De la llave a la c elula: las facetas cambiantes del agua

M. Picquart1 e I. Carrasco Morales2 . 1 Depto. de F sica, UAM-I 2 Depto. de Atenci on a la Salud, UAM-X
Recibido: 18 de junio de 2008 Aceptado:16 de julio de 2008 Seguramente, la caracter stica m as prominente del agua es la decepci on, porque en realidad es una sustancia de complejidad innita, de gran e inapreciable importancia, dotada de una rareza y belleza sucientes como para excitar y retar a cualquiera que pretenda conocerla. Owen R. Fennema Resumen El agua juega un papel capital en los procesos de la vida. Es un l quido complejo cuyas propiedades son objetos de investigaciones permanentes. Se encuentra en c elulas, connada en cavidades dentro de las prote nas, ligada a su supercie, en capas entre los tejidos, representa del 70 al 80 % de la masa celular. El agua interfacial (tambi en llamada ligada o estructurada) juega un papel fundamental en la estabilidad y funci on de las prote nas y de los acidos nucleicos. Muchos trabajos han mostrado que las propiedades estructurales y din amicas del agua interfacial son muy diferentes del agua en bulto. Se ha mostrado tambi en su papel en la relaci on din amica funci on de las prote nas, que se traduce por una activaci on del movimiento de las prote nas. Hasta los setentas, pocos fueron los bi ologos que pensaban que el agua no era s olo un mero solvente con propiedades homog eneas (agua en bulto). Han sido los trabajos de bioqu micos, biof sicos y f sicos que han puesto a luz, la zona de interacci on entre las biomol eculas y las mol eculas de agua vecinas. Introducci on El agua es una sustancia, un l quido, un gas, un s olido, una mol ecula, un cuerpo puro... todo a la vez pero no obligatoriamente al mismo tiempo para el mismo observador. Es tambi en un elemento natural que en el estado l quido y s olido recubre m as de 5 los dos tercios de la supercie de la tierra y es contenida en poca cantidad en su atm osfera. El agua (H2 0; M = 18 g/mol) que entra entre el 50 y 99 % en la composici on de los organismos vivientes, es l quida entre 0 y 100 C, a presi on atmosf erica. Esta particularidad no es frecuente ya que las mol eculas con masa molar vecina son gases en las mismas condiciones de temperatura y presi on. Esto se explica por la forma de la mol ecula y la asimetr a de la carga electr onica. En primer an alisis, todos los atomos est an constituidos de un n ucleo denso, cargado positivamente alrededor del cual gravitan electrones de carga negativa. Desde el punto de vista el ectrico, un atomo est a siempre neutro. El m as peque no de todos es el atomo de hidr ogeno que posee un solo electr on. Es frecuente representar a un atomo como un planeta (el n ucleo) con sat elites dando vueltas alrededor (los electrones) ya que un tal modelo es f acilmente comprensible. Pero esto supone impl citamente que los electrones tienen trayectorias bien conocidas y casi circulares. No es el caso. Los f sicos no conocen el movimiento de los electrones alrededor de un n ucleo pero pueden calcular la probabilidad de encontrar un electr on en un lugar dado alrededor de este n ucleo (Fig. 1). La presencia de estos electrones es muy importante ya que permiten a los atomos ligarse el uno al otro. El enlace qu mico entre dos atomos se forma cuando pares de atomos, comparten pares de electrones. Estos electrones compartidos no pertenecen m as ni al uno ni al otro sino a los dos. Una tal repartici on no siempre es equitable ya que algunos atomos pueden tener m as anidades para los electrones. Es lo que pasa en la mol ecula de agua en donde el ox geno tiene tendencia a atrapar m as fuertemente los electrones que el hidr ogeno. Entonces, la asociaci on de un atomo de ox geno con dos atomos de hidr ogeno mucho m as peque nos en una conguraci on no lineal (como es el caso de la mol ecula de agua) produce una asimetr a de la estructu-

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ra y la constituci on de un dipolo el ectrico. Se dice que una tal mol ecula es polar.

Figura 1. El atomo de hidr ogeno con su nube electr onica en el estado fundamental. La distribuci on de la densidad dene la forma del atomo. La densidad decrece del rojo al azul.

En la materia, cual sea su estado, los atomos o las mol eculas nunca est an inm oviles sino en movimiento continuo dependiendo de la temperatura: es la agitaci on t ermica. En el vapor de agua, la agitaci on t ermica de las mol eculas de agua es grande: se mueven en todas las direcciones independientemente las unas de las otras y aparentemente de manera desordenada. Este comportamiento es t pico de todos los gases. Si se enfr a el vapor de agua, la energ a de agitaci on t ermica disminuye y las mol eculas pueden ligarse las unas a las otras. Se juntan en paquetes para formar gotas de agua l quida que caen en el fondo del recipiente. Cuando el vapor se transforma progresivamente en l quido, se pueden formar enlaces entre mol eculas vecinas. Estos enlaces se deben a la polaridad de la mol ecula y se establecen cuando una mol ecula intercambia un electr on de uno de sus hidr ogenos con un ox geno de una mol ecula vecina (formaci on de un puente de hidr ogeno). Las mol eculas de agua sucientemente cercanas, establecen una red de enlaces intermoleculares localmente inestables y en permanente reconstrucci on. La libertad de cada mol ecula es limitada por el campo de fuerzas de la poblaci on molecular, permitiendo que el agua se quede en fase l quida a las temperaturas y presiones compatibles con la vida. Para cambiar este estado hacia una fase gaseosa, basta te oricamente con romper los puentes de hidr ogeno. A presi on constante, esto se puede conseguir aumentando la energ a cin etica de las mol eculas por calentamiento o cualquier otra forma de energ a.

La transici on hacia un estado s olido es frecuentemente m as compleja que la vaporizaci on. Es necesario reducir las vibraciones intermoleculares y construir uno o varios cristales por agregaci on de mol eculas de agua. Esto se obtiene bajando a un m as la temperatura. La construcci on de una supercie cristalina s olida, el desplazamiento de estas mol eculas hacia esta supercie, su orientaci on para integrarla y la constituci on de nuevos enlaces en un sistema cristalino, necesita energ a y tiempo. Si el enfriamiento es sucientemente r apido o la cohesi on intermolecular est a reforzada por crioprotectores, se puede obtener un estado v treo (l quido innitamente viscoso) no cristalino. En los otros casos, la probabilidad de formar el primer cristal depende mucho de la presencia de motivos moleculares adecuados presentes en la supercie de las mol eculas en suspensi on en el agua, en sus impurezas o en la pared del recipiente. La formaci on de este primer cristal es demorada en el agua pura que puede quedarse te oricamente en subenfriamiento hasta -49 C. Lo importante en la formaci on del hielo (agua s olida) es que los puentes de hidr ogeno (que se pueden f acilmente doblar en el l quido) se endurecen y se vuelven casi rectil neales. Las mol eculas de agua forman entonces una estructura muy r gida y organizada. En las c elulas, las monocapas moleculares de hidrataci on adsorbidas sobre los constituyentes biol ogicos tienen propiedades vecinas a las del hielo: poca agitaci on molecular, orientaci on preferencial de las mol eculas y poder de solvataci on d ebil [1]. El agua es un solvente para muchos cuerpos. Transporta sustancias que provienen del medio externo o formadas en los seres vivientes. Participa tambi en en numerosas reacciones qu micas en el organismo y permite la fabricaci on de nuevas mol eculas vitales. Hace m as de 35 a nos, Tait and Franks [2] publicaron un art culo con el objetivo de llamar la atenci on sobre algunas areas de investigaci on, sobre el estado del agua en los sistemas bioqu micos y biol ogicos. En dicho art culo, algunas deducciones a prop osito del papel del agua en tales sistemas, fueron en parte especulativas. Ser a interesante realizar un balance y analizar los logros as como hacer una reexi on multidisciplinaria sobre estos problemas. Existe evidencia de que el agua no es un simple solvente inerte para las reacciones bioqu micas y que juega un papel importante en la din amica de muchas de ellas.

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En un art culo recientemente publicado en Nature [3], Mart n Chaplin pregunta No subestimamos la importancia del agua en biolog a celular? Contesta considerando varios ejemplos: el efecto del agua sobre las prote nas como parte integrante de ellas y su papel en los procesos de plegamiento, en su actividad y din amica; el papel de las mol eculas ordenadas del agua en la transferencia de protones y electrones; el agua y la estructura de los acidos nucleicos y nalmente el papel del agua celular en la actividad de la c elula. Pero antes de abordar estos temas haremos un peque no recordatorio de algunas de las propiedades del agua. Polimorsmo del agua Las fuerzas responsables de la organizaci on del agua son de naturaleza electrost atica. Las mol eculas de agua son dipolos el ectricos que pueden tambi en formar puentes de hidr ogeno. En el agua en bulto estos dipolos tienen orientaciones aleatorias y por eso se considera como un medio is otropo. La mol ecula posee dos hidr ogenos electropositivos y un ox geno electronegativo. Generalmente se representa como cuatro cargas colocadas en los cuatro v ertices de un tetraedro (Fig. 2-a). En promedio, cada mol ecula est a ligada por un puente de hidr ogeno a cuatro mol eculas vecinas (Fig. 2-b) dispuestas en tetraedro alrededor de ella. El tiempo de vida de un puente de hidr ogeno en el agua en bulto es del orden de 1011 s y su energ a es de 3-5 kcal mol1 . La introducci on de una sustancia ajena en esta fase acuosa homog enea crea un desequilibrio. A su contacto las mol eculas de agua est an sometidas a esfuerzos que van a privilegiar ciertas orientaciones: se forma una zona de agua interfacial pero, a diferencia del agua en bulto; muy anis otropa. Se admite que estos esfuerzos se ejercen dentro de un espesor de por lo menos cuatro capas de agua (1.1 nm). La estructura y por lo tanto las propiedades del agua interfacial son muy diversas y dependen de la hidrofobicidad o de la hidrolicidad de la sustancia que se introduce. Se ha mencionado tambi en la posibilidad de uni on con mol eculas con puentes de hidr ogeno presentando bifurcaciones [4]. Sustancia hidr ofoba Esta sustancia posee grupos apolares que no atraen al agua y por lo tanto, las mol eculas de agua que la rodean y que estaban unidas por puentes de hidr ogeno se van a reorganizar y establecer entre ellas nuevos puentes de hidr ogeno. A esto se le llama hidrataci on hidr ofoba. De esta manera las mol eculas de agua compensan la ruptura del equilibrio que

Figura 2. Estructura del agua: a) Mol ecula aislada; b) La disposici on tetra edrica; c) En el hielo.

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ten an en el agua en bulto. La hidrataci on hidr ofoba es exot ermica y se acompa na de una variaci on de entrop a negativa (S < 0). La densidad de esta agua es superior a uno. El tiempo de vida de los puentes de hidr ogeno es del orden de 106 s mucho m as grande que en el agua en bulto y juega un papel importante en la estabilizaci on de las biomol eculas [5-7]. Al encontrar una regi on apolar con un peque no radio de curvatura (metano. . . , cadena lateral de prote na. . . ) las mol eculas de agua se reorientan ya que no pueden formar puente de hidr ogeno hacia la supercie hidr ofoba. Esta se encuentra encerrada en una peque na jaula con caras pentagonales (clatratos, Fig. 3) cuyos v ertices est an ocupados por mol eculas de agua y los lados formados por puentes de hidr ogeno tangentes a la supercie. Estas estructuras presentan variaciones en funci on del radio de curvatura [8]. Por otra parte, se han descubiertos puentes de hidr ogeno entre el agua y el benceno [9-12], con los atomos de hidr ogeno de las mol eculas de agua hacia la nube de electrones . M as recientemente se han encontrado el mismo tipo de interacci on con otros n ucleos arom aticos [13-16].

giones polares se unen a las mol eculas de agua por puentes de hidr ogeno jugando el papel de donadores o de aceptadores de hidr ogeno. El acido ribonucle co (ARN) y el acido desoxiribonucle co (ADN) han sido estudiados por numerosos m etodos. En el estado cristalino, el ADN est a cubierto de una capa de agua estructurada, no congelable e impermeable a los iones que representa m as o menos 80 % de su masa. Se estima a veinte mol eculas de agua por nucle otido, jadas sobre los ox genos libres de los grupos fosfato, de los fosfodiesters y de los az ucares y sobre las bases. Si se a nade agua a este ADN, se ina dejando espacio para mol eculas de agua m as libre. Esta agua interna depende de la estructura A, Z o B del ADN [19-22]. El agua interfacial o ligada o estructurada En su libro Qu mica de los alimentos, O. R. Fennema [23], menciona que el agua ligada no es una cantidad f acilmente identicable y homog enea, por lo que la terminolog a descriptiva es dif cil, no existiendo ninguna denici on generalmente aceptada. Anota como ejemplos siete deniciones diferentes, todas v alidas: 1) El agua ligada es el contenido de agua de equilibrio de una muestra a una temperatura y humedad relativa (baja) apropiada; 2) El agua ligada no contribuye signicativamente a la constante diel ectrica a altas frecuencias y por tanto tiene su movilidad rotacional restringida por la sustancia con la que est a asociada; 3) El agua ligada no congela a una temperatura baja arbitraria (normalmente -40 C o m as baja); 4) El agua ligada es inutilizable como solvente para solutos adicionales; 5) El agua ligada produce un ensanchamiento de l nea en los experimentos de resonancia magn etica nuclear (RMN) de protones; 6) El agua ligada se mueve con las macromol eculas en los experimentos de velocidades de sedimentaci on, viscosidad o difusi on; 7) El agua ligada se encuentra en la vecindad de solutos y otras sustancias no acuosas y tiene propiedades que dieren signicativamente del resto de la masa de agua del mismo sistema. Seg un el, la combinaci on de las deniciones 3 y 7 parece la m as satisfactoria ya que produce una imagen conceptual y permite un proceder realista para cuanticarla. En los sistemas biol ogicos o macromol eculas esta agua puede existir en varias formas. Hay mol eculas de agua ligadas m as fuertemente a las macromol eculas y que forman parte integral de ellas. A esta agua, Fennema la llama constitutiva [23]. No se puede eliminar con ning un procedimiento

Figura 3. Clatrato de agua.

Sustancia hidr ola Estas sustancias atraen al agua, contienen grupos ionizados o polares. Pueden ser mojadas (como el vidrio) y si sus fuerzas de cohesi on interna son d ebiles, pueden solubilizarse. Al contacto con tal sustancia, el agua forma una capa de solvataci on (hydration shell) que constituye una pantalla que impide su precipitaci on. Los dipolos de agua se organizan radialmente alrededor de las regiones ionizadas formando multicapas ordenadas de agua [17-18]. Esta agua est a a muy alta presi on (hasta 34 kbaros) y su densidad puede llegar a 1.2 g cm3 . Las re-

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experimental. La capa que sigue es una monocapa de mol eculas de agua en contacto directo con los grupos polares o cargados de la macromol ecula. Algunos autores llaman solamente a esta monocapa como agua ligada [1], otros como agua vecinal [23] o interfacial y esta ilustrada en la Fig. 4. Detr as vienen multicapas menos ligadas pero con propiedades sucientemente alteradas con respecto al agua en bulto, que Mentr e por ejemplo, llama agua estructurada [1].

En un trabajo reciente, Tehei et al. [24] han estudiado por dispersi on de neutrones, la din amica del agua intracelular de Haloarcula marismortui, un organismo hal olo aislado del Mar Muerto. Los resultados de los experimentos realizados sobre dos espectr ometros diferentes revelan una constante de difusi on traslacional de 1.3105 cm2 s1 (a 285 K), cercana a la encontrada en otras c elulas, a la del agua en bulto, y tambi en a la del agua a 3.5 M NaCl que ba naba las c elulas. Vale recordar que el Mar Muerto tiene una muy alta concentraci on de NaCl, 275 g l1 , mientras la del mar es de 35 g l1 y la del plasma 9 g l1 . Pero los investigadores encontraron tambi en un componente muy lento correspondiendo a una constante de difusi on traslacional 250 veces m as peque na que la del agua en bulto. Esta agua lenta, representa el 76 % del agua celular en H. marismortui. Los mismos experimentos realizados sobre Escherichia coli no muestran el segundo componente. El componente lento se deber a a una estructura espec ca del agua relacionada a la alta cantidad de iones potasio que se encuentra en estas c elulas. Toda mol ecula posee una movilidad traslacional y una movilidad rotacional. En el primer caso, la mol ecula se desplaza de un punto a otro. Esta forma de movilidad es elevada en los uidos y muy reducida en los s olidos. En el segundo caso, la mol ecula gira u oscila en su lugar. Los movimientos moleculares no son solamente movimientos desordenados debidos a la agitaci on t ermica. Pueden ser orientados por campos el ectricos o magn eticos. Muchos trabajos sobre el agua asociada a macromol eculas fueron realizados por difracci on de rayos X, por resonancia magn etica nuclear (RMN) y m as recientemente por difracci on de neutrones. El primer m etodo s olo es aplicable a cristales. Las prote nas y los acidos nucleicos en el estado cristalino son muy hidratados salvo en algunos puntos de contacto entre mol eculas. Se encuentran en su forma tridimensional nativa [25]. Esta hidrataci on es a la vez una ventaja ya que permite el estudio del agua, y un inconveniente porque turba al an alisis. Se detecta solamente las mol eculas de agua encerradas en cavidades macromoleculares y a veces en contacto directo con la supercie. Adem as el agua en bulto que se encuentra lejos de las macromol eculas perturba mucho los resultados. Esta t ecnica solamente da una subestimaci on de la organizaci on del agua [1].

Figura 4. Organizaci on del agua al contacto de una mol ecula. La primera capa tiene mol eculas fuertemente orientadas. En las capas siguientes el agua es menos organizada. Adaptada de la ref. 1.

Se considera que en estas capas de agua (ligada y estructurada), las mol eculas tienen una movilidad disminuida con respecto al agua en bulto. Cuando se queda en su lugar durante los fen omenos de osmosis, es llamada tambi en osmoticamente inactiva. Se congela dif cilmente, tiene una masa y un calor espec co diferentes del agua com un, tiene anomal as t ermicas, una conductividad de protones mayor y un poder de exclusi on de los s olutos mucho mayor que el del agua en bulto. Qu e tipo de agua se encuentra en las c elulas? La respuesta es compleja ya que los diferentes tipos de sustancias mencionadas anteriormente se encuentran y se puede pensar que agua en bulto, en clatratos y en capas m as o menos estructuradas coexisten. Pero la composici on del citoplasma est a dominada por un tipo de mol eculas, las prote nas. Por lo tanto, el tipo de agua que rodea las prote nas debe de ser el que se encuentra en las c elulas. En qu e proporci on y cual es su papel? Es aqu donde los cient cos divergen.

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Los trabajos por RMN han mostrado que el agua en las estructuras ricas en macromol eculas tiene una movilidad reducida y una viscosidad elevada. La RMN de protones permite estimar la movilidad de mol eculas que contienen protones gracias a una cantidad llamada tiempo de correlaci on que var a como el inverso de la movilidad. Fullerton et al. [26], por ejemplo, han trabajado sobre la lisozima en polvo. La prote na fue totalmente deshidratada y progresivamente rehidratada. Se mostr o que pudo retener 25 % de agua, que es tambi en la cantidad necesaria para cubrir toda su supercie. Una parte de esta agua es estructurada (5.5 %) con una movilidad rotacional d ebil muy poco diferente a la de la prote na. Se tratar a del agua atra da por los grupos ionizados, o sea 42 mol eculas de agua por macromol ecula. Se comporta como un s olido. De all viene su nombre en la literatura de agua ice-like (parecida al hielo). El agua ligada a los grupos polares est a menos inmovilizada. Finalmente, encontraron que la cantidad total de agua perturbada por la presencia de las macromol eculas representaba un espesor promedio de 2.6 capas de mol eculas de agua, o sea 0.8 nm. En trabajos recientes [27-29], encontraron un espesor de mol eculas de agua de 0.63 nm alrededor de la mol ecula de col agena de mam feros. Largas o cortas distancias? El espesor de agua modicada por la supercie es uno de los objetos de trabajo del grupo de G.H. Pollack [30-32]. En un trabajo reciente [31], Zheng et al. han realizado experimentos con suspensiones de micro esferas cerca de varias supercies: gel de acido poliacr lico, m usculo, monocapa hidrof lica con grupos carbox licos, etc. En todos los casos aparece en funci on del tiempo, una zona de exclusi on de las micro esferas que puede alcanzar 250m. Se piensa generalmente, que las mol eculas de agua se adsorben sobre las supercies hidr olas y que el ordenamiento adicional por capas sucesivas de agua se ve r apidamente quebrado por el efecto de la agitaci on t ermica. Cu ales podr an ser entonces las razones de un tal ordenamiento sobre largas distancias como lo muestran varios experimentos? Dos posibilidades existen: que la energ a de los puentes de hidr ogeno manteniendo las mol eculas juntas es mayor que lo previsto, o que la agitaci on t ermica que tiende a separarlas es necesariamente m as peque na que lo previsto. Parece que la segunda posibilidad ser a posible si uno considera las observaciones realizadas sobre soluciones acuosas de micro esferas coloidales. A una relaci on vol umica del orden del 1 %, las suspen-

siones de micro esferas presentan una coexistencia de dos fases, una desordenada y la segunda ordenada, parecida a un cristal [33-35]. En la fase desordenada, los movimientos debidos a la agitaci on t ermica tienen la amplitud esperada, mientras que en la fase ordenada, aunque las micros esferas est en separadas las unas de las otras por varios micr ometros, la trayectoria libre media disminuye de un orden de magnitud. Aparentemente, los efectos de la agitaci on t ermica en las regiones ordenadas puede ser menor que lo que se piensa. Esto podr a predisponer las mol eculas a un ordenamiento a largas distancias que no violar a los principios f sicos. Como el hielo, el agua ligada y hacia una cierta distancia, el agua estructurada tienen la propiedad de excluir los solutos. En este caso no es tan absoluta como en el caso del hielo: depende de la naturaleza de los solutos y para los iones sigue el orden de la serie de Hofmeister: Mg2+ > Ca2+ > Sr2+ > Ba2+ > Li+ > Na+ > K+ > Rb+ > Cs+ > > CH3 COO > citrato3 > tartrato2 > SO2 4 Cl > NO3 > ClO3 > I > SCN . La causa de este fen omeno reside en que la fuerza de atracci on con la cual las mol eculas de agua son atra das a la supercie de los iones para formar el ion hidratado es proporcional al inverso del cuadrado de su radio. Por tanto, a carga igual, parad ojicamente son los iones que tienen la masa at omica m as peque na que son los m as voluminosos en soluci on ya que su acci on sobre las mol eculas de agua es m as fuerte. En particular, el ion sodio hidratado es m as grande (rN a = 0.180 nm) que el ion potasio hidratado (rK = 0.121 nm). As , Horowitz y Miller [36] observaron que el citosol de los ovocitos no se comporta como una simple soluci on acuosa: puede excluir los solutos. Los autores mostraron que solamente 35 % del agua del citoplasma ten a las mismas propiedades de solvataci on para el sodio que el agua en bulto, lo que signica que el sodio esta excluido de m as o menos 65 % del agua citopl asmica. Para explicar esta exclusi on propusieron que la mayor parte del agua estaba en contacto con puentes de hidr ogeno con las macromol eculas y que eso le daba propiedades est ericas particulares. Muchos trabajos sobre el agua ligada, estructurada, o connada han sido desarrollados; que han mostrado sus caracter sticas principales: viscosidad mayor que el agua en bulto, densidad (como en el caso del hielo) menor que la del agua en bulto, exclusi on y partici on de los iones, etc. . . fuera o dentro de la c elula [1, 37-40].

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Si las macromol eculas pueden cambiar las propiedades del agua, debe de haber una relaci on tambi en entre el agua que rodea las macromol eculas y la estructura y funci on de las macromol eculas y de las prote nas en particular. Relaci on hidrataci onfunci on de una prote na Una prote na posee exibilidad y su din amica depende de su estructura ya que los movimientos son esenciales para que la prote na cumpla su funci on biol ogica en la cual el agua juega un papel importante: se trata de actividades catal ticas, inmunol ogicas, reguladoras y de transporte que se desarrollan en un entorno acuoso. La inuencia del agua de hidrataci on de una prote na sobre sus propiedades termodin amicas ha sido seguida por diversas t ecnicas experimentales: movimiento de una sonda en Resonancia Electr onica de Esp n (ESR), observaci on del espectro de absorci on infrarroja, medici on del calor espec co, medici on de la actividad enzim atica, etc. usando prote na liolizada e hidratada poco a poco. Por ejemplo, en el caso de la lisozima, la actividad enzim atica empieza cuando la tasa de hidrataci on llega a 0.22 gramo de agua por gramo de prote na para ser operacional al valor de 0.32, o sea una monocapa de agua, o 300 mol eculas de agua a la supercie de la prote na [41]. Simulaciones por din amica molecular han mostrado que la adici on de mol eculas de agua llevaba a una diluci on de la prote na sin cambiar las propiedades del sistema. A baja hidrataci on, solamente algunos peque nos c umulos (clusters) de mol eculas de agua ligadas por puentes de hidr ogeno est an presentes en le sistema. A alta hidrataci on, la prote na est a cubierta de manera homog enea, de una red de mol eculas de agua ligadas por puentes de hidr ogeno. La transici on entre estos dos estados, es una transici on de percolaci on del agua de hidrataci on [42]. Pero se ha mostrado tambi en que la adici on de mol eculas de agua en cavidades que no pod an ser completamente hidratadas desestabilizaba la estructura de la prote na induciendo un desplegamiento de la misma. Para estudiar la estructura y la din amica del agua cerca de prote nas globulares solubles se puede usar la difracci on de rayos X o de neutrones cuando esta u ltima es accesible ya que la longitud de onda de estas radiaciones es del orden de la distancia interat omica. Pero estas dos t ecnicas son complementarias: la primera no ve los atomos ligeros de hidr ogeno o de deuterio y la segunda s . Esto permiti o determi-

nar la estructura de un cristal de carboximioglobina con las 89 mol eculas de agua que est an en su supercie [43]. Estas t ecnicas permiten obtener informaciones a diferentes escalas espaciales: a baja resoluci on se tiene informaci on sobre el tama no de la prote na mientras que a alta resoluci on se tiene acceso a los detalles de la estructura de la prote na y de las mol eculas de agua. Los neutrones presentan adem as la ventaja de estudiar la din amica de un sistema ya que la energ a de los neutrones t ermicos es del orden de magnitud de la energ a de agitaci on t ermica de los sistemas moleculares. La c-cocianina es una prote na globular soluble cuya estructura fue determinada con una muy buena resoluci on por difracci on de rayos X [44]. Su estructura secundaria contiene 83 % de h elices alfa. Se encuentra en abundancia en las cianobacterias en donde est a implicada en la fotos ntesis, en la cual la energ a luminosa colectada por los crom oforos es convertida en energ a qu mica. En una prote na, 50 % de los atomos, son atomos de hidr ogeno por lo tanto es necesario poder separar los efectos debidos a los atomos de hidr ogeno de la prote na y a los del agua. Para esto se hacen crecer las cianobacterias en agua pesada (D2 O) lo que hace que en las cianobacterias no queden m as que el 1 % de atomos de hidr ogeno y de esta se extrae la c-cocianina deuteriada. Cuando se hidrata esta u ltima con proporciones variables de agua ligera, se puede seguir por difusi on inel astica de neutrones la din amica del agua en la supercie de la prote na. A tiempos cortos, del orden de los picosegundos, las mol eculas de agua poseen movimientos de difusi on limitados a saltos sobre sitios adyacentes a lo largo de la interfase. En el agua en bulto esta difusi on se hace por saltos aleatorios y cuatro veces m as r apido. La comparaci on de las propiedades din amicas del agua en bulto y las del agua interfacial ha mostrado que est au ltima a temperatura ambiente se comportaba como agua superenfriada (agua l quida debajo del punto de cristalizaci on) a baja temperatura. El agua interfacial a 25o C se parece al agua s uper enfriada a 0o C [44]. Las interacciones entre el agua y una prote na son de dos tipos: hidr ofobas cerca de los residuos apolares, hidr olas cerca de los residuos cargados y polares. Esto conduce a una representaci on muy sencilla de una prote na globular en t ermino de un coraz on hidr ofobo y una supercie discontinua hidr o-

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la. Para separar las contribuciones hidr ofobas de las contribuciones hidr olas se pueden estudiar sistemas modelos. Varios autores han usados sistemas diferentes. Por ejemplo, un vidrio poroso de s lice, el Vycor, que posee grupos cargados en la supercie, presenta interacciones hidr olas con el agua. Es un buen sistema modelo ya que se puede controlar la tasa de hidrataci on de los poros. En condiciones de monocapa de agua, los resultados de din amica molecular muestran una similitud muy grande con la c-cocianina [44]. Adem as, la estructura del agua interfacial estudiada por difracci on de neutrones a temperatura ambiente, es muy cercana a la del agua superenfriada a baja temperatura y el resultado m as espectacular es que no se observa ninguna cristalizaci on del agua entre la temperatura ambiente y la del nitr ogeno l quido (-176o C). Por otra parte se ha descrito que la estructura del agua superenfriada es semejante a la del hielo amorfo. En un trabajo reciente, Gabel y Bellissent-Funel [45] han mostrado que en el caso de la c-cocianina con trehalosa la movilidad del agua de hidrataci on es reducida, de una orden de magnitud con respecto al agua en bulto. La parvalb umina que se extrae de los vertebrados superiores es una prote na globular soluble que interviene en el ciclo de contracci on relajaci on de los tejidos musculares. Su anidad diferente para los iones calcio y magnesio permite regular la concentraci on relativa de estos dos iones en el medio celular. Su estructura ha sido determinada por difracci on de rayos X. Se caracteriza por la presencia de h elices alfa y de iones calcio y magnesio. Se ha estudiado la inuencia del agua de hidrataci on sobre los movimientos internos de la prote na, hidratando poco a poco el polvo de parvalbumina hidrogenada con agua pesada. A tiempos de observaci on de picosegundos, por difusi on inel astica de neutrones se ha detectado y observado el crecimiento de la movilidad de ciertos residuos cargados de supercie, muy hidr olos, de la prote na: lisina, acido asp artico y acido glutam nico a partir de una cantidad de agua correspondiente a una monocapa para la cual la prote na se vuelve funcional. Los resultados de RMN del carbono 13 han permitido asociar a los movimientos de las cadenas laterales, el de la cadena carbonada polipept dica, ya que el tiempo de observaci on en este caso es del orden del nanosegundo [46].

Conclusi on Numerosos progresos han sido realizados en el conocimiento del agua interfacial y de su papel en la funci on de las macromol eculas biol ogicas. Si el agua juega un papel fundamental en la estabilidad y la funci on de las prote nas globulares, la prote na misma ejerce una inuencia importante sobre la estructura y din amica del agua cercana. Los dos efectos est an estrechamente ligados. Los movimientos m as lentos del agua de hidrataci on en la supercie de una prote na parecen una condici on necesaria para que una macromol ecula biol ogica pueda cumplir plenamente su funci on. La c elula es un medio altamente heterog eneo que contiene numerosas especies qu micas en cantidades numerables de ejemplares, pero cada uno de ellos puede tener una orientaci on y una vecindad tan diferente que pueden reaccionar de manera diferente y parece dif cil hacer cualquier predicci on de naturaleza estad stica. Se estima que una bacteria como Escherichia coli contiene solamente una centena de protones alejados los unos de los otros por varias centenas de nan ometros y por lo tanto no pueden ser responsable de un gradiente de concentraci on. La misma cosa es para los iones de calcio cuya concentraci on celular se estima a 103 M pero con solamente 108 M a 106 M libres es decir no acomplejados por macromol eculas pero solvatados. Si se considera a esta bacteria como paralelepip edica (de volumen V = 2 1 1 m3 = 2 1015 L), una concentraci on de 106 M corresponde a un n umero de mol eculas de calcio n = Na 106 V , sea n = 6 1023 106 2 1015 = 1200 mol eculas. Si se supone cada mol ecula al centro de un cubo de lado a, la distancia entre dos mol eculas es aproximadamente la raiz c ubica de V /n, sea a = 0.1m. Para una concentraci on de 108 M se encuentran 12 mol eculas separadas de 0.6m. Para una c elula supuestamente esf erica se encuentra los mismos ordenes de magnitud. C omo imaginar que una decena o unos miles de iones, separados por numerosas macromol eculas puedan determinar un gradiente de concentraci on a estas distancias? Esta heterogeneidad de la c elula repercute a su vez sobre el agua en contacto con estas mol eculas. En la c elula, existir an al menos los cuatro tipos de agua descritos anteriormente: el agua de solvataci on sobre los grupos i onicos, el agua ligada por puentes de hidr ogeno a grupos polares de residuos hidr olos o a nubes de electrones rodeando n ucleos arom aticos y el agua en clatratos alrededor de residuos hidr ofo-

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bos (Fig. 5). En estas condiciones el agua ya no ser a un solvente sino una interfase [1].

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Figura 5. Macromol ecula con los diferentes tipos de agua que se pueden encontrar: A. Solvataci on; B. Puentes de hidr ogeno cerca de residuos donadores de hidr ogeno; C. Puentes de hidr ogeno cerca de residuos aceptadores de hidr ogeno; D. Puentes de hidr ogeno con nubes de electrones ; E. Clatratos en regiones hidrofobas.

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Para concluir, citar e P. Mentr e [1]: Los grandes descubrimientos de la bioqu mica fueron hechos in vitro en las condiciones de aplicaci on de la ley de acci on de masa, a diluciones muchas m as d ebiles que las que existen en las c elulas. Sus extraordinarias consecuencias en la comprensi on de la vida de la c elula, hicieron olvidar a los investigadores durante decenas de a nos que las macromol eculas en la c elula forman un mundo incomparablemente m as denso y heterog eneo que en el tubo de ensayo. Se producen interacciones potentes, de naturaleza f sica, que dan un nuevo enfoque a los fen omenos. Estos fen omenos necesitan de un estudio multidisciplinario y espero que este art culo contribuya a llevarlo a cabo. Referencias 1. Mentr e P., Leau dans la cellule : Une interface dynamique et h et erog` ene des macromol ecules, 1995, Masson, Paris.

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