realiza de 25 a 30 C y necesita de 7 a 10 das, al cabo de los cuales el cido ctrico es precipitado en forma de citrato de calcio y se recupera al tratarlo con cido sulfrico.

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Figura 25. Proceso metablico que conduce a la acumulacin de citrato. La produccin de citrato implica los siguientes pasos: 1. Descomposicin de las hexosas a piruvato y acetil CoA, 2. Formacin del oxalacetato a partir de piruvato y CO2, 3. Acumulacin de citrato dentro del ciclo de Kreebs o ciclo del cido tricarboxlico. La oxidacin del piruvato y el ciclo del cido ctrico se realizan en la matriz mitocondrial. Fuente: Claudia Zambrano

Leccin 20. Otros procesos industriales Existen una amplia gama de productos industriales elaborados mediante procesos donde intervienen los microorganismos, aqu se relacionan los que tienen importancia para el rea de los alimentos: Produccin de cido giberlico El cido giberlico es utilizado para acelerar la produccin de malta y se obtiene del hongo Fusarium monoliforme. Para su produccin se requieren dos condiciones importantes, un bajo contenido de nitrgeno y una mezcla de fuentes de carbono24.
24

Ward, O.P. 1989. Biotecnologa de la fermentacin. Principios, procesos y productos. Edit. Acribia S.A. Zaragoza. Espaa. 159p.

83

Produccin de cido glutmico El cido glutmico se utiliza como potenciador del sabor en los alimentos y se obtiene de procesos de fermentacin con Corynebacterium glutamicum. Para la produccin del glutamato, se utiliza como materia prima las melazas o almidn hidrolizado con una adecuada fuente de nitrgeno y la ruta utilizada es la va de Embden-Meyerhoff-Parnas. Produccin de Lisina La lisina es un aminocido esencial en la nutricin de animales y el hombre por lo que su produccin es muy importante a nivel industrial. Este aminocido se produce por fermentacin directa de un mutante de Corynebacterium glutamicum. Produccin de enzimas La produccin industrial de enzimas, utilizando los procesos metablicos de los microorganismos, se ha ido ampliando cada vez ms debido a los diferentes usos y aplicaciones en la industria de los alimento. Entre otros se encuentran:

Microorganismo
Mucor, E. coli

Enzima que produce

Renina (Quimosina)

Utilidad de la enzima
Participa en produccin de queso la

Observaciones
E. coli ha sido modificada genticamente para este fin.

Aspergillus oryzae

Proteasas

Ablanda carnes y modifica la masa de pan y galletas. La pectinasa eleva el rendimiento del zumo, reduce la viscosidad y mejora la extraccin del color de las frutas (Ward,1989)

Aspergillus niger

Pectinasa

Jugos de frutas

Aspergillus niger Saccharomyces fragilis Saccharomyces cerevisiae Trichoderma viride Bacillus subtilis

Lipasa Lactasa Invertasa Celulasa -amilasa

Participa en la produccin de queso Fabricacin de dulces Fabricacin de dulces Jugos de frutas, caf Elaboracin de cerveza la

Enzima intracelular

Tabla 5. Microorganismos productores de enzimas utilizadas en el rea de alimentos Fuente: Claudia Zambrano

La mayora de enzimas son extracelulares lo que favorece su obtencin y los costos de produccin. Las proteasas son las de mayor produccin industrial.

84

Cul es la diferencia fundamental entre fermentacin y respiracin? Preguntas de repaso Qu es la glucolisis? Cules son los productos del ciclo de Kreebs? Cul es la diferencia entre la fermentacin homolctica y la fermentacin heterolctica?

Para qu sirve la microbiologa? La Xanthomona campestris es un bacilo Gramnegativo que afecta las plantas produciendo una enfermedad llamada: putrefaccin negra. En este caso la bacteria utiliza la glucosa, elaborada por la planta, para formar una masa gomosa llamada Xantano. Esta sustancia obstruye el transporte de nutrientes de la planta. El xantano no produce efectos adversos en el humano, por lo que puede utilizarse como espesante en productos lcteos y aderezos para ensaladas y en cosmticos como las cremas para el cutis y los champs. Para lograr esto, se debi identificar una cepa de Xanthomona campestris que utilizara la lactosa, como fuente de carbono, en vez de la glucosa, de manera que pudiera transformar el principal azcar presente en el suero de la leche, producto de desecho en la elaboracin del queso, y que gracias a este bacteria puede convertirse en xantano, obteniendose un valor agregado en la elaboracin del queso25.

Captulo 5. Microorganismos indicadores de alimentos Muchos alimentos son elaborados en condiciones desfavorables que facilitan la contaminacin con varios microorganismos. Sin embargo la supervivencia y multiplicacin de estos microorganismos depende de la composicin del alimento y las condiciones de almacenamiento, entre otros. Para controlar estas dificultades se han establecido un grupo de microorganismos que al ser identificados en los alimentos indican o sealan la calidad, idoneidad e inocuidad del producto alimenticio por lo que su adecuado reconocimiento es fundamental para la evaluacin del proceso productivo y validar, as, el producto final que llegar al consumidor.
25

USDA.2007.Estados Unidos. 27-35p.

85 Las lecciones que se encuentran en este captulo son: Leccin 21. Mesfilos Leccin 22. Coliformes Leccin 23. Salmonella Leccin 24. Clostridium sulfito reductor Leccin 25. Staphylococo aureus Leccin 26. Hongos y levaduras Leccin 27. Listeria monocytogenes Leccin 28. Escherichia coli O157:H7 Leccin 29. Bacillus cereus

Leccin 21. Mesfilos El recuento de microorganismos mesfilos es considerado el recuento indicador ms general y amplio de alimentos, pues incluye todos los gneros aerobios y facultativos que crecen en medios simples a una temperatura entre 20-45.C. El nmero de microorganismos mesfilos es un indicador del grado de contaminacin de los alimentos en cualquier etapa del proceso de produccin26. Los alimentos pueden tener una apariencia normal pero si su recuento de mesfilos es alto, sealara que la alteracin del producto est cercana, por lo que tambin se considera un indicador de la vida til o media del alimento. El recuento de mesfilos tiene algunas limitaciones27:

26

Snchez, M y col. 1988. Anlisis microbiolgico de alimentos. INS. Bogot. Colombia. p 18.

27

Yousef, A and Carlstrom,C. 2006. Microbiologa de los alimentos. Manual de Laboratorio. Edit. Acribia. Zaragoza. Espaa. p.78.

86 - Los alimentos fermentados, como por ejemplo el queso Cheddar, contienen naturalmente un nmero elevado de carga microbiana, por lo que el nmero de mesfilos no es til para evaluar la calidad microbiolgica de estos alimentos. - El medio utilizado para la recuperacin de estos microorganismos no permite el crecimiento de aquellos que son exigentes en sus requerimientos nutricionales por lo que no permiten evaluar este tipo de microorganismos. - Por las condiciones de incubacin de los mesfilos no se puede determinar ni anaerobios estrictos ni hongos y levaduras.

Leccin 22. Coliformes Son bacterias aerobias o facultativas anaerobias, gram negativas, no formadoras de esporas, con formas bacilares y fermentadoras de lactosa con la produccin de cido y gas en 48 h. a 35.C. Los coliformes comprenden al menos tres gneros: Escherichia, Klebsiella y Enterobacter. Como los coliformes se encuentran normalmente en tracto intestinal, su presencia en los alimentos puede indicar contaminacin fecal, adems de una mala calidad higinica en el proceso, falta de higiene en los manipuladores o recontaminacin despus del proceso. Sin embargo, la presencia de nmeros elevados de coliformes en un alimento tambin puede deberse al crecimiento de un pequeo inculo de origen no fecal. Por lo tanto, el recuento de coliformes debe interpretarse cuidadosamente.

Leccin 23. Salmonella El gnero Salmonella pertenece a la familia Enterobacteriaceae y comprende un grupo de bacterias que se caracterizan por ser gram negativas flageladas y de forma bacilar. Las salmonelas son anaerobias facultativas, por lo que presentan las dos vas metablicas: oxidativa y fermentativa. Adems, fermentan la glucosa formando cido y gas, pero no fermentan la lactosa; crecen en citrato como nica fuente de carbono, descarboxilan la lisina y suelen producir sulfuro de hidrogeno (H2S). La mayor parte de los serotipos de Salmonella solo crecen en el intervalo de temperaturas mesfilos. La pasteurizacin inactiva eficazmente estas bacterias. La va de entrada de las salmonellas y de otros agentes de infecciones grastrointestinales es la oral. Los alimentos pueden contaminarse con excretas humanas o de animales en cualquier punto del proceso productivo. Sin embargo, los principales vehculos de transmisin son la carne (ternera, cerdo, aves), los huevos y los productos industrializados que contienen estas materias primas28.

28

Snchez, M y col. 1988. Anlisis microbiolgico de alimentos. INS. Bogot. Colombia. p 31

87 El agua es uno de los vehculos de transmisin de la Salmonella y en general, los serotipos de mayor incidencia son la Salmonella typhimurium y Salmonella enteritidis. Leccin 24. Clostridium Sulfito Reductor Es el grupo ms importante de bacterias anaerobias formadoras de esporas y se encuentran normalmente en el suelo, por eso se consideran contaminantes naturales de la mayora de alimentos, especialmente los de origen vegetal. Igualmente, algunos Clostridium spp. se encuentran en el tracto gastrointestinal de los animales por lo que se les considera contaminantes naturales de los alimentos de origen natural. En el caso de estos ltimos alimentos el microorganismo se nutre de ellos y con la coccin de la carne el nivel de oxgeno disminuye lo que lleva a la formacin de las endosporas. La presencia de recuentos altos de bacterias esporuladas en un alimento puede indicar una severa contaminacin ambiental, deficiente manipulacin o fallas en el proceso trmico destinado a la eliminacin de esporas. La esterilizacin comercial de alimentos enlatados se ha diseado para destruir los esporulados patgenos. Los principales Clostridium asociados a enfermedades transmitidas por alimentos (ETAs) son: C. botulinum (proteoltico y no proteoltico), C. butyricum, C. perfringens, C. sporogenes y C. tyrobutyricum29. El C. botulinum en condiciones de anaerobiosis (por ejemplo, enlatados) sintetiza una exotoxina considerada la ms potente de las toxinas naturales. Esta toxina tiene una fuerte afinidad por el sistema nervioso (neurotoxina), donde bloquea la acetilcolina, una sustancia qumica que permite la transmisin del impulso nervioso (neurotransmisor). Esta toxina puede ser destruida por la mayor parte de los mtodos de coccin que llegan a los 100 C.

Leccin 25. Staphyloccocus aureus Es un coco Gram positivo que se organiza en forma de racimos y que presenta una alta capacidad de supervivencia en condiciones de sequedad durante un largo perodo de tiempo. Incluso pueden crecer en alimentos o medios de cultivo con bajas concentraciones de agua. La presencia de Staphyloccocus aureus en un alimento se interpreta como indicativo, principalmente, de contaminacin a partir de piel, boca y fosas nasales

29

Yousef, A and Carlstrom,C. 2006. Microbiologa de los alimentos. Manual de Laboratorio. Edit. Acribia. Zaragoza. Espaa. p.95.

88 de los manipuladores de alimentos, material, equipos sucios y materias primas de origen animal contaminados30. Son varios los mtodos utilizados que pueden disminuir la poblacin de Staphyloccocus aureus pero que no destruyen la toxina que este microorganismo produce. De hecho, est puede permanecer activa incluso despus del proceso de pasteurizacin.

Leccin 26. Hongos y Levaduras La presencia de una gran cantidad de levaduras y mohos no es deseable en los alimentos, excepto en los quesos madurados por mohos. Un elevado nmero de estos microorganismos en los alimentos indica una mala higiene y manipulacin deficiente, abuso de temperatura, tratamiento inadecuado o contaminacin postproceso. Cuando los hongos se desarrollan en alimentos cidos, pueden consumir los ingredientes cidos y en consecuencia aumentar el pH del producto, es decir tornarlo bsico, lo que puede favorecer el crecimiento de bacterias contaminantes que no haban crecido antes por la acidez del alimento.

Leccin 27. Listeria Monocytogenes Es un bacilo gram positivo, no formador de esporas, mvil por la presencia de flagelos cuando se cultiva a 20-25 oC. La movilidad es mucho menor o se pierde por completo al cultivar la bacteria a 37 C. Es una bacteria aerbica y microaeroflica y puede crecer en un intervalo de temperatura desde 1C hasta 45 C, siendo ptima entre 35-37 C, lo que permite su crecimiento en condiciones de refrigeracin. Tambin puede crecer en condiciones cidas. Es una bacteria inocua en el medio ambiente, por lo que se ha aislado de materias primas como: leche, ensaladas, carnes y pescados. Igualmente, puede encontrarse en el ambiente donde se procesan los alimentos, por lo que se debe evaluar peridicamente la presencia de esta bacteria en muestras tomadas de la lnea de produccin31. Leccin 28. Escherichia coli O157:H7 Bacteria Gram negativa flagelada, de forma bacilar y anaerobio facultativo (es decir posee las dos rutas metablicas: respiratoria y fermentativa). Fermenta glucosa y otros carbohidratos produciendo cido y gas.
30 31

Snchez, M y col. 1988. Anlisis microbiolgico de alimentos. INS. Bogot. Colombia. p 25 Yousef, A and Carlstrom,C. 2006. Microbiologa de los alimentos. Manual de Laboratorio. Edit. Acribia. Zaragoza. Espaa. p.112.

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Las diferentes cepas de E. coli se clasifican de acuerdo a dos tipos de antgenos presentes en su superficie: El antgeno O de la capa de lipopolisacaridos y el antgeno flagelar denominado H. En la actualidad se reconoce la existencia de 167 antgenos O y 53 antgenos H. Los serotipos de E. coli se identifican con estos dos antgenos aadiendo dos nmeros al nombre de la especie. El primero indica el antgeno O y el segundo el H, por ejemplo: E. coli 055:H6, E. coli O111:H8. E. coli O157:H7 y E. coli O167:H432 . E. coli es un microorganismo normal del tracto intestinal y la mayora de cepas son inocuas para el ser humano. Las cepas patgenas se clasifican de acuerdo a sus factores de virulencia, los sndromes clnicos que provocan y sus mecanismos de patogenicidad. El ganado vacuno es el principal reservorio de E. coli O157:H7, por lo que esta bacteria est muy asociada con carne picada de vacuno poco cocida. Aunque tambin se ha aislado de: leche cruda y pasteurizada, cuajadas de queso y lechuga. El agua tambin se considera un vehculo para su transmisin.

Leccin 29. Bacillus cereus Es un microorganismo aerobio, Gram positivo, esporulado y se encuentra normalmente en el suelo, vegetales, alimentos crudos y procesados. Cuando se encuentra un recuento alto de este microorganismo (mayor de 106 UFC/g) en un alimento puede ocasionar intoxicacin alimentaria. Se ha asociado a brotes de enfermedad de alimentos con almidn, carnes cocidas, hortalizas, sopas, ensaladas y pudines33.

Qu utilidad tiene el recuento de mesfilos en alimentos? Preguntas de repaso Qu indica la presencia de coliformes en el alimento? Qu beneficio tiene la esporulacin para el microorganismo?

Para qu sirve la microbiologa?

32 33

Ibis. p.117 Ibis. p.124

90 La importancia de identificar microorganismos patgenos en los alimentos, radica en poder organizar las medidas preventivas necesarias que eviten afecciones al consumidor y que adems, fundamenten la implantacin de sistemas de calidad que garanticen la inocuidad e idoneidad del alimento. Dentro de estos sistemas se destacan las Buenas Prcticas de Manufactura (BPM) y la identificacin de Puntos Crticos de Control (HACCP), que en parte se basan en los hallazgos microbiolgicos obtenidos durante el proceso de produccin o en el producto final.

Captulo 6. Enfermedades transmitidas por alimentos (ETAs) Las ETAs se refieren a los procesos patolgicos causados por el consumo de un alimento contaminado por bacterias, protozoos, helmintos o virus. Si la ETAs tiene un origen bacteriano puede clasificarse, en infecciones e intoxicaciones, de acuerdo a la forma como acta el agente causal (Figura 26):

Figura 26. Tipos de ETAs. Fuente: Tomada y modificada de Youself, 2006

En el caso de las ETAs, la infeccin se origina por la ingestin de microorganismos vivos en el alimento y la intoxicacin por el consumo de toxinas producidas por los microorganismos. En este ltimo caso no es necesaria la presencia del microorganismo sino la de la toxina.

91 A su vez, las enfermedades de tipo infeccioso se pueden clasificar en: - Infecciones no invasivas (toxiinfecciones) que se refieren a aquellas infecciones que se producen en el intestino y los microorganismos causantes de la enfermedad elaboran toxinas que aumentan su patogenicidad. - Infecciones invasivas, en las cuales el agente causal puede atravesar la barrera intestinal y colonizar otros tejidos.

Las lecciones que se encuentran en este captulo son: Leccin 30. Enfermedades transmitidas por alimentos de tipo txico Leccin 31. Enfermedades transmitidas por alimentos de tipo infeccioso Leccin 32. Enfermedades transmitidas por alimentos causadas por Protozoos Leccin 33. Enfermedades transmitidas por alimentos causadas por Helmintos Leccin 34. Enfermedades transmitidas por alimentos causadas por Virus

Leccin 30. Enfermedades transmitidas por alimentos de tipo txico

Gastroenteritis estfiloccica Es producida por el Staphylococcus aureus y se considera una de las ms frecuentes. Debe haber al menos 106 UFC/g o mL para que el microorganismo produzca la cantidad suficiente de toxina y se desarrolle la enfermedad. Los sntomas aparecen a las 4-6 horas de haber consumido el alimento y los ms frecuentes son: dolores abdominales, vmitos, nauseas, diarreas y no cursa con fiebre. Normalmente se da en los extremos de la vida: nios y adultos mayores. Los alimentos ms relacionados con este tipo de ETA son los productos de pastelera rellenos de crema, productos lcteos, ensaladas y algunos productos crnicos34.

Botulismo El botulismo es un tipo de intoxicacin por alimentos producida por el C. botulinum, debido a la neurotoxina que sintetiza este microorganismo y que lleva a

34

Yousef, A and Carlstrom,C. 2006. Microbiologa de los alimentos. Manual de Laboratorio. Edit. Acribia. Zaragoza. Espaa. p.119.

92 una parlisis progresiva que dura de 1 a 10 das y que puede producir la muerte por insuficiencia cardiaca y respiratoria. Sus sntomas aparecen a los 1 o 2 das de ingesta del microorganismo y se incluye tambin debilidad y dificultad para deglutir. El botulismo no es una enfermedad frecuente, solo se registran algunos casos anuales, aunque en ocasiones se presentan brotes en restaurantes. Parece ser que el C. botulinum es incapaz de competir de manera eficaz con la microflora normal del intestino, por lo que la produccin de toxina por las bacterias ingeridas casi nunca causa botulismo en adultos. A diferencia de los nios cuya flora intestinal no est bien desarrollada y el C. botulinum puede producir el botulismo infantil35.

Intoxicacin por Aflatoxina Este tipo de intoxicacin se produce por la ingesta de la aflatoxina, una micotoxina elaborada por el Aspergillus flavus, un hongo filamentoso y que se ha encontrado principalmente en el man. En el humano, esta aflatoxina, se ha relacionado con la cirrosis y el cncer heptico y en el ganado produce daos graves cuando consume alimentos contaminados con la aflatoxina.

Leccin 31. Enfermedades transmitidas por alimentos de tipo infeccioso Gastroenteritis por C. perfringens (Toxinfeccin) Si se ingiere C. perfringens en un alimento, la bacteria esporula en el intestino y simultneamente produce una toxina, para luego continuar con una infeccin no invasiva. Con la formacin de la toxina aparecen los sntomas tpicos: dolor abdominal y diarrea. La mayora de los casos son leves y no se diagnostican. Los sntomas suelen aparecer de 8 a 12 horas despus de la ingestin y el tratamiento es la rehidratacin oral. Este tipo de gastroenteritis es muy similar a la producida por el B. cereus. Colitis Hemorrgica o Diarrea del viajero (Toxinfeccin)

35

Tortora, G.J. y col. 2007. Introduccin a la microbiologa. Edit. Mdica Panamericana. 9. Edicin. Buenos Aires. p 650.

93 La mayor parte de las cepas patgenas de E.coli se clasifican en: enteropatgenas, enterotoxignicas, enteroinvasivas, enteroagregativas y entero hemorrgicas. La E. coli O157:H7 y otros miembros del grupo enterohemorrgico, como son: O26:H11, O111:H8 y O157:NM, se consideran los causantes de la colitis hemorrgica. El perodo de incubacin suele ser entre 3 a 4 das, tiempo en el cual la bacteria coloniza el intestino grueso y produce la toxina. Ataca principalmente los extremos de la vida: nios y adultos mayores. Los sntomas con los que cursa la enfermedad son: intensos dolores abdominales y diarrea que termina siendo sanguinolenta de acuerdo al progreso de la enfermedad. Ocasionalmente hay vmitos y no se presenta con fiebre. En los nios puede desembocar en un sndrome urmico hemoltico (HUS) que lleva a un dao renal severo y finalmente la muerte.

Clera (Toxiinfeccin) Enfermedad producida por el Vibrio cholerae, un bacilo Gram negativo de forma curva que posee un nico flagelo polar. El vehculo de transmisin es el agua no tratada y por consiguiente los alimentos preparados con este tipo de agua. La bacteria llega al intestino y all se reproduce liberando una exotoxina que induce a las clulas intestinales a secretar gran cantidad de lquidos y electrlitos. Adems, altera las contracciones normales musculares, lo que causa una diarrea grave que puede estar acompaada de vmitos. Esta diarrea se caracteriza por tener heces acuosas con masas de moco intestinal y clulas epiteliales y que se conoce como heces en agua de arroz. La perdida de lquidos y electrlitos puede provocar shock, colapso y muerte.

Listeriosis (Infeccin invasiva) Es un tipo de ETA, donde la dosis infectiva es de ms de 102 UFC/g o mL. El perodo de incubacin oscila entre una y varias semanas. Se presenta principalmente en nios menores de 4 aos, embarazadas, adultos mayores y pacientes inmunocomprometidos. Los principales sntomas son bacteremia y meningoencefalitis. La tasa de mortalidad es del 20 30%. En el caso de las mujeres embarazadas puede llevar al aborto, nacimiento de nios muertos o partos prematuros36. Este microorganismo puede resistir los efectos del congelamiento, secado y calentamiento suave y puede multiplicarse a bajas temperaturas (especie sicrtofa). Salmonelosis (Infeccin invasiva)

36

Yousef, A and Carlstrom,C. 2006. Microbiologa de los alimentos. Manual de Laboratorio. Edit. Acribia. Zaragoza. Espaa. p.150.

94 Los principales agentes causales de la fiebre tifoidea (entrica) son la Salmonella typhi y Salmonella paratyphi y sus sntomas incluyen diarrea, dolor abdominal, dolor de cabeza y fiebre alta y prolongada. Su perodo de incubacin vara de 1 a 7 semanas. Este tipo de salmonelosis corresponde a menos del 5% del total de casos de salmonelosis. La forma ms frecuente de salmonelosis humana es la gastroentrica o enterocoltica cuya causa puede ser cualquiera de los 150 serotipos de Salmonella. Es una enfermedad que cursa con: diarrea, dolor abdominal, escalofros, fiebre moderada, vmitos, deshidratacin y dolores de cabeza. Su perodo de incubacin se encuentra entre 12 y 36h y su duracin de 1 a 4 das37.

Shigelosis (Infeccin invasiva) Tambin conocida como disentera bacilar y producida por cualquiera de los 4 tipos de Shigella, bacilos Gram negativo anaerobios facultativos: S. sonnei, S. dysenteriae, S. flexneri y S. boydii. Es una bacteria que soporta los cidos gstricos y llega al intestino grueso donde ataca las clulas intestinales, diseminndose por ellas. La disentera es consecuencia del dao de la pared intestinal y puede producir hasta 20 deposiciones diarias, clicos abdominales y fiebre. La S. dysenteriae produce la toxina de Shiga que es muy virulenta y en algunos casos tambin se le atribuye a E. coli 38.

Leccin 32. Enfermedades transmitidas por alimentos causadas por Protozoos Son enfermedades de tipo infeccioso cuyo agente causal es un protozoo. Entre las principales encontramos:

Giardiasis Su agente causal es la Giardia lamblia y como se menciono anteriormente es un protozoo flagelado. Produce diarrea prolongada, que puede durar semanas y que cursa con malestar general, nauseas, flatulencia, debilidad, prdida de peso y clicos abdominales. Su patogenicidad se debe a que ocupa gran parte de la pared intestinal e impide la absorcin de los alimentos. Se transmite por agua contaminada y se disemina a travs de las heces de portadores sanos o no. Enfermedad Amibiana
37 38

Ibis. p.162 Tortora, G.J. y col. 2007. Introduccin a la microbiologa. Edit. Mdica Panamericana. 9. Edicin. Buenos Aires. p 324.

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Tambin es conocida como Disentera Amebiana o Amibiasis y su agente causal es la Entamoeba histolytica. Este protozoo se puede encontrar, en forma de quiste, contaminando el agua o los alimentos. Una vez llega el quiste al intestino (soporta los cidos estomacales) se fija a su pared y libera trofozotos que penetran las clulas epiteliales lo que produce una diarrea que puede ser sbita o progresiva, casi siempre acompaada de clico, flatulencia y deposiciones mucosanguinolentas. Estas crisis pueden mejorar incluso sin tratamiento mdico. La amibiasis intestinal, ocasionalmente, puede complicarse y producir amibiasis de tipo extraintestinal39: - Perforacin del coln con la consecuente peritonitis del paciente. - Amibiasis heptica, cuya frecuencia y gravedad estn relacionados directamente con las malas condiciones sanitarias en que se encuentren las personas. - Amibiasis cerebral, muy rara y cuya va de invasin, posiblemente, es a travs del sistema circulatorio por va carotidea. - Amibiasis genital y cutnea, por malos hbitos higinicos

Leccin 33. Enfermedades transmitidas por alimentos causadas por Helmintos Las enfermedades transmitidas por este tipo de organismos estn relacionadas con las malas condiciones higinicas de los manipuladores y las zonas de trabajo, adems de una inadecuada preparacin de los alimentos. Son tambin conocidas como Helmintiasis intestinales. Teniasis Los agentes causantes de esta patologa, dependen del alimento ingerido: - Taenia saginata (Tenia de la vaca) - Taenia solium (Tenia del cerdo) - Diphyllobothrium latum (Tenia del pez) El ciclo infeccioso inicia cuando el ganado ingiere pastos o alimento que contiene los huevos de la Taenia y pasan al estado de larva, llamada cisticerco que se aloja en el msculo del animal. Al consumir carne de vaca o cerdo mal cocida el hombre adquiere la infeccin. En el intestino humano los cisticercos pasan al estado adulto y se adquieren a la pared intestinal mediante ventosas ubicadas en la cabeza de

39

Argello M. 1985. De la Entamoeba histolytica a la enfermedad amibiana. Laboratorios Synthesis. Divisin Gastrointestinal. Bogot. Colombia.p.85

96 la Taenia. Esta afeccin es benigna y asintomtica, pero el humano est permanentemente eliminando los huevos de la Taenia. En el caso de la Teniasis por T. solium puede producir complicaciones conocidas como: cisticercosis oftlmica, cuando las larvas atraviesan intestino y se alojan en el ojo o neurocisticercosis, que se produce cuando las larvas se desarrollan en el sistema nervioso central. En el caso de la Diphyllobothrium latum su transmisin est relacionada principalmente con el consumo de trucha y salmn mal cocidos y tambin con el sashimi y sushi, alimentos que se consumen crudos.

Fasciolosis humana Es una enfermedad zoontica producida por la Fasciola heptica, transmitida por el consumo del hgado, mal cocido, de animales, que se encuentra contaminado con el trematodo. Una vez en el intestino humano el parasito, produce sntomas leves como fiebre y al cabo de 3 meses de migracin llega a los conductos biliares donde alcanza la madurez y elimina huevos permanentemente. En la mayora de los casos la enfermedad cursa asintomtica y ocasionalmente se puede complicar produciendo obstruccin biliar, colecistitis aguda o crnica, ruptura heptica y cirrosis.

Ascariasis Es una enfermedad causada por el nematodo Ascaris lumbricoides. Se transmite a partir de la ingestin de huevos del nematodo que pueden permanecer en los alimentos o en el agua, obviamente sin el debido manejo o tratamiento. En el tubo digestivo superior los huevos liberan pequeas larvas en forma de gusanos que pasan a la sangre y luego a pulmones. De all migran hacia la garganta donde son deglutidas y en el intestino, nuevamente, las larvas crecen y liberan huevos 40.

Leccin 34. Enfermedades transmitidas por alimentos causadas por Virus Hepatitis A El agente causal de esta enfermedad es el virus de la Hepatitis A (HAV), clasificado como un picornavirus, que presenta una cadena simple de RNA y que carece de cubierta. El virus puede sobrevivir varios das en las superficies donde se preparan los alimentos, como las tablas de picar y es resistente al cloro en las concentraciones que se utilizan para potabilizar el agua, lo que facilita la
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Tortora, G.J. y col. 2007. Introduccin a la microbiologa. Edit. Mdica Panamericana. 9. Edicin. Buenos Aires. p 376.

97 contaminacin de los alimentos o las bebidas. Los moluscos y las ostras que se cosechan de aguas contaminadas, son otra fuente de infeccin (Tortora, 2007). Una vez ingresa el virus al organismo por va oral se multiplica en las clulas intestinales y se disemina, va hematgena, hasta el hgado, los riones y el bazo. Su sintomatologa comienza con anorexia, malestar general, nauseas, diarrea, molestias abdominales, fiebre y escalofros. Por lo menos el 50% de las infecciones por HAV son subclnicas. La cantidad de virus excretado en heces es alto, antes de aparecer los sntomas, por lo que un manipulador de alimentos puede transmitir el virus sin saberlo. Un solo manipulador puede contaminar simultneamente a docenas o cientos de personas, causando un fuerte impacto en la salud pblica. La contaminacin de un alimento con HAV puede ocurrir en cualquier punto durante el cultivo, cosecha, procesamiento, distribucin o preparacin del mismo. La principal fuente de diseminacin del virus son los manipuladores de alimentos de puntos de venta (por ejemplo restaurantes) o quienes preparan alimentos para eventos sociales (por ejemplo bodas, aniversarios, etc).

Gastroenteritis viral La causa ms frecuente de esta enfermedad es el rotavirus, aunque tambin se encuentran los virus tipo Norwalk. Su forma de transmisin es por va fecal-oral a travs de los alimentos y del agua. Luego de un perodo de incubacin de 18 a 48h se presentan vmitos y diarrea durante dos o tres das. La gravedad de los sntomas depende de la magnitud de la dosis infectante. El nico tratamiento es la rehidratacin oral.
Qu diferencia hay entre una diarrea viral o una causada por protozoos? Preguntas de repaso Qu efectos produce la perdida de lquidos y electrlitos durante la infeccin por V. cholerae? La adhesin es un factor que influye en la patogenicidad de un microorganismo?

Para qu sirve la microbiologa? En la naturaleza el agua raramente esta pura, incluso el agua-lluvia se contamina al caer a la Tierra y el rea de alimentos no est exenta de la contaminacin microbiolgica del agua. Este tipo de contaminacin es un punto fundamental de analizar, debido a que la mayora de industrias alimenticias requieren como materia prima de produccin, el agua. La microbiologa acutica es el estudio de los microorganismos y sus actividades en aguas naturales como los lagos,

98 estanques, arroyos, ros, estuarios y ocanos. Las aguas residuales domsticas e industriales llegan a los lagos y arroyos afectando profundamente los ecosistemas y por consiguiente los recursos hdricos que sern utilizados para consumo humano o para la industria alimenticia. En este caso, el estudio microbiolgico de los ambientes acuticos permite mitigar los efectos perjudiciales de los microorganismos o conocer las interacciones benficas de los mismos y lograr recuperar dichos ambientes.

Capitulo 7. Microbiologa de ambientes y manipuladores El medio ambiente que rodea la elaboracin del alimento es muy importante, pues a partir de este entorno el producto puede contaminarse o tener una alta carga microbiana que afecta la calidad del alimento. Por esto es necesario evaluar microbiolgicamente el ambiente, las superficies y los manipuladores de alimentos, de manera que se pueda detectar la contaminacin secundaria en el proceso del alimento. Aquellos sitios con una frecuente contaminacin debern ser evaluados ms seguido, una vez tomadas las medidas correctivas, con el fin de mantener las buenas condiciones en la elaboracin del producto. Los resultados obtenidos en la evaluacin microbiolgica del rea de produccin permitirn determinar la frecuencia con que debe hacerse la limpieza e higienizacin, as como comprobar la eficacia de los manipuladores en el momento de elaborar el alimento.

Las lecciones que se encuentran en este captulo son: Leccin 35. Evaluacin del ambiente Leccin 36. Evaluacin de los manipuladores de alimentos

Leccin 35. Evaluacin del ambiente La evaluacin del ambiente tiene 3 finalidades importantes: - Recuento total de microorganismos. - Identificacin de microorganismos indicadores. - Deteccin de microorganismos patgenos.

Evaluacin de superficies

99

Las superficies que pueden ser evaluadas en el rea de alimentos son los equipos, envases, sala de maduracin, entre otros. Las superficies que no entran en contacto directo con el alimento tambin pueden ocasionar contaminacin, por ejemplo: paredes, suelos y vestuario de los operarios. Las superficies a muestrear pueden ser rugosas, lisas, planas, curvas y rincones, continuas o con hendiduras y rendijas, etc., por esto la eleccin del mtodo utilizado para tomar la muestra depende de las caractersticas de la superficie.

Evaluacin del aire El grado de contaminacin microbiolgica del aire en una industria alimenticia influye en la calidad y seguridad de los alimentos pues el aire es un vehculo muy eficaz para el transporte de los microorganismos y esto se puede deber a: - Las actividades propias de la elaboracin del alimento, por ejemplo el uso de harinas como materia prima. - La humedad relativa del sitio de trabajo. - Movimientos fuertes del aire. Los microorganismos contaminantes ms encontrados en el anlisis del aire son los mohos (esporas) y las bacterias esporuladas, por ser la forma resistente de las bacterias.

Leccin 36. Evaluacin de los manipuladores de alimentos La evaluacin de los manipuladores de alimentos es un punto muy importante dentro de la produccin de alimentos pues son considerados uno de los principales focos de contaminacin de los alimentos. La flora microbiana de los manipuladores puede llegar a multiplicarse hasta alcanzar una dosis infectante que contamine al alimento o las superficies donde se elabore el mismo. Para reducir lo ms posible este riesgo es necesario que el personal que labora en el rea de alimentos sea capacitado en conceptos como la higiene personal, la manipulacin higinica de los alimentos y el uso adecuado del equipo de proteccin individual: guantes, gorro, tapabocas, delantal, botas, etc. Igualmente, es importante que el manipulador comunique a su jefe directo la presencia de sntomas que indiquen el curso de alguna patologa que pueda afectar la elaboracin del alimento, como por ejemplo: - Ictericia - Diarrea - Vmitos - Fiebre

100 - Dolor de garganta - Lesiones de piel visiblemente infectadas - Supuracin de ojos, odos o nariz.

Infovideo que presenta las condiciones de higiene en el manejo de los alimentos.

La evaluacin de ambientes se relacionar con el alimento elaborado? Preguntas de repaso Cmo capacitar al manipulador de alimentos en manejo higinico del alimento? Qu medidas de control microbiolgico se pueden utilizar en el rea de alimentos?

Para qu sirve la microbiologa ? El mtodo ms eficaz para el control de las enfermedades son las vacunas. Aunque el inters en el desarrollo de vacunas disminuy con la introduccin de los antibiticos, poco a poco ha ido intensificndose. Las vacunas solamente se empezaron a producir masivamente, cuando se desarrollaron los cultivos celulares, por ejemplo el virus de la viruela se cultivaba en vientres rasurados de terneros, lo que obviamente dificultaba su produccin. Un modelo conveniente que permite el desarrollo de muchos virus, es el embrin de pollo. Es importante destacar que la primera vacuna contra el virus de la hepatitis B utiliz antgenos virales extrados de personas que padecan la enfermedad de forma crnica, pues no se dispona de otra fuente para recuperarlos. Actualmente, esta vacuna se obtiene por tcnicas recombinantes de DNA por lo que no se necesita de un husped celular o animal para la reproduccin del microorganismo con fines de vacuna.

UNIDAD DIDCTICA 3

101 TCNICAS DE LABORATORIO UTILIZADAS EN EL LABORATORIO DE ALIMENTOS

UNIDAD 3. Tcnicas de laboratorio utilizadas en el laboratorio de alimentos En la Unidad 3 se introduce al estudiante en las tcnicas bsicas de identificacin microbiana en las que se incluye la microscopa, Introduccin las tinciones y el cultivo de microorganismos en diferentes medios. Adems, se hace referencia a pruebas ms especializadas como son las pruebas serolgicas y/o moleculares. La adecuada identificacin de un microorganismo, ya sea patgeno o no, le permitir al estudiante organizar estrategias adecuadas de control y manejo de la lnea de produccin logrando as la mxima calidad del producto alimenticio que este elaborando. 1. El estudiante explica los diferentes tipos de tincin utilizados para la identificacin de microorganismos. Competencias 2. El estudiante analiza y argumenta las estrategias a seguir frente al hallazgo de microorganismos patgenos en la lnea de produccin. 3. El estudiante identifica las tcnicas de cultivo ms idneas para la identificacin de microorganismos en las diferentes etapas de produccin del alimento. Lograr que el estudiante comprenda la utilidad de las diferentes tcnicas de identificacin de microorganismos asociados a los alimentos y de acuerdo a los resultados obtenidos optimizar el proceso relacionado con la elaboracin del alimento. 1. Que el estudiante determine las principales tcnicas de identificacin microscpica y de tincin asociadas con los alimentos. Objetivos 2. Que el estudiante identifique claramente las tcnicas de cultivo utilizadas en el rea de alimentos. 3. Que el estudiante establezca los mtodos de identificacin apropiados para el reconocimiento de microorganismos asociados a ETAs.

Justificacin

Propsito

Horas de trabajo acadmico Palabras clave

El contenido de esta unidad corresponde a un crdito acadmico, que equivale a 12 horas de acompaamiento tutorial y 36 horas de trabajo independiente. Tcnicas de laboratorio, microscopa, tinciones, medios de cultivo, diluciones seriadas, evaluacin de ambiente.

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Mapa Conceptual Unidad 3: Tcnicas de laboratorio usadas en el laboratorio de alimentos

Capitulo 8. Generalidades La amplia variedad microbiana encontrada en los alimentos debe ser aislada preliminarmente utilizando medios de cultivo apropiados para el ciclo de crecimiento y reproduccin de cada microorganismo. Esto facilita enormemente la identificacin del microorganismo asociado a una enfermedad de transmisin por alimentos. Igualmente, esta identificacin se corrobora con tcnicas microscpicas y tinciones especiales que permiten diferenciar las estructuras bacterianas, mejorando as la observacin en las muestras del laboratorio. Las lecciones que se encuentran en este captulo son: Leccin 37. Microscopa Leccin 38. Preparacin en fresco Leccin 39. Tipos de tincin

103

Leccin 40. Medios de cultivo

Leccin 37. Microscopa La utilizacin del microscopio es fundamental en la identificacin de los microorganismos pues es el instrumento que permite visualizar aquello que no se puede ver a simple vista. La observacin en el microscopio se logra mediante dos factores principalmente: aumento y resolucin.

Aumento La capacidad que tiene el microscopio para amplificar un objeto es fundamental para que el ojo pueda apreciar con precisin e independencia las caractersticas de lo que observa y as identificar claramente el microorganismo presente en la preparacin. Normalmente se expresa por el signo x y luego el nmero de ampliacin del objetivo: 4x, 10x, 40x y 100x.

Resolucin Se refiere a la capacidad que tiene el microscopio para dar imgenes distintas de puntos situados muy cerca uno del otro en el objeto que se est observando. El manejo del microscopio es un conocimiento previo que debe recordarse del estudio anterior en el curso de biologa. El estudiante debe ubicar este tema en el curso mencionado de biologa, pgina Web de la UNAD, en las siguientes direcciones41:
Video: el Microscopio parte 1 Vdeo: El microscopio parte 2 Manual de Prcticas de Biologa: Microscopia Pginas 15 a 43

Leccin 38. Preparaciones en fresco

41

Pia, C. Manual de laboratorio. Curso Biologa. UNAD.

104 Para este caso los microorganismos se pueden observar in vivo o en fresco y corresponde a la forma ms simple de observacin. Existen principalmente dos tipos de tcnicas utilizadas para este tipo de preparaciones: En fresco Este mtodo microscpico permite observar el microorganismo vivo y conocer sus caractersticas, morfologa, color, tamao real, movimiento, evita las deformaciones de su morfologa producidas por las tcnicas de coloracin y fijacin. Este tipo de preparacin se emplea para detectar trofozotos mviles de parsitos intestinales como Entamoeba hystolitica, huevos y quistes de otros parsitos (como el caso de las tenias y ascaris), larvas y gusanos adultos, hifas de hongos, Candida, etc.

Gota Pendiente En este tipo de observacin microscpica se construye una pequea cmara cerrada que permite la observacin continua de la movilidad bacteriana o el crecimiento de clulas individuales de un microcultivo.

Leccin 39. Tipos de tinciones La mayora de los microorganismos son incoloros lo que dificulta la identificacin de los mismos. Por esto se requiere someterlos a tinciones que permitan el contraste de sus estructuras y se facilite la observacin. Lo primero que se debe hacer es tomar una muestra previa y realizar un frotis o extendido, es decir colocar una pelcula del microorganismo sobre la lmina portaobjetos y dejarla secar al aire. Antes de teir el microorganismo, a partir del frotis, es necesario realizar un procedimiento denominado Fijacin y que permite preservar la morfologa y composicin qumica de la clula. Consiste en la muerte del organismo o clula que se quiera observar, de manera que las estructuras que posea en estado vivo se conservan con un mnimo de artificios. La fijacin puede ser mediante sustancias qumicas (acetona, formaldehido, tetrxido de osmio, entre otros) o por accin del calor (flameado). En general, los colorantes utilizados son sales compuestas por un in positivo y un in negativo, uno de los cuales est coloreado y se conoce como cromforo. El color de los denominados colorantes bsicos est en el in positivo; en los colorantes cidos, est en el in negativo. En un pH 7 las bacterias presentan una carga levemente negativa, por lo tanto, el in positivo coloreado en un colorante

105 bsico es atrado haca la clula bacteriana con carga negativa. Los colorantes bsicos se utilizan ms que los cidos, debido a que estos ltimos no son atrados por la mayor parte de las bacterias pues la superficie bacteriana con carga negativa repele los iones negativos del colorante, de modo que este tie el fondo y no la estructura bacteriana42. Entre los colorante bsicos ms usados estn: azul de metileno, fuscina bsica, cristal violeta y safranina. Los colorantes cidos se utilizan para teir tejidos animales infectados de microorganismos: fuscina cida, eosina y rojo Congo. En microbiologa de alimentos el recuento directo de microorganismos utilizando mtodos microscpicos es limitado, debido a la dificultad en la identificacin y en el recuento bacteriano. Sin embargo, el anlisis microscpico de una muestra alimenticia puede dar un panorama previo de los microorganismos presentes en el alimento. Existen dos tipos de tcnicas de tincin utilizadas en el rea de alimentos: Tincin simple Esta tincin permite destacar el microorganismo completo para que se vean las formas y las estructuras celulares bsicas y normalmente se utiliza como una solucin acuosa o alcohlica de un colorante bsico nico. Algunas veces es necesario aplicar una sustancia qumica que intensifica la coloracin y que se conoce como mordiente. Esta sustancia tiene funciones como: aumentar la afinidad de un muestra biolgica por un colorante, cubrir una estructura (por ejemplo, un flagelo) para darle mayor espesor y/o facilitar la observacin despus del teido. En el laboratorio las tinciones simples ms utilizadas son: Azul de metileno, carbolfucsina, el violeta de genciana (cristal violeta) y la safranina. Permiten identificar las cepas del yogurt y el vinagre (cocos, bacilos y estreptococos). En el caso de los hongos y levaduras la tincin ms utilizada es el azul de lactofenol.

Tincin diferencial Se utiliza para poder distinguir entre los diferentes tipos de bacterias o sus estructuras intracelulares. El primer colorante es el primario, que acta como una tincin simple. Luego se hace la diferenciacin, que consiste en aplicar una solucin que quita el colorante primario a algunas clulas, bacterias o estructuras.
42

Tortora, G.J. y col. 2007. Introduccin a la microbiologa. Edit. Mdica Panamericana. 9. Edicin. Buenos Aires. p 69.

106 El siguiente colorante es el colorante secundario o de contraste, que como su nombre lo indica permite contrastar estructuras o clulas para poder diferenciarlas. La tincin diferencial ms utilizada en el rea de microbiologa es la tincin de Gram y se utiliza para diferenciar las bacterias en dos grandes clases: grampositivas y gramnegativas, adems de permitir identificar la morfologa celular bacteriana (cocos, bacilos, positivos, negativos.) (Figura 27). Esta tincin se denomin as por el bacterilogo dans Christian Gram, quien la desarroll en 1844.

Figura 27. Tincin de Gram. Se observa la coloracin caracterstica violeta de las bacterias Gram positivas (lado izquierdo de la imagen) y la rosada de las bacterias Gram negativas (lado derecho de la imagen). Fuente: Infobiol.com

Como ya se menciono, sobre la base de su reaccin a la tincin de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, Gram-positivas y Gram-negativas (en este caso, los trminos positivo y negativo no tiene nada que ver con carga elctrica, sino simplemente designan dos grupos morfolgicos distintos de bacterias). Las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas tien de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la clula Gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectandas de peptidoglicano as como algo de cido teicoico. Generalmente, 80%-90% de la pared de la clula Gram-positiva es peptidoglicano. La pared de la clula Gram-negativa, por otro lado, contiene una capa mucho ms delgada, nicamente de peptidoglicano y est rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolpidos, lipopolisacridos, y lipoprotenas. Slo 10% - 20% de la pared de la clula gram-negativa es peptidoglicano.

Leccin 40. Medios de cultivo Para la adecuada identificacin de un microorganismo, adems de la observacin microscpica y la tincin, se hace necesario que haya un crecimiento de la

107 bacteria en condiciones controladas de temperatura, oxgeno y fuente de carbono, entre otros. Esto es lo que se conoce como cultivo de un microorganismo. Dicho crecimiento, para que sea totalmente controlado, se realiza en condiciones de laboratorio, y en sustratos llamados medios de cultivo, que contienen los nutrientes necesarios para el adecuado crecimiento microbiolgico.

Clases de medios de cultivo El tipo de medio de cultivo a utilizar depende del microorganismo de inters y de la necesidad de realizar ese cultivo. Los medios se pueden utilizar para el crecimiento de una especie o para diferenciar entre cepas o especies. En la literatura se encuentran diferentes formas para clasificar los medios de cultivo utilizados en el laboratorio. A continuacin se enumeran algunas: Segn su consistencia o estado fsico pueden ser: 1. Lquidos o caldos, que se emplean fundamentalmente para cultivar los microorganismos y obtener grandes cantidades de los mismos; para la produccin de metabolitos especficos y estimular y promover la seleccin de algn o algunos microorganismos e impedir que otros se multipliquen.

2. Semislidos, que se utilizan para identificaciones bioqumicas y averiguar si el microorganismo estudiado es mvil. Los medios semislidos tienen una consistencia blanda.

3. Slidos o Agares, que se utilizan para obtener colonias aisladas de microorganismos. A diferencia de los lquidos se les agrega Agar. El agar es un polisacrido acdico producido por ciertas algas rojas, es un elemento solidificante que se lica completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. El agar se usa a una concentracin del 1,5%. Con mnimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en l. La Gelatina es otro agente solidificante pero se emplea mucho menos ya que bastantes bacterias provocan su licuacin.

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Segn su utilidad prctica pueden ser: 1. No selectivos o generales: permiten el cultivo y crecimiento de una amplia gama de microorganismos. Por ejemplo, Caldo nutritivo, Agar nutritivo, Agar Soya Tripticasa (TSA), Agar marino 2216 o Zobell. A menudo estn enriquecidos con materiales como: sangre, suero, Hemoglobina, Factor X, Factor V, glutamina, u otros factores accesorios para el crecimiento de las bacterias (Agar Sangre, Schaeadler, etc.).

2. Selectivos: (pueden ser de moderada o de alta selectividad) permiten el aislamiento y crecimiento del microorganismo o grupo de microorganismos de inters, para lo cual se manipulan factores ya sean de tipo nutricional o de tipo ambiental. Algunos medios son selectivos porque contienen un producto qumico, como la azida sdca, el telurito potsico o el cristal violeta, que inhiben el desarrollo de algunos microorganismos pero no de otros. En el caso de utilizar factores nutricionales, se aaden al medio de cultivo sustancias que inhiban el crecimiento de ciertos grupos de microorganismos, permitiendo a la vez el crecimiento de otros. Los antibiticos, el cloruro sdico en altas concentraciones, colorantes y algunas sustancias qumicas, son ejemplos de agentes selectivos que se aaden a los medios para inhibir el crecimiento de otros microorganismos diferentes al de inters. El agar SPS (denominado de esta forma porque contiene sulfadiacina y sulfato de polimixina) se utiliza para identificar Clostridium botulinum, agente causal de una grave intoxicacin alimentaria. El medio SPS permite el crecimiento de esta bacteria, pero inhibe el de otras especies de Clostridium. Un ejemplo de la accin de los colorantes que inhiben selectivamente determinados microorganismos, es el verde brillante (Agar verde brillante), utilizado para establecer la presencia de Salmonella en heces fecales, ya que inhibe las bacterias Gram positivas y la mayora de las bacterias intestinales. Para el caso de los factores ambientales se puede manipular la temperatura, el grado de humedad, el pH, la concentracin de oxgeno o la intensidad de la luz. Son ejemplo de este tipo de medios: Agar Tiosulfato, Citrato, Sales de bilis, Sacarosa (TCBS) para cultivo de Vibrio y Agar Cetrimida para cultivo de Pseudomonas.

Otros medios de cultivo utilizados son: Enriquecidos: suprimen el crecimiento de la flora competitiva normal potenciando el cultivo y crecimiento deseado (Selenito, medio con Vitamina K).

109 Para aislamientos especializados: formulaciones nutritivas especiales que satisfacen requerimientos de grupos especficos de microorganismos, ayudando a su identificacin (Lowenstein). En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. En el caso de los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentacin de los microorganismos que ayuden a identificarlos, por ejemplo el caso de la lactosa. Diferenciales: permiten distinguir unos microorganismos de otros por las caractersticas que presentan las colonias. Para estos medios de cultivo se tienen en cuanta principalmente las caractersticas fisiolgicas especficas de los microorganismos, por ejemplo, nutricin, respiracin, entre otras. Algunos medios diferenciales llevan incluido un indicador de pH, que pone de manifiesto la degradacin de un nutriente especfico (generalmente un azcar) por el cambio de color que se origina cuando ste es metabolizado. Los colorantes que se aaden a estos medios actan como indicadores para detectar, por ejemplo, la formacin de cido. Un ejemplo es el medio Rojo Fenol, que es de color rojo en pH bsico y amarillo en pH cido. Utilizando el cultivo de microorganismos en medio diferencial se pueden distinguir las bacterias que fermentan la lactosa (con produccin de cido) de las no fermentadoras. Otros componentes como los colorantes actan inhibiendo el crecimiento de cierto grupo de microorganismos, por ejemplo la Violeta de Genciana impide el crecimiento de la mayora de las bacterias Gram-positivas. Algunos medios pueden ser a la vez selectivos y diferenciales. El agar Mac Conkey es un ejemplo de medio selectivo y diferencial. La presencia de sales biliares y cristal violeta inhiben el crecimiento de bacterias no entricas (accin selectiva); la fermentacin de lactosa con liberacin de productos cidos hace virar un indicador de pH incorporado en el medio (accin diferencial). El agar sangre es un agar que contiene hemates y permite reconocer los microorganismos que producen hemlisis. Por ejemplo para aislar la bacteria que causa la escarlatina, se utiliza el medio de agar sangre. Las colonias de esta bacteria producen hemlisis, es decir, muerte y lisis de los hemates generando una zona transparente a su alrededor. El Agar eosina-azul de metileno (EAM) permite identificar el crecimiento de coliformes y E. coli. Este medio contiene peptona, lactosa y los colorantes eosina y azul de metileno. En dicho medio se inhibe el crecimiento de otras bacterias, pero no el de las coliformes (stas desarrollan colonias tpicas). E. coli muestra colonias grandes, oscuras, negro-azuladas, centro casi negro, con brillo metlico verdoso causado por la luz reflejada. La presencia de coliformes como Enterobacter se

110 manifiesta en colonias grandes, de color rosado plido, mucosas, con centro oscuro y sin brillo metlico. Seleccionando los medios adecuados se puede llegar a la identificacin de casi cualquier bacteria.

Lectura de profundizacin sobre el cultivo de microorganismo y que incluye medios de cultivo, mtodos de aislamiento y crecimiento bacteriano. Fuente: Universidad de Navarra. Instituto de agrobiotecnologa.

Qu significa resolucin? Preguntas de repaso Por qu es til la identificacin de Gram para recetar un tratamiento antibitico? Cmo se relaciona el metabolismo microbiano con los medios de cultivo utilizados?

Para qu sirve la microbiologa? Los microorganismos por s solos no son capaces de causar dao, pero gracias a los procesos evolutivos han logrado organizarse y convivir con especies diferentes, de manera que se relacionan simbiticamente unos a otros, logrando as un mayor poder de accin. Esto lo han hecho gracias a la posibilidad que tienen de formar lo que se conoce como biofilms o biopeliculas: agrupacin de bacterias formando una biomasa en torno a una superficie cualquiera. Mediante a la observacin directa con el microscopio lser cofocal de barrido (CSML), el cual permite ver el biofilm bacteriano in vivo, en tiempo real y completamente hidratado, se ha demostrado claramente que la mayora de biofilms estn formados por microcolonias de clulas bacterianas (15-20% volumen), envueltas en una densa matriz polimrica extracelular (75-80%) con marcados canales de agua (Londoo, 2006). Un ejemplo de la accin de estos biofilms es el V. cholerae, que gracias a esta forma de organizacin, puede sobrevivir en el ocano y resistir la accin del cido estomacal. Una vez el Vibrio atraviesa el estmago, las clulas individualmente se separan del biofilm y colonizan el intestino donde empieza a producir su patologa caracterstica43.

43

Zambrano, M.A. y Surez, L. 2006. Biofilms bacterianos. Universitas Odontolgica. PUJ. 19-25p.

111

Capitulo 9. Tcnicas de cultivo en alimentos En general las bacterias requieren una serie de condiciones estndar para su crecimiento y desarrollo, sin embargo existe un grupo de microorganismos que necesita ambientes y nutrientes especiales para poder crecer, aislarse y ser identificados en los alimentos. Esto hace necesario que deba haber claridad en las diferentes tcnicas de recuperacin y caracterizacin de los microorganismos causantes de una enfermedad o de la descomposicin de un alimento, de manera que el control y erradicacin del microorganismo sea mucho ms efectivo y finalmente se obtenga un producto apto para el consumo humano.

Las lecciones que se encuentran en este captulo son: Leccin 41. Tcnica de diluciones seriadas Leccin 42. Sistemas de siembra y recuento de colonias Leccin 43. Tcnicas de cultivo Leccin 44. Tcnicas de identificacin de microorganismos Leccin 45. Tcnicas microbiolgicas utilizadas en la evaluacin de ambientes

Leccin 41. Tcnica de diluciones seriadas Cuando la muestra del alimento debe ser analizada microbiolgicamente es necesario realizar una serie de diluciones seriadas, que facilitan el recuento final de microorganismos presentes en dicho alimento. La muestra original se diluye para que el nmero de colonias desarrolladas en la placa, se encuentren entre 30 y 300 colonias y as permitir un ptimo crecimiento y facilitar la lectura. Cuando la muestra se diluye, el clculo del resultado se realiza contando las colonias en aquellas placas que tengan entre 30 y 300 colonias, se promedia y se multiplica por el factor de dilucin (Figura 28). El diluyente utilizado no debe afectar la viabilidad ni reproduccin de los microorganismos. Los diluyentes ms utilizados son: Agua de peptona tamponada (0,1%), solucin salina isotnica y caldo de Tristona-sal.

Leccin 42. Sistemas de siembra y recuento de colonias

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La cantidad de microorganismos presentes en un alimento depende del tipo de proceso al que se someta, su transporte y manipulacin. Antes de que un alimento se analice microbiolgicamente se le deben hacer diluciones seriadas para que el recuento de colonias sea ajustado a la realidad y a partir de estas diluciones sembrar.

Figura 28. Tcnica de diluciones seriadas. Se observa el procedimiento prctico para la realizacin de esta tcnica, ampliamente utilizada en el rea de los alimentos y la farmacutica. Fuente:http://aulavirtual.usal.es/aulavirtual/demos/microbiologia/unidades/ documen/uni_02/58/texthtml/cap804.htm

La siembra se refiere a la operacin de transferir e incorporar la dilucin respectiva a una caja de petri con su correspondiente medio de cultivo. Existen varias formas de siembra:

113 La siembra en superficie se realiza cuando, una vez solidificado el agar, se incorpora la dilucin y se extiende sobre la superficie mediante la tcnica de estra. Se utiliza para el recuento de hongos y levaduras. La siembra en profundidad se realiza cuando la dilucin se dispensa primero en la caja de Petri vaca y luego se adiciona el agar tibio para mezclarlo con la dilucin. Esta tcnica se utiliza para el recuento de mesfilos. Una vez se llevan a incubar los medios de cultivo a los tiempos y temperatura que requieran los microorganismos para su crecimiento se debe evaluar el recuento de colonias. Para esto es necesario enumerar las unidades formadoras de colonias (UFC). El valor de UFC es un valor que expresa el nmero relativo de microorganismos de un taxn determinado en un volumen de un metro cbico de muestra. Este procedimiento de denomina recuento en placa y que en ltimas determina el nmero de clulas que pueden formar colonias en las cajas de petri observadas. El recuento de colonias puede hacerse visualmente o con ayuda de un contador de colonias. Conociendo el factor de dilucin, el volumen del inculo y el nmero de colonias de la placa (o el promedio de las placas duplicadas), el nmero de microorganismos del alimento se calcula mediante la siguiente expresin:

Recuento (UFC/ml o g) =

Media del nmero de colonias de placas duplicadas Factor de dilucin x Volumen inoculado en la placa

Examen macroscpico de colonias El examen morfolgico de las colonias bacterianas es un paso preliminar importante para la identificacin de las colonias aisladas a partir de los alimentos. Las colonias bacterianas se caracterizan por ser redondeadas, colonias puntiformes o circulares, bordes lisos y en algunos casos ondulados y lobulados. Igualmente se observan diferentes coloraciones. Las colonias de levaduras son similares a las bacterianas mientras que las colonias de hongos filamentosos son ms grandes y con aspecto algodonoso. El excesivo desarrollo de los mohos puede dar lugar a dificultades para el recuento. Para la identificacin de un microorganismo, adems de sus caractersticas morfolgicas, se debe someter a pruebas adicionales bioqumicas, fisiolgicas, serolgicas o genticas. Adems, el examen microscpico (tincin simple o diferencial) es fundamental para la identificacin morfolgica de la cepa.

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Leccin 43. Tcnicas de cultivo Las tcnicas de cultivo se realizan para enriquecer, enumerar (se refiere al recuento de colonias) o aislar microorganismos.

Enriquecimiento Es una tcnica que se utiliza cuando la cantidad de microorganismos presentes en el alimento no es la suficiente para ser detectada por el recuento directo en placa o para revitalizar microorganismos presentes en el alimento. El enriquecimiento se realiza en dos pasos fundamentales: - Preenriquecimiento o enriquecimiento primario, en el cual se utiliza un medio no selectivo buscando la recuperacin del microorganismo de inters. Normalmente no se utilizan medios extremadamente ricos ni una incubacin ptima que favorezcan el crecimiento acelerado de los microorganismos, pues el objetivo primordial de esta fase es un aumento moderado en el nmero de microorganismos para luego pasar a la siguiente fase. - Enriquecimiento secundario o selectivo, en esta etapa se hace un subcultivo, partiendo de la fase anterior, a un caldo selectivo donde, nicamente, crecer el microorganismo de inters y se inhibir el resto de microorganismos. Se utiliza para la identificacin de microorganismos como: Clostridium perfringes, Listeria monocytogenes, Salmonelas y Escherichia coli O157:H7. Tcnica del Nmero Ms Probable (NMP) Esta tcnica tambin se conoce como tcnica de tubos mltiples (Yousef, 2003) y se utiliza para determinar el recuento presuntivo de coliformes. Para analizar el alimento mediante la tcnica del NMP la muestra se diluye por la tcnica de diluciones seriadas, como se describi anteriormente y luego se transfiere una alcuota o muestra a un medio selectivo diferencial, que normalmente es caldo Bilis Verde Brillante (BRILLA) donde, despus de la incubacin, se evidencia el crecimiento de los microorganismos por la turbidez del medio y la reaccin tpica de coliformes, que en este caso es la produccin de gas a partir de la lactosa y que se evidencia en los tubos invertidos de Durham. El nmero de tubos positivos de las diluciones observadas se convierte en tablas estandarizadas para hallar el

115 NMP. El NMP se basa en frmulas de probabilidad y es una estimacin de la densidad media de coliformes en la muestra44. Aislamiento El aislamiento de un microorganismo en un alimento se logra siempre que la muestra, enriquecida o no, se siembra en una placa que contenga un medio selectivo o selectivo diferencial adecuado. Para esta siembra se utiliza, principalmente, se utiliza la tcnica de estra. El cultivo en estos medios es el sistema ms confiable para aislar el microorganismo que se est investigando. A continuacin se presentan los principales medios utilizados en el aislamiento de patgenos en alimentos:

Microorganismo

Medio de cultivo utilizado

Agar Baird-Parker

Staphylococcus aureus Agar manitol sal

Agar ADN azul de toluidina

Listeria monocytogenes

Agar Oxford Modificado (MOX)

Agar Sulfito Bismuto Salmonella

44

Observaciones Medio selectivo-diferencial: El S. aureus forma colonias circulares, negras, rodeadas por un halo opaco y una zona clara. Medio selectivo-diferencial: El S. aureus produce cambio de color, apareciendo una tonalidad amarilla brillante Medio diferencial: Detecta la desoxirribonucleasa del S. aureus Medio selectivo-diferencial: Presenta sustancias antimicrobianas como el cloruro de litio, sulfato de colistina y moxalactamo y que L. monocytogenes resiste. Medio selectivo/diferencial: El bismuto selecciona la Salmonella frente a coliformes y Gram positivos

Yousef, A and Carlstrom,C. 2006. Microbiologa de los alimentos. Manual de Laboratorio. Edit. Acribia. Zaragoza. Espaa. p.176.

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Medio selectivo/diferencial: presenta componentes que inhiben el desarrollo de Gram positivas Se utiliza para diferenciar y enumerar coliformes. La novoviocina impide el crecimiento de los Gram positivos y de algunos Gram negativos, mientras que la mayor parte de las enterobacterias son resistentes al antibitico. Confirma E. coli O157:H7 pues este serotipo no fermenta el sorbitol.

Agar Entrico Hektoen

Escherichia coli O157:H7

Caldo modificado para E. coli con novobiocina (mEC+N)

Caldo Sorbitol Rojo de Fenol

Tabla 6. Principales medios de cultivo utilizados en el aislamiento de microorganismos asociados a ETAs. Fuente: Claudia Zambrano

Leccin 44. Tcnicas de identificacin de microorganismos Una vez aislado el microorganismo, se han desarrollado una serie de tcnicas que permiten su identificacin. Estas tcnicas se pueden clasificar en tres grandes grupos: Pruebas bioqumicas, Pruebas inmunolgicas y Pruebas genticas o moleculares.

Pruebas Bioqumicas En este caso se busca determinar las actividades metablicas especficas de cada microorganismo mediante la identificacin de metabolitos que reaccionan con los reactivos del medio de cultivo, produciendo virajes en el pH que se manifiestan con cambios en el color del medio. Las pruebas bioqumicas pueden ser tan sencillas como transferir una colonia a una lmina portaobjetos donde haya una gota de perxido de hidrgeno (H2O2) y observar si hay produccin de gas. Esta prueba se conoce como Catalasa y permite diferenciar entre Estafilococos y Estreptococos. Otro ejemplo es la prueba de fermentacin de lactosa, que puede determinarse a partir de la siembra de agar MacConkey: si las colonias formadas son de color violeta, indican que son gneros lactofermentadores (E. coli, Klebsiella, Enterobacter) y si son colonias incoloras se est frente a no lactofermentadores (Salmonella, Shiguella, Proteus).

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Pruebas inmunolgicas o serolgicas La importancia de este tipo de pruebas radica en la rapidez, relativa sencillez en el procedimiento y la especificidad demostrada por la mayora de las tcnicas que estn siendo utilizadas con este objetivo. Adems permiten estudios rpidos epidemiolgicos de ETAs que surjan en la poblacin. Este tipo de pruebas se fundamentan en el hecho de que los microorganismos son antignicos, es decir que cuando ingresan en el cuerpo del humano o de un animal estimulan la formacin de anticuerpos. Los anticuerpos son protenas que circulan en la sangre y se unen especficamente con el microorganismo que origino su produccin. Las pruebas serolgicas son muy tiles en la identificacin temprana de la hepatitis A. Los marcadores serolgicos de la infeccin aguda por VHA son Anticuerpos IgM (IgM anti-VHA) que se logran identificar 5-10 das antes del inicio de los sntomas y van disminuyendo durante los siguientes 6 meses hasta ser indetectables. Adems, las pruebas serolgicas no slo permiten diferenciar entre especies bacterianas sino tambin entre cepas de una misma especie. Las cepas con diferentes antgenos se denominan serotipos, serovariedades (serovares) o biovariedades (biovares)45. Una prueba serolgica muy utilizada en el rea de alimentos es ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas). Esta tcnica puede ser: - Indirecta, que utiliza la deteccin de anticuerpos producidos por los patgenos asociados a la enfermedad (utilizada en el campo de la microbiologa mdica). - Directa, que detecta los antgenos del patgeno y es la ms utilizada en el rea de alimentos. En la ELISA directa se trabaja con la bacteria desconocida (el agente causal de la ETAs) que se introduce en los pocillos de una microplaca que contiene adheridos anticuerpos conocidos. La reaccin entre los anticuerpos conocidos y la bacteria permite identificar la bacteria. Se utiliza para la deteccin de Salmonella, pues permite descartar rpidamente los alimentos negativos, para esta bacteria, con una mayor rapidez. Tambin se utiliza en la identificacin de Listeria monocytogenes y Clostridium perfringes enterotoxignico y la deteccin de toxinas bacterianas y micotoxinas.
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Tortora, G.J. y col. 2007. Introduccin a la microbiologa. Edit. Mdica Panamericana. 9. Edicin. Buenos Aires. p 766.

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Pruebas genticas o moleculares Estas pruebas se fundamentan en el hecho que la informacin gentica de una clula bacteriana se encuentra en el cromosoma y, a veces, en el plsmido. Las secuencias que conforman el cromosoma son nicas para cada bacteria, lo que es utilizado para su identificacin. Las principales tcnicas utilizadas en alimentos son: - Hibridacin de cido nucleco, en este caso la molcula de DNA del agente causal se somete al calor para romper los enlaces de hidrogeno entre los bases y separar las hebras que conforman el DNA. Luego se enfran con lentitud las cadenas separadas para permitir que se unan a sondas de DNA (secuencia conocida y nica de DNA) marcadas con enzimas que facilitan su identificacin debido a reacciones colorimtricas. Este paso es el que se conoce como hibridacin. Si una sonda de DNA se hibrida con DNA de un microorganismo desconocido es posible identificarlo por la semejanza de sus secuencias. Esta tcnica se utiliza en la identificacin de Salmonella. - Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), permite la identificacin del microorganismo causal al aumentar la cantidad de DNA microbiano, utilizando enzimas termorresistentes (ADN-polimerasa), nucletidos y un cebador (oligonucletidos diseados para unirse de forma complementaria a una nica secuencia del DNA investigado). Si el DNA buscado no existiera en el alimento, el cebador no podra unirse y no se producira la amplificacin. Una vez amplificado el DNA, mediante una serie de pasos que incluyen calentamientos y enfriamientos sucesivos, la muestra se pasa por electroforesis en gel de agarosa para compararla con un patrn especfico de DNA, que permite la identificacin del microorganismo asociado a la ETAs. En el rea de alimentos esta tcnica se utiliza para la identificacin de Listeria monocytogenes. Igualmente, el diagnstico de la gastroenteritis viral se realiza evaluando muestras de heces o vmito con PCR.

Lectura de profundizacin sobre el uso de las tcnicas moleculares en el rea de la biotecnologa. Fuente: Amgen. Compaa mundial de biofarmacia (biotecnologa aplicada a productos farmacuticos).

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Infovideo que muestra los pasos a seguir para la realizacin de la prueba serolgica de ELISA. Fuente: Abnova Corp. Empresa productora de anticuerpos y protenas.

Leccin 45. Tcnicas microbiolgicas utilizadas en la evaluacin del ambiente

Evaluacin de superficies Para la evaluacin de superficies se recomienda tener en cuenta las caractersticas de la superficie:

Mtodo de la torunda En este mtodo se utiliza una torunda estril, que en el extremo tiene una bola de algodn (aproximadamente 0,5 cm de dimetro y 2 cm de largo) unida a una varilla de madera (12-15 cm) y puede ser construida por el analista. Esta torunda se sumerge en agua estril para poder tomar la muestra de la superficie46. Es recomendable en aquellas superficies de difcil acceso o que no sean totalmente planas (superficies irregulares). Tambin es conocido como el mtodo del frotis.

Mtodo de la esponja Se utiliza para evaluar superficies amplias o para la recuperacin de microorganismos que tienen una baja incidencia en las zonas analizadas. En este caso se trabaja con una esponja natural o sinttica estril (5x5 cm) y libre de antimicrobianos. Para tomar la muestra se humedece la esponja en agua estril y se restriega sobre la superficie que se quiere muestrear. Si la finalidad del muestreo es: - La deteccin de patgenos, la esponja se transfiere a un caldo de enriquecimiento y la mezcla se lleva a incubar, para continuar con el proceso de identificacin. - Cuantificar la flora del ambiente, la esponja se mezcla con 50 a 100 mL de diluyente y se realizan las diluciones correspondientes47.

Yousef, A and Carlstrom, C. 2006. Microbiologa de los alimentos. Manual de Laboratorio. Edit. Acribia. Zaragoza. Espaa. p.182. 47 Ibis. p.194

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120 Mtodo de replicacin de microorganismos por contacto directo con agar (RODAC) Tambin es conocido como Placa de contacto. Se aplica en superficies planas de fcil acceso y que hayan sido previamente limpiadas o higienizadas. En este caso se utilizan medios de cultivo apropiados que recuperen el microorganismo de inters y que contengan una mayor cantidad de agar a la normal, de manera que exceda la superficie de la caja de petri. Esto con el fin de tomar adecuadamente la muestra, pues para eso se presiona la placa contra la superficie a analizar y se mueve sin dejar de presionar. Despus se coloca la tapa y se lleva a incubar, para observar el crecimiento bacteriano.

Evaluacin del aire Los mtodos ms utilizados para la evaluacin del aire son: Sedimentacin Consiste en exponer el medio de cultivo al ambiente, por un determinado tiempo, por ejemplo, 15 min. Los microorganismos del aire se depositan, por la fuerza de la gravedad, en el medio de cultivo, que se lleva a incubar y de acuerdo al recuento bacteriano se establecer que nivel de contaminacin existe en el aire.

Filtracin En este caso se hacen pasar corrientes de aire a travs de microfiltros, con un dimetro de poro definido. Los microorganismos que hayan quedado en el filtro sern removidos mediante un diluyente adecuado, para luego inocularlos en los medios de cultivo necesarios para su crecimiento.

Evaluacin de manipuladores de alimentos La evaluacin del manipulador de alimentos se inicia con la valoracin de manos y uas utilizando un escobilln impregnado de agua estril para facilitar la recuperacin de los microorganismos presentes. El escobilln se pasa por dedos y uas para obtener una adecuada muestra del operario. Luego se pone en medio lquido de Tioglicolato para favorecer el crecimiento bacteriano y a partir de este caldo se siembra en los medios de cultivo correspondientes para la identificacin del microorganismo, por ejemplo, agar sangre y agar nutritivo.

121 Otra tcnica utilizada es la impresin de dedos o guantes y que consiste en presionar los dedos o los guantes sobre el medio de cultivo y esta muestra se lleva a cultivar para recuperar los microorganismos presentes. Tambin se pueden obtener muestras de secrecin farngea y secrecin nasal las cuales se siembran en los medios de cultivo correspondiente para identificar la flora microbiana presente y evaluar la presencia o no de microorganismos patgenos. Otro punto anatmico importante a evaluar en el manipulador de alimentos es la cavidad oral. Grandes masas de bacterias se desarrollan en el interior de la boca, en las superficies epiteliales de la lengua, mejillas y en los dientes, por lo que su valoracin indica las condiciones en que esta laborando el manipulador. Existe un grupo de microorganismos, asociados con problemas de contaminacin en vinos como son los Streptococcus mitis, Streptococcus salivarius y Lactobacillus. Estas bacterias se asocian con la produccin de aminas bigenas, que se definen como compuestos orgnicos de nitrgeno y que estn relacionadas con una serie de alteraciones fsicas en el consumidor, como por ejemplo y donde se destaca, la migraa. De ah el inters en identificar este tipo de microorganismos en manipuladores vincolas48.
Cules son las ventajas de los mtodos utilizados en el rea de alimentos? Preguntas de repaso El mtodo del NMP se utiliza en que caso? Qu ventajas tienen las pruebas serolgicas y moleculares contra las Tcnicas microbiolgicas de rutina?

Para qu sirve la microbiologa? Hacia 1815 se empezaron a incluir las primeras prcticas de control microbiolgico en los procedimientos quirrgicos y el cloro fue uno de los primeros antispticos en usarse, incluso antes de que se supiera el papel real de los microorganismos en las enfermedades. Se utilizaba como cloruro de calcio para el lavado de manos y evitar la contaminacin microbiana de heridas quirrgicas. Fue muy importante para impedir la sepsis puerperal, que era transmitida por las manos de los mdicos y de las parteras, y considerada como la causa de hasta el 25% de las muertes post-parto en mujeres49. Actualmente el hipoclorito de sodio, de calcio o de litio son las soluciones ms utilizadas en las industrias alimenticias, en restaurantes, hoteles y hospitales y su actividad antimicrobiana es evaluada mediante tcnicas microbiolgicas que validan la accin de dichos desinfectantes. En general, el control microbiolgico de los establecimientos alimenticios o de las
Angarita, E. 1990. Aminas vasopresoras en vinos, cervezas y jugos de frutas. Alimentaria. Vol. 1. No. 7. Pg 12-15. 49 Troya, J. 2007. Evaluacin de la efectividad de desinfectantes Divosan Forte y MH en la desinfeccin de equipos y parea de trabajo en una empresa procesadora de helados. Tesis. PUJ. p.17.
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122 reas intrahospitalarias, se realiza con el fin de comprobar el grado de limpieza de los mismos y por consiguiente el efecto de los desinfectantes en uso.

Gloosario cido nucleco: Biomolcula que almacena la informacin gentica de un organismo y que est conformada por un azcar (pentosa), un grupo fosfato y bases nitrogenadas (adenina, guanina, timina y citosina) ARNmensajero: Tipo de cido nucleco que participa en la produccin de protenas llevando la informacin codificada desde el DNA (ncleo) hasta los ribosomas (citoplasma). Biocontrol: Se refiere al uso de cualquier organismo vivo que facilite el manejo o control de las diferentes plagas en el rea agrcola. Biofertilizantes: Se refiere a un grupo de microorganismos que gracias a sus procesos metablicos pueden mejorar los problemas de deficiencia de nutrientes en el suelo y mejorar la productividad agrcola. Biomasa: Masa total de los seres vivos que estn en un rea determinada. Diploide: Se refiere a las clulas que tienen el nmero completo de cromosomas del organismo. Cuerpo basal: Corresponde a un orgnelo intracelular que permite la formacin y el anclaje de cilios y flagelos. Ectoparasitos: Son aquellos parsitos que se mantienen externamente al husped que colonizan. Endoparsitos: Son aquellos parsitos que habitan dentro del cuerpo de su husped. Enzima: Sustancia de tipo protenica que acelera una reaccin bioqumica. Enzimas Hidrolticas: Tambin llamadas hidrolasas y son enzimas que rompen los enlaces de tipo ster, ter, peptdo, glucosilo, entre otros, utilizando molculas de agua. Enzimas proteolticas: Tambin llamadas proteasas y son aquellas que actan sobre el enlace peptdico de las protenas.

123 Especie: Es un concepto que sigue siendo muy discutido, pero puede definirse como el grupo de organismos con un hbitat particular, caractersticas fsicas similares y frtiles entre s. Exoesqueleto: Se refiere al tipo de esqueleto externo que tienen algunos seres vivos como los artrpodos. Forma Vegetativa: Corresponde a la forma infectante y activa de un microorganismo. Gametos: Clula reproductora, masculina o femenina, con la mitad de los cromosomas del organismo y que al unirse con otro gameto forma el cigoto. Genoma: Se refiere al conjunto del material gentico presente en un organismo. Glicoprotenas: Tambin llamadas Glucoprotenas y corresponde a biomolculas formadas por protenas y carbohidratos. Haploide: Se refiere a las clulas que tienen la mitad del nmero total de cromosomas del organismo. Heterocigoto: Se refiere al organismo que presenta los dos alelos diferentes para una determinada caracterstica. Interferon: Corresponde a un tipo de protena antiviral producida por clulas animales, como los macrfagos y los linfocitos, despus que estas han sido infectadas con un virus. Lipoprotenas: Biomlecula formada por la unin de un lpido y una protena. Meiosis: Divisin celular que ocurre en las clulas sexuales y en la cual se reduce a la mitad el nmero de cromosomas del organismo. Microscopio Electrnico: Tipo de microscopio que utiliza electrones emitidos por un filamento catdico a alta velocidad y que contiene tres o ms electromagnetos en forma de anillo, uno que funciona como lente, otro como objetivo y otro como amplificador. Se pueden obtener amplificaciones de 100.000x. Mitosis: Divisin celular que ocurre en el ncleo y en la cual se mantiene el nmero completo de cromosomas del organismo, lo que da lugar a dos clulas idnticas a la original. Polmero: Se refiere a cualquier compuesto qumico formado por la unin de repetidas unidades bsicas llamados monmeros. En los seres vivos existen tres ejemplos importantes de polmeros: cidos nuclecos, polisacridos y protenas.

124 Polisacrido: Resultan de la unin de muchos monmeros de hexosas (azcares de 6 carbonos) con la correspondiente perdida de agua. Su frmula es (C6H10O5) Plantas Transgnicas: Hace referencia a las plantas que han sido modificadas genticamente para mejorar alguna de sus caractersticas biolgicas. Procesos Fermentativos: Son aquellos procesos en los cuales intervienen enzimas microbianas que transforman sustancias orgnicas produciendo compuestos de utilidad industrial. Protoplastos: Se refiere a clulas vegetales sin paredes celulares. Respuesta Inmunolgica: Se refiere a la reaccin que tiene el sistema inmunolgico o de defensa frente a un organismo o sustancia extraa. Ribosoma: Organelo celular encargado de la produccin de protenas. Sustrato: Se refiere a la base o material donde puede crecer un ser vivo. Taxonoma: Ciencia relacionada con la organizacin o clasificacin de los seres vivos. Transcriptasa reversa: Tambin llamada transcriptasa inversa. Es una enzima que poseen algunos virus y que utiliza el RNA viral como molde para producir DNA bicatenario complementario y as poderlo incorporar ms fcilmente a la clula husped. Virin: Es el trmino que se le asigna a una partcula de virus individual y que mantiene toda su capacidad infecciosa. Zigosopora: Tipo de espora sexual que se produce en los hongos y que permite su clasificacin taxonmica.

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Bibliografa Angarita, E. 1990. Aminas vasopresoras en vinos, cervezas y jugos de frutas. Alimentaria. Vol. 1. No. 7. Pg 12-15. Argello M. 1985. De la Entamoeba histolytica a la enfermedad amibiana. Laboratorios Synthesis. Divisin Gastrointestinal. Bogot. Colombia. 153p. Bergey, D.H. 1984. Bergeys manual of systematic bacteriology. Crdova Frunz, J.L. 2002. La qumica y la cocina. 3. Ed. Fondo de cultura econmico. Mxico. 153 p. Herrera, J.R. 2001. El pensamiento biolgico a travs del microscopio. Fondo de cultura econmico. Mxico. p.17 Llorente-Bousquets y col.1995. Historia de la biologa comparada. De Nicols de Cusa a Francis Bacn. Vol. III. UNAM.Mxico. p.59. McEwen,J.G. 1994. Los priones. Innovacin y ciencia. Vol.III.No.4. 39-42p. Purves, W.K. et col.2004. Life. The science of biology. 7a.Edicin.Edit. Sinauer Associates. U.S.A. p. 525. Snchez, M y col. 1988. Anlisis microbiolgico de alimentos. INS. Bogot. Colombia. 71p. Tortora, G.J. y col. 2007. Introduccin a la microbiologa. Edit. Mdica Panamericana. 9. Edicin. Buenos Aires.960p. Ward, O.P. 1989. Biotecnologa de la fermentacin. Principios, procesos y productos. Edit. Acribia S.A. Zaragoza. Espaa. 274p. Yousef, A and Carlstrom, C. 2006. Microbiologa de los alimentos. Manual de Laboratorio. Edit. Acribia. Zaragoza. Espaa. 300 p.