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Mtodos em Biotecnologia - Citometria de Fluxo II

Citometria de uxo - Funcionalidade celular on-line em bioprocessos


Teresa Lopes da Silva1, Alberto Reis1, Christopher Hewitt2 e Jos Carlos Roseiro1 1 Instituto Nacional e Engenharia e Tecnologia Industrial - Departamento de Biotecnologia, Estrada do Pao do Lumiar, 1649-038, Lisboa Codex - Portugal, E-mail: teresa.lopesilva@ineti.pt 2 Biochemial Engineering - School of Engineering (Chemical Engineering), The University of Birmingham, Edgbaston, B15 2TT, UK.

Introduo
A necessidade de se obter informao no decorrer dos bioprocessos, tem contribudo para o aparecimento e utilizao de uma grande diversidade de tcnicas e ferramentas concebidas para o efeito. Os dados obtidos no s tm permitido aprofundar o conhecimento dos processos, como tambm o desenvolvimento de novas estratgias. Um citmetro de fluxo um sistema constitudo por 5 elementos: fonte(s) de radiao, (lmpada de mercrio ou laser), uma cmara de fluxo, unidades de filtros pticos para seleco de um intervalo de comprimento de onda especfico a partir duma gama espectral mais vasta, fotododos ou fotomultiplicadores para a deteco sensvel e processamento dos sinais com interesse e uma unidade que processa os dados recolhidos (Figura 1). A suspenso celular injectada e atravessa a cmara onde se d a passagem clula a clula atravs do feixe de radiao, perpendicular ao fluxo. A passagem individual das clulas obtida atravs da focagem hidrodinmica do fluxo de amostra, sendo esta injectada no seio de uma soluo salina (sheath fluid) que tambm atravessa a cmara (Figura 2). A diferena de velocidades entre os dois fluidos faz com que o fluxo se processe em regime laminar. A velocidade de escoamento da soluo de revestimento (sheath fluid) superior da amostra, e ajustvel, o que permite reduzir e controlar a espessura da soluo da amostra de forma a que possa passar uma clula de cada vez. Desta forma, podem detectar-se at 10000 clulas (eventos) por segundo. O feixe de radiao de excitao ao interceptar a partcula (clula) na cmara, sofre disperso quer na direco frontal (forward scattering), quer lateral (side scattering). A radiao assim dispersa detectada directamente por fotododos (disperso frontal) ou pode ser desviada a 90 por lentes, espelhos dicricos e filtros pticos e focada em fotomultiplicadores. A combinao destes tipos de radiao dispersa revela informaes importantes tais como a dimenso celular, a granularidade/complexidade e a morfologia. Compostos intracelulares com fluorescncia intrnseca (ex: clorofilas, ficobiliprotenas, NAD(P)H, etc.) ou passveis de se ligarem a corantes fluorescentes (fluorocromos), permitem a diferenciao selectiva de subpopulaes com base na combinao de vrios fluorocromos. A fluorescncia destes compostos tambm detectada por fotomultiplica-

dores, atravs de um sistema de lentes, espelhos dicricos e filtros pticos. Os citmetros actuais mais sofisticados podem possuir at 16 detectores em simultneo (radiao dispersa e fluorescente), o que permite analizar mltiplas possibilidades de caractersticas celulares e/ou componentes celulares de um elevado nmero de clulas de forma individual (Rieseberg el al., 2001). Esta versatilidade designa-se por anlise multiparamtrica. Crte-Real et al. (2002) publicaram um extenso artigo de divulgao sobre a citologia analtica (citometria de fluxo) em estudos de leveduras. A presente publicao abordar a mesma tcnica, mas aplicada a estudos de organismos procariticos (bactrias), em bioprocessos.

1. Deteco e contagem de Microrganismos


Classicamente a viabilidade em bactrias definida pela capacidade destas formarem colnias em meios de cultura slidos ou de proliferarem em meios de cultura lquidos. Estes ensaios so morosos, principalmente se o organismo em estudo apresenta uma baixa taxa de crescimento, reflectindo-se em longos tempos de incubao (horas ou dias). Por outro lado, estes sistemas de deteco da viabilidade celular esto dependentes do crescimento das bactrias em ambientes artificiais. Este facto limita a interpretao dos resultados obtidos por estes mtodos, uma vez que a escolha de um meio de cultura inadequado pode resultar numa contagem de colnias imprecisa. Alm disso, algumas clulas crescem apenas em condies anaerbias, outras em condies aerbias e, outras em ambas as condies. Portanto, a contagem realmente representativa de todos os microrganismos de uma determinada populao apenas poder ser feita atravs de mtodos pticos. Devido ao coeficiente de variao (erro estatstico) associado contagem (n0.5), necessrio examinar mais de 100 eventos para se obter um coeficiente de variao inferior a 10%. Com 1000 eventos, este coeficiente atinge 3% e acima de 5000, inferior a 1%. Por este motivo, e tambm devido

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rapidez da anlise, a Citometria de Fluxo prefervel Citometria de Imagem , a menos que seja necessria informao espacial das clulas.
Fotomultiplicadores Fluorescncias

FL3 FL4

FL2

seu equipamento, pelo que este mtodo, pela sua rapidez e simplicidade, se tornou vastamente utilizado (Application note, BD Biosciences). Acresce que a regio delineada pelas esferas nos grficos de radiao dispersa pode ser utilizada como controlo de alinhamento do laser on-line. A contagem precisa e rigorosa de clulas exige suspenses de clulas individuais, no agregadas. Os agregados de clulas quando inoculados em meio slido, do origem a uma nica colnia, ou a um nico evento no citmetro. Por exemplo, se uma clula num tripleto positiva para um marcador de morte celular, todo o agregado celular ser contabilizado como uma clula morta, mas as outras duas clulas viveis iro produzir uma colnia, quando inoculadas em placas de agar. Situaes como esta introduzem um erro significativo na contagem de clulas por citometria de fluxo. Os agregados de clulas podem ser dispersos atravs de mtodos qumicos ou mecnicos. Os mtodos mecnicos tm uma vasta aplicao, mas podem surgir problemas quando aplicados a microrganismos filamentosos ou leveduras. O tratamento com ultra-sons o mtodo mais adequado na desagregao de clulas, mas importante optimizar os nveis de energia a utilizar, bem como os tempos de aplicao desses nveis, e garantir que essas condies sejam aplicadas de forma reprodutvel (Nebevon-Caron et al., 2000).

FL1

Laser

Fotomultiplicador Radiao dispersa a 90

Lentes de Convergncia
Fotododo Detector de disperso frontal

Cmara de Fluxo

Figura 1 - Congurao de um citmetro de uxo (BD Biosciences/ Enzifarma)

H vrios mtodos de contagem de clulas. O mais utilizado o mtodo de contagem raciomtrico baseado na adio de uma determinada concentrao de partculas de referncia (esferas que emitem fluorescncia) amostra. O volume da amostra analisado pode ser determinado a partir do nmero de esferas contadas enquanto a amostra est a passar no citmetro; a contagem das clulas ento determinada dividindo o nmero de clulas contadas por este volume. A utilizao do mtodo raciomtrico permite corrigir tempos mortos e variaes de fluxo que eventualmente possam ocorrer num equipamento que funcione com diferenas de presso no processamento da amostra. A maioria dos fabricantes de citmetros de fluxo produz esferas de contagem de concentrao conhecida para o
Amostra Sheat Fluid

2. O conceito de viabilidade celular do ponto de vista da Citometria de Fluxo


A informao que se pode retirar dos ensaios de viabilidade1 sobre os estados fisiolgicos das clulas limitada a dois nveis extremos de actividade metablica: o saudvel, presente em clulas viveis com capacidade para se dividirem, e o correspondente morte celular. Contudo, a sensibilidade dos microrganismos ao ambiente em que se desenvolvem pe em causa a informao obtida atravs dos ensaios de viabilidade, pois clulas que se encontrem num estado fisiolgico intermdio entre o metabolicamente activo e a morte celular podem no ser contabilizadas. A vantagem da citometria de fluxo em analisar clulas individualmente consiste na deteco de uma variedade de estados fisiolgicos celulares intermdios que realmente existem numa determinada populao, descobrindo assim uma heterogeneidade nunca antes revelada (Nebe-von Caron et al., 1995, 2000). Alm disso, os dados obtidos atravs das tcnicas da microbiologia clssica so relativos cultura como um todo, ou seja, uma amostra representativa da cultura microbiana apresenta um nico valor, referente mdia dos valores de um determinado parmetro, de todas as clulas. Contudo, numa populao microbiana, as clulas no se encontram todas no mesmo estado metablico e fisiolgico, pelo que
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Cmara de Fluxo

Figura 2 - (Adaptao de slide disponvel em Berkeley University/Flow Cytometry Facility, ver endereo da internet nas Referncias). Representao esquemtica de uma cmara de uxo. A passagem individual das clulas (eventos) conseguida por focagem hidrodinmica do uxo de amostra no seio de uma soluo salina (sheat uid).

Diluies seriadas da amostra e posterior inoculao das diluies correspondentes a concentraes adequadas de microrganismo, de modo a obter-se um nmero de colnias contveis em placas de Petri.

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Tabela 1. Classicao da funcionalidade celular baseada na actividade

metablica da clula (Nebe-von-Caron et al., 2000)


Estado Fisiolgico Clulas Saudveis Clulas Vitais Propriedade Observada a) Membranas citoplasmticas intactas polarizadas b) Presena do sistema de trasnsporte activo a) Ausncia do sistema de transporte activo que exclu o BE a) Ausncia de transporte activo que exclu o BE b) Membrana citoplasmtica despolarizada a) Ausncia do sistema de transporte activo que exclu o BE b) Membrana citoplasmtica despolarizada permeabilizada

Clulas Intactas

Clulas Mortas

se torna necessrio detectar e descrever as vrias subpopulaes de forma diferenciada. A citometria de fluxo permite a avaliao da heterogeneidade de culturas microbianas, escala da clula individual, no ignorando outras ferramentas importantes tais como a microscopia de varrimento confocal e a anlise de imagem (Porter et al., 1996). Desta forma, dados discretos representando subpopulaes diferentes podem fornecer uma imagem mais detalhada e real da complexidade e heterogeneidade que ocorre num determinado bioprocesso (Porter et al., 1996; Rieseberg et al., 2001). Por estes motivos, esta tcnica tem tido cada vez mais impacto na comunidade cientfica. A combinao de vrios fluorocromos em citometria de fluxo permite a diferenciao de diferentes subpopulaes numa determinada populao, correspondentes a diferentes nveis de funcionalidade das clulas. Esta diferenciao levou introduo do termo vivel, mas no culturvel, aplicado a clulas que no estando metabolicamente activas, tambm no esto mortas e, evidentemente, no so reveladas atravs dos ensaios de viabilidade celular. A utilizao de critrios do funcionamento celular tais como o potencial da membrana citoplasmtica e a integridade da mesma, os quais sero descritos adiante em detalhe, permitem caracterizar estes estados metablicos (Nebe-von Caron et al. 2000). As clulas de bactrias saudveis so delimitadas por uma membrana citoplasmtica que lhes permite comunicar selectivamente com o ambiente que as rodeia. Os sistemas de transporte activo geram um gradiente electroqumico que fundamental para o perfeito funcionamento de uma clula saudvel. O corante fluorescente brometo de etdio (BE) consegue atravessar uma membrana polarizada, mas s se liga s cadeias do ADN quando a clula no possui um sistema de transporte activo no especfico proto/ antiporte. Este sistema quando se encontra activo, expulsa este fluorocromo da clula (Midgley, 1987). O iodeto de propdio (IP) tambm se liga s cadeias do ADN, mas no consegue atravessar uma membrana citoplasmtica saudvel. Bis-oxonol um corante lipoflico e aninico que acumula intracelularmente desde que a clula se encontre despolarizada, como se ver adiante. A utilizao da mistura destes corantes permite a diferenciao dos seguintes estados metablicos funcionais: clulas saudveis (com

capacidade para se dividirem), vitais, intactas e permeabilizadas (Tabela 1). Pensa-se que quando uma clula se encontra Flurocromo sob stresse, alguns dos sistemas Carbocianinas (Corante Lipoflico catinico) DiO de transporte activo so afectados (clulas vitais), seguindo-se Brometo de Etdeo (BE) a despolarizao da membrana Brometo de Etdio (BE) citoplasmtica (clulas intactas) e, Bis-oxonol (BOX) DiO mais tarde, a sua permeabilizao Brometo de Etdio (BE) (mortas). Clulas sem a membrana Bis-oxonol (BOX) citoplasmtica intacta no conseIodeto de Propdio guem manter ou gerar o gradiente de potencial electroqumico que origina o potencial de membrana. Alm disso, a sua estrutura interna, no estando protegida por uma membrana citoplasmtica intacta, encontra-se livremente exposta ao meio ambiente, pelo que estas clulas acabaro por se decompor. Todas estas etapas conduzem morte celular (Nebe-von-Caron e Badley, 1995, Hewitt e Nebe-Von-Caron, 2001). assim possvel diferenciar o estado fisiolgico de uma clula individual, para alm do clssico e estrito conceito de viabilidade, baseado no funcionamento de alguns sistemas de transporte activo, ou na presena ou ausncia da membrana citoplasmtica intacta e polarizada. A capacidade das clulas vitais e intactas de se dividirem pode ser demonstrada em separado, atravs da tcnica cell sorting (Hewitt et al., 1999a, Nebe-von-Caron et al., 2000). A citometria de fluxo surge assim como uma tcnica consistente e fivel na deteco das verdadeiras percentagens de clulas viveis e mortas, numa determinada populao de microrganismos e, por vezes, em situaes em que a microbiologia clssica no consegue dar qualquer resposta. A deteco de actividade metablica, reveladora de crescimento associado diviso celular de fcil execuo, mas pode haver metabolismo mesmo na ausncia de crescimento, e que produza efeitos indesejveis tais como a degradao de alimentos, a acumulao de toxinas ou a transferncia de genes. Em caso de leses, dormncia (estado fisiolgico intermdio entre a morte e o metabolicamente activo) ou privao extrema de nutrientes nas clulas, a actividade metablica pode no ser facilmente detectvel. Nestas circunstncias, possvel determinar a integridade da membrana atravs da reteno ou excluso de corantes. 2.1 Estimativa do potencial de membrana O potencial de membrana o parmetro de viabilidade actividade metablica mais utilizado em citometria de fluxo aplicada a microrganismos. gerado pela diferena de concentraes de ies no interior e no exterior da membrana citoplasmtica e, como componente do gradiente electroqumico, est intimamente relacionado coma formao de ATP na clula (Shapiro, 2000)

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Em bactrias metabolicamente activas com membranas citoplasmticas intactas, a diferena de potencial , situa-se geralmente entre 100 e 200 mV, encontrando-se o interior da membrana carregado negativamente. A despolarizao da membrana ocorre quando o valor de se desloca para valores menos negativos, portanto, mais prximos de zero e, a hiperpolarizao ocorre quando a alterao dos valores de se d na direco oposta, ou seja, para valores mais negativos. O valor de nulo quando a membrana apresenta danos estruturais tais que permite a livre passagem de ies, o que pode suceder quando a clula sofre, por exemplo, um tratamento trmico, ou um tratamento com antibiticos da famlia das beta-lactamas, entre outros. O tratamento das clulas com ionforos, tais como a cianina carbonil m-clorofenilhidrazona (CCCP), tambm anula o potencial de membrana, por destruio do gradiente de protes que existe na membrana citoplasmtica (Novo et al., 1999, 2000; Wu et al., 1995), denominado, por isso, protonforo. O potencial de membrana pode ser medido directamente atravs de microelctrodos, mas esta tcnica torna-se tanto mais difcil de aplicar quanto menor for o tamanho da clula. A medio de atravs da citometria de fluxo normalmente realizada utilizando corantes lipoflicos de distribuio/partio. Estes, devido sua natureza lipoflica, conseguem atravessar facilmente a membrana e ali acumulam de acordo com a sua carga. Assim, o a) gradiente de concentrao de um catio lipoflico C+ atravs de uma membrana citoplasmtica intacta determinado pela diferena de potencial transmembranar, de acordo com a lei de Nernst: [C+]i/[C+]=e (-F/RT) Onde [C+]i corresponde concentrao de ies de C+ no interior da membrana, [C+]o a concentrao de ies de C+ no exterior da membrana, o potencial de membrana, R a constante dos gases, T a temperatura em graus Kelvin e F a constante de Faraday. Uma vez atingido o equilbrio entre as clulas e o catio do corante, este ir acumular-se no interior da membrana se esta estiver polarizada (ou hiperpolarizada), pois nesta situao o interior daquela encontra-se carregado negativamente, favorecendo a interaco electrosttica entre essas cargas negativas e as cargas positivas do corante (Figura 3 a). Quando a clula se encontra despolarizada, ocorre precisamente o mecanismo
Fluorocromos de Resposta Rpida

inverso: o potencial da membrana diminui (deslocando-se, portanto, para valores menos negativos), levando a que haja uma menor distribuio de cargas negativas no interior da membrana e, nestas circunstncias, o corante ter tendncia para acumular no exterior da membrana, onde haver uma menor distribuio de cargas positivas (Figura 3 b). Todo este processo ocorre de forma inversa quando se est perante a interaco entre um corante lipoflico aninico e a membrana, devido s interaces electrostticas que se estabelecem entre o anio C- e a distribuio de cargas no interior da membrana. Estes fluorocromos so denominados sondas de resposta lenta (demoram entre poucos segundos a vrios minutos at atingirem o equilbrio na partio) e so adequados para medir variaes de potencial de membrana em clulas. Existem outros fluorocromos, designados de resposta rpida, adequados para respostas de variao de potencial mais rpidas que ocorrem em nervos e msculos (Haugland, 2002) A emisso de fluorescncia s ocorre significativamente quando o corante se encontra acumulado no interior da membrana. O sinal emitido depende de alteraes que ocorram nos locais de ligao entre a membrana o corante, bem como do volume da clula. Com o objectivo de elimi-

Espao Extracelular
Hiperpolarizao

Membrana
Despolarizao

Espao Intracelular
Fluorocromos de Resposta Lenta

b)
Hiperpolarizao

Espao Extracelular

Membrana
Despolarizao

Espao Intracelular

Fluorocromos de Resposta Rpida

Fluorocromos de Resposta Lenta

Figura 3 - (Adptao de Haugland, 2002) Mecanismo da resposta dos uorocromos sensveis ao potencial de membrana dos microrganismos. Os ourocromos (sondas) de resposta lenta so anies ou caties lipoflicos que so translocados atravs da membrana por um mecanismo electrofortico. As alteraes de uorescncia derivam da resposta da sonda ao campo elctrico que se estabelece no interior e no exterior da membrana. Os uorocromos de resposta rpida so adequados a respostas de variaes de potencial muito rpidas, como as que ocorrem em clulas de msculos. (a) Mecanismo de resposta de uma sonda catinica de potencial de membrana, de resposta lenta. Uma vez atingido o equilbrio entre entre as clulas e o catio, este acumula-se no interior da membrana se esta estiver polarizada ou hiperpolarizada , pois nesta situao, o interior daquela encontrase carregado mais negativamente. (b) - Mecanismo de resposta de uma sonda aninica de potencial de membrana, de resposta lenta. Uma vez atingido o equilbrio entre entre as clulas e o anio, este acumula-se no interior da membrana se esta estiver despolarizada , pois nesta situao, o interior daquela encontra-se carregado menos negativamente.

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nar esta dependncia, que fonte de erro da determinao de , tm sido realizadas medies raciomtricas de potencial de membrana, por serem prticamente independentes do volume celular (Novo et al, 1999). Na tabela 2 encontram-se alguns dos corantes utilizados na determinao do potencial de membrana. 2.2 Avaliao da integridade da membrana A integridade da membrana pode ser detectada por reteno ou excluso dos corantes. No mtodo de reteno do corante, as clulas so incubadas com um substrato no fluorescente, o qual clivado por enzimas intracelulares, resultando da aco enzimtica um produto fluorescente que retido nas clulas apenas quando a membrana citoplasmtica est intacta. Este mtodo poder no ser rigoroso devido a uma eventual perda de actividade enzimtica, ao transporte ineficiente do substrato no fluorescente, e expulso do corante atravs do sistema de bombas de efluxo.
Tabela 2. A notao de Sims (DiYCn+1)(2m+1) permite

BOX ou Bis-oxonol, para detectar o potencial de membrana, o brometo de etdio (BE) para detectar clulas cujo sistema de transporte que exclui este corante se encontra afectado e o iodeto de propdio (IP) para deteco da integridade da membrana. Esta mistura foi utilizada em clulas de E. coli W3110 em fase de crescimento exponencial, que foram aquecidas a 60C, durante 30 segundos. sabido que este tratamento trmico induz nesta bactria no s a perda do potencial da membrana citoplasmtica como tambm a permeabilizao da mesma (Nebe-von-Caron e Badley, 1995; Boswell et al., 1998, Hewitt et al., 1998, 1999b). A fluorescncia emitida pelas clulas de E. coli coradas com a mistura BOX+BE+IP (Figura 4 a) permitiu diferenciar 4 subpopulaes, correspondentes a (A) clulas saudveis, no coradas; (B) clulas vitais, sem o sistema de transporte activo que exclui o BE e, so, portanto, coradas por este corante; (C), clulas intactas, sem o sistema de transporte activo que exlcui o BE, mas com potencial de membrana, coradas por EB/BOX; e (D) clulas mortas com as membranas citoplasmticas permeabilizadas, coradas por EB/BOX/PI. Outros organismos testados (Citrobacter sp., Actinobacter sp., Pseudomonas sp., e Bacillus sp.) revelaram resultados semelhantes. No entanto, a excluso dos corantes no foi verificada em todas as espcies. Quando clulas de Rhodococcus sp., foram tratadas e coradas da mesma forma com a mistura BOX+BE+IP , apenas trs populaes foram diferenciadas (Figura 4 b). Quando estes resultados foram comparados com os resultados obtidos pela E. coli, verificou-se que a populao composta por clulas saudveis (Figura 4 a, populao A) no estava presente e que todas as clulas de Rhodococcus sp. foram coradas pelo BE. Neste caso, as clulas deste microrganismo. podem ter perdido o sistema de transporte activo no especfico proto/antiporte, que requerido para excluir o BE das clulas. 2. Clulas de Bacillus licheniformis CCMI2 1034 (bactria gram-positiva) coradas com a mistura DiOC6(3)+IP A mistura de DiOC6(3) e PI pode tambm ser utilizada para diferenciar clulas metabolicamente activas, clulas com as membranas citoplasmticas despolarizadas e clulas com membranas citoplasmticas permeabilizadas. A utilizao do DiOC6(3) na diferenciao de bactrias gram-positivas com alteraes do potencial de membrana prefervel a outros tipos de corantes, pois estas clulas, quando se encontram em fase exponencial, geram um potencial de membrana tal que excluem os corantes aninicos, tal como o Bis-oxonol, no permitindo a diferenciao destas clulas (Hewitt e Nebe-von-caron, 2004). A Figura 5 mostra a diminuio da intensidade da fluorescncia do DiOC6(3) em clulas de Bacillus licheniformis CCMI 1034 recolhidas em estado estacionrio (D=0,27 h-1), incubadas durante 10 minutos com CCCP,
Coleco de Culturas de Microrganismos Industriais, localizada no Laboratrio de Microbiologia Industrial, Departamento de Biotecnologia, Instituto Nacional de Engenharia e Tecnologia Industrial.
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descrever a estrutura das cianinas simtricas, pela qual Y pode ser substitudo por O (oxi-oxonis), S (tiooxonis), I (indo-oxonis) ; n o nmero de grupos CH2 e m o nmero de grupos CH=CH-CHFamlia Aninicos Grupo Bis-oxonol Corante DiBAC4(3) DiSBAC2(3) DiBAC4(5) Rh 123 Referncias Suller and Lloyd, 1999

Catinicos

Rodamina

Diaper e Edwards, 1994 Novo et al, 1999 Novo et al, 1999 Monfort et al, 1996 Novo et al, 1999

Carbocianinas

DiOC2(3) DiOC5(3) DiOC6(3) DiIC1(5)

TO-PRO-3, um corante de excitao no vermelho, considerado por vrios autores como marcador de excluso de corantes, pode corar clulas intactas, tal como o brometo de etdio (Nebe-von-Caron, et al, 2000). A excluso do iodeto de propdio assim o mtodo de eleio e o mais utilizado na deteco da integridade da membrana, pois evita problemas associados actividade enzimtica do corante. Portanto, devem ser tomadas precaues na interpretao da reteno e excluso dos corantes. A melhor forma de entender o mecanismo da excluso dos corantes a utilizao de corantes em misturas. A prxima seco descrever duas aplicaes de misturas de corantes fluorescentes em bactrias (uma gram-negativa e uma gram-positiva), e, nalguns casos, os cuidados que devem ser tomados na interpretao dos resultados. 2.3 Marcao com mistura de uorocromos 1. Clulas de Escherichia coli W3110 (bactria gramnegativa) coradas com a mistura BOX+BE+IP A figura 4 mostra a utilizao de uma combinao de trs corantes fluorescentes: o cido bis-(1,3-dibutilbarbitrico),

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comprovando que a emisso de fluorescncia deste corante mais intensa quando as clulas esto metabolicamente activas, com as membranas citoplasmticas polarizadas. Este comportamento foi igualmente observado em clulas de Staphylococcus aureus, quando tratadas com gramicidina, outro ionforo tambm utilizado na reduo do potencial de membrana (Diaper et al., 1992), e em clulas de outra estirpe de Staphylococcus aureus tratadas com CCCP, mas coradas com DiOC2(3) (Novo et al., 1999).

Nmero de Eventos

Clulas em estado estacionrio (0.27h-1 )+ CCCP (10 min)

Clulas em estado estacionrio (0.27h-1)

DiOC6(3)

Figura 5 - (Retirada de Reis et al., 2004) Efeito da adio de cianina carbonil m-clorofenilhidrazona (CCCP) no potencial de membrana de clulas de Bacillus licheniformis CCMI 1034, em estado estacionrio (D=0,27 h-1), quando coradas com DiOC6(3).

Figura 4 - (Retirada de Hewitt e Nebe-Von-Caron, 2001) (a) Fluorescncia emitida por clulas de E.coli 3110 em fase exponencial, submetidas a um tratamento trmico (60C durante 30 s), coradas com a mistura brometo de etdio + bis-oxonol + iodeto de propdio (BEP) e (b) uorescncia emitida por clulas de Rhodococcus sp. coradas com a mesma mistura. Quatro subpopulaes foram difrenciadas, correspondentes a (A) clulas saudveis, no coradas; (B) clulas vitais, sem o sistema de transporte activo que exclui o BE e, so, portanto, coradas por este corante; (C), clulas intactas, sem o sistema de transporte activo que exlcui o BE, mas com potencial de membrana, coradas por EB/BOX; e (D) clulas mortas com as membranas citoplasmticas permeabilizadas, coradas por EB/BOX/PI. As medies no citmetro de uxo foram realizadas num Coulter Epics Elite com excitao a 488 nm, proveniente de um laser de argon (15 mW). As uorescncias do IP, BE e BOX foram medidas a 635, 575 e 525 nm, respectivamente. Devido elevada sobreposio dos espectros de emisso do BE e do IP, o sistema foi compensado de forma a eliminar a uorescncia emitida pelo IP no detector de emisso de uorescncia do BE.

A Figura 6 a) mostra o grfico de densidades correspondente a clulas de Bacillus licheniformis CCMI 1034 quando submetidas a um tratamento trmico a 100C, durante 10 minutos, e posteriormente coradas com uma mistura de DiOC6(3) +PI. possvel diferenciar duas subpopulaes (B) e (D), que correspondem respectivamentes a clulas com membranas polarizadas (B), que no so coradas por nenhum dos corantes e, uma outra sub-populao (D), composta por clulas coradas por ambos os flurocromos. A interpretao desta ltima sub-populao, baseada na colorao destas clulas por ambos os corantes, levaria a concluir que estas clulas possuem membranas polarizadas (coradas pelo DiOC6(3) ), mas permeabilizadas (coradas pelo IP), o que contraditrio. Mason et al., 1995, observaram que clulas de E.coli, quando submetidas ao mesmo tratamento trmico e coradas com DiOC6(3), apresentavam uma fluorescncia superior s clulas saudveis (possuidoras de membranas citoplasmticas polarizadas). Teoricamente, clulas que so coradas por este composto possuem membranas polarizadas, pelo que a fluorescncia do DiOC6(3) emitida por clulas submetidas ao tratamento trmico (que induz a despolarizao e permeabilizao da membrana) deveria ser baixa ou ausente. Os autores explicaram esta discrepncia baseando-se no carcter lipoflico do DiOC6(3). A estrutura das cadeias dos fosfolpidos das membranas citoplasmticas das clulas, quando expostas a elevadas temperaturas colapsa, ficando as regies hidrofbicas da membrana expostas e acessveis ao DiOC6(3) que ir ligar-se a esses centros, devido sua elevada afinidade por aquelas regies. Nesta situao, a emisso da florescncia do DiOC6(3) detectada em clulas mortas no dependente do potencial de membrana, mas sim da afinidade daquele composto pelas regies hidrofbicas da membrana expostas. Clulas recolhidas de uma cultura contnua em estado estacionrio taxa de diluio de 0.27 h-1 (max>1h -1), quando coradas com a mistura de DiOC6(3) e PI apresentam o grfico de densidades mostrado na figura 6 b), onde posBoletim de Biotecnologia 37

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svel diferenciar quatro subpopulaes, correspondentes a clulas polarizadas (A), coradas pelo DiOC6(3); clulas despolarizadas (B), no coradas; clulas despolarizadas e permeabilizadas (C), coradas pelo PI; e clulas despolarizadas e permeabilizadas com a membrana citoplasmtica danificada (possvelmente clulas fantasmas), coradas pelo DiOC6(3) e PI. A existncia de clulas fantasmas foi posteriormente confirmada pela anlise destas quatro subpopulaes por microscopia de transmisso electrnica. A Figura 7 mostra uma seco de uma amostra de clulas de Bacillus licheniformis CCMI 1034, quando privadas de nutrientes, por um perodo de trs horas. Foi possvel identificar dois tipos distintos de clulas: umas com estruturas do tipo clula fantasma, com pouco ou nenhum material citoplasmtico no interior do envelope da clula, que contrastam com clulas consideradas normais, cujo contedo citoplasmtico no interior de clula se apresenta denso. Pensa-se que as estruturas que perderam o contedo celular se encontram num estado avanado de lise celular, podendo ser responsveis pela intensa fluorescncia do DiOC6(3), conforme se observou em clulas submetidas ao tratamento trmico a 100 C. assim suposto que a sub-populao (D) corresponde a clulas com um elevado grau de leso nas suas membranas, equiparado aos danos que ocorrem na membrana citoplasmtica quando sujeita a um tratamento trmico drstico (100C, durante 10 minutos).

II

Figura 6 - (Retirada de Reis et al., 2004) (a) Clulas de Bacillus licheniformis CCMI 1034 submtidas a um tratamento trmico (banho de gua a 100, durante 10 minutos), coradas com a mistura de DiOC6(3)+IP. Duas subpopulaes foram diferenciadas, correspondentes a (B) clulas com a membrana citoplasmtica despolarizada, no coradas por nenhum dos corantes; e (D) clulas com a membrana citoplasmtica permeabilizada, coradas por ambos os corantes DiOC6(3)+IP. (b) (b) Clulas de Bacillus licheniformis CCMI 1034 em estado estacionrio (D=0.27 h-1), coradas com a mistura DiOC6(3)+IP. Quatro subpopulaes foram diferenciadas, correspndentes a (A) clulas saudveis, coradas pelo DiOC6(3); (B) clulas com a membrana citoplasmtica despolarizada, no coradas; (C) clulas com a membrana despolarizada e permeabilizada, coradas pelo IP; e (D) clulas com a membrana citoplasmtica despolarizada, permeabilizada e danicada. As medies no citmetro de uxo foram realizadas num Coulter Epics Elite com excitao a 488 nm, proveniente de um laser de argon (15 mW). As uorescncias do IP e do DiOC6(3) foram medidas a 635 e 525 nm, respectivamente.

Figura 7 - (Retirada de Reis et al., 2004) Fotograa de transmisso electrnica (x 25000) de clulas do Bacillus licheniformis CCMI 1034 em carncia de nutrientes por um perodo de 3 horas. possvel visualisar clulas fantasma que apresentam um reduzido contedo material citoplasmtico no interior do envelope da clula. Estas estruturas (I), contrastam com as estruturas do tipo II, relativas a clulas normais, cujo contedo citoplasmtico denso.

Com base na explicao destas quatro subpopulaes, foi ento sugerida a seguinte dinmica entre elas: Quando as clulas saudveis (sub-populao A) so submetidas a um determinado tipo de stresse, alguns dos seus sistemas de transporte activo podero ser afectados, o que induz a despolarizao da membrana citoplasmtica (sub-populao B). Este estado metablico poder evoluir para a permeabilizao da membrana, indicando morte celular (sub-populao C) e, mais tarde, a membrana poder colapsar (sub-populao D). Porm, ensaios posteriores

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confirmaram que as clulas com membranas despolarizadas que compem a sub-populao (B), em presena de uma fonte fresca de energia, conseguem repolarizar as suas membranas, evoluindo para a sub-populao (A), composta por clulas saudveis (Reis et al., 2004, submetido para publicao). associado diviso celular. O mtodo das viabilidades tem por base a diluio da amostra e posterior inoculao em meios no selectivos, pelo que necessrio esperar pelo menos 12 horas at se obterem resultados, mais uma vez demasiado tarde para se poderem fazer alteraes durante o controlo de processo. importante realar uma vez mais que estados fisiolgicos em que as clulas se encontrem sob stresse ou danificadas, correspondentes a clulas viveis mas no cultivveis, no so detectados por estes mtodos. As tcnicas de colorao utilizadas em microscopia tambm sofrem das mesmas limitaes da contagem manual de clulas. Os modelos matemticos utilizados para prever a evoluo da biomassa ao longo de uma fermentao so muitas vezes imprecisos porque assentam no pressuposto de que uma determinada populao de bactrias homognea do ponto de vista fisiolgico e da sua capacidade de diviso celular, o que, como se viu atrs, no corresponde realidade. A presena de uma elevada percentagem de clulas permeabilizadas, consideradas mortas, ter um impacto negativo na sntese de qualquer produto desejado ou na degradao de agentes poluentes. Da que a monitorizao da concentrao do produto, da biomassa, dos nutrientes e de outros substratos deva ser acompanhada pela monitorizao do desenvolvimento das subpopulaes de uma cultura microbiana, no decorrer do processo. Hewitt et al. (1999b), atravs da utilizao da tcnica de misturas de corantes fluorescentes em citometria de fluxo at-line, demonstraram que ocorria uma reduo de 20% na viabilidade de clulas de E.coli na ltima fase da fermentao em regime semi-contnuo, devido severa limitao de carbono que se verificou nas timas etapas da fermentao (Figura 8). As anlises que fornecem informaes sobre a evoluo do bioprocesso, quando realizadas on-line (o equipamento est em contacto directo com a cultura atravs de uma sonda, por exemplo), tero um acrescido benefcio relativamente aos mtodos de monitorizao at-line e offline, uma vez que permitiro obter informao no tempo real da fermentao, e a tempo de se tomarem decises na estratgia do processo (Alison et al, 2002). A montagem da Citometria de Fluxo on-line em unidades de fermentao garantir, num futuro prximo, um significativo aumento da produtividade do processo. Este sistema, em associao com uma estratgia do controlo do processo baseada na adio de uma fonte de energia que seja dependente do nmero de clulas com um baixo potencial de membrana (subpopulao de clulas com as membranas despolarizadas que capaz de evoluir para a repolarizao da membrana em presena de uma fonte fresca de energia, confrome se viu atrs) permitir reduzir o nmero de clulas que no contribuam para a sntese do produto desejado, e, por conseguinte, aumentar a produtividade global do processo (Nebe-von-Caron et al., 2000).

3. Citometria de Fluxo on-line nos processos biotecnolgicos, num futuro prximo


No decurso de qualquer bioprocesso, essencial a monitorizao da proliferao celular, bem como da viabilidade. As informaes da concentrao de biomassa so cruciais na tomada de decises, durante o controlo do processo. Estas informaes podem permitir a recolha do produto na concentrao adequada, de forma a obterem-se produtividades mximas, ou ainda a activao de sistemas indutveis no tempo correcto, de modo a optimizar-se a eficincia global do processo. A existncia de uma fraco significativa de clulas mortas ou dormentes durante qualquer parte da evoluo do bioprocesso reflectir-se- negativamente no rendimento global do processo, uma vez que estas clulas no contribuem para a formao do produto. Portanto, importante a obteno de informao rigorosa e precisa sobre os estados fisiolgicos das clulas presentes numa determinada populao. Tal como foi referido atrs, a marcao com misturas de corantes permite obter esta informao com um elevado grau de preciso num intervalo de tempo reduzido e com tempo de resposta quase em tempo real, mostrando numerosas vantagens relativamente aos mtodos tradicionalmente utilizados na determinao da viabilidade celular. As tcnicas de microbiologia clssica utilizadas para monitorizar a proliferao e a viabilidade celular apresentam vrios inconvenientes. Como j foi referido, a densidade ptica, o peso seco e a contagem manual de colnias do uma indicao do crescimento associado diviso celular, mas no do qualquer informao sobre o estado fisiolgico das clulas. Alm disso, os resultados da evoluo da concentrao da biomassa (peso seco) de uma determinada fermentao s esto disponveis aps um perodo de tempo relativamente prolongado, na maioria dos casos demasiado tarde para se poder fazer qualquer alterao no controlo do processo. Por outro lado, este tipo de medies realizados nas fases iniciais das fermentaes, quando as concentraes de biomassa so geralmente baixas, impreciso, pois tem associado um elevado erro experimental. Acresce que as leituras de densidade ptica raramente do conta de alteraes na dimenso das clulas. Por seu lado, a contagem manual de clulas morosa e, em termos estatsticos, assenta no princpio de uma distribuio igualitria na cmara de contagem, uma situao altamente improvvel. Do ponto de vista da microbiologia clssica, uma clula considerada vivel quando se comprova o seu crescimento

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Figura 8 - (Retirada de Hewitt et al., 1999b) Clulas de E. coli W3110 colhidas 5 h (a), 16 h (b) e 36 h (c) aps o incio de uma fermentao de alta densidade, em regime semi-contnuo, coradas com a mistura de BOX+IP. Trs subpopulaes foram diferenciadas, correspondentes a (A) clulas saudveis, no coradas; clulas sem potencial de membrana (B), coradas com BOX ; e (C) clulas com membranas despolarizadas, coradas pelo BOX e pelo IP.

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Agradecimentos
O trabalho realizado pelos autores na Universidade de Birmingham (Reino Unido) foi financiado pelo projecto Europeu do Quinto Programa quadro (QLK3-1999-0004) Enhanced, Intelligent Processing of Food and Related Wastes using Thermophilic Populations. Teresa Lopes da Silva e Alberto Reis agradecem Fundao para a Cincia e a Tecnologia o apoio financeiro atravs das bolsas de Doutoramento BD/5453/2001 e Ps-Doutoramento BPD/ 8039/2002, respectivamente. Referncias Bibliogrcas
Alison, S., Gaensakoo, R., Harvey, L.M. and Mcneil, B., 2002. Use of at-line and in-situ near-infrared spectroscopy to monitor biomass in an industrial fed-batch Escherichia coli process. Biotechnol. Bioeng., 80, 4, 405-413.

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